Summary
慢性伤口是从糖尿病小鼠模型上的急性伤口发展，通过在全厚皮伤后诱导高水平的氧化应激。伤口用催化酶和谷胱甘肽过氧化物酶抑制剂进行治疗，导致皮肤微生物群中细菌的愈合和生物膜发育受损。
Abstract
慢性伤口的发展，由于在一个或多个复杂的细胞和分子过程中涉及适当的愈合有缺陷的调节。仅在美国，它们就影响 650 万人，每年成本为 400 亿英镑。尽管在了解慢性伤口如何发展人类方面已经投入了大量精力，但基本问题仍未得到解答。最近，我们开发了一种新的小鼠模型，用于具有许多人类慢性伤口特征的糖尿病慢性伤口。使用db/db-/-小鼠，我们可以在伤人后立即在伤口组织中诱导高水平的氧化应激（OS），使用与抗氧化酶催化酶特有的抑制剂的一次性治疗，从而产生慢性伤口。谷胱甘肽过氧化物酶。这些伤口具有高水平的操作系统，自然发展生物膜，在治疗后20天内完全慢性，可以保持开放超过60天。这种新颖的模型具有人类糖尿病慢性伤口的许多特征，因此可以大大有助于促进对伤口如何成为慢性的基本理解。这是一个重大突破，因为人类慢性伤口给患者带来严重的疼痛和痛苦，如果得不到解决，则导致截肢。此外，这些伤口非常昂贵和费时治疗，并导致患者个人收入重大损失。通过使用我们的慢性伤口模型，这一研究领域的进步可以显著改善数百万在这种衰弱条件下受苦的人的医疗保健。在这个协议中，我们非常详细地描述了导致急性伤口成为慢性伤口的程序，这是以前没有做过的。
Introduction
伤口愈合涉及复杂的细胞和分子过程，这些过程在时间和空间上受到调节，在顺序和重叠阶段组织，涉及许多不同的细胞类型，包括但不限于免疫反应和血管系统1.皮肤受伤后，因子和血细胞立即聚集到伤口部位，并启动凝血级联形成血块。平衡后，血管分裂，让进入伤口部位的氧气、营养物质、酶、抗体和化学因子，使多态细胞清除伤口床的异物碎片，并分泌蛋白解酶2.激活的血小板分泌各种生长因子，以刺激伤口边缘的角蛋白细胞，使受伤区域重新上皮。被招募到伤口部位的单核细胞分化成巨噬细胞，其中噬菌体和死中性粒细胞和分泌其他因素，以保持角蛋白细胞增殖和亲迁移信号。在增殖阶段，在继续再上皮化的同时，由成纤维细胞、单核细胞/巨噬细胞、淋巴细胞和内皮细胞组成的新的造粒组织继续重建过程2。血管生成通过促进内皮细胞增殖和迁移来刺激，导致新的血管发育。细胞外基质的分体化和改造为环境设置了屏障。当伤口愈合和造粒组织演变为疤痕时，凋亡可消除炎症细胞、成纤维细胞和内皮细胞，而不会造成额外的组织损伤。成纤维细胞重塑细胞外基质的各种成分（如胶原蛋白）增强了组织的拉伸强度，使新形成的组织几乎与未受伤的皮肤2一样强壮和灵活。
任何偏离这种高度协调的进展到伤口关闭导致受损和/或慢性伤口3。慢性伤口的特点是氧化应激增加，慢性炎症，微血管受损，伤口中胶原蛋白基质异常。氧化应激，特别是在伤口，可以延迟伤口封闭2，5。当伤口愈合的第一阶段，炎症阶段变得不受管制时，宿主组织由于炎症细胞5的不断涌入而承担广泛的损害，释放细胞毒性酶，自由氧基增加，以及不受监管的炎症介质，导致细胞死亡6，7。
在这个破坏性的微环境中，生物膜形成细菌利用宿主营养物质，导致宿主组织2的损害。这些生物膜难以控制和去除，因为由蛋白质、DNA、RNA 和多糖组成的水合物细胞外聚合物物质使体内的细菌能够对传统抗生素疗法具有耐受性，并避开宿主的先天和适应性免疫反应2，8，9。
