Summary
Flödescytometri i kombination med visuella kluster erbjuder en lätt-till-använda och snabb metod för att studera vattenlevande biofilmer. Det kan användas för biofilm karaktärisering, identifiering av förändringar i biofilm gemenskapens struktur, och upptäckt av abiotiska partiklar inbäddad i biofilmen.
Abstract
Biofilmer är dynamiska konsortier av mikroorganism som spelar en nyckelroll i sötvatten ekosystem. Genom att ändra deras samhällsstruktur, biofilmer svara snabbt på miljöförändringar och därmed kan användas som indikatorer på vattenkvalitet. För närvarande är biofilm bedömning mestadels baserade på integrativ och funktionella slutpunkter, såsom fotosyntetiska eller respiratorisk verksamhet, som inte ger information om biofilm gemenskapsstrukturen. Flödescytometri och computational visualisering erbjuder en alternativ, känslig och lätt-till-använda metod för bedömning av gemenskapens sammansättning, särskilt den photoautotrophic delen av sötvatten biofilmer. Det kräver endast grundläggande provberedning, varefter hela provet körs genom flödescytometer. Information om encelliga optiska och fluorescerande används för computational visualisering och biologiska tolkningen. Dess främsta fördelar över andra metoder är hastigheten på analys och hög-information-innehåll karaktär. Flödescytometri ger information om flera mobilnät och biofilm drag i en enskild mätning: partikelstorlek, densitet, pigment innehåll, abiotiska innehåll i biofilm och grova taxonomisk information. Men ger den inte information om biofilm sammansättning på artnivå. Vi ser stor potential i att utnyttja metoden för miljöövervakning av akvatiska ekosystem och som en första biofilm utvärdering steg som informerar nedströms detaljerade undersökningar av kompletterande och mer detaljerade metoder.
Introduction
Biofilmer är dynamiska konsortier av mikroorganism som spelar en nyckelroll i sötvatten ekosystem, alltifrån primärproduktion, näringsämne cykling och vattenrening till att påverka fördelningen av mikroorganismer och deras biologiska mångfald i ekosystemet 1. När biofilmer utsätts till växlande miljöförhållanden eller stressfaktorer, såsom kemikalier, deras gemenskapsstruktur snabbt skiftar mot mer toleranta arter2,3. Deras hög känslighet förvandlar biofilmer till attraktiva modellsystem för miljömässiga övervakning4, dock ingen av de nuvarande metoderna passar perfekt att faktiskt spåra dynamiken i en biofilm gemenskap på ett snabbt och enkelt sätt.
Vanliga består metoder för att karakterisera biofilmer av mätning av funktionella och strukturella slutpunkter. På nivån för hela gemenskapen ger fotosyntetiserande och respiratoriska aktivitet samt aktiviteten av extracellulära enzymer information om funktionella biofilm5,6,7,8 ,9. Biomassa periodisering används som en indikator för övergripande biofilm tillväxt. Strukturella förändringar mäts för närvarande antingen genom att använda traditionella artbestämning med ljusmikroskop eller med nukleotidbaserade tekniker (t.ex., denaturing gradient gel-elektrofores (DGGE), automatiserade ribosomal intergenic spacer analys (ARISA), metagenomik)10,11,12. Dessa metoder ger information men är tidskrävande att utföra eller kräver specifika kunskaper, eller är fortfarande under utveckling. Slutligen, nya metoder för utvärdering av den extracellulära polymera substanser (EPS)13,14 och biofilm arkitektur1, medan känslig, låg genomströmning och har ännu inte utvecklats mot övervakningsändamål.
Det är uppenbart att för en fullständig karakterisering av sötvatten biofilmer, är det nödvändigt att kombinera flera olika metoder, som ger inblick biofilm funktion, sammansättning och arkitektur. För miljöövervakning, däremot, krävs en snabb och känslig metod som kan upptäcka förändringar i biofilmen och aktivera grundläggande biologiska tolkningen av förskjutningarna på funktionella och strukturella nivå.
Vi har utvecklat en ny metod för mikrobiell gemenskapen karakterisering av den phototrophic delen av stream biofilmer (vegetarianer), vilket är tillräckligt snabbt för övervakningsändamål och samtidigt ger tillräcklig information om gemenskapens biofilm struktur att tillåta biologiska tolkningen15. Det är baserat på encelliga flödescytometri (FC) biofilm prover och tillsammans med computational visualisering och ger information om optiska och fluorescerande egenskaper av biofilmen på enstaka cellnivå.
