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Charakterisierung der aquatischen Biofilme mit Durchflusszytometrie

doi: 10.3791/57655 Published: June 6, 2018

Summary

Durchflusszytometrie in Kombination mit visuellen clustering bietet eine einfach zu bedienende und schnelle Methode zur Untersuchung von aquatischer Biofilms. Biofilm-Charakterisierung, Erkennung von Veränderungen in der Struktur der Biofilm-Gemeinschaft und die Detektion von abiotischen Partikeln eingebettet im Biofilm einsetzbar.

Abstract

Biofilme sind dynamische Konsortien von Mikroorganismen, die eine Schlüsselrolle in Süßwasser-Ökosystemen spielen. Durch die Veränderung ihrer Gemeinschaftsstruktur, Biofilmen schnell auf Veränderungen der Umwelt reagieren und können somit als Indikatoren für die Qualität des Wassers verwendet werden. Derzeit basiert Biofilm Bewertung meist auf integrative und funktionalen Endpunkte wie photosynthetische oder Atemwege Tätigkeit, die keine Informationen über die Struktur der Biofilm-Gemeinschaft bieten. Durchflusszytometrie und computergestützte Visualisierung bieten eine alternative, sensibel und leicht zu bedienende Methode zur Beurteilung der Gemeinschaft Zusammensetzung, insbesondere von den photoautotrophen Teil von Süßwasser Biofilmen. Es erfordert nur grundlegende Probenvorbereitung, nach deren Ablauf die gesamte Probe durch das Durchflusszytometer ausgeführt ist. Die einzelligen optische und fluoreszierende Informationen wird für computergestützte Visualisierung und biologischen Interpretation verwendet. Die wichtigsten Vorteile gegenüber anderen Methoden sind die Geschwindigkeit der Analyse und der hohe Informationsgehalt Natur. Durchflusszytometrie liefert Informationen über verschiedene Zell- und Biofilm Eigenschaften in einer einzigen Messung: Partikelgröße, Dichte, Pigmentanteil, abiotische Inhalte in den Biofilm und groben taxonomische Informationen. Jedoch bietet es keine Informationen über Zusammensetzung der Biofilm auf Artniveau. Wir sehen hohes Potential bei der Verwendung der Methode für die Umweltüberwachung aquatischer Ökosysteme und als erste Biofilm Evaluation Schritt, die stromabwärts informiert detaillierte Untersuchungen durch ergänzende und genauere Methoden.

Introduction

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Biofilme sind dynamische Konsortien von Mikroorganismen, die eine in Süßwasser-Ökosystemen, Primärproduktion Schlüsselrolle, nährstoffkreisläufe und Wasseraufbereitung bis hin zu beeinflussen die Verteilung der Mikroorganismen und ihrer Artenvielfalt des Ökosystems 1. wenn Biofilme an sich verändernde Umweltbedingungen oder Stressoren, wie Chemikalien, ausgesetzt sind rückt die Gemeinschaftsstruktur schnell toleranter Arten2,3. Ihre hohe Empfindlichkeit verwandelt sich Biofilme in attraktive Modellsysteme für ökologische Überwachung4, jedoch keine der aktuellen Methoden perfekt geeignet ist, um die Dynamik einer Biofilm-Gemeinschaft tatsächlich in eine schnelle und einfache Weise zu verfolgen.

Die häufig verwendete Satz von Methoden zur Charakterisierung von Biofilmen besteht aus der Messung der funktionellen und strukturellen Endpunkte. Auf der Ebene der gesamten Gemeinschaft enthält Photosynthese und Atmung sowie die Aktivität extrazellulärer Enzyme Informationen über den Funktionszustand der Biofilm5,6,7,8 ,9. Biomasse-Abgrenzung dient als Indikator für Gesamtwachstum Biofilm. Strukturelle Veränderungen sind derzeit entweder mit traditionellen speziesidentifizierung mit Lichtmikroskopie oder Nukleotid-basierte Techniken (z.B.Denaturierenden Gradienten Gelelektrophorese (DGGE), automatisierte ribosomale intergenetischer Distanzstück gemessen. Analyse (ARISA), Metagenomik)10,11,12. Diese Methoden informieren, sondern sind zeitaufwendig, durchzuführen, oder erfordern spezielle Kenntnisse oder sind noch in der Entwicklungsphase. Schließlich neue Methoden zur Bewertung der extrazelluläre Polymere Substanzen (EPS)13,14 und der Biofilm Architektur1, während der empfindlichen, sind niedrig-Durchsatz und noch nicht in Richtung entwickelt worden Überwachungszwecke.

Es ist offensichtlich, dass für eine vollständige Charakterisierung von Süßwasser Biofilmen, es notwendig ist, verschiedene Methoden, die Einblick in die Biofilm-Funktion, die Zusammensetzung und die Architektur zu kombinieren. Für die Umweltüberwachung, auf der anderen Seite ist eine schnelle und empfindliche Methode, die ist erkennen Veränderungen im Biofilm und ermöglichen grundlegende biologische Deutung der Verschiebungen auf die funktionellen und strukturellen Ebene, erforderlich.

