Summary
Citometria a flusso in combinazione con il clustering visual offre un facile da usare e veloce metodo per lo studio di biofilm acquatici. Può essere utilizzato per la caratterizzazione di biofilm, rilevamento delle modifiche nella struttura della comunità di biofilm e la rilevazione delle particelle abiotiche incorporato nel biofilm.
Abstract
I biofilm sono consorzi dinamici del microorganismo che svolgono un ruolo chiave negli ecosistemi d'acqua dolce. Modificando la loro struttura di comunità, biofilm rispondere rapidamente ai cambiamenti ambientali e possono essere quindi utilizzati come indicatori della qualità dell'acqua. Attualmente, biofilm valutazione si basa principalmente sugli endpoint integrativo e funzionale, come l'attività fotosintetica o respiratoria, che non forniscono informazioni sulla struttura di comunità di biofilm. Citometria a flusso e visualizzazione computazionale offrono un metodo alternativo, sensibile e facile da usare per valutare la composizione della Comunità, in particolare della parte autotrofe del biofilm d'acqua dolce. Richiede solo la preparazione di base del campione, dopo che l'intero campione è gestito attraverso il citometro a flusso. Le informazioni ottiche e fluorescente di cella singola viene utilizzate per la visualizzazione del calcolo e interpretazione biologica. I suoi principali vantaggi rispetto ad altri metodi sono la velocità di analisi e la natura di alto contenuto di informazioni. Citometria a flusso fornisce informazioni su diversi tratti di biofilm e cellulare in una singola misurazione: granulometria, densità, contenuto di pigmenti, abiotici contenuti nel biofilm e grossolane informazioni tassonomiche. Tuttavia, non fornisce informazioni sulla composizione di biofilm a livello di specie. Vediamo elevato potenziale nell'uso del metodo per il monitoraggio ambientale degli ecosistemi acquatici e come valutazione iniziale biofilm passo che informa a valle dettagliate indagini dai metodi complementari e più dettagliati.
Introduction
I biofilm sono consorzi dinamici del microorganismo che svolgono un ruolo chiave negli ecosistemi d'acqua dolce, che vanno dalla produzione primaria, ciclo dei nutrienti e purificazione dell'acqua ad influenzare la distribuzione dei microrganismi e della loro biodiversità nell'ecosistema 1. quando biofilm sono esposti a condizioni ambientali o a fattori di stress, quali i prodotti chimici, la loro struttura di comunità si sposta rapidamente verso più tollerante specie2,3. Loro alta sensibilità si trasforma il biofilm in sistemi modello attraente per monitoraggio ambientale4, tuttavia nessuno dei metodi attualmente è perfettamente adatto per tracciare effettivamente la dinamica di una comunità di biofilm in un modo facile e veloce.
Il comunemente utilizzato set di metodi per la caratterizzazione di biofilm consiste nella misurazione di endpoint funzionale e strutturale. A livello dell'intera comunità, l'attività fotosintetica e respiratoria, nonché l'attività degli enzimi extracellulari fornisce informazioni sullo stato funzionale del biofilm5,6,7,8 ,9. Attribuzione di biomassa viene utilizzato come un indicatore per la crescita complessiva del biofilm. Cambiamenti strutturali sono attualmente misurate sia tramite identificazione di specie tradizionali con microscopia chiara o con tecniche basate su nucleotide (ad es., denaturing gradient gel electrophoresis (DGGE), distanziale intergenica ribosomale automatizzato analisi (ARISA), metagenomica)10,11,12. Questi metodi forniscono informazioni ma sono richiede molto tempo per eseguire, o richiedono conoscenze specifiche o sono ancora in fase di sviluppo. Infine, nuovi metodi per la valutazione delle sostanze polimeriche extracellulari (EPS)13,14 e il biofilm architettura1, mentre sensibile, sono basso-throughput e non sono state ancora sviluppate verso a fini di controllo.
È evidente che per una completa caratterizzazione di biofilm d'acqua dolce, è necessario combinare diversi metodi, che consentono di comprendere la funzione di biofilm, la composizione e l'architettura. Per il monitoraggio ambientale, d'altra parte, un metodo veloce e sensibile che è in grado di rilevare le modifiche nel biofilm e abilitare base interpretazione biologica dei mutamenti a livello strutturale e funzionale è necessario.
Abbiamo sviluppato un nuovo metodo per la caratterizzazione della comunità microbica del componente phototrophic di flusso biofilm (perifiton), che è abbastanza veloce per fini di controllo e allo stesso tempo fornisce sufficienti informazioni sulla comunità di biofilm struttura per consentire l'interpretazione biologica15. Si basa su singola cellula flusso cytometry (FC) di campioni di biofilm ed accoppiato con visualizzazione computazionale e fornisce informazioni sulle proprietà ottiche e fluorescente del biofilm a livello di singola cellula.