Arbetsflödet efter biofilm provtagningen består av provberedning i form av ultraljudsbehandling, fixering och storlek-baserade filtrering av proverna följt av bedömningen av provet av flödescytometri. Förvärvade data ger information om flera olika cellulära egenskaper i en enda mätning: partikelstorlek, densitet, pigment innehåll, abiotiska innehåll (t.ex. mikroplast) i biofilmen. Denna uppsättning data är än analyseras via computational visualisering med hjälp av visuella stokastiska granne inbäddning (viSNE)16, som möjliggör snabb och enkel tolkning av data. Även om ett par veckor krävs för att ställa in och optimera metoden, en gång ställa, det tar bara några timmar från att samla in proverna som biofilm att tolka resultaten.
De främsta fördelarna med den presenterade metoden framför andra är hastigheten på analys och hög-information-innehåll. Proverna kan dessutom lagras i flera veckor efter samlingen utan förlust av deras optiska och fluorescens egenskaper. Detta kan vara mycket användbart när karakterisering av ett stort antal prover krävs, till exempel stora provtagning studier eller biologisk övervakning program, men kan också ge en betydande mängd information i mindre undersökande studier.
Presenterade protokollet är baserat på flöde-flödescytometrisk analys av phototrophic biofilmer (vegetarianer) som samlats in från olika platser i en ström. Många steg i protokollet, t.ex. valet av platser lämpliga för övervakningsändamål beror på målen för forskningen och därför inte kan förskrivas. Andra ger mindre frihet och kräva att protokollet följs noggrant, detta görs klart i det detaljerade protokollet nedan.
Protokollet börjar med valet av platser för biofilm-baserade miljöövervakning. Nästa steg är att ställa upp den-flödescytometer (FC) så att dess mätningar möjliggör diskriminering mellan olika phototrophic organismer som lever i biofilmer i övervakad miljö. Detta görs genom att samla biofilm prover från webbplatser, att identifiera de fluorescerande egenskaperna hos olika arter förekommer i biofilmen och ställa in flödescytometer med lasrar och filter som gör att mätning vid lämplig optisk våglängder. När FC har set-up, biofilmer kan samlas in från webbplatser regelbundet, optiska och fluorescerande egenskaperna för de enda partiklarna i den biofilm som mätt med flödescytometri, och data analyseras av visuella klustring. För bättre tolkning av resultaten är det möjligt att bygga en FC referensdatabas av lokala biofilm-levande arter och deras fenotyper och använda databasen för att identifiera olika taxonomier i FC data. Validering är möjligt genom fluorescens-baserade sortering av identifierade kluster av enstaka celler använder FACS och mikroskopi-baserade taxonomisk identifiering av den aktuella arten. En schematisk av protokollet ges i figur 1.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. ekosystemens urval och Biofilm provtagning
- Välj ett akvatiska ekosystem av intresse och hitta provtagningspunkterna där biofilmer växa. Grunda delar av en ström med sakta till medium vattenflöde och en stenig streambed för biofilm fastsättning är lämpliga17,18.
- Valfritt: Om webbplatsen inte har tillräckligt ytor för biofilm fastsättning, eller att minska biofilmer variationen inom en plats, placera artificiella substrat för biofilm fastsättning (t.ex. glasskivor, keramiska plattor) in på webbplatsen, medan att se till att de är placerade i samma riktning med avseende på vattenflödet och vid liknande djup och ljusintensitet19.
- För att avgöra miljöförhållandena på webbplatsen provtagning, användning portabla instrument att mäta ljusintensitet, är vattentemperatur, konduktivitet, syre och pH precis ovanför den ytan biofilmen att avsmakas från. Under loppet av provtagning, ta upprepade mätningar (3 – 5) för att beräkna medelvärden.
- Valfritt: Ta vattenprover för att fastställa relevanta vatten kemi parametrar (löst organiskt kol (DOC), K+, Na+, Ca2 +, Mg2 +, Cl–, F-, SO42 -, PO42 - , Ingen32-, SiO44 -).
- Använda skyddshandskar, samla in jämförbara stenar (i storlek, form och typ) från varje webbplats (eller artificiella substrat). Stenarna bör utsättas för liknande flöde och ljusförhållanden18.
- Filtrera tillräckligt ström med vatten från webbplatsen genom 0,22 μm filter, så att den är redo för alla insamlade prover (t.ex. 15 mL per prov).
- Använda en mjuk tandborste för att ta bort biofilmen från underlaget till en mätkolv (borste tills alla biofilm tas bort) med 15 mL av filtrerad ström vatten20.
- Fixa proverna i 0,01% PARAFORMALDEHYD och 0,1% glutaraldehyd21.