Wir haben eine neue Methode zur Charakterisierung der mikrobiellen Gemeinschaft der phototrophe Komponente von Stream Biofilmen (Periphyton), entwickelt, ist schnell genug für Überwachungszwecke und gleichzeitig ausreichend informiert über den Biofilm-Gemeinschaft Struktur, biologische Deutung15zu ermöglichen. Es basiert auf einzellige Durchflusszytometrie (FC) der Biofilm Proben und gepaart mit computergestützten Visualisierung und bietet Informationen über optische und fluoreszierende Eigenschaften des Biofilms auf der Ebene der einzelnen Zelle.

Der Workflow nach der Probenahme Biofilm besteht der Probenvorbereitung in Form von Beschallung, Fixierung und Größe-basierte Filterung der Proben, gefolgt von der Beurteilung der Probenmaterials durch Durchflusszytometrie. Die erfassten Daten geben Auskunft über mehrere zellulären Eigenschaften in einer einzigen Messung: Partikelgröße, Dichte, Pigmentanteil, abiotische Inhalte (z. B. mikroplastik) im Biofilm. Dieser Satz von Daten ist als über computergestützte Visualisierung mit visuellen stochastische Nachbar einbetten (ViSNE)16, ermöglicht schnelle und einfache Interpretation der Daten analysiert. Obwohl ein paar Wochen erforderlich sind, um einrichten und optimieren die Methode einmal eingerichtet, es dauert nur wenige Stunden von den Biofilm Probenahmen zur Interpretation der Ergebnisse.

Die wichtigsten Vorteile der vorgestellten Methode gegenüber anderen sind die Geschwindigkeit der Analyse und hohen Informationsgehalt. Darüber hinaus können die Proben für mehrere Wochen nach der Entnahme ohne Verlust von ihren optischen und Fluoreszenzeigenschaften gespeichert werden. Dies kann sehr nützlich sein bei der Charakterisierung von einer großen Anzahl von Proben ist erforderlich, wie z. B. große Stichproben Studien oder Biomonitoring-Programme, sondern bieten auch eine beträchtliche Menge an Informationen in kleinere explorative Studien.

Die vorgestellte Protokoll basiert auf Fluss-durchflusszytometrischen Analyse von phototrophe Biofilmen (Periphyton) von verschiedenen Standorten eines Baches gesammelt. Viele Schritte des Protokolls, z. B. die Auswahl der Standorte für Überwachungszwecke, die Ziele der Forschung abhängig und daher können nicht verordnet werden. Andere weniger Freiheit ermöglichen und erfordern, dass das Protokoll aufmerksam verfolgt, wird in das ausführliche Protokoll unten deutlich.

Das Protokoll beginnt mit der Auswahl der Standorte für Biofilm-basiertes Umweltmonitoring. Der nächste Schritt ist Setup Durchflusszytometer (FC), so dass seine Messungen Diskriminierung zwischen verschiedenen phototrophe Organismen in Biofilmen in der überwachten Umgebung ermöglichen. Dies erfolgt durch das Sammeln von Biofilm-Proben von den Sites, identifizieren die fluoreszierenden Eigenschaften der verschiedenen Arten in den Biofilm und Einrichten der Durchflusszytometer mit Laser und Filter, die Messung an den entsprechenden optischen aktivieren Wellenlängen. Nachdem die FC Aufbau wurde, können Biofilme werden gesammelt von den Seiten in regelmäßigen Abständen die optischen und fluoreszierenden Eigenschaften der einzelnen Partikel in den Biofilm-Durchflusszytometrie gemessen und die Daten analysiert durch visuelle clustering. Für bessere Interpretation der Ergebnisse ist es möglich, eine FC-Referenzdatenbank von lokalen Biofilm-Lebewesen und ihre Phänotypen zu bauen und die Datenbank verwenden, um verschiedene Taxonomien in den FC-Daten zu identifizieren. Die Validierung ist möglich durch Fluoreszenz basierende Sortierung der identifizierten Cluster von Einzelzellen mit FACS und Mikroskopie-basierte taxonomische Identifizierung der vorliegenden Art. Eine schematische Darstellung des Protokolls ist in Abbildung 1aufgeführt.

