Summary
Cytometry זרימה בשילוב עם קיבוץ באשכולות חזותית מציע שיטה קלה לשימוש ומהיר עבור הלומדים biofilms הימית. זה יכול לשמש biofilm אפיון, זיהוי שינויים במבנה הקהילה biofilm, וזיהוי של חלקיקים והאביוטיים שמוטבע על biofilm.
Abstract
Biofilms הם קונסורציומים דינמי של מיקרואורגניזם לשחק תפקיד מפתח מערכות אקולוגיות מים מתוקים. על ידי שינוי המבנה הקהילתי שלהם, biofilms להגיב במהירות לשינויים סביבתיים, יכול לשמש ובכך גם אינדיקטורים של איכות המים. כיום, biofilm הערכה זו מבוססת בעיקר על אינטגרטיבי פונקציונלי הקצה, כגון פעילות פוטוסינתטיים או הנשימה, אשר אינם מספקים מידע על מבנה הקהילה biofilm. Cytometry זרימה והדמיה חישובית מציעים שיטה חלופית רגיש, קל לשימוש עבור הערכה של הרכב הקהילה, במיוחד של החלק photoautotrophic של biofilms מים מתוקים. זה דורש רק בסיסי הכנת הדוגמא, אחרי אשר המדגם כולו הוא לעבור את cytometer זרימה. החד-תאיים אופטי פלורסנט ומידע משמש עבור ויזואליזציה חישובית ופרשנות ביולוגי. היתרונות העיקריים שלה על פני שיטות אחרות הם המהירות של ניתוח והטבע גבוהה-מידע-תוכן. Cytometry זרימה מספקת מידע על מספר התכונות הסלולר והדואר biofilm מידה יחיד: גודל החלקיקים, צפיפות, פיגמנט תוכן, תוכן והאביוטיים biofilm ולאחר מידע טקסונומי גס. אולם, הוא אינו מספק מידע על הרכב biofilm ברובד מינים. אנו רואים פוטנציאל גבוה בשימוש של השיטה עבור ניטור סביבתי של המערכת האקולוגית הימית, כמו הערכה ראשונית biofilm השלב, המיידע במורד הזרם מפורט חקירות על ידי שיטות משלימות ומפורט יותר.
Introduction
Biofilms הם קונסורציומים דינמי של מיקרואורגניזם לשחק תפקיד מפתח מערכות אקולוגיות מים מתוקים, החל הייצור הראשוני, רכיבה על אופניים מזין, טיהור מים המשפיעים על ההתפלגות של מיקרואורגניזמים, שלהם הביולוגי של המערכת האקולוגית 1. כאשר biofilms חשופים לתנאי הסביבה המשתנים או לחצים, כגון כימיקלים, מבנה הקהילה שלהם משתנה במהירות כלפי מינים יותר סובלנית2,3. רגישות גבוהה שלהם הופכת biofilms מודל אטרקטיבי מערכות ניטור סביבתי4, אולם אף אחת משיטות הנוכחי מתאים באופן מושלם לאתר למעשה את הדינמיקה של קהילה biofilm בצורה קלה ומהירה.
ערכת נפוץ של שיטות לאפיון biofilms מורכב המדד של נקודות קצה תפקודית ומבניים. ברמה של הקהילה כולה, פעילות פוטוסינתטיים, מערכת הנשימה, כמו גם הפעילות של אנזימים חוץ-תאית מספק מידע אודות למצב התפקודי של biofilm5,6,7,8 ,9. התשלום של ביומסה משמש כמחוון לצמיחה biofilm הכללית. שינויים מבניים נמדדים כיום גם על ידי שימוש לזן מסורתי עם מיקרוסקופ אור או עם טכניקות מבוססות נוקלאוטיד (למשל, denaturing הדרגתיות בג'ל (DGGE), מרווח intergenic ribosomal אוטומטיות ניתוח (ARISA), metagenomics)10,11,12. שיטות אלה מספקים מידע אבל הם זמן רב לביצוע, או דורשים ידע ספציפי, או נמצאים עדיין בשלבי פיתוח. לבסוף, שיטות חדשות על ההערכה של13,חוץ-תאית חומרים פולימריים (EPS)14 , biofilm אדריכלות1, תוך רגישות, תפוקה נמוכה, לא פותחו עדיין כלפי למטרות ניטור.
זה ניכר כי עבור אפיון מלא של מים מתוקים biofilms, יש צורך לשלב מספר שיטות שונות, אשר מספקים תובנה biofilm פונקציה, הרכב ואת הארכיטקטורה. עבור ניטור סביבתי, מצד שני, שיטה מהירה רגיש כי הוא מסוגל לזהות שינויים biofilm ולאפשר הפירוש הביולוגי הבסיסי משמרות ברמה תפקודית ומבניים נדרש.
פיתחנו שיטה חדשה עבור הקהילה מיקרוביאלי אפיון של הרכיב phototrophic של זרם biofilms (periphyton), אשר מהיר מספיק למטרות ניטור, באותו זמן מספק מספיק מידע על קהילת biofilm מבנה כדי לאפשר פרשנות ביולוגי15. בהתבסס על cytometry זרימה בתא יחיד (FC) דוגמאות biofilm, בשילוב עם ויזואליזציה חישובית ומספק מידע על מאפיינים אופטיים, פלורסנט של biofilm ברמה תא בודד.