2. bestämning av optimala flödet-flödescytometrisk (FC) parametrar
- Överföra delprover till ett ljusmikroskop (använder en 40 X / 0.75 mål; om nödvändigt använda ett 100 × 1.3 olja mål) och identifiera arten som finns i den prover22,23.
- Ordning identifierade enda arter från lämpliga kultur samlingar (t.ex. den experimentella Phycology och kultur insamling av alger på universitetar av Goettingen [EPSAG] eller kultur insamling av alger på universitetet i Köln [CCAC] om övervakning sker i centrala europeiska ekosystem).
- Växa i släktet kontinuerligt i liknande miljöförhållanden (t.ex., ljus, temperatur, pH) till miljön biofilm proven togs från. Vistas inom 1 ° C och 0,5 pH punkt från miljöprover rekommenderas.
- För att lossa/skingra cellerna, sätta 15 mL av enstaka arter prover i centrifugrör och lägga rören i mitten av ett vattenbad och doppa, så att provet flytande yta är på samma nivå som ytan av badet. Sonikera proverna för 1 min 45 kHz24,25.
- Spela in absorbans och fluorescens spektra av släktet med hjälp av en tallrik-läsare. Hänvisas till Plattläsare val för instruktioner. I det här exemplet 96 brunnar platt botten transparent polystyrol plattor var lastade med 200 µL provvolymen och Absorbansen mättes. (Inställningar används: a fluorescens skanningsläge; utsläpp våglängd steg storlek 10 nm, emission scan nummer 30, bandbredd 20 nm, få 100, 25 blixtar, 20 US integration tid eller (b) absorbans skanningsläge; 25 blixtar, bandbredd 9 nm).
- Ställa in en flödescytometer med lasrar, dichroic splitters och filter som tillsammans täcker alla de fluorescerande spänner där olika arter har specifika egenskaper. För centrala europeiska strömmar, en 405 nm, 488 nm och 638 nm laser producerar användbara resultat.
- Justera inställningen spänning av fotomultiplikatorer (gäller inte alla flöde cytometers) och spänna av de uppmätta fluorescences för att inkludera minst 99% av alla händelser av proverna.
- Alternativt om det finns kunskap om arter som finns i biofilmer, börja med steg 2.2. Fluorescerande egenskaper är kända, börja med steg 2,6.
3. Valfritt: Beredning av en Flow-flödescytometrisk referensdatabas
Obs: FC tillåter inte taxonomisk identifiering av celler som finns i biofilmen. En referensdatabas FC mätningar av enstaka arter som är kända att vara närvarande i de biofilmer, odlas under liknande förhållanden som biofilmer, kan hjälpa till med tolkningen av data.
-
Referens: enstaka arter
- Med optimerad FC parametrar in i 2,5 – 7, Mät den optiska och fluorescerande egenskaper för enstaka arter (fast i PARAFORMALDEHYD och glutaraldehyd och filtreras genom filter av lämplig storlek för flödescytometer).
- Normalisera data från enstaka arter på samma sätt som data från de biofilmer (se steg 6.1.2).
-
Referens: skadade och ruttnande celler
En av de viktigaste indikatorerna på biofilm hälsa är fraktionen av skadad/döende celler som finns i biofilmen. För att kvantifiera dessa celler, kan en referens av ruttnande celler förberedas.- Ta 1 mL delprover av utspädda biofilmer och centrifugera dem i rumstemperatur vid 8000 x g i 10 minuter i en bordsskiva centrifug. Centrifugerade resulterande i 1 mL 90% etanol och förvara suspensionen över natten vid 4 ° C. Upprepa nästa dag.
- Med hjälp av optimerad FC-inställningarna, Mät den optiska och fluorescerande egenskaper för skadade och ruttnande cellerna (fast och filtreras).
-
Referens: mikroplast
Obs: om intresserad övervakning mikroplast partiklar i biofilmer, kontrollera om de skiljer sig nog från biotiska partiklar i optisk och fluorescens egenskaper för identifiering.- Avbryta mikroplast partiklarna enligt instruktionerna mikroplast producentens och mäta deras optiska och fluorescerande egenskaper (med FC parametrar från 2,7).
- Tillsätt mikroplast partiklarna biofilm och lämna över natten vid 4 ° C.
- Filtrera indragning och åtgärd med samma FC parametrar som ovan.
4. prova beredning och förvaring
- När FC har inrättats och FC referensdatabasen är den klar, kan en fortsätta med utvärderingen av färska biofilm prover, som tagits enligt steg 1,1 – 7. För att lossa/skingra biofilmen, överföra 15 mL av proverna från kolvar (se steg 1,7) i centrifugrör.