Il flusso di lavoro dopo il biofilm campionamento consiste di preparazione del campione sotto forma di sonicazione, fissazione e filtraggio basato sulle dimensioni dei campioni seguiti da valutare il campione tramite flusso cytometry. I dati acquisiti forniscono informazioni sulle caratteristiche cellulari diversi in una singola misurazione: granulometria, densità, contenuto di pigmenti, abiotici contenuti (ad es. microplastiche) nel biofilm. Questo set di dati è che analizzati tramite visualizzazione computazionale utilizzando visual stocastico prossimo incorporamento (viSNE)16, che consente il veloce e facile interpretazione dei dati. Anche un paio di settimane è necessario configurare e ottimizzare il metodo, una volta impostato, ci vogliono solo poche ore dalla raccolta dei campioni di biofilm per l'interpretazione dei risultati.
I principali vantaggi del metodo presentato sopra gli altri sono la velocità di analisi e di alto contenuto di informazioni. Inoltre, i campioni possono essere conservati per diverse settimane dopo la raccolta senza perdita di loro ottica e proprietà di fluorescenza. Questo può essere molto utile quando è richiesto, ad esempio campionamento grandi studi o programmi di biomonitoraggio caratterizzazione di un gran numero di campioni, ma può anche fornire una notevole quantità di informazioni in più piccoli studi esplorativi.
Il protocollo presentato si basa sull'analisi cytometric di flusso, di phototrophic biofilm (perifiton), raccolto da diversi punti di un flusso. Molti passaggi del protocollo, ad esempio la selezione di siti appropriati per il monitoraggio, dipendono gli obiettivi della ricerca e pertanto non possono essere prescritto. Altri consentono meno libertà e richiedono che il protocollo è seguito da vicino, ciò è reso chiaro nel protocollo dettagliato qui sotto.
Il protocollo inizia con la selezione dei siti per il monitoraggio ambientale basato su biofilm. Il passo successivo è quello di set-up il citometro a flusso (FC) così che le sue misure permettono discriminazione tra diversi organismi phototrophic vivono in biofilm nell'ambiente monitorato. Questa operazione viene eseguita attraverso la raccolta di campioni di biofilm dai siti, identificare le proprietà fluorescenti di diverse specie presenti nel biofilm e configurando il citometro a flusso con filtri che permettono la misurazione del ottico e laser lunghezze d'onda. Una volta che la FC è stato istituito, i biofilm possono essere raccolti dai siti periodicamente, le proprietà ottiche e fluorescente delle singole particelle presenti nel biofilm misurata da citometria a flusso e i dati analizzati dal clustering visual. Per la migliore interpretazione dei risultati, è possibile costruire un database di riferimento FC di specie locali di biofilm-vivente e loro fenotipi e utilizzare il database per identificare differenti tassonomie nei dati FC. La convalida è possibile attraverso l'ordinamento basato su fluorescenza dei cluster individuati di singole cellule mediante FACS e basati su microscopia identificazione tassonomica delle specie presenti. Un disegno schematico del protocollo è dato in Figura 1.
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Protocol
1. ecosistema selezione e campionamento di Biofilm
- Selezionare un ecosistema acquatico di interesse e trovare siti di campionamento dove crescono i biofilm. Parti poco profonde di un flusso con lento al flusso idrico medio e un alveo pietroso per biofilm allegato sono appropriati17,18.
- Opzionale: Se il sito non dispone di sufficienti superfici per biofilm allegato, o per diminuire la variabilità di biofilm all'interno di un sito, inserire substrati artificiali per il fissaggio di biofilm (ad es. lastre di vetro, piastrelle di ceramica) il sito, facendo in modo che Essi sono posti nella stessa direzione rispetto al flusso di acqua e a simili profondità e intensità luminosa19.
- Per determinare le condizioni ambientali presso il sito di campionamento, uso strumenti portatili per misurare l'intensità della luce, temperatura, conducibilità, ossigeno e pH proprio sopra il superficie biofilm è da campionare da. Nel corso del campionamento, è necessario prendere misure ripetute (3 – 5) al fine di calcolare i valori medi.
- Optional: Parametri di chimica dell'acqua prendere campioni di acqua al fine di determinare rilevanti (carbonio organico (DOC), disciolto K+, Na+, Ca2 +, Mg2 +, Cl–, F-, SO42 -, PO42 - , NO32 -,4SiO4 -).
- Uso di guanti protettivi, raccogliere pietre paragonabile (in dimensione, forma e tipo) da ogni sito (o substrati artificiali). Le pietre devono essere esposti al flusso simile e condizioni di luce18.
- Filtro acqua a sufficienza in diretta dal sito attraverso 0,22 μm filtri, in modo che è pronto per tutti i campioni raccolti (ad esempio, 15 mL per campione).
- Utilizzare uno spazzolino morbido per rimuovere il biofilm dal substrato in un matraccio (spazzola finché non viene rimosso tutti i biofilm) con 15 mL di filtrato flusso acqua20.