זרימת העבודה לאחר דגימה biofilm כוללת הכנת הדוגמא בדמות sonication, קיבוע, המבוססת על גודל סינון של הדגימות ואחריו הערכת המדגם על ידי cytometry זרימה. הנתונים שהושגו לספק מידע על מספר תכונות הסלולר במידה יחיד: גודל החלקיקים, צפיפות, פיגמנט תוכן, תוכן והאביוטיים (למשל microplastics) biofilm. קבוצת נתונים זו הינו מ נותחו באמצעות ויזואליזציה חישובית באמצעות חזותי השכן סטוכסטי הטבעה (viSNE)16, אשר מאפשרת פרשנות קלה ומהירה של הנתונים. למרות כמה שבועות נדרשים להגדיר ולשפר את השיטה, לאחר ההגדרה, זה לוקח רק כמה שעות של איסוף הדגימות biofilm לפרש את התוצאות.
היתרונות העיקריים של שיטת שהוצגו על פני האחרים הם המהירות של ניתוח גבוהה-מידע-תוכן. יתר על כן, ניתן לאחסן את הדגימות למשך מספר שבועות אחרי אוסף ללא אובדן שלהם אופטי ומאפיינים זריחה. זה יכול להיות שימושי מאוד בעת אפיון של מספר רב של דוגמאות נדרש, כגון מחקרים דגימה גדולה או תוכניות אפידמיולוגיה סביבתית, אך יכול גם לספק כמות משמעותית של מידע קטן גישוש במחקרים.
פרוטוקול הציג מבוסס על ניתוח תזרים-cytometric של biofilms phototrophic (periphyton) שנאספו ממקומות שונים של זרם. שלבים רבים של הפרוטוקול, למשל מבחר אתרים המתאימים למטרות, ניטור תלויים מטרות המחקר, ולכן לא יכול שייקבעו. אחרים מאפשרים פחות חופש ודורשים כי הפרוטוקול מלווה מקרוב, זה נעשה ברור בפרוטוקול מפורט להלן.
הפרוטוקול מתחיל עם המבחר של אתרים מבוססי biofilm ניטור סביבתי. השלב הבא הוא שיבנו הזרימה-cytometer (FC) כך המידות שלה לאפשר אפליה בין אורגניזמים שונים phototrophic המתגוררים biofilms בסביבת תחת פיקוח. זה מבוצע על ידי איסוף דגימות biofilm מן האתרים, זיהוי מאפייני מינים שונים נוכח את biofilm והגדרת את הזרימה-cytometer עם לייזרים ומסננים המאפשרים מדידה ב המתאים אופטי פלורסנט אורכי גל. ברגע מועדון הכדורגל כבר הגדרת, biofilms יכול להיות שנאספו מן האתרים מעת לעת, המאפיינים אופטי ו פלורסנט של החלקיקים יחיד נוכח את biofilm נמדדת cytometry זרימה, ואת הנתונים נותחו על ידי קיבוץ באשכולות חזותי. לפרשנויות טוב יותר של התוצאות, זה אפשרי לבנות מסד נתונים הפניה FC של המינים biofilm-החיים המקומי, פנוטיפים שלהם, להשתמש במסד הנתונים לזיהוי מיונים שונים בנתוני ה-FC. אימות הוא אפשרי דרך המבוססת על ידי קרינה פלואורסצנטית מיון האשכולות מזוהה של תאים בודדים באמצעות FACS מבוסס מיקרוסקופיה זיהוי טקסונומי של המין האנושי הנוכחי. תיאור סכמטי של הפרוטוקול ניתנת באיור1.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. המערכת האקולוגית הבחירה ודגימה Biofilm
- בחר את המערכת האקולוגית הימית עניין ולמצוא אתרי הדגימה שבו biofilms גדלים. חלקים הרדוד של נחל איטי על זרימת מים בינונית, וטפסו סטוני עבור הקובץ המצורף biofilm המתאים17,18.
- אופציונלי: אם האתר לא קיים מספיק משטחים biofilm המצורף, או כדי להקטין את מידת ההשתנות biofilms בתוך אתר, להכניס מצעים מלאכותיים עבור הקובץ המצורף biofilm (למשל שקופיות זכוכית, אריחי קרמיקה) בתוך האתר, תוך הקפדה כי הם ממוקמים באותו כיוון ביחס זרם המים ועל עומק דומה, עוצמת האור19.
- כדי לקבוע את התנאים הסביבתיים באתר דגימה, מכשירים ניידים לשימוש כדי למדוד את עוצמת האור, טמפרטורת המים, מוליכות, חמצן ו- pH מעל biofilm משטח הוא ניתן לטעום מן. במרוצת בסיום הדיגום, לנקוט בצעדים חוזרות ונשנות (3-5) על מנת לחשב ערכים מרושע.
- אופציונלי: לקחת דגימות מים על מנת לקבוע רלוונטיות מים כימיה פרמטרים (מומס פחמן אורגני (DOC), K+Na+, Ca2 +, Mg2 +, Cl–, F-, אז42 -, פו42 - ,2-3,4SiO4 -).
- באמצעות כפפות מגן, לאסוף אבנים דומות (ב גודל, צורה וסוג) כל אתר (או מצעים מלאכותיים). האבנים צריך להיחשף זרימה דומה ו לתנאי תאורה18.
- לסנן מספיק זרם מים מן האתר דרך מסננים μm 0.22, כך שהוא מוכן עבור כל הדגימות שנאספו (למשל, 15 מ"ל לכל דגימה).