- Sätt varje rör i mitten av ett vattenbad och doppa så att flytande ytan av provet är på samma nivå som ytan av badet. Sonikera proverna för 1 min 45 kHz.
- Fixa proverna i 0,01% PARAFORMALDEHYD och 0,1% glutaraldehyd (lager i nanopure vatten). Förvaras vid 4 ° C tills den för analys.
- Viktigt: Använd hälften av proverna för flödescytometri analys och hålla hälften i lagring för säkerhet och valfria validering med fluorescens-aktiverad cell sortering eller ljusmikroskop (se avsnitt 6).
Observera: lagrade i kylen, fast biofilm proverna bör hålla sina optiska och fluorescerande egenskaper för upp till tre veckor.
5. kör provet genom FC
- Om proverna förvarades i kylskåp, Sonikera dem snabbt eller Pipettera flera gånger för att separera partiklarna. Filtrera delproverna med 50 μm filter (filterstorlek beror på bredden på FC kapillären) innan du mäter.
- Ladda de enskilda proverna (1 – 2 mL, detta beror på den flödescytometer som används) i en flödescytometer och mät den optiska och fluorescerande egenskaper för varje partikel. Upprepa mätningen tre gånger per varje biologisk replikat (tre tekniska replikat).
- Exportera data från FC i CSV-format.
6. dataförberedelse och korrelation analys
FC kan analysera flera parametrar (t.ex., signal området, höjd, bredd) för varje uppmätt optiska boende och fluorescens utbud. Kör en korrelation analys på de uppmätta variablerna och endast behålla de mätningar som inte är starkt korrelerade. Detta avlägsnar vanligtvis alla utom en FC parameter (t.ex., signal område) och kan också ta bort starkt korrelerade fluorescerande mätningar (vanligtvis härrör från samma laser och angränsande filter).
-
Kör CYT som en verktygslåda i Matlab:
- Importera den reducera FC data i CSV-format från alla prover som ska analyseras i den CYT programvara16, inklusive alla tekniska och biologiska replikerar. (Klicka på +, fil filtrera *.csv, Välj filer som ska importeras).
- Omvandla de fluorescerande kanalerna av alla prover med hyperbolisk arcsinus omvandlingen. Värdet av kofaktor måste väljas; 150 verk för mest phototrophic biofilmer och flöde cytometers, men optimering kan vara nödvändigt för särskilt experimentella uppställningar och heterotrofa biofilmer. (Höger-högerklick/Transform/Enter kofaktor 150)
- För kvalitetskontroll, visuellt jämföra (i CYT) histogram av enskilda prover och enskilda optiska och fluorescerande kanaler att se till att det finns ingen extremvärden på tekniska och biologiska nivån för replikering. Extremvärden kommer att manifesteras i betydligt skiftade fluorescerande optiska fördelningar mellan replikerar. (Välj Data, Välj kanal, tomt)
- Alternativ: kör en principalkomponentanalys (PCA) på medianvärden av fluorescerande distributioner och se till att tekniska och biologiska replikat kluster tillsammans.
- Sammanfoga tekniska replikerar i varje biologisk replikat och delprov biologiska replikerar, så att var och en representeras av samma antal partiklar (celler, cellen fragment och abiotiska partiklar) och så att det totala antalet partiklar analyseras av Barnes-Hut stokastiska granne inbäddning (bh-SNE) är omkring 150 000 (för bästa visualisering resultat26). (Välj Data, högerklicka, Merge/delprov)
- För jämförelse mellan prover är det viktigt att välja endast de prover som ska jämföras. Urvalet av prov och kör bh-SNE27. När algoritmen är färdiga, nya kanaler, visas namngivna bh-SNE1 och bh-SNE2. Dessa är SNE koordinaterna för alla analyserade partiklar, som kan användas för att visualisera data i ett spridningsdiagram (viSNE karta). (Välj Data, Välj kanaler, högerklicka, bh-SNE, ja normaliserade data)
- I viSNE kartan, partiklar placeras enligt likheten och grupperade i visuellt separera kluster. Inspektera optisk/fluorescerande egenskaperna av kluster och märke och namn som är väl avgränsade och har olika optiska/fluorescens egenskaper med hjälp av ritverktygen i CYT. (Välj kanal bh-SNE1, bh-SNE2)
- Valfritt: Om en referensdatabas för enda mikrobiell art (mätt med samma flödescytometri och odlas under liknande förhållanden!) är tillgänglig, exportera viSNE kartorna i Matlab och projicera referensdatabasen på kartorna. På detta sätt, kan särskilt kluster anslutas till särskilda arter/taxonomiska grupper (skript finns tillgängliga för nedladdning på https://github.com/anzezupanic/FC_analysis). (Session/spara)
- Felsökning: Om bh-SNE analysen inte returnerar visuellt separera kluster, men en enda stor, alltför många partiklar användes i bh-experten. Försök igen med färre partiklar per prov. Om det finns inga kluster, men ganska glesa enskilda punkter, öka antalet partiklar används.