- Difficoltà i campioni in 0,01% paraformaldeide e 0,1% di glutaraldeide21.
2. determinazione dei parametri ottimale flusso-cytometric (FC)
- Sottocampioni di trasferimento di un microscopio ottico (utilizzando un 40 X / 0.75 obiettivo; se necessario, utilizzare un obiettivo di olio 100 × 1.3) e identificare le specie presenti nei campioni22,23.
- Singola specie ordine identificato da collezioni di colture adeguate (ad es. l'algologia sperimentale e cultura raccolta di alghe all'Università di Goettingen [EPSAG] o cultura raccolta di alghe all'Università di Colonia [CCAC] se monitoraggio viene eseguito in ecosistemi europei centrali).
- Crescere le singole specie continuamente in condizioni ambientali simili (ad es., luce, temperatura, pH) per l'ambiente che sono stati prelevati i campioni di biofilm. Soggiornare all'interno di 1 ° C e 0,5 punto di pH da campioni ambientali è raccomandato.
- Per staccare/disperdere le cellule, mettere 15 mL di campioni di singole specie in provette da centrifuga e mettere i tubi al centro di una vasca di acqua e immergere, in modo che la superficie del liquido del campione è allo stesso livello come la superficie della vasca. Sonicare i campioni per 1 min a 45 kHz24,25.
- Registrare gli spettri di assorbimento e fluorescenza delle singole specie utilizzando un lettore di piastra. Fare riferimento al lettore di piastre di scelta per le istruzioni. In questo esempio, lastre di polistirolo trasparente Fondo piatto 96 pozzetti sono stati caricati con 200 µ l di campione e assorbanza è stata misurata. (Impostazioni utilizzate: modalità di scansione (a) fluorescenza; fase di lunghezza d'onda di emissione dimensioni 10 nm, emissione scansione numero 30, larghezza di banda 20 nm, guadagno 100, 25 lampeggia, US 20 modalità di scansione di tempo o (b) assorbanza integrazione; 25 lampeggia, larghezza di banda 9 nm).
- Impostare il citometro a flusso con laser, Splitter dicroiche e filtri che in combinazione coprono tutte quelle gamme fluorescente in cui specie differenti hanno proprietà specifiche. Per i flussi europei centrale, una 405 nm, 488 nm e 638 nm laser produrre risultati utili.
- Regolare l'impostazione della tensione di fotomoltiplicatori (non applicabili a tutti i citometri a flusso) e la gamma delle fluorescenze misurati per includere almeno il 99% di tutti gli eventi dei campioni.
- In alternativa, se la conoscenza sulle specie presenti nel biofilm è disponibile, iniziare dal passaggio 2.2. Se la proprietà fluorescenti sono noti, iniziare con passo 2.6.
3. facoltativo: Preparazione di un Database di riferimento di flusso-cytometric
Nota: Il FC non consente identificazione tassonomica delle cellule presenti nel biofilm. Un database di riferimento di FC misurazioni di unica specie conosciuta per essere presente nei biofilm, coltivate in condizioni simili come il biofilm, può aiutare con l'interpretazione dei dati.
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Riferimento: singola specie
- Utilizzando i parametri FC ottimizzati impostati in 2.5 – 7, misurare le proprietà ottiche e fluorescente di singola specie (risolto in paraformaldeide e glutaraldeide e filtrata attraverso filtri di dimensioni adeguate per il citometro a flusso).
- Normalizzare i dati da singole specie allo stesso modo come i dati dal biofilm (Vedi punto 6.1.2).
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Riferimento: cellule danneggiate e decadente
Uno dei più importanti indicatori della salute di biofilm è la frazione delle cellule danneggiate/morendo presenti nel biofilm. Per quantificare queste cellule, può essere preparato un riferimento di cellule in decomposizione.- Prendere sottocampioni 1ml di biofilm diluito e li Centrifugare a temperatura ambiente a 8.000 x g per 10 minuti in una centrifuga da tavolo. Sospendere il pellet risultante in 1 mL di etanolo al 90% e memorizzare la sospensione durante la notte a 4 ° C. Ripetere il giorno successivo.
- Utilizzando le impostazioni ottimizzate di FC, misurare le proprietà ottiche e fluorescente delle cellule danneggiate e decadente (fissi e filtrata).
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Riferimento: taminino
Nota: se siete interessati a particelle di microplastic nel biofilm di monitoraggio, verifica se differiscono abbastanza da particelle biotiche in ottica e proprietà di fluorescenza per l'identificazione.- Sospendere le particelle di microplastic secondo le istruzioni del produttore microplastiche e misurare le loro proprietà ottiche e fluorescente (utilizzando parametri FC da 2,7).
- Aggiungere le particelle di microplastic nell'esempio di biofilm e lasciare tutta la notte a 4 ° C.
- Filtrare la sospensione e la misura con gli stessi parametri FC come sopra.