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Protocol

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(1) Ökosystem Auswahl und Biofilm-Sampling

  1. Wählen Sie eine aquatische Ökosystem von Interesse und finden Sie Probenahmestellen wo Biofilme wachsen zu. Flache Teile eines Baches mit langsam zum Medium Wasser fließen und einen steinigen Flussbett zur Befestigung der Biofilm sind geeignete17,18.
  2. Optional: Wenn die Website nicht genügend Flächen zur Befestigung der Biofilm zu verringern und einen die Biofilme Variabilität innerhalb einer Website haben, setzen Sie künstlichen Substraten für Biofilm-Anlage (z.B. Glas-Objektträger, keramische Fliesen) Ortsbild, gleichzeitig aber dafür sorgen, dass Sie befinden sich in der gleichen Richtung in Bezug auf den Wasserfluss und ähnliche Tiefe und Intensität des Lichts19.
  3. Um festzustellen, die Umweltbedingungen der Probenahme-Website, verwenden tragbare Messgeräte zur Messung der Lichtintensität, ist Temperatur, Leitfähigkeit, Sauerstoff und pH-Wert direkt über der Oberfläche Biofilm, entnommen werden. Im Laufe der Probenahme Maßnahmen Sie wiederholt (3 – 5) um Mittelwerte zu berechnen.
  4. Optional: Nehmen Wasserproben Ermittlung relevanter Wasser Chemie Parameter (gelösten organischen Kohlenstoffs (DOC), K+, Na+, Ca2 +, Mg2 +, Cl, F-, SO42 -, PO42- , Keine32-, SiO44-).
  5. Mit Schutzhandschuhen, sammeln Sie vergleichbare Steinen (Größe, Form und Art) von jeder Seite (oder künstlichen Substraten). Die Stones sollten ähnliche Flow und Lichtverhältnissen18ausgesetzt werden.
  6. Filtern Sie genug Strom Wasser von der Website durch 0,22-μm-Filter, so dass es für alle gesammelten Proben (z. B. 15 mL pro Probe) bereit ist.
  7. Verwenden Sie eine weiche Zahnbürste zum Entfernen des Biofilms vom Substrat in einer Flasche (Bürste, bis alle Biofilm entfernt wird) mit 15 mL gefiltertem Strom Wasser20.
  8. Befestigen Sie die Proben in 0,01 % Paraformaldehyd und 0,1 % Glutaraldehyd21.

2. Bestimmung der optimalen Durchfluss-durchflusszytometrischen (FC) Parameter

  1. Teilproben auf einem Lichtmikroskop übertragen (mit einem 40 X / 0,75 Ziel; verwenden Sie ggf. ein 100 × 1,3-Öl-Ziel) und identifizieren die Artenvielfalt in den Proben22,23.
  2. Bestellung identifiziert einzelne Spezies aus entsprechende Kultur Sammlungen (z.B. experimentelle Phykologie und Kultur Sammlung von Algen an der Universität Göttingen [EPSAG] oder Kultur Sammlung von Algen an der Universität zu Köln [CCAC] Wenn die Überwachung in den zentralen europäischen Ökosystemen erfolgt).
  3. Wachsen Sie die einzige Art in ähnlicher Umweltbedingungen (z. B. Licht, Temperatur, pH-Wert) kontinuierlich an die Umgebung, die, der die Biofilm Proben entnommen wurden. Innerhalb von 1 ° C und 0,5 pH-Punkt aus der Umweltproben empfiehlt.
  4. Zum lösen/Dispergieren der Zellen, 15 mL der einzelnen Arten Proben in Zentrifuge Röhren und legen Sie die Rohre in der Mitte von einem Wasserbad und Tauchen Sie, so dass die flüssige Oberfläche der Probe auf dem gleichen Niveau wie die Oberfläche des Bades ist. Beschallen Sie die Proben 1 min 45 kHz24,25.
  5. Notieren Sie die Absorption und Fluoreszenz Spektren der einzelnen Arten mit einem Teller-Reader. Entnehmen Sie bitte Platte Leser Wahl für Anweisungen. In diesem Beispiel 96-Well Flachboden transparenten Polystyrol-Platten wurden mit 200 µL Probenvolumen geladen und Extinktion gemessen. (Einstellungen verwendet: (a) Fluoreszenz-Scan-Modus; Emission Wellenlänge Schritt Größe 10 nm, Emission Scan Nummer 30, Bandbreite 20 nm, gewinnen 100, 25 Blitze, 20 US Scan Zeit oder (b) Absorption Integrationsmodus; 25 Blitze, Bandbreite 9 nm).
  6. Richten Sie das Durchflusszytometer mit Laser, dichroitischen Splitter und Filter, die in Kombination diese fluoreszierende Bereiche abdecken, in denen verschiedene Arten bestimmte Eigenschaften haben. Für zentrale europäische Ströme, ein 405 nm, 488 nm und 638 nm Laser brauchbare Ergebnisse produzieren.
  7. Passen Sie die Spannungseinstellung von den Photomultipliern (gilt nicht für alle fließen Cytometers) und das Leistungsspektrum der gemessenen Ausblühungen um mehr als 99 % aller Ereignisse der Proben erweitert.
  8. Alternativ, wenn Kenntnisse über Artenvielfalt in den Biofilmen verfügbar ist, beginnen Sie mit Schritt 2.2. Wenn fluoreszierende Eigenschaften bekannt sind, beginnen Sie mit Schritt 2.6.