- Valfritt: I stället för att förlita sig på bh-SNE för den klustring, andra kluster metoder (t.ex., hierarkisk, centroiden-baserade eller densitet baserad klustring) kan användas på normaliserade data och sedan ovanpå viSNE karta (https://github.com/ anzezupanic/FC_analysis).
- När kluster har identifierats, räkna antalet partiklar i varje kluster som tillhör varje biologisk replikat i varje prov. Bedöma skillnaderna mellan proven, med ANOVA och Tukey's test med lämpligt (t.ex., Holmes) korrigering för flera jämförelse.
7. tillval: Validering av klustret tolkning med hjälp av fluorescens-aktiverad Cell sortering
- När kluster har identifierats, använda fluorescens-aktiverad cell sortering (FACS) för att sortera dem ur proverna om så önskas, förutsatt att FACS har en liknande (eller identiska) konfiguration av lasrar och fluorescerande filter.
- För varje identifierade kluster ger CYT optiska och fluorescerande grindar som definierar klustret. Använda dessa portar för att sortera ut partiklar i varje kluster med FACS och sedan identifiera de sorterade celler använder ljusmikroskop.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Använda proceduren presenteras här (figur 1), analyserades prover från flera platser i en lokal ström i Schweiz. På varje plats, tre liknande stora stenar (10 – 12 cm) togs, och biofilmer var borstas bort stenarna. Proverna var då sonicated, fast, filtreras och senare analyseras med flödescytometri. Inställningen av flödescytometer och referensdatabasen används var desamma som beskrivs i en tidigare papper15: tre lasrar användes (405, 488 och 638 nm), sju dichroic splitters och tio filter som omfattas fluorescens utsläpp från 425 till > 755 nm , och den referens database inklusive > 30 arter som täcker cyanobakterier, blågröna alger, kiselalger och rödalger som hittades i biofilmer i schweiziska ström. Det totala antalet partiklar används för skapandet av viSNE kartorna var cirka 150 000 (figur 2A). Med den beskrivna metoden är det möjligt att skilja mellan de olika platserna (figur 2B), kategorisera olika delar av viSNE kartan i subpopulationen av cellerna med grova taxonomisk information (figur 3) och fastställa vilka subpopulationer skilde mellan proverna (figur 4).
Ett liknande tillvägagångssätt har använts för att kvantifiera mikroplast partiklar i en biofilm. Ren prover av mikroplast partiklar av liknande storlek till celler i sötvatten biofilmer (ca. 10 µm), biofilmer prover odlas i laboratoriet i närvaro eller frånvaro av mikroplast partiklar (med biofilm tillväxt protokoll beskrivs i Linneas o.a. 20115) mättes och jämfördes (figur 5). Det bestämdes att mikroplast partiklar med kända optiska och fluorescerande egenskaper kraftfullt kan upptäckas i halter över 1000 ppm.
Figur 1: schemat för protokollet experimentella. Provtagning för de miljömässiga biofilmer följs av identifiering av arter som finns i biofilmen, bestämning av deras optiska och fluorescerande egenskaper och passande flödescytometer med lämpliga lasrar och filter att mäta dessa egenskaper. För flöde-flödescytometrisk mätningar, är sonicated proverna, fixa och lagras. När tillräckligt många prover har samlats de mäts av flödescytometri där för varje uppmätt cell, ett antal optiska och fluorescens boenden erhålls och analyseras med hjälp av visuella klustring. Valfritt (prickade pilarna), är det möjligt att bygga en FC-databas av arter som finns i övervakade biofilmer och använda databasen för tolkningen av resultaten. Det är också möjligt att använda ytterligare valideringsmetoder, t.ex. fluorescens-baserade cell sortering och taxonomiska analys med ljusmikroskop vänligen klicka här för att visa en större version av denna siffra.