4. preparazione e conservazione del campione
- Una volta che è stato istituito il FC e il database di riferimento FC è pronto, si può procedere con la valutazione del biofilm freschi campioni, raccolti secondo passaggi 1.1 – 7. Per staccare/disperdere il biofilm, trasferire 15 mL dei campioni dai palloni (Vedi punto 1.7) in provette da centrifuga.
- Mettere ogni tubo al centro del bagno d'acqua e immergere in modo che la superficie del liquido del campione è allo stesso livello come la superficie della vasca. Sonicare i campioni per 1 min a 45 kHz.
- Difficoltà i campioni in 0,01% paraformaldeide e 0,1% glutaraldeide (stock in acqua nanopure). Conservare a 4 ° C fino al momento dell'analisi.
- Importante: Utilizzare metà dei campioni per analisi di citometria a flusso e tenere metà in deposito per la sicurezza e per la convalida opzionale con fluorescenza-attivato delle cellule cernita e/o microscopia (Vedi sezione 6).
Nota: Stored in frigorifero, i campioni di biofilm fisso dovrebbero tenere loro proprietà ottiche e fluorescenti per fino a tre settimane.
5. esecuzione dell'esempio attraverso il FC
- Se i campioni sono stati conservati in frigorifero, li Sonicare rapidamente o pipetta parecchie volte per separare le particelle. Filtrare i sottocampioni con 50 μm filtri (filtro dimensione dipende dalla larghezza del capillare FC) prima della misurazione.
- Caricare i campioni individuali (1 – 2 mL, questo dipende il citometro a flusso utilizzato) nel citometro a flusso e misurare le proprietà ottiche e fluorescente di ogni particella. Ripetere la misurazione tre volte per ogni replica biologico (tre replicati tecnici).
- Esportare i dati da FC in formato CSV.
6. preparazione dei dati e analisi di correlazione
FC in grado di analizzare diversi parametri (ad es., area di segnale, altezza, larghezza) per ogni proprietà ottica misurata e la fascia di fluorescenza. Eseguire un'analisi di correlazione su variabili misurate e mantenere solo quelle misure che non sono altamente correlate. Questo di solito rimuove tutti, ma un parametro FC (ad es., area di segnale) e può anche rimuovere altamente correlate misure fluorescente (solitamente derivanti dal laser stesso e limitrofi filtri).
-
Eseguire CYT come un toolbox di Matlab:
- Replica di importazione il FC ridotto dei dati in formato CSV da tutti i campioni che devono essere analizzati nel CYT software16, comprese tutte le tecniche e biologiche. (Fai clic su +, File CSV di filtro, selezionare i file per l'importazione).
- Trasformare i canali fluorescenti di tutti i campioni utilizzando la trasformazione di arcoseno iperbolico. Il valore del cofattore deve essere selezionata; 150 opere per più phototrophic biofilm e citometri a flusso, ma ottimizzazione potrebbero essere necessari per particolari configurazioni sperimentali e biofilm eterotrofi. (Right-Click/trasformazione/immettere cofattore 150)
- Per il controllo qualità, confrontare visivamente (in CYT) gli istogrammi dei singoli campioni e singoli canali ottici e fluorescenti per assicurarsi che non ci sono nessun valori anomali a livello tecnico e biologico della replica. Valori erratici si manifesteranno in distribuzioni fluorescente/ottico significativamente spostati tra le repliche. (Selezionare dati, selezionare il canale, trama)
- Alternativa: eseguire un'analisi delle componenti principali (PCA) sui valori mediani delle distribuzioni fluorescente e assicurarsi che tecniche e biologiche replica cluster insieme.
- Unisci il tecnico replica in ogni replica biologico e frazionare la replica di biologica, così che ciascuno è rappresentato dallo stesso numero di particelle (cellule, frammento di cella e particelle abiotiche) e in modo che il numero totale di particelle analizzate da Neighbor stocastico Barnes-capanna incorporamento (bh-SNE) è circa 150.000 (per migliore visualizzazione risultati26). (Selezionare dati, clic destro, Merge/sottocampione)
- Per il confronto tra i campioni, è importante selezionare solo quei campioni che devono essere confrontati. Selezionare i campioni ed eseguire bh-SNE27. Una volta che l'algoritmo è finiti, nuovi canali, denominati bh-SNE1 e bh-SNE2 vengono visualizzati. Queste sono le coordinate SNE di tutte le particelle analizzate, che possono essere utilizzate per visualizzare i dati in un grafico a dispersione (viSNE mappa). (Selezionare i dati, selezionare canali, tasto destro del mouse, bh-SNE, sì dati normalizzati)
- Nella mappa viSNE, particelle sono posizionate secondo la somiglianza e raggruppate in cluster visivamente separabili. Controllare le proprietà di ottica/fluorescente del cluster e marchio e nome quelli che sono ben separati e hanno proprietà diverse ottiche/fluorescenza utilizzando strumenti di disegno disponibili in CYT. (Selezionare il canale bh-SNE1, bh-SNE2)
- Facoltativo: Se è disponibile un database di riferimento delle singole specie microbiche (misurati con la stessa impostazione di citometria a flusso e coltivate in condizioni simili!), esportare le mappe viSNE in Matlab e il database di riferimento di proiettare le mappe. In questo modo, i cluster di particolari possono essere collegati a gruppi particolari specie/tassonomici (script disponibili per il download a https://github.com/anzezupanic/FC_analysis). (Sessione/Salva)
- Risoluzione dei problemi: Se l'analisi di bh-SNE non restituisce i cluster visivamente separabili, ma una sola grande, troppe particelle sono state utilizzate in bh-SNE. Riprovare con un minor numero di particelle per esempio. Se non esistono i cluster, ma piuttosto radi singoli punti, aumentare il numero di particelle utilizzato.