- שימוש במברשת שיניים רכה כדי להסיר את biofilm המצע לתוך בקבוקון (מברשת עד להסרת כל biofilm) עם 15 מ"ל של מים מסוננים זרם20.
- לתקן את הדגימות 0.01% paraformaldehyde ו- 0.1% גלוטראלדהיד21.
2. קביעת פרמטרים זרימה אופטימלית-cytometric (FC)
- להעביר subsamples מיקרוסקופ אור (באמצעות 40 X / 0.75 אובייקטיבי; אם יש צורך להשתמש מטרה שמן 100 × 1.3), לזהות את הזן נוכח דגימות22,23.
- סדר מזוהה בזן אחד מאוספי תרבות מתאימה (למשל פיקולוגיה ניסיוני וגם תרבות אוסף של אצות ב אוניברסיטת גטינגן [EPSAG] או תרבות אוסף של אצות-באוניברסיטת קולון [CCAC] אם הפיקוח מתבצע על מערכות אקולוגיות האירופי המרכזי).
- גדלים של אחד המינים ברציפות בתנאים סביבתיים דומים (למשל, אור, טמפרטורה, pH) לסביבה שנלקחו הדגימות biofilm. נשאר בתוך 1 ° C ו 0.5 נקודת ה-pH בין דגימות סביבתיים מומלץ.
- כדי לנתק/לפזר התאים, לשים 15 מ"ל של אחד המינים דגימות לתוך צנטריפוגה צינורות לשים הצינורות במרכז באמבט מים, להטביע, כך השטח נוזלי של המדגם היא באותה רמה כמו פני השטח של בית המרחץ. Sonicate את הדגימות עבור 1 דקות בגיל 45 קילו-הרץ24,25.
- שיא ספיגת, קרינה פלואורסצנטית הספקטרום של המין יחיד שימוש בקורא צלחת. נא עיין לקורא צלחת של בחירה עבור הוראות. בדוגמה זו, לוחות polystyrol שקוף שטוח 96-ובכן, היו מפוצצות 200 נפח דגימה µL, ספיגת נמדדה. (ההגדרות המשמשות: מצב סריקה קרינה פלואורסצנטית (א); פליטת שלב אורך הגל גודל 10 ננומטר, פליטה סריקה מספר 30, רוחב פס 20 ננומטר, לקבל 100, הבזקים 25, ארה ב 20 במצב סריקה זמן או (ב) ספיגת אינטגרציה; 25 הבזקים, רוחב פס 9 ננומטר).
- להגדיר את cytometer זרימה עם לייזרים, מפצלי ודיקרואיק זוהר ומסננים שמכסים בשילוב כל הטווחים האלו פלורסנט בהם מינים שונים יש מאפיינים ספציפיים. עבור זרמים אירופה המרכזית, 405 ננומטר, 488 ננומטר, 638 ננומטר לייזר לייצר תוצאות שימושיות.
- להתאים את שקיעת מתח photomultipliers (לא ישים את כל cytometers זרימה) ואת טווח fluorescences נמדד לכלול לפחות 99% של כל האירועים של הדגימות.
- לחלופין, אם ידע על מינים נוכח biofilms זמין, להתחיל עם שלב 2.2. אם פלורסנט מאפיינים ידועים, להתחיל עם שלב 2.6.
3. אופציונלי: הכנת מסד הפניה זרימה-cytometric
הערה: FC אינו מאפשר זיהוי טקסונומי של תאים נוכח biofilm. הפניה מסד נתונים של FC מדידות של אחד המינים ידוע להיות נוכח biofilms, גדלו בתנאים דומים כמו biofilms, יכול לעזור עם הפרשנות של הנתונים.
-
סימוכין: אחד המינים
- באמצעות הפרמטרים FC ממוטבת להגדיר ב- 2.5 – 7, למדוד את המאפיינים אופטי וניאון של אחד המינים (קבוע paraformaldehyde, גלוטראלדהיד, מסונן דרך מסננים בגודל המתאים עבור cytometer זרימה).
- לנרמל את הנתונים מכל אחד המינים באותה דרך של הנתונים מ biofilms (ראה שלב 6.1.2).
-
סימוכין: תאים פגומים ורקובה
אחד האינדיקטורים החשובים ביותר של בריאות biofilm הוא השבר של תאים פגומים/גוסס נוכח biofilm. כדי לכמת תאים אלה, ניתן להכין הפניה של מרקיבים תאים.- קח 1 מ"ל subsamples של biofilms מדולל, centrifuge אותם בטמפרטורת החדר ב x 8000 g למשך 10 דקות ומפרידה שולחן. להשעות בגדר שנוצר ב- 90% 1 מ"ל אתנול ולאחסן ההשעיה בן לילה ב 4 º C. חזור ביום הבא.
- באמצעות הגדרות FC ממוטבת, למדוד את המאפיינים אופטי וניאון של תאים פגומים, רקובה (קבוע, מסונן).
-
התייחסות: microplastics
הערה: אם מעוניינת ניטור חלקיקי microplastic biofilms, לבדוק אם הם שונים מספיק מתוך חלקיקי ביוטיים אופטי פלורסצנטיות מאפיינים עבור זיהוי.- להשעות את החלקיקים microplastic על פי ההוראות של המפיק microplastics ולמדוד את תכונותיהם אופטי, פלורסנט (באמצעות הפרמטרים FC 2.7).
- להוסיף את החלקיקים microplastic המדגם biofilm ולהשאיר במשך הלילה ב 4 º C.