3. optional: Vorbereitung einer Flow-durchflusszytometrischen Referenzdatenbank

Hinweis: FC erlaubt keine taxonomische Identifizierung der Zellen in den Biofilm. Eine Referenzdatenbank FC Messungen einzelner Arten bekannt, vorhanden in den Biofilmen, unter ähnlichen Bedingungen wie die Biofilme gewachsen sein helfen bei der Interpretation der Daten.

  1. Hinweis: einzelne Spezies
    1. Mit den optimierten Parametern FC 2,5 – 7 einrichten, die optischen und fluoreszierenden Eigenschaften der einzelnen Arten (in Paraformaldehyd und Glutaraldehyd fixiert und durch Filter von geeigneter Größe für das Durchflusszytometer gefiltert) zu messen.
    2. Normalisieren Sie die Daten von einzelnen Arten in der gleichen Weise wie die Daten aus den Biofilmen (siehe Schritt 6.1.2).
  2. Referenz: beschädigte und zerfallende Zellen
    Einer der wichtigsten Indikatoren der Biofilm-Gesundheit ist der Anteil der beschädigt/sterben Zellen im Biofilm vorhanden. Zur Quantifizierung dieser Zellen kann ein Verweis der verfallenden Zellen hergestellt werden.
    1. Nehmen Sie 1 mL Teilproben von verdünnten Biofilmen und Zentrifugieren sie bei Raumtemperatur bei 8.000 X g für 10 Minuten in einer Tischplatte Zentrifuge. Das resultierende Pellet in 1 mL 90 % Ethanol auszusetzen und die Suspension über Nacht bei 4 ° c Lagern Am nächsten Tag wiederholen.
    2. Mit der optimierten FC-Einstellungen, Messen Sie die optischen und fluoreszierenden Eigenschaften der beschädigten und zerfallenden Zellen (fixiert und gefiltert).
  3. Referenz: mikroplastik
    Hinweis: bei Interesse bei der Überwachung der Microplastic Partikel in den Biofilmen, prüfen Sie, ob sie genug unterscheiden sich von biotischen Partikel in der optischen und Fluoreszenzeigenschaften zur Identifikation.
    1. Auszusetzen Sie die Microplastic Partikel gemäß den Anweisungen des Herstellers mikroplastik und Messen Sie ihre optischen und fluoreszierenden Eigenschaften (mit FC-Parameter von 2,7).
    2. Der Biofilm-Probe die Microplastic Partikel hinzu und lassen Sie über Nacht bei 4 ° C.
    3. Filtern Sie die Federung und Messen mit der gleichen FC-Parametern wie oben.

4. Probieren Sie Zubereitung und Lagerung

  1. Nachdem die FC eingerichtet wurde und die FC-Referenz-Datenbank bereit ist, kann man mit der Auswertung der frischen Biofilm Proben entsprechend Schritte 1.1 – 7 Vorgehen. Zum lösen/Dispergieren der Biofilm, übertragen Sie 15 mL der Proben aus den Kolben (siehe Schritt 1,7) in Zentrifuge Rohre.
  2. Setzen Sie jedes Rohr in der Mitte von einem Wasserbad und Tauchen Sie, so dass die flüssige Oberfläche der Probe auf dem gleichen Niveau wie die Oberfläche des Bades ist. Beschallen Sie die Proben 1 min bei 45 kHz.
  3. Befestigen Sie die Proben in 0,01 % Paraformaldehyd und 0,1 % Glutaraldehyd (bestand im Nanopure Wasser). Lagerung bei 4 ° C bis zur Analyse bereit.
  4. Wichtig: Verwenden Sie die Hälfte der Proben für die Durchflusszytometrie Analyse und halten Sie die Hälfte im Speicher für Sicherheit und optional Validierung mit Fluoreszenz-aktivierte Zellsortierung und/oder Lichtmikroskopie (siehe Abschnitt 6).
    Beachten Sie: gespeichert in den Kühlschrank stellen, sollten die festen Biofilm Proben ihrer optischen und fluoreszierenden Eigenschaften für bis zu drei Wochen halten.

5. Ausführen des Beispiels durch den FC

  1. Wenn die Proben im Kühlschrank aufbewahrt wurden, Beschallen sie schnell oder pipette mehrmals, um die Partikel zu trennen. Filtern Sie die Teilproben mit 50 μm-Filter (Filtergröße hängt die Breite der FC Kapillare) vor der Messung.
  2. Laden Sie die einzelnen Samples (1 – 2 mL, dies hängt von der Durchflusszytometer verwendet) in das Durchflusszytometer und die optischen und fluoreszierenden Eigenschaften jedes Teilchens zu messen. Wiederholen Sie die Messung dreimal pro jedes biologische replizieren (drei technische Wiederholungen).
  3. Exportieren Sie die Daten aus der FC im CSV-Format.