- Opzionale: Invece di basarsi su bh-SNE per il clustering, altri metodi di clustering (ad es., gerarchico, basato su centroide o densità basato clustering) possono essere utilizzati sui dati normalizzati e poi sovrapposta alla mappa viSNE (https://github.com/ anzezupanic/FC_analysis).
- Una volta identificati i cluster, contare il numero di particelle in ogni cluster appartenendo a ogni replica biologico in ciascun campione. Valutare le differenze tra i campioni, usando test ANOVA e di Tukey con appropriato (ad es., Holmes) correzione per il confronto di più.
7. facoltativo: Convalida dell'interpretazione di Cluster utilizzando l'ordinamento fluorescenza-attivato delle cellule
- Una volta identificati i cluster, è possibile utilizzare fluorescenza-attivato delle cellule ordinano (FACS) per ordinarli fuori i campioni se lo si desidera, purché la FACS ha una configurazione simile (o identica) di laser e filtri fluorescenti.
- Per ogni cluster identificati, CYT fornisce porte ottiche e fluorescente che definiscono il cluster. Utilizzare queste porte per ordinare fuori le particelle in ogni cluster con il FACS e quindi identificare le celle ordinate utilizzando la microscopia chiara.
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Representative Results
Utilizzando la procedura presentata qui (Figura 1), sono stati analizzati campioni prelevati da diversi siti di un torrente locale in Svizzera. In ogni sito, tre pietre di dimensioni simili (10 – 12 cm) sono state prese e biofilm erano spazzolati via le pietre. I campioni sono stati poi sonicato, fisso, filtrata e successivamente analizzati mediante citometria a flusso. L'installazione del citofluorimetro e il database di riferimento utilizzati erano gli stessi come descritto in un precedente carta15: tre laser sono stati utilizzati (405, 488 e 638 nm), sette divisori dicroici e dieci filtri che copriva le emissioni di fluorescenza da 425 a > 755 nm e il database di riferimento tra cui > 30 specie che coprono i cianobatteri, alghe verdi, diatomee ed alghe rosse che sono state trovate nei biofilm nel flusso di Swiss. Il numero totale di particelle utilizzato per la creazione delle mappe viSNE era circa 150.000 (Figura 2A). Utilizzando l'approccio descritto, è possibile distinguere tra i diversi siti (Figura 2B), categorizzare diverse parti della mappa viSNE nella sottopopolazione delle cellule con informazioni tassonomiche grossolane (Figura 3) e stabilire che sottopopolazioni erano differenti fra i campioni (Figura 4).
Un approccio simile è stato utilizzato per quantificare le particelle di microplastic in un biofilm. I campioni puri di microplastic particelle di dimensioni simili alle cellule in acqua dolce biofilm (ca. 10 µm), campioni di biofilm coltivati in laboratorio in presenza o assenza di particelle microplastic (utilizzando protocolli di crescita di biofilm descritti in Tlili et al. 20115) sono stati misurati e confrontati (Figura 5). È stato determinato che particelle di microplastic con note proprietà ottiche e fluorescente possono essere rilevate robustamente alle concentrazioni superiore a 1.000 ppm.