- לסנן את ההשעיה ולמדוד עם אותם הפרמטרים FC כמו לעיל.
4. לטעום הכנה ואחסון
- ברגע FC הוגדרה FC הפניה מסד הנתונים יהיה מוכן, אחד יכול להמשיך עם ההערכה של דגימות biofilm טריים, שנאסף על פי שלבים 1.1 – 7. כדי לנתק/לפזר biofilm, להעביר 15 מ"ל של הדגימות המבחנות (ראה צעד 1.7) לתוך צנטריפוגה צינורות.
- לשים כל שפופרת במרכז באמבט מים ויציפו כך השטח נוזלי של המדגם היא באותה רמה כמו פני השטח של בית המרחץ. Sonicate את הדגימות עבור 1 דקות ב- 45 קילו-הרץ.
- לתקן את הדגימות ב- 0.01% paraformaldehyde ו- 0.1% גלוטראלדהיד (מלאי במים nanopure). לאחסן ב 4 ° C עד מוכן לניתוח.
- חשוב: השתמש מחצית הדגימות לניתוח cytometry זרימה, לשמור חצי באחסון עבור בטיחות, אימות אופציונלי עם תא לפעיל על-ידי קרינה פלואורסצנטית מיון ו/או מיקרוסקופ אור (ראה סעיף 6).
הערה: מאוחסנות במקרר, הדגימות biofilm קבוע צריך לשמור על תכונותיהם אופטי, פלורסנט עד שלושה שבועות.
5. מריץ את הדגימה קבוצת הכדורגל
- אם הדגימות היו מאוחסנים במקרר, sonicate אותם במהירות או פיפטה מספר פעמים כדי להפריד בין החלקיקים. לסנן את subsamples עם מסננים μm 50 (בגודל המסנן תלוי רוחב נימי FC) לפני מדידה.
- את דוגמיות בודדות (1-2 מ ל, זה תלוי cytometer זרימה המשמש) לתוך cytometer זרימת ולמדוד את המאפיינים אופטי ו פלורסנט של כל חלקיק. חזור על המדידה שלוש פעמים לכל כל שכפול ביולוגי (משכפל טכני שלושה).
- לייצא את הנתונים קבוצת הכדורגל בתבנית. csv.
6. נתונים הכנה וניתוח מתאם
FC ניתן לנתח מספר פרמטרים (למשל, האות באזור, גובה, רוחב) עבור כל מאפיין אופטי נמדד וטווח קרינה פלואורסצנטית. להפעיל ניתוח המתאם על המשתנים נמדד ולשמור רק את המידות האלה זה לא בקורלציה גבוהה. זה בדרך כלל מסיר כל מלבד פרמטר FC אחד (למשל, האות אזור), באפשרותך גם להסיר מאוד בקורלציה מדידות פלורסנט (בדרך כלל הנובעות באותו הלייזר ו השכנה פילטרים).
-
הפעל CYT בתור ארגז כלים ב- Matlab:
- לייבא את הנתונים FC מופחתת בתבנית. csv מכל משכפל כדוגמאות הולכים להיות מנותח לתוך ה CYT תוכנה16, כולל כל טכנית וביולוגית. (לחץ +, קובץ סינון *. csv, בחר קבצים עבור ייבוא).
- להפוך את הערוצים פלורסנט של כל הדגימות באמצעות טרנספורמציית סינוס היפרבולי. הערך של קופקטור צריכה להיות מסומנת; 150. מתאים ביותר phototrophic biofilms זרימה cytometers, אבל אופטימיזציה ייתכן שיהיה צורך מסוים setups ניסיוני, heterotrophic biofilms. (ימינה-לחיצה/צורה/הזן קופקטור 150)
- עבור בקרת איכות, חזותית להשוות (CYT) את היסטוגרמות של דוגמאות בודדות, והערוצים אופטי, פלורסנט כדי לוודא שלא יהיו לא ליניאריים ברמה טכנית וביולוגית של שכפול. ליניאריים יתגשם בהתפלגויות פלורסנט/אופטי שהוסטו באופן משמעותי בין משכפל. (בחר נתונים, בחר ערוץ, מגרש)
- האלטרנטיבה: להפעיל ניתוח גורמים ראשיים (PCA) על הערכים החציוני של הפצות פלורסנט וודא כי טכנית וביולוגית משכפל אשכול ביחד.