6. die Datenaufbereitung und Korrelationsanalyse

FC kann mehrere Parameter (z.B.Signalbereich, Höhe, Breite) für jeden gemessenen optischen Eigenschaften und Fluoreszenz-Bereich analysieren. Führen Sie eine Korrelationsanalyse auf den Messgrößen und halten Sie nur die Messungen, die nicht stark korreliert sind. Dadurch entfällt in der Regel alle, aber ein FC-Parameter (z.B. Signalbereich) und können auch entfernen stark korreliert fluoreszierende Messungen (in der Regel die aus dem gleichen Laser und benachbarten Filter).

  1. CYT als eine Toolbox in Matlab ausführen:
    1. Der reduzierten FC Importdaten im CSV-Format aus den Proben, die analysiert werden, in die CYT Software16, einschließlich aller technischen und biologischen repliziert. (Klicken Sie auf + Datei *.CSV zu filtern, wählen Sie Dateien für den Import).
    2. Die fluoreszierende Kanäle aller Proben, die Verwendung der hyperbolischen ARCSIN Transformation zu verwandeln. Der Wert der Cofaktor muss ausgewählt werden; für bestimmte Versuchsaufbauten und heterotrophen Biofilme werden 150 Werke für die meisten phototrophe Biofilme und fließen Cytometers sondern Optimierung. (Right-Click/Transform/geben Sie Cofaktor 150)
    3. Für die Qualitätskontrolle visuell zu vergleichen (im CYT) die Histogramme der einzelnen Proben und optische und fluoreszierende Einzelkanäle um sicherzustellen, dass die technischen und biologischen Ebene der Replikation gibt es keine Ausreißer. Ausreißer werden in deutlich verschobenen Leuchtstoff/optische Verteilungen zwischen den Wiederholungen manifestieren. (Daten auswählen, wählen Sie Kanal, Plot)
      1. Alternative: laufen Sie eine Hauptkomponentenanalyse (PCA) auf die mittlere Werte der fluoreszierenden Distributionen und stellen Sie sicher, dass technische und biologische Wiederholungen zusammen gruppieren.
    4. Zusammenführung der technischen in jedem biologischen Replikation repliziert und Teilstichprobe der biologischen repliziert, so dass jeweils die gleiche Anzahl von Teilchen (Zellen, Zelle Fragment und abiotischen Partikeln) vertreten ist und damit die Gesamtzahl der Partikel durch analysiert Barnes-Hütte stochastische Nachbar einbetten (bh-SNE) ist rund 150.000 (für beste Visualisierung Ergebnisse26). (Wählen Sie Daten, Rechte Maustaste, Merge/Teilstichprobe)
    5. Für den Vergleich zwischen Proben ist es wichtig, nur diese Proben auswählen, die verglichen werden sollen. Wählen Sie die Proben und führen Sie bh-SNE27. Sobald der Algorithmus beendet, neue Kanäle ist, erscheinen benannte bh-SNE1 und bh-SNE2. Dies sind die SNE-Koordinaten aller analysierten Partikel, die verwendet werden können, um die Daten in einem Streudiagramm (ViSNE Karte) zu visualisieren. (Daten auswählen, wählen Sie Kanäle, Rechte Maustaste, bh-SNE, ja normalisierten Daten)
    6. Partikel sind in der Karte ViSNE nach Ähnlichkeit positioniert und in optisch trennbar Cluster gruppiert. Überprüfen Sie den optische/fluoreszierende Eigenschaften der Cluster und Mark und Namen sind gut getrennt und haben verschiedene optische/Fluoreszenzeigenschaften von mit den Zeichenwerkzeugen in CYT erhältlich. (Wählen Sie Kanal bh-SNE1, bh-SNE2)
    7. Optional: Wenn eine Referenzdatenbank von mikrobiellen Spezies (gemessen mit der gleichen Durchflusszytometrie Einstellung und unter ähnlichen Bedingungen gewachsen!) zur Verfügung steht, ViSNE Karten in Matlab exportieren und die Karten die Referenzdatenbank projizieren. Auf diese Weise können bestimmte Cluster an bestimmten Arten/taxonomischen Gruppen (Skripte zum Download unter https://github.com/anzezupanic/FC_analysis) angeschlossen werden. (Sitzung/speichern)
    8. Problembehandlung: Wenn die bh-ans-Analyse nicht optisch trennbar Cluster, sondern eine einzige große zurück, zu viele Partikel in der bh-ans dienten. Wiederholen Sie den Vorgang mit weniger Partikel pro Probe. Wenn es keine Cluster, aber eher spärlich Einzelpunkte gibt, erhöhen Sie die Anzahl der Teilchen verwendet.
  2. Optional: Anstatt auf bh-SNE für das clustering, andere clustering Methoden (z.B.hierarchische, Schwerpunkt-basierte oder Dichte basierend clustering) verwendet werden können auf die normalisierten Daten und dann überlagert die ViSNE Karte (https://github.com/ Anzezupanic/FC_analysis).
  3. Sobald der Cluster identifiziert wurden, die Anzahl der Teilchen pro Cluster gehören zu jedem biologischen replizieren in jeder Probe. Bewerten Sie Unterschiede zwischen den Proben mit ANOVA und Tukey Test mit entsprechenden (z. B.Holmes) Korrektur für mehrere Vergleich.