Figura 1: Schema del protocollo sperimentale. Raccolta dei campioni ambientali biofilm è seguita da identificazione delle specie presenti nel biofilm, determinazione di loro proprietà ottiche e fluorescente e montaggio il citometro a flusso con laser appropriato e filtri per misurare questi Proprietà. Per misure di flusso-cytometric, i campioni sono sonicati, difficoltà e memorizzati. Quando abbastanza campioni sono stati raccolti che sono misurati tramite flusso cytometry dove per ogni cella misurata, un numero di ottica e proprietà di fluorescenza sono ottenuti e analizzati utilizzando il clustering di visual. Opzionalmente (le frecce tratteggiate), è possibile creare un database di FC delle specie presenti nei biofilm monitorati e utilizzare il database per l'interpretazione dei risultati. È anche possibile utilizzare ulteriori metodi di convalida, ad esempio ordinamento basati sulla fluorescenza delle cellule e l'analisi tassonomica usando microscopia Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2: confronto biofilm ambientali utilizzando viSNE mappe. (A) viSNE mappe ottenute da troppe cellule (300.000) hanno un singolo grande cluster (in alto), troppo poche cellule (10.000) non formano grappoli a tutti (in basso), mentre un numero ottimale di aggregati di cellule (ca. 150.000) forma chiaramente visivamente separabili (al centro). (B) sottoinsiemi della mappa viSNE che appartengono a sei diversi campioni sono differenziate in altra parte della mappa viSNE. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 3: Clustering delle sottopopolazioni delle particelle nel biofilm. (A) diverse parti della mappa viSNE sono popolati da particelle con diverse ottiche e proprietà di fluorescenza che danno indizi sull'origine biotica/abiotici delle particelle e tassonomica che raggruppare le particelle biotiche (cellule) appartengono al (lunghezze d'onda dall'alto in basso: 525 nm, 695 nm, 660 nm). Per ogni lunghezza d'onda, la scala dei colori è normalizzata da più alta fluorescenza misurata (rosso) al più basso misurato (blu). (B) proiezione di base di riferimento (punti rossi) sulla mappa di viSNE può aiutare a interpretare quali parti della mappa sono popolati da quali taxa e/o abiotiche particelle: decadente di cellule (in alto), diatomee (al centro), cianobatteri (in basso). (C) in base alle informazioni in (A) e (B) e i cluster visivamente separabili della mappa viSNE, è possibile assegnare diverse parti della mappa viSNE a cluster differenti (SP1-11) e categorizzare i cluster di conseguenza. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 4: analisi statistica dei campioni biofilm. (A) quantificazione è effettuata contando il numero di particelle di ogni sottopopolazione appartenendo a diverse repliche biologiche. A – F rappresentano sei diverse località lungo un torrente locale, da cui sono stati prelevati i campioni di biofilm. (B) analisi varianza può essere utilizzato per valutare la differenza statistica tra i campioni, con appropriata correzione di confronto più (p < 0,05, pairwise Tukey HSD tutti siti vs sito A). Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 5: monitoraggio delle particelle microplastic con viSNE. (A) Microplastic particelle, biofilm d'acqua dolce (B) , (C) acqua dolce biofilm miscelati con particelle di microplastic, (D) fluorescenza delle particelle misurata dal FC a 695 nm. La scala dei colori è normalizzata da più alta fluorescenza misurata (rosso) al più basso misurato fluorescenza (blu) a 695 nm. Il rapporto tra le particelle microplastic e particelle di biofilm è approssimativamente 1:1. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
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Discussion
Il protocollo descritto sopra è relativamente semplice da implementare. Tuttavia, mentre le impostazioni di default presentato sono state indicate per essere adatto a tutti phototrophic biofilm provato finora, ottimizzazione (come descritto nel protocollo) è necessario per massimizzare le informazioni ottenute dal metodo. Infatti, le proprietà ottiche e fluorescente di biofilm possono variare, a seconda delle condizioni ambientali (stagione, temperatura e composizione chimica dell'acqua)1. Pertanto, è importante tener conto di questa variabilità quando si impostano le analisi FC. Un modo per fare questo è prendendo campioni rappresentativi di biofilm dai siti di campionamento e/o assunzione di singole specie e coltivarle in condizioni diverse e misura usando diverse configurazioni di memoria. Singola specie in crescita è anche utile per costruire un database di proprietà fluorescente che può essere utilizzato per interpretare i risultati FC. Tuttavia, per fare questo, è importante che le singole specie sono state misurate in condizioni simili a quelle in cui sta andando il biofilm da campionare. Ad esempio, un database di FC misurazioni della singola specie in crescita a 25 ° C vi dirà molto poco circa la composizione di un biofilm cresce a 15 ° C. È, tuttavia, non è assolutamente necessario per costruire un database di riferimento per utilizzare questo metodo in modo efficace. Già con l'utilizzo del protocollo FC base, è possibile ottenere informazioni sulla dimensione, granularità e la presenza del pigmento differente in cellule presenti nel biofilm. Clustering di Visual consente la classificazione delle cellule in cluster che sono simili nella proprietà misurate e determinazione di cui proprietà ha cambiato la maggior parte tra i campioni. Il database di riferimento, tuttavia, diventa importante quando si assegnano le identità tassonomiche ai cluster diversi. Una volta che sono stati rilevati cambiamenti nelle proprietà di biofilm, è possibile correlarli con misurazioni fisiche e chimiche dell'acqua presso i siti di campionamento. Questo permette di determinare quale fattore ambientale ha la più forte influenza sopra la comunità di biofilm nell'ecosistema monitorato.