- מיזוג הצד הטכני משכפל ב כל שכפול ביולוגי, subsample שהביולוגי משכפל, כך כל אחד מיוצג על ידי אותו מספר חלקיקים (תאים, רסיס תא, חלקיקים והאביוטיים) ועל כך המספר הכולל של חלקיקים נותחו על ידי בארנס-האט השכן סטוכסטי הטבעה (bh-סנה) היא בסביבות 150,000 (עבור תוצאות הטוב ויזואליזציה26). (בחר את הנתונים, לחץ לחיצה ימנית, מיזוג/Subsample)
- לשם השוואה בין דגימות, חשוב לבחור רק את הדגימות שאינן לצורך השוואה. בחר את הדגימות ולהפעיל bh-סנה27. לאחר האלגוריתם ערוצים חדשים, סיים, בשם bh-SNE1 ו- bh-SNE2 להופיע. אלה סנה נקודות הציון של כל החלקיקים שנותחה, אשר יכול לשמש כדי להמחיש את הנתונים במגרש פיזור (viSNE מפה). (בחר נתונים, בחר ערוצים, לחץ לחיצה ימנית, bh-סנה, כן נתונים מנורמל)
- במפת viSNE, חלקיקים ממוקם על פי דמיון, המקובצים אשכולות ספרבילית מבחינה ויזואלית. בדוק את מאפייני אופטי/פלורסנט אשכולות, מארק ואת שם אלה מופרדים היטב, יש מאפיינים שונים אופטי/זריחה באמצעות כלי הציור זמין CYT. (בחר ערוץ bh-SNE1, bh-SNE2)
- אופציונלי: אם הפניה מסד נתונים של אחד המינים מיקרוביאלית (נמדד עם אותה הגדרה cytometry זרימה, גדלו בתנאים דומים!) זמין, לייצא את המפות viSNE לתוך Matlab, משליכים מסד הנתונים-הייחוס על המפות. בדרך זו, ניתן לחבר מסוים אשכולות לקבוצות מינים מסוים/בטקסונומיה (זמינה להורדה ב https://github.com/anzezupanic/FC_analysis קבצי script). (הפעלה/שמירה)
- פתרון בעיות: אם ניתוח bh-סנה אינו מחזיר אשכולות ספרבילית מבחינה ויזואלית, אבל אף אחד גדול, חלקיקים רבים מדי שימשו bh-סנה. נסה שוב עם פחות חלקיקים לדגימה. אם אין אשכולות, אבל די דליל נקודות בודדות, להגדיל את מספר החלקיקים בשימוש.
- אופציונלי: במקום להסתמך על bh-סנה עבור קיבוץ באשכולות, שיטות קיבוץ באשכולות אחרים (למשל, היררכי, המבוססים על centroid או צפיפות המבוסס על קיבוץ באשכולות) שניתן להשתמש על נתונים מנורמל ו ואז יונחו על המפה viSNE (https://github.com/ anzezupanic/FC_analysis).
- ברגע האשכולות זוהו, לספור את מספר החלקיקים באשכול כל השייכים כל שכפול ביולוגי בכל מדגם. להעריך את ההבדלים בין הדגימות, באמצעות מבחן ANOVA, של Tukey עם המתאים (למשל, הולמס) תיקון להשוואה מרובים.
7. אופציונלי: אימות של פרשנות האשכול באמצעות תא לפעיל על-ידי קרינה פלואורסצנטית מיון
- ברגע האשכולות זוהו, השתמש תא לפעיל על-ידי קרינה פלואורסצנטית מיון (FACS) כדי למיין אותן הדגימות אם רצונך בכך, ובלבד FACS יש תצורה דומה (או זהות) של לייזרים ומסננים פלורסנט.
- עבור כל אשכול מזוהה, CYT מספק שערים אופטי, פלורסנט המגדירים את האשכול. השתמש השערים הללו כדי לפתור את החלקיקים באשכול כל עם FACS ולאחר מכן לזהות תאים ממוינים באמצעות מיקרוסקופ אור.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
באמצעות ההליך המובאת כאן (איור 1), דגימות שנלקחו מספר אתרים של זרם מקומי בשוויץ נותחו. בכל אתר, נלקחו שלוש אבנים בגודל דומה (10-12 ס מ), biofilms היו מוברש את האבנים. הדגימות היו אז sonicated, קבוע, מסוננים, לאחר מכן נותחו על ידי cytometry זרימה. ההתקנה של cytometer את זרימת ומסד הנתונים-הייחוס המשמש היו אותו הדבר כפי שמתואר הנייר הקודם15: לייזרים שלושה שימשו (405, 488, 638 nm), שבע מפצלי ודיקרואיק זוהר ומסננים עשר זה מכוסה פליטת קרינה פלואורסצנטית 425 ל > 755 ננומטר , כולל מסד נתונים של הפניה > 30 מינים כיסוי כחוליות, אצות, diatoms, אדומיות שנמצאו biofilms בזרם שוויצרי. המספר הכולל של חלקיקים המשמש עבור יצירה של המפות viSNE היה כ 150,000 (איור 2 א). באמצעות הגישה המתוארת, זה אפשרי להבדיל בין האתרים השונים (איור 2B), לסווג בחלקים שונים של המפה viSNE של subpopulation של תאים עם מידע טקסונומי גס (איור 3) ולהקים אשר subpopulations היו שונים בין הדגימות (איור 4).
בגישה דומה שימשה לכמת החלקיקים microplastic ממבנה biofilm. דוגמאות טהור של חלקיקים microplastic גודל דומה לתאים biofilms מים מתוקים (ca. 10 מיקרומטר), דגימות biofilms גדל במעבדה נוכחות או היעדרות של חלקיקים microplastic (באמצעות פרוטוקולים צמיחה biofilm המתוארים Tlili. et al. 20115) נמדדו והשוו (איור 5). נקבע כי ניתן להבחין robustly microplastic חלקיקים עם אופטי ידוע ומאפייני פלורסנט בריכוזים מעל 1,000 דפים לדקה.