Figur 2: jämföra miljömässiga biofilmer med viSNE maps. (A) viSNE kartor från för många celler (300.000) har ett enda stort kluster (överst), alltför få (10.000) celler inte bildar kluster på alla (botten), medan en optimala antalet cell (ca. 150.000) form tydligt visuellt separera kluster (mitten). (B) delmängder av viSNE karta som hör till sex olika prover har olika densitet i annan del av viSNE karta. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3: klustring av subpopulationer av partiklar i biofilmer. (A) olika delar av viSNE kartan är befolkade av partiklar med olika optiska och fluorescens egenskaper som ger ledtrådar till partiklarna biotiska/abiotiska ursprung och som taxonomisk grupp biotiska partiklarna (celler) tillhör (våglängder från toppen till botten: 525 nm, 695 nm, 660 nm). För varje våglängd, är färgskalan normaliserade från högsta uppmätta fluorescens (röd) till lägsta uppmätta (blå). (B) projektion av referensdatabasen (röda prickar) till viSNE kartan kan hjälpa till att tolka vilka delar av kartan är befolkade av vilka taxa och/eller abiotiska partiklar: förfalla celler (överst), kiselalger (mitten), cyanobakterier (nederst). (C) baserat på information i (A) och (B) och visuellt separera kluster av viSNE kartan, är det möjligt tilldela olika delar av viSNE kartan till olika kluster (SP1-11) och kategorisera kluster med detta. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 4: statistisk analys av proverna som biofilm. (A) kvantifiering utförs genom att räkna antalet partiklar av varje subpopulation som tillhör olika biologiska replikat. A – F representerar sex olika platser längs en lokal ström, som biofilm proverna togs. (B) ANOVA kan användas för att utvärdera statistiska skillnaden mellan proven, med lämpliga flera jämförelse korrigering (p < 0,05, parvisa Tukey HSD alla webbplatser vs webbplats A). Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 5: spårning mikroplast partiklar med viSNE. (A) mikroplast partiklar, (B) sötvatten biofilmer, (C) sötvatten biofilm blandat med mikroplast partiklar, (D) fluorescens av partiklar mätt med FC på 695 nm. Färgskalan är normaliserade från högsta uppmätta fluorescens (röd) till lägsta uppmätta fluorescens (blå) på 695 nm. Förhållandet mellan mikroplast partiklar och biofilm partiklar är ungefär 1:1. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Protokollet beskrivs ovan är relativt enkel att genomföra. Samtidigt presenterade standardinställningarna har visat sig vara lämplig för alla phototrophic biofilm testat hittills, är dock optimering (som beskrivs i protokollet) nödvändigt att maximera den information som erhålls från metoden. Faktiskt kan den optiska och fluorescerande egenskaper för biofilmer variera beroende på miljöförhållanden (säsong, temperatur, kemiska sammansättningen av vattnet)1. Det är därför viktigt att ta hänsyn till denna variation när du ställer in FC analyserna. Ett sätt att göra detta är genom att ta representativa prover av biofilmer från provtagningspunkterna eller tar enstaka arter och växande dem i olika förhållanden och mäta dem med hjälp av olika inställningar. Växande enstaka arter är också användbart att konstruera en databas av fluorescerande egenskaper som kan användas för att tolka FC. För att göra detta, är det dock viktigt att de enda arterna har mätts under liknande förhållanden till dem under vilka biofilmer ska provtas. Till exempel berättar en databas med FC mätningar av enstaka arter växer vid 25 ° C mycket lite om sammansättningen av en biofilm som växer vid 15 ° C. Det är dock inte absolut nödvändigt att bygga en referensdatabas för att använda denna metod effektivt. Redan med hjälp av grundläggande FC-protokollet, är det möjligt att få information om storlek, kornighet och förekomsten av olika pigment i cellerna som finns i biofilmen. Visuella kluster kan klassificeringen av celler i kluster som har liknande uppmätta egenskaper och beslutsamhet som boendet har förändrats mest mellan prover. Databasen, men blir viktig när du tilldelar de olika klustren taxonomiska identiteter. När förändringar i biofilm boenden har upptäckts, är det möjligt att korrelera dem med fysiska och kemiska mätningar av vattnet vid provtagningspunkterna. Detta tillåter att avgöra vilka miljöfaktor har det starkaste inflytandet över gemenskapens biofilm i övervakade ekosystemet.