Ci sono anche alcune limitazioni al metodo. Per esempio, FC non consente l'identificazione della composizione biofilm a livello di specie. Inoltre, quando vengono rilevate modifiche nelle proprietà di biofilm, FC non può attribuire cause responsabile: uno spostamento verso specie più tolleranti o fenotipi più tolleranti (specie rimangono lo stesso). Altri, metodi complementari, quali metagenomica, sono necessarie per affrontare questa domanda. Un'altra limitazione del metodo è che solo il componente phototrophic di biofilm, ricco di pigmenti con diverse proprietà fluorescenti, è analizzato. Mentre è certamente possibile utilizzare il metodo per la caratterizzazione di biofilm eterotrofi, non è chiaro se è possono ottenere informazioni sufficienti con analisi senza macchia. A causa della bassa fluorescenza naturale di batteri e funghi, diverse impostazioni devono essere utilizzati, e pertanto non è possibile valutare i componenti phototrophic ed eterotrofi del biofilm insieme in un singolo FC eseguire. Piuttosto, sarebbe necessari che separa il campione e la valutazione di una parte con phototrophic e una parte con l'impostazione eterotrofo. Infine, c'è una limitazione con utilizzando il viSNE per visualizzazione di biofilm. I migliori risultati si ottengono con ca. 150.000 cellule imaged insieme. Questo imposta un limite per il numero di campioni che possono essere analizzati e confrontati con il metodo senza informaticamente diluire i campioni troppo. Ad esempio, se uno volesse confrontare 150 campioni, quindi ogni campione sarebbe solo rappresentato da ca. 1.000 cellule. Un modo per aggirare questa limitazione è per analizzare i campioni utilizzando un approccio "spostando la finestra" in cui gruppi di campioni di sovrapposizione può essere analizzato separatamente utilizzando viSNE e quindi i risultati raggruppati insieme, una soluzione del genere, tuttavia, non è stata ancora implementata.
Noi crediamo che la valutazione di base di citometria a flusso di biofilm può essere applicata in modo efficiente al monitoraggio degli ecosistemi acquatici. Può essere utilizzato per confrontare campioni di serie temporali o preso in luoghi diversi, e, fatta eccezione per il campionamento stesso, ha il potenziale per un'automazione completa. Il metodo può essere considerato come un passo di valutazione iniziale biofilm che fornisce informazioni per a valle dettagliate indagini con metodi complementari e più dettagliati. Infine, può essere esteso per applicazioni più specifiche, quali l'individuazione di contaminazione abiotici del biofilm, come abbiamo indicato per il caso di microplastic.
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Disclosures
Gli autori non hanno nulla a rivelare.
Acknowledgments
Il lavoro presentato è stato supportato da una borsa di studio di Ambizione SNF (PZ00P2_142533) e un assegno di ricerca Velux (Amplebig). Vorremmo ringraziare Bettina Wagner per aiuto con il lavoro sperimentale.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Multimeter | WTW | MultiLine 3620 IDS | For measuring temperature, pH, dissolved oxygen |
| Ultrasonic cleaner | VWR International | 97043-986 | Tank dimesions: 15*14*10 cm |
| Flow cytometer | Beckman Coulter | Gallios | Lasers: 405, 488 and 638 nm. Filters bands in Supplementary Table 11. Sgier et, Nat Comm, 2016. |
| Plate reader | Tecan | Infinite M200 | used for selecting appropriate setting of the FC |
| Cell sorter | Beckman Coulter | MoFlo Astrios | Settings in Supplementary Table 12. Sgier et, Nat Comm, 2016. |
| Fluorescence microscope | Zeiss | Axiovert 135 | Zeiss EC Plan-Neofluar 40x/0.75 objective |
| SOFTWARE | |||
| Matlab | MathWorks | R2013a | software for numerical computing |
| CYT | Dana Pe'er Lab | Version 1.1 | free interactive visualization tool for analysis of cytometry data |
References
- Battin, T. J., Besemer, K., Bengtsson, M. M., Romani, A. M., Packmann, A. I. The ecology and biogeochemistry of stream biofilms. Nat Rev Microbiol. 14 (4), 251-263 (2016).
- Rotter, S., Heilmeier, H., Altenburger, R., Schmitt-Jansen, M. Multiple stressors in periphyton - comparison of observed and predicted tolerance responses to high ionic loads and herbicide exposure. J Appl Ecol. 50 (6), 1459-1468 (2013).
- Tlili, A., et al. Pollution-induced community tolerance (PICT): towards an ecologically relevant risk assessment of chemicals in aquatic systems. Freshw Biol. 61 (12), 2141-2151 (2016).
- Lavoie, I., Lavoie, M., Fortin, C. A mine of information: Benthic algal communities as biomonitors of metal contamination from abandoned tailings. Science of the Total Environment. 425, 231-241 (2012).
- Tlili, A., Montuelle, B., Berard, A., Bouchez, A. Impact of chronic and acute pesticide exposures on periphyton communities. Sci Total Environ. 409 (11), 2102-2113 (2011).