7. optional: Validierung von Cluster-Interpretation mit Fluoreszenz-aktivierte Zellsortierung

  1. Sobald der Cluster identifiziert haben, verwenden Sie Fluoreszenz-aktivierte Zelle Sortieren (FACS), um sie aus den Proben, wenn gewünscht, zu sortieren, sofern die FACS (identische oder ähnliche) Konfiguration von Lasern und fluoreszierenden Filter hat.
  2. Für jeden identifizierten Cluster bietet CYT optische und fluoreszierende Tore, die den Cluster zu definieren. Verwenden Sie diese Tore zu sortieren, die Partikel in jedem Cluster mit dem FACS und dann die sortierten Zellen mittels Lichtmikroskopie zu identifizieren.

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Representative Results

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Mit dem Verfahren hier vorgestellten (Abbildung 1), wurden Proben aus mehreren Standorten von einem lokalen Strom in der Schweiz analysiert. An jedem Standort drei ähnliche große Steinen (10 – 12 cm) entstanden und Biofilmen waren die Stones abgebürstet. Die Proben wurden dann beschallt, fixiert, gefiltert und später durch Durchflusszytometrie analysiert. Das Setup der Durchflusszytometer und Referenz-Datenbank verwendet, waren die gleichen wie in einem früheren Papier15beschrieben: drei Lasern dienten (405, 488 und 638 nm), sieben dichroitischen Splitter und zehn Filter, die Fluoreszenz Emissionen von 425 bis erfasst > 755 nm , und die Referenz-Datenbank einschließlich > 30 Arten für Grünalgen, Kieselalgen, Cyanobakterien und Rotalgen, die in Biofilmen in Schweizer Stream gefunden wurden. Die Gesamtzahl der Partikel, die für die Erstellung der ViSNE Karten verwendet wurde etwa 150.000 (Abbildung 2A). Mit dem beschriebenen Ansatz, ist es möglich, zwischen den verschiedenen Standorten (Abb. 2 b) zu unterscheiden, verschiedene Teile der Karte ViSNE in Subpopulation von Zellen mit groben taxonomische Informationen (Abbildung 3) kategorisieren und schaffen die Subpopulationen unterschieden sich zwischen den beiden Stichproben (Abbildung 4).

Ein ähnlicher Ansatz wurde verwendet, um Microplastic Partikel in einem Biofilm zu quantifizieren. Reine Proben von Microplastic Partikeln von ähnlicher Größe zu Zellen in Süßwasser Biofilmen (ca. 10 µm), Biofilme Proben im Labor gezüchtet, in der Anwesenheit oder Abwesenheit von Microplastic Partikeln (unter Verwendung von Biofilm-Wachstum-Protokollen in Tlili Et Al. beschrieben 2011-5) wurden gemessen und verglichen (Abbildung 5). Es wurde festgestellt, dass Microplastic Partikel mit bekannten optischen und fluoreszierende Eigenschaften robust bei Konzentrationen über 1.000 ppm nachgewiesen werden können.

Figure 1
Abbildung 1: Schema des experimentellen Protokolls. Die Umwelt Biofilme Probenentnahme ist gefolgt von Identifikation der Artenvielfalt im Biofilm, Bestimmung von ihrer optischen und fluoreszierenden Eigenschaften und passend das Durchflusszytometer mit geeigneten Laser und Filter zu messen Eigenschaften. Für Flow-durchflusszytometrischen Messungen die Proben sind beschallt, beheben und gespeichert. Wenn genügend Proben gesammelt wurden, dass sie durch Durchflusszytometrie wo für jede gemessene Zelle gemessen werden, eine Reihe von optischen und Fluoreszenzeigenschaften stammen und mit visuellen clustering analysiert. Optional (gepunktete Pfeile), es ist möglich, erstellen Sie eine FC-Datenbank der Artenvielfalt in überwachten Biofilmen und verwenden Sie die Datenbank für die Interpretation der Ergebnisse. Es ist auch möglich, weitere Validierungsmethoden, z.B. Fluoreszenz basierende Zellsortierung und taxonomische Analyse mit Lichtmikroskopie verwenden Klicken Sie bitte hier, um eine größere Version dieser Figur.