איור 1: סכימה של פרוטוקול נסיוני. אוסף של הדגימות biofilms סביבתיים ואחריו זיהוי המינים המצויים biofilm, קביעת המאפיינים שלהם אופטי, פלורסנט, הולם את הזרימה-cytometer עם לייזרים המתאים ומסננים כדי למדוד את אלה מאפיינים. למדידות זרימה-cytometric, הדגימות הן sonicated, לתקן, מאוחסנים. כאשר מספיק דגימות נאספו שהם נמדדים לפי cytometry זרימה שם עבור כל תא נמדד, מספר אופטי ומאפיינים פלורסצנטיות מתקבלים, נותחה באמצעות אשכולות חזותי. אופציונלי (חיצים מנוקד), זה אפשרי לבנות מסד FC של מינים הנמצאים תחת פיקוח biofilms ולהשתמש במסד הנתונים לפרשנויות של התוצאות. אפשרי גם להשתמש בשיטות אימות נוסף, למשל תא מבוסס על-ידי קרינה פלואורסצנטית מיון טקסונומי ניתוח באמצעות מיקרוסקופ אור אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 2: השוואת biofilms סביבתיים באמצעות מפות viSNE. (א) viSNE מפות המתקבל מדי תאים (300,000) יש מקבץ גדול יחיד (למעלה), תאים (10,000) מעט מדי לא בצורת אשכולות של כל (למטה), בעוד מספר אופטימלי של התא (ca. 150,000) טופס באופן חזותי ברור ספרבילית אשכולות (באמצע). (B) קבוצות משנה של המפה viSNE שייך ששת המדגמים שונים כוללים צפיפויות שונות בחלק אחר של המפה viSNE. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 3: קיבוץ באשכולות של subpopulations של חלקיקים ב biofilms. (א) בחלקים שונים של המפה viSNE יאוכלסו על ידי חלקיקים עם שונה אופטי ואת המאפיינים של קרינה פלואורסצנטית לתת רמזים על מוצאם ביוטיים והאביוטיים של החלקיקים אשר בטקסונומיה לקבץ את החלקיקים ביוטיים (תאים) שייכים (אורכי גל מלמעלה למטה: 525 nm, 695 nm, 660 ננומטר). עבור כל אורך גל, בסולם הצבעים הוא מנורמל מן הגבוה ביותר נמדד זריחה (אדום) כדי הנמוך ביותר שנמדד (כחול). (B) הקרנה של המאגר הפניה (נקודות אדומות) על גבי המפה viSNE יכול לעזור לפרש אילו חלקים של המפה יאוכלסו על ידי איזה taxa ו/או חלקיקים והאביוטיים: מרקיבים תאים (למעלה), diatoms (באמצע), כחוליות (למטה). (ג) מבוסס על המידע ב- (א) ו- (ב) ו האשכולות ספרבילית חזותית של המפה viSNE, זה אפשרי להקצות חלקים שונים של המפה viSNE אשכולות שונים (SP1-11) ולסווג את האשכולות בהתאם. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 4: ניתוח סטטיסטי של הדגימות biofilm. (א) כמת מתבצע על ידי ספירת מספר חלקיקים של כל subpopulation השייכים משכפל ביולוגיים שונים. A-F מייצגות שישה מיקומים שונים לאורך נחל מקומיים, שממנו נלקחו הדגימות biofilm. (B) ANOVA ניתן להשתמש כדי להעריך את הבדל סטטיסטי בין הדגימות, עם הצורך תיקון השוואה מרובים (p < 0.05, HSD Tukey pairwise כל אתרי לעומת אתר A). אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 5: מעקב אחר חלקיקים microplastic עם viSNE. (א) Microplastic חלקיקים, biofilms מים מתוקים (B) , (ג) biofilm מים מתוקים מעורבבים עם חלקיקים microplastic, (ד) זריחה של החלקיקים נמדדת FC-695 ננומטר. הסולם צבע מנורמל מן הגבוה ביותר נמדד זריחה (אדום) כדי הנמוך ביותר שנמדד קרינה פלואורסצנטית (כחול)-695 ננומטר. היחס בין חלקיקים microplastic חלקיקים biofilm הוא כ 1:1. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
פרוטוקול המתואר לעיל הוא פשוט יחסית ליישום. עם זאת, בעוד הגדרות ברירת המחדל הציג הוכחו מתאים biofilm כל phototrophic נבדקו עד כה, אופטימיזציה (כמתואר בפרוטוקול) יש צורך למקסם את המידע המתקבל בשיטת. אכן, אופטי, פלורסנט מאפייני biofilms יכול להשתנות, בהתאם התנאים הסביבתיים (העונה, הטמפרטורה, ההרכב הכימי של המים)1. לכן, חשוב לקחת בחשבון את ההשתנות בעת הגדרת הבדיקות FC. דרך אחת לעשות זאת על-ידי לקיחת מדגמים מייצגים של biofilms מן האתרים דגימה ו/או לוקח את אחד המינים הגדלים אותם תנאים שונים ולמדוד אותם באמצעות setups שונים. גידול אחד המינים שימושי גם לבנות מסד נתונים של נכסים פלורסנט יכול לשמש כדי לפרש את התוצאות FC. אולם, לשם כך, חשוב כי המין יחיד נמדדו בתנאים דומים לאלו שתחתיו biofilms הולכים ניתן לטעום. לדוגמה, מסד נתונים של FC מדידות של אחד המינים גדל ב- 25 ° C אספר מעט על ההרכב של ממבנה biofilm גדל ב 15 º C. . אבל, זה לא הכרחי לבנות מסד נתונים הפניה כדי להשתמש בשיטה זו ביעילות. כבר עם באמצעות פרוטוקול FC בסיסי, זה אפשרי לקבל מידע על גודל, צפיפות נוכחות של פיגמנט שונים נוכח biofilm התאים. קיבוץ באשכולות ויזואלי מאפשר סיווג של תאים לתוך אשכולות דומה מאפייני נמדד ונחישות אשר המאפיין השתנה ביותר בין הדגימות. מסד הנתונים-הייחוס, עם זאת, הופכת לחשובה בעת הקצאת זהויות בטקסונומיה האשכולות. לאחר שינויים במאפייני biofilm זוהו, זה אפשרי לתאם אותם עם מדידות פיזיקליות, כימיות של המים באתרים הדגימה. פעולה זו מאפשרת לקבוע לאיזה גורם סביבתי יש השפעה חזקה ביותר על הקהילה biofilm של המערכת האקולוגית שנמצא תחת פיקוח.