Det finns också vissa begränsningar till metoden. Till exempel tillåter FC inte identifiering av biofilm sammansättning på artnivå. Dessutom när ändringar i biofilm egenskaper identifieras, FC kan inte tillskriva ansvariga orsaker: en förskjutning mot mer toleranta arter eller mot mer tolerant fenotyper (arter kvar samma). Andra, kompletterande metoder, såsom metagenomik, behövs för att ta itu med denna fråga. En annan begränsning för metoden är att endast den phototrophic delen av biofilmer, rik med pigment med olika fluorescerande egenskaper, analyseras. Det är visserligen möjligt att använda metoden för heterotrofa biofilm karakterisering, är det inte klart huruvida tillräcklig information kan erhållas med fläck-fri analys. Olika inställningar måste användas på grund av den låga naturliga fluorescensen av bakterier och svampar, och det är därför inte möjligt att utvärdera phototrophic och heterotrofa komponenterna av biofilmen tillsammans i en enda FC kör. Snarare, separera provet och utvärdera en del med phototrophic och en del med inställningen heterotrofa skulle vara nödvändigt. Slutligen finns det en begränsning med viSNE för biofilm visualisering. Bästa resultat uppnås med ca. 150.000 celler avbildats tillsammans. Detta sätter en gräns för antalet prover som kan analyseras och jämförs med metoden utan att beräkningsmässigt späda proverna för mycket. Exempelvis om man ville jämföra 150 prover, skulle sedan varje prov bara representeras av ca. 1000 celler. En väg runt denna begränsning är att analysera prover med en ”flytta fönster” metod där överlappande grupper av prov kan analyseras separat med viSNE och sedan resultaten poolade tillsammans, en sådan lösning, dock, har ännu inte genomförts.
Vi tror att flödescytometri-baserat utvärderingen av biofilmer kan tillämpas effektivt på övervakning av akvatiska ekosystem. Det kan användas för att jämföra tidsserier prover eller prover som tagits på olika platser, och, med undantag för provtagning själv, har potentialen för fullständig automation. Metoden kan betraktas som ett första biofilm utvärdering steg som ger information för nedströms detaljerade utredningar med kompletterande och mer detaljerade metoder. Slutligen kan det utökas till mer specifika applikationer, såsom detektion av abiotiska kontaminering av biofilmer, som vi har visat för fallet av mikroplast.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har något att avslöja.
Acknowledgments
Presenterade arbetet stöddes av en SNF Ambizione Fellowship (PZ00P2_142533) och ett Velux forskningsanslag (Amplebig). Vi skulle vilja tacka Bettina Wagner för hjälp med det experimentellt arbetet.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Multimeter | WTW | MultiLine 3620 IDS | For measuring temperature, pH, dissolved oxygen |
| Ultrasonic cleaner | VWR International | 97043-986 | Tank dimesions: 15*14*10 cm |
| Flow cytometer | Beckman Coulter | Gallios | Lasers: 405, 488 and 638 nm. Filters bands in Supplementary Table 11. Sgier et, Nat Comm, 2016. |
| Plate reader | Tecan | Infinite M200 | used for selecting appropriate setting of the FC |
| Cell sorter | Beckman Coulter | MoFlo Astrios | Settings in Supplementary Table 12. Sgier et, Nat Comm, 2016. |
| Fluorescence microscope | Zeiss | Axiovert 135 | Zeiss EC Plan-Neofluar 40x/0.75 objective |
| SOFTWARE | |||
| Matlab | MathWorks | R2013a | software for numerical computing |
| CYT | Dana Pe'er Lab | Version 1.1 | free interactive visualization tool for analysis of cytometry data |
References
- Battin, T. J., Besemer, K., Bengtsson, M. M., Romani, A. M., Packmann, A. I. The ecology and biogeochemistry of stream biofilms. Nat Rev Microbiol. 14 (4), 251-263 (2016).
- Rotter, S., Heilmeier, H., Altenburger, R., Schmitt-Jansen, M. Multiple stressors in periphyton - comparison of observed and predicted tolerance responses to high ionic loads and herbicide exposure. J Appl Ecol. 50 (6), 1459-1468 (2013).
- Tlili, A., et al. Pollution-induced community tolerance (PICT): towards an ecologically relevant risk assessment of chemicals in aquatic systems. Freshw Biol. 61 (12), 2141-2151 (2016).
- Lavoie, I., Lavoie, M., Fortin, C. A mine of information: Benthic algal communities as biomonitors of metal contamination from abandoned tailings. Science of the Total Environment. 425, 231-241 (2012).
- Tlili, A., Montuelle, B., Berard, A., Bouchez, A. Impact of chronic and acute pesticide exposures on periphyton communities. Sci Total Environ. 409 (11), 2102-2113 (2011).
- Dorigo, U., et al. Lotic biofilm community structure and pesticide tolerance along a contamination gradient in a vineyard area. Aquat Microb Ecol. 50 (1), 91-102 (2007).