- Dorigo, U., et al. Lotic biofilm community structure and pesticide tolerance along a contamination gradient in a vineyard area. Aquat Microb Ecol. 50 (1), 91-102 (2007).
- Pesce, S., et al. Evaluation of single and joint toxic effects of diuron and its main metabolites on natural phototrophic biofilms using a pollution-induced community tolerance (PICT) approach. Aquat Toxicol. 99 (4), 492-499 (2010).
- Ricart, M., et al. Effects of low concentrations of the phenylurea herbicide diuron on biofilm algae and bacteria. Chemosphere. 76 (10), 1392-1401 (2009).
- Martinez, A., Kominoski, J. S., Larranaga, A. Leaf-litter leachate concentration promotes heterotrophy in freshwater biofilms: Understanding consequences of water scarcity. Sci Total Environ. , 1677-1684 (2017).
- Corcoll, N., et al. Comparison of four DNA extraction methods for comprehensive assessment of 16S rRNA bacterial diversity in marine biofilms using high-throughput sequencing. Fems Microbiol Lett. 364 (14), (2017).
- Welsh, A. K., McLean, R. J. Characterization of bacteria in mixed biofilm communities using denaturing gradient gel electrophoresis (DGGE). Curr Protoc Microbiol. , Chapter 1, Unit 1E 1 (2007).
- Ranjard, L., et al. Characterization of bacterial and fungal soil communities by automated ribosomal intergenic spacer analysis fingerprints: Biological and methodological variability. Appl Environm Microbiol. 67 (10), 4479-4487 (2001).
- Stewart, T. J., Traber, J., Kroll, A., Behra, R., Sigg, L. Characterization of extracellular polymeric substances (EPS) from periphyton using liquid chromatography-organic carbon detection-organic nitrogen detection (LC-OCD-OND). Environ Sci Pollut R. 20 (5), 3214-3223 (2013).
- Kroll, A., et al. Mixed messages from benthic microbial communities exposed to nanoparticulate and ionic silver: 3D structure picks up nano-specific effects, while EPS and traditional endpoints indicate a concentration-dependent impact of silver ions. Environ Sci Pollut R. 23 (5), 4218-4234 (2016).
- Sgier, L., Freimann, R., Zupanic, A., Kroll, A. Flow cytometry combined with viSNE for the analysis of microbial biofilms and detection of microplastics. Nat Commun. 7, 11587 (2016).
- Amir el, A. D., et al. viSNE enables visualization of high dimensional single-cell data and reveals phenotypic heterogeneity of leukemia. Nat Biotechnol. 31 (6), 545-552 (2013).
- Mora-Gomez, J., Freixa, A., Perujo, N., Barral-Fraga, L. Limits of the biofilm concept and types of aquatic biofilms. Aquatic Biofilms: Ecology, Water Quality and Wastewater Treatment. , 3-27 (2016).
- Matthaei, C. D., Guggelberger, C., Huber, H. Local disturbance history affects patchiness of benthic river algae. Freshw Biol. 48 (9), 1514-1526 (2003).
- Tlili, A., Hollender, J., Kienle, C., Behra, R. Micropollutant-induced tolerance of in situ periphyton: Establishing causality in wastewater-impacted streams. Water Res. 111, 185-194 (2017).
- Robinson, C. T., Rushforth, S. R. Effects of physical disturbance and canopy cover on attached diatom community structure in an idaho stream. Hydrobiologia. 154, 49-59 (1987).
- Pomati, F., Nizzetto, L. Assessing triclosan-induced ecological and trans-generational effects in natural phytoplankton communities: A trait-based field method. Ecotoxicology. 22 (5), 779-794 (2013).
- Hulliger, J. Methoden zur Untersuchung und Beurteilung der Fliessgewässer. , Vol. Umwelt-Vollzug Nr. 0740, Bundesamt für Umwelt, Bern (2007).
- Tlili, A., et al. In situ spatio-temporal changes in pollution-induced community tolerance to zinc in autotrophic and heterotrophic biofilm communities. Ecotoxicology. 20 (8), 1823-1839 (2011).
- Foladori, P., Laura, B., Gianni, A., Giuliano, Z. Effects of sonication on bacteria viability in wastewater treatment plants evaluated by flow cytometry - Fecal indicators, wastewater and activated sludge. Water Res. 41 (1), 235-243 (2007).
- Buesing, N., Gessner, M. O. Comparison of detachment procedures for direct counts of bacteria associated with sediment particles, plant litter and epiphytic biofilms. Aquat Microb Ecol. 27 (1), 29-36 (2002).
- van der Maaten, L., Hinton, G. Visualizing Data using t-SNE. J Mach Learn Res. 9, 2579-2605 (2008).
- van der Maaten, L. Accelerating t-SNE using Tree-Based Algorithms. J Mach Learn Res. 15, 3221-3245 (2014).