Figure 2
Abbildung 2: Vergleich ökologischer Biofilme mit ViSNE Maps. (A) ViSNE Karten entnommen zu viele Zellen (300.000) haben einen großen Cluster (oben), zu wenig (10.000) Zellen bilden keine Cluster an alle (unten), während eine optimale Anzahl von (ca. 150.000) Form eindeutig optisch trennbar zellcluster (Mitte). (B) Teilmengen der ViSNE Karte, die sechs verschiedenen Proben gehören, verfügen über unterschiedliche dichten in anderen Teil der ViSNE Karte. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Figure 3
Abbildung 3: Clustering von Subpopulationen von Partikeln in Biofilmen. (A) verschiedene Teile der Karte ViSNE sind bevölkert von Teilchen mit verschiedenen optischen und Fluoreszenzeigenschaften, die Hinweise geben, um der biotischen/abiotischen Ursprung der Partikel und welcher taxonomischen der biotischen Partikel (Zellen Gruppe) angehören (Wellenlängen von oben nach unten: 525 nm, 695 nm, 660 nm). Für jede Wellenlänge ist die Farbskala von höchsten gemessenen Fluoreszenz (rot) auf niedrigsten gemessenen (blau) normalisiert. (B) Projektion der Referenzdatenbank (rote Punkte) auf die ViSNE Karte kann helfen, interpretieren, welche Teile der Karte durch die Taxa und/oder abiotische Partikel bevölkert sind: zerfallende Zellen (oben), Kieselalgen (Mitte), Cyanobakterien (unten). (C) basierend auf Informationen in (A) und (B) und die optisch trennbar Cluster der ViSNE Karte, ist es möglich verschiedene Cluster (SP1-11) verschiedene Teile der Karte ViSNE zuweisen und die Cluster entsprechend zu kategorisieren. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Figure 4
Abbildung 4: Statistische Analyse der Biofilm Proben. (A) Quantifizierung erfolgt durch zählen der Anzahl von Partikeln aus jeder Subpopulation Zugehörigkeit zu verschiedenen biologischen repliziert. A – F stehen sechs verschiedene Standorte entlang eines lokalen Baches, von denen der Biofilm-Proben entnommen wurden. (B) ANOVA kann verwendet werden, um statistisch signifikanter Unterschied zwischen den beiden Stichproben zu bewerten, mit den entsprechenden mehrere Vergleich Korrektur (p < 0,05, paarweise Tukey HSD alle Seiten Vs Standort A). Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Figure 5
Abbildung 5: Tracking-Microplastic Partikel mit ViSNE. (A) Microplastic Partikel, Süßwasser Biofilmen (B) , (C) Süßwasser Biofilm gemischt mit Microplastic Partikeln, (D) Fluoreszenz der Partikel gemessen an FC bei 695 nm. Die Farbskala ist normiert aus höchsten gemessenen Fluoreszenz (rot) auf niedrigsten gemessenen Fluoreszenz (blau) bei 695 nm. Das Verhältnis zwischen Microplastic Partikeln und Biofilm Partikel ist ungefähr 1:1. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

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Discussion

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Das oben beschriebene Protokoll ist relativ einfach zu implementieren. Während die vorgestellten Standardeinstellungen für alle phototrophe Biofilm getestet bisher geeignet gezeigt wurden, ist jedoch Optimierung (wie im Protokoll beschrieben) notwendig, die Informationen aus der Methode zu maximieren. In der Tat, die optischen und fluoreszierenden Eigenschaften von Biofilmen können variieren, abhängig von den Umgebungsbedingungen (Jahreszeit, Temperatur, chemische Zusammensetzung des Wassers)1. Daher ist es wichtig, zu berücksichtigen diese Variabilität bei der Einrichtung der FC-Analysen. Nur einen Weg das ist durch Entnahme von repräsentativen Proben von Biofilmen aus der Probenahmestellen und/oder einzelne Arten und wächst sie in unterschiedlichen Bedingungen und Messen Sie mit verschiedenen Setups. Wachsende Spezies ist auch nützlich, eine Datenbank mit fluoreszierenden Eigenschaften zu konstruieren, die verwendet werden, um die FC-Ergebnisse zu interpretieren. Hierzu ist es jedoch wichtig, dass die einzelnen Arten in ähnliche Bedingungen gemessen worden sind, unter denen die Biofilme abgetastet werden sollen. Zum Beispiel wird eine Datenbank der FC Messungen der einzelnen Arten wachsen bei 25 ° C sagen sehr wenig über die Zusammensetzung der Biofilm wächst bei 15 ° C. Es ist jedoch nicht zwingend notwendig, eine Referenzdatenbank zur Verwendung dieser Methode effektiv zu bauen. Bereits mit dem grundlegenden FC-Protokoll ist es möglich, Informationen über Größe, Granularität und Vorhandensein von verschiedenen Pigment in den Zellen in den Biofilm. Visuelle clustering ermöglicht die Einteilung der Zellen in Clustern, die ähnlich in den gemessenen Eigenschaften und die Entschlossenheit, die Eigenschaft von denen die meisten zwischen Proben geändert wurde. Referenz-Datenbank wird jedoch wichtig, wenn verschiedene Cluster taxonomische Identitäten zuweisen. Sobald Veränderungen im Biofilm Eigenschaften erkannt haben, ist es möglich, sie mit physikalischen und chemischen Messungen des Wassers an den Meßstellen zu korrelieren. Dadurch bestimmen, welche Umweltfaktor hat den stärksten Einfluss auf die Biofilm-Gemeinschaft im überwachten Ökosystem.