ישנם גם כמה מגבלות לשיטה. למשל, FC אינו מאפשר הזיהוי של הרכב biofilm במינים. יתר על כן, כאשר שינויים במאפייני biofilm מזוהים, מועדון הכדורגל לא יכול לייחס גורם אחראי: משמרת כלפי מינים יותר סובלנית או לכיוון סובלנית יותר פנוטיפים (מינים נותרת זהה). שיטות אחרות, משלימים, כגון metagenomics, יש צורך להתייחס לשאלה זו. מגבלה נוספת של השיטה היא כי רק המרכיב phototrophic של biofilms, עשיר עם פיגמנטים עם מאפיינים שונים פלואורסצנט, ניתוח. . זה בהחלט אפשרי לשימוש בשיטת אפיון heterotrophic biofilm, זה לא ברור אם ניתן להשיג מספיק מידע עם כתם חינם ניתוח. עקב פלורסצנטיות טבעי נמוך של חיידקים ופטריות, הגדרות שונות יש לשמש, לכן לא ניתן להעריך את רכיבי phototrophic ו- heterotrophic biofilm בברית FC יחיד להפעיל. במקום זאת, הפרדת המדגם והערכת חלק אחד עם phototrophic וחלק אחד עם ההגדרה heterotrophic היה הכרחי. לבסוף, יש מגבלה עם שימוש של viSNE להמחשת biofilm. התוצאות הטובות ביותר מושגות עם ca. תאים 150,000 יחד עם תמונה. פעולה זו מגדירה גבול עבור מספר דוגמאות כי ניתן לנתח לעומת השיטה ללא שהמפתחות דילול הדגימות מדי. לדוגמה, אם אחד רוצה להשוות 150 דוגמאות, אז כל דגימה רק תיוצג על ידי ca. 1,000 תאים. דרך אחת לעקוף מגבלה זו כדי לנתח את הדגימות תוך שימוש בגישה "הזזת חלון" שבו חופפים קבוצות של דגימות ניתן לנתח בנפרד באמצעות viSNE, ולאחר מכן את התוצאות איחדו יחד, פתרון כזה, עם זאת, עדיין לא יושמה.
אנו מאמינים כי ניתן להחיל ביעילות cytometry זרימה המבוסס על הערכת biofilms על הפיקוח על המערכת האקולוגית הימית. זה יכול לשמש כדי להשוות בין זמן-סדרת דוגמאות או דגימות שנלקחו במקומות שונים, וכולל, מלבד הדוגמאות עצמו, פוטנציאל אוטומציה מלאה. השיטה יכולה להיחשב כפי שלב ההערכה הראשונית biofilm המספק מידע עבור במורד הזרם מפורט חקירות עם שיטות משלימות ומפורט יותר. בסופו של דבר, אותו ניתן להרחיב יישומים ספציפיים יותר, כגון זיהוי של זיהום והאביוטיים biofilms, כפי שהראתי לתיק של microplastic.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
המחברים אין לחשוף.
Acknowledgments
העבודה הציג נתמכה על ידי מלגת Ambizione SNF (PZ00P2_142533) ומענק מחקר Velux (Amplebig). ברצוננו להודות בטינה וגנר לעזרה במציאת עבודה ניסויית.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Multimeter | WTW | MultiLine 3620 IDS | For measuring temperature, pH, dissolved oxygen |
| Ultrasonic cleaner | VWR International | 97043-986 | Tank dimesions: 15*14*10 cm |
| Flow cytometer | Beckman Coulter | Gallios | Lasers: 405, 488 and 638 nm. Filters bands in Supplementary Table 11. Sgier et, Nat Comm, 2016. |
| Plate reader | Tecan | Infinite M200 | used for selecting appropriate setting of the FC |
| Cell sorter | Beckman Coulter | MoFlo Astrios | Settings in Supplementary Table 12. Sgier et, Nat Comm, 2016. |
| Fluorescence microscope | Zeiss | Axiovert 135 | Zeiss EC Plan-Neofluar 40x/0.75 objective |
| SOFTWARE | |||
| Matlab | MathWorks | R2013a | software for numerical computing |
| CYT | Dana Pe'er Lab | Version 1.1 | free interactive visualization tool for analysis of cytometry data |
References
- Battin, T. J., Besemer, K., Bengtsson, M. M., Romani, A. M., Packmann, A. I. The ecology and biogeochemistry of stream biofilms. Nat Rev Microbiol. 14 (4), 251-263 (2016).
- Rotter, S., Heilmeier, H., Altenburger, R., Schmitt-Jansen, M. Multiple stressors in periphyton - comparison of observed and predicted tolerance responses to high ionic loads and herbicide exposure. J Appl Ecol. 50 (6), 1459-1468 (2013).