- Pesce, S., et al. Evaluation of single and joint toxic effects of diuron and its main metabolites on natural phototrophic biofilms using a pollution-induced community tolerance (PICT) approach. Aquat Toxicol. 99 (4), 492-499 (2010).
- Ricart, M., et al. Effects of low concentrations of the phenylurea herbicide diuron on biofilm algae and bacteria. Chemosphere. 76 (10), 1392-1401 (2009).
- Martinez, A., Kominoski, J. S., Larranaga, A. Leaf-litter leachate concentration promotes heterotrophy in freshwater biofilms: Understanding consequences of water scarcity. Sci Total Environ. , 1677-1684 (2017).
- Corcoll, N., et al. Comparison of four DNA extraction methods for comprehensive assessment of 16S rRNA bacterial diversity in marine biofilms using high-throughput sequencing. Fems Microbiol Lett. 364 (14), (2017).
- Welsh, A. K., McLean, R. J. Characterization of bacteria in mixed biofilm communities using denaturing gradient gel electrophoresis (DGGE). Curr Protoc Microbiol. , Chapter 1, Unit 1E 1 (2007).
- Ranjard, L., et al. Characterization of bacterial and fungal soil communities by automated ribosomal intergenic spacer analysis fingerprints: Biological and methodological variability. Appl Environm Microbiol. 67 (10), 4479-4487 (2001).
- Stewart, T. J., Traber, J., Kroll, A., Behra, R., Sigg, L. Characterization of extracellular polymeric substances (EPS) from periphyton using liquid chromatography-organic carbon detection-organic nitrogen detection (LC-OCD-OND). Environ Sci Pollut R. 20 (5), 3214-3223 (2013).
- Kroll, A., et al. Mixed messages from benthic microbial communities exposed to nanoparticulate and ionic silver: 3D structure picks up nano-specific effects, while EPS and traditional endpoints indicate a concentration-dependent impact of silver ions. Environ Sci Pollut R. 23 (5), 4218-4234 (2016).
- Sgier, L., Freimann, R., Zupanic, A., Kroll, A. Flow cytometry combined with viSNE for the analysis of microbial biofilms and detection of microplastics. Nat Commun. 7, 11587 (2016).
- Amir el, A. D., et al. viSNE enables visualization of high dimensional single-cell data and reveals phenotypic heterogeneity of leukemia. Nat Biotechnol. 31 (6), 545-552 (2013).
- Mora-Gomez, J., Freixa, A., Perujo, N., Barral-Fraga, L. Limits of the biofilm concept and types of aquatic biofilms. Aquatic Biofilms: Ecology, Water Quality and Wastewater Treatment. , 3-27 (2016).
- Matthaei, C. D., Guggelberger, C., Huber, H. Local disturbance history affects patchiness of benthic river algae. Freshw Biol. 48 (9), 1514-1526 (2003).
- Tlili, A., Hollender, J., Kienle, C., Behra, R. Micropollutant-induced tolerance of in situ periphyton: Establishing causality in wastewater-impacted streams. Water Res. 111, 185-194 (2017).
- Robinson, C. T., Rushforth, S. R. Effects of physical disturbance and canopy cover on attached diatom community structure in an idaho stream. Hydrobiologia. 154, 49-59 (1987).
- Pomati, F., Nizzetto, L. Assessing triclosan-induced ecological and trans-generational effects in natural phytoplankton communities: A trait-based field method. Ecotoxicology. 22 (5), 779-794 (2013).
- Hulliger, J. Methoden zur Untersuchung und Beurteilung der Fliessgewässer. , Vol. Umwelt-Vollzug Nr. 0740, Bundesamt für Umwelt, Bern (2007).
- Tlili, A., et al. In situ spatio-temporal changes in pollution-induced community tolerance to zinc in autotrophic and heterotrophic biofilm communities. Ecotoxicology. 20 (8), 1823-1839 (2011).
- Foladori, P., Laura, B., Gianni, A., Giuliano, Z. Effects of sonication on bacteria viability in wastewater treatment plants evaluated by flow cytometry - Fecal indicators, wastewater and activated sludge. Water Res. 41 (1), 235-243 (2007).
- Buesing, N., Gessner, M. O. Comparison of detachment procedures for direct counts of bacteria associated with sediment particles, plant litter and epiphytic biofilms. Aquat Microb Ecol. 27 (1), 29-36 (2002).
- van der Maaten, L., Hinton, G. Visualizing Data using t-SNE. J Mach Learn Res. 9, 2579-2605 (2008).
- van der Maaten, L. Accelerating t-SNE using Tree-Based Algorithms. J Mach Learn Res. 15, 3221-3245 (2014).