Es gibt auch einige Einschränkungen der Methode. Zum Beispiel erlaubt FC nicht die Identifizierung der Biofilm Zusammensetzung auf Artniveau. Außerdem, wenn Änderungen in den Biofilm Eigenschaften erkannt werden, kann nicht FC verantwortliche Ursachen zuschreiben: eine Verschiebung in Richtung mehr Toleranz Arten oder gegenüber toleranter Phänotypen (Arten der selben bleiben). Andere, ergänzende Methoden, z. B. Metagenomik, genügen, um mit dieser Frage beschäftigen. Eine weitere Einschränkung der Methode ist, dass nur die phototrophe Komponente von Biofilmen, reich mit Pigmenten mit verschiedenen fluoreszierenden Eigenschaften analysiert wird. Während es sicherlich möglich, die Methode zur Charakterisierung der heterotrophen Biofilm zu verwenden ist, ist es nicht klar, ob genügend Informationen mit fleckenfreie Analyse abgerufen werden können. Aufgrund der niedrigen natürliche Fluoreszenz von Bakterien und Pilzen verschiedene Einstellungen müssen verwendet werden, und es ist daher nicht möglich, die phototrophe und heterotrophen Komponenten des Biofilms zusammen in einer einzigen FC laufen zu bewerten. Trennung der Probenmaterials und Bewertung einerseits mit phototrophe und ein Teil mit der heterotrophen Einstellung wäre vielmehr notwendig. Schließlich gibt es eine Einschränkung bei der Verwendung der ViSNE für Biofilm Visualisierung. Die besten Ergebnisse sind mit ca. 150.000 Zellen zusammen abgebildet. Dies setzt ein Limit für die Anzahl der Proben, die analysiert und verglichen mit der Methode ohne rechnerisch Verdünnung der Proben zu viel werden kann. Zum Beispiel wenn man 150 Proben vergleichen wollte, würde dann jede Probe nur von ca. 1.000 Zellen dargestellt werden. Eine Möglichkeit um diese Einschränkung, die Proben unter Verwendung eines "beweglichen Fenster" Ansatzes in dem überlappenden Gruppen Proben analysiert werden kann separat mit ViSNE und anschließend die Ergebnisse zu analysieren, eine solche Lösung aber zusammengefasst ist, wurde noch nicht implementiert.

Wir glauben, dass die Durchflusszytometrie-basierte Auswertung der Biofilme effizient angewendet werden kann, für die Überwachung der aquatischen Ökosysteme. Es kann verwendet werden, um Zeitreihen Muster oder Proben an verschiedenen Standorten zu vergleichen, und mit Ausnahme der Probenahme, hat Potenzial für komplette Automatisierung. Die Methode kann als eine anfängliche Biofilm Auswertungsschritt, die Informationen für flussabwärts bietet Untersuchungen mit ergänzenden und genauere Methoden detaillierte betrachtet werden. Schließlich kann es für spezielle Anwendungen, wie die Erkennung von abiotischen Kontamination von Biofilmen, erweitert werden, wie wir, für den Fall der Microplastic gezeigt haben.

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Disclosures

Die Autoren haben nichts preisgeben.

Acknowledgments

Die vorgestellte Arbeit wurde von einem SNF Ambizione Fellowship (PZ00P2_142533) und ein Velux-Forschungsstipendium (Amplebig) unterstützt. Wir möchten Bettina Wagner für Hilfe bei der experimentellen Arbeit zu danken.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Multimeter WTW MultiLine 3620 IDS For measuring temperature, pH, dissolved oxygen
Ultrasonic cleaner VWR International 97043-986 Tank dimesions: 15*14*10 cm
Flow cytometer Beckman Coulter Gallios Lasers: 405, 488 and 638 nm. Filters bands in Supplementary Table 11. Sgier et, Nat Comm, 2016. 
Plate reader Tecan Infinite M200 used for selecting appropriate setting of the FC
Cell sorter Beckman Coulter MoFlo Astrios Settings in Supplementary Table 12. Sgier et, Nat Comm, 2016. 
Fluorescence microscope Zeiss Axiovert 135 Zeiss EC Plan-Neofluar 40x/0.75 objective
SOFTWARE
Matlab MathWorks R2013a software for numerical computing
CYT Dana Pe'er Lab Version 1.1 free interactive visualization tool for analysis of cytometry data

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

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Charakterisierung der aquatischen Biofilme mit Durchflusszytometrie
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Sgier, L., Merbt, S. N., Tlili, A., Kroll, A., Zupanic, A. Characterization of Aquatic Biofilms with Flow Cytometry. J. Vis. Exp. (136), e57655, doi:10.3791/57655 (2018).More

Sgier, L., Merbt, S. N., Tlili, A., Kroll, A., Zupanic, A. Characterization of Aquatic Biofilms with Flow Cytometry. J. Vis. Exp. (136), e57655, doi:10.3791/57655 (2018).

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