- Tlili, A., et al. Pollution-induced community tolerance (PICT): towards an ecologically relevant risk assessment of chemicals in aquatic systems. Freshw Biol. 61 (12), 2141-2151 (2016).
- Lavoie, I., Lavoie, M., Fortin, C. A mine of information: Benthic algal communities as biomonitors of metal contamination from abandoned tailings. Science of the Total Environment. 425, 231-241 (2012).
- Tlili, A., Montuelle, B., Berard, A., Bouchez, A. Impact of chronic and acute pesticide exposures on periphyton communities. Sci Total Environ. 409 (11), 2102-2113 (2011).
- Dorigo, U., et al. Lotic biofilm community structure and pesticide tolerance along a contamination gradient in a vineyard area. Aquat Microb Ecol. 50 (1), 91-102 (2007).
- Pesce, S., et al. Evaluation of single and joint toxic effects of diuron and its main metabolites on natural phototrophic biofilms using a pollution-induced community tolerance (PICT) approach. Aquat Toxicol. 99 (4), 492-499 (2010).
- Ricart, M., et al. Effects of low concentrations of the phenylurea herbicide diuron on biofilm algae and bacteria. Chemosphere. 76 (10), 1392-1401 (2009).
- Martinez, A., Kominoski, J. S., Larranaga, A. Leaf-litter leachate concentration promotes heterotrophy in freshwater biofilms: Understanding consequences of water scarcity. Sci Total Environ. , 1677-1684 (2017).
- Corcoll, N., et al. Comparison of four DNA extraction methods for comprehensive assessment of 16S rRNA bacterial diversity in marine biofilms using high-throughput sequencing. Fems Microbiol Lett. 364 (14), (2017).
- Welsh, A. K., McLean, R. J. Characterization of bacteria in mixed biofilm communities using denaturing gradient gel electrophoresis (DGGE). Curr Protoc Microbiol. , Chapter 1, Unit 1E 1 (2007).
- Ranjard, L., et al. Characterization of bacterial and fungal soil communities by automated ribosomal intergenic spacer analysis fingerprints: Biological and methodological variability. Appl Environm Microbiol. 67 (10), 4479-4487 (2001).
- Stewart, T. J., Traber, J., Kroll, A., Behra, R., Sigg, L. Characterization of extracellular polymeric substances (EPS) from periphyton using liquid chromatography-organic carbon detection-organic nitrogen detection (LC-OCD-OND). Environ Sci Pollut R. 20 (5), 3214-3223 (2013).
- Kroll, A., et al. Mixed messages from benthic microbial communities exposed to nanoparticulate and ionic silver: 3D structure picks up nano-specific effects, while EPS and traditional endpoints indicate a concentration-dependent impact of silver ions. Environ Sci Pollut R. 23 (5), 4218-4234 (2016).
- Sgier, L., Freimann, R., Zupanic, A., Kroll, A. Flow cytometry combined with viSNE for the analysis of microbial biofilms and detection of microplastics. Nat Commun. 7, 11587 (2016).
- Amir el, A. D., et al. viSNE enables visualization of high dimensional single-cell data and reveals phenotypic heterogeneity of leukemia. Nat Biotechnol. 31 (6), 545-552 (2013).
- Mora-Gomez, J., Freixa, A., Perujo, N., Barral-Fraga, L. Limits of the biofilm concept and types of aquatic biofilms. Aquatic Biofilms: Ecology, Water Quality and Wastewater Treatment. , 3-27 (2016).
- Matthaei, C. D., Guggelberger, C., Huber, H. Local disturbance history affects patchiness of benthic river algae. Freshw Biol. 48 (9), 1514-1526 (2003).
- Tlili, A., Hollender, J., Kienle, C., Behra, R. Micropollutant-induced tolerance of in situ periphyton: Establishing causality in wastewater-impacted streams. Water Res. 111, 185-194 (2017).
- Robinson, C. T., Rushforth, S. R. Effects of physical disturbance and canopy cover on attached diatom community structure in an idaho stream. Hydrobiologia. 154, 49-59 (1987).
- Pomati, F., Nizzetto, L. Assessing triclosan-induced ecological and trans-generational effects in natural phytoplankton communities: A trait-based field method. Ecotoxicology. 22 (5), 779-794 (2013).
- Hulliger, J. Methoden zur Untersuchung und Beurteilung der Fliessgewässer. , Vol. Umwelt-Vollzug Nr. 0740, Bundesamt für Umwelt, Bern (2007).
- Tlili, A., et al. In situ spatio-temporal changes in pollution-induced community tolerance to zinc in autotrophic and heterotrophic biofilm communities. Ecotoxicology. 20 (8), 1823-1839 (2011).
- Foladori, P., Laura, B., Gianni, A., Giuliano, Z. Effects of sonication on bacteria viability in wastewater treatment plants evaluated by flow cytometry - Fecal indicators, wastewater and activated sludge. Water Res. 41 (1), 235-243 (2007).
- Buesing, N., Gessner, M. O. Comparison of detachment procedures for direct counts of bacteria associated with sediment particles, plant litter and epiphytic biofilms. Aquat Microb Ecol. 27 (1), 29-36 (2002).
- van der Maaten, L., Hinton, G. Visualizing Data using t-SNE. J Mach Learn Res. 9, 2579-2605 (2008).
- van der Maaten, L. Accelerating t-SNE using Tree-Based Algorithms. J Mach Learn Res. 15, 3221-3245 (2014).