研究慢性伤口至关重要，因为它们影响650万人，仅在美国每年就花费400亿美元。糖尿病患者增加了患慢性伤口的风险，需要截肢以遏制感染的传播。这些患者在截肢后5年内有50%的死亡风险，这归因于糖尿病11的病理生理学机制。宿主的免疫系统和伤口愈合中的微生物群之间的关系是正在进行的研究的一个重要课题，因为慢性伤口的后果，如果得不到解决，包括截肢和死亡12。
尽管在了解慢性伤口如何发展人类方面已经投入了大量精力，但慢性伤口是如何形成的，为什么形成，目前还不清楚。研究受损愈合机制的实验很难在人类身上进行，伤口愈合专家只能看到慢性伤口患者已经达到慢性数周到数月。因此，专家无法研究哪些过程出错，导致伤口发展成慢性2。缺乏能够概括人类慢性创伤复杂性的动物模型。直到我们的模型被开发，没有慢性伤口研究模型存在。
慢性伤口模型是在瘦素受体（db/db-/--）13中发生突变的小鼠身上开发的。这些小鼠肥胖，糖尿病，有损伤愈合，但不开发慢性伤口14。血糖水平平均在200毫克/分升左右，但可以高达400毫克/分升15。当伤口组织中高水平的氧化应激（OS）在伤伤后立即诱发时，伤口就变成慢性16。db/db-/-伤口在20天内被认为是慢性的，并且保持开放60天或更长时间。细菌产生的生物膜在伤人后三天开始发育;成熟的生物膜在伤后20天可见，并持续到伤口关闭。我们在这些小鼠中发现的生物膜形成细菌也存在于人类糖尿病慢性伤口中。
氧化应激是通过两种抗氧化酶抑制剂，即催化酶和谷胱甘肽过氧化物酶来治疗伤口，这两种酶具有分解过氧化氢的能力。过氧化氢是一种活性氧，通过蛋白质、脂质和DNA的氧化会导致细胞损伤。催化过氧化氢分解成危害较少的化学物质氧和水。3-Amino-1，2，4-triazole （ATZ） 通过专门和共价地结合酶的活性中心来抑制催化酶，使其17、18、19起灭活。ATZ一直被用来研究氧化应激在体外和体内通过抑制催化酶20，21，22，23，24的影响。谷胱甘肽过氧化物酶通过抗氧化剂谷胱甘肽催化过氧化氢的减少，是保护细胞免受氧化应激的重要酶25。Mercaptosuccinic酸（MSA）通过与酸醇酶的selenocystein活性位点结合来抑制谷胱甘肽过氧化物酶，使其26日失活。MSA已用于研究氧化应激在体外和体内以及20，27，28的影响。
这种新型慢性伤口模型是一个强大的研究模型，因为它与人类糖尿病慢性伤口观察到的许多相同特征相同，包括由于OS增加引起的长期炎症和皮肤微生物群形成的天然生物膜。伤口有损皮肤-表皮相互作用，异常基质沉积，血管生成不良和血管受损。雄性小鼠和雌性小鼠都会出现慢性伤口，因此两性都可用于研究慢性伤口。因此，慢性伤口模型可以大大有助于促进对此类伤口如何开始的基本理解。使用这种慢性伤口模型可以回答有关如何通过受损伤口愈合的生理学和宿主的微生物群的贡献来启动/实现慢性的基本问题。
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Protocol
所有实验均按照联邦法规完成，加州大学加州大学河滨分校IACUC批准了相关政策和程序。
1. 动物
- 使用糖尿病和肥胖的B6。BKS（D）-用于慢性伤口模型的Leprdb/J小鼠。购买选项包括用于繁殖的异质动物或直接用于实验的同源物。
- 繁殖异质动物雄性和雌性，以产生后代。统计上，只有四分之一的垃圾会长成糖尿病和肥胖症（db/db-/-）。
- 出生3周后，与它们的幼崽一起，将和家-db/db----小鼠一起。分离db/db-/-小鼠在出生后5周与其他db/db-/--小鼠一起，并与其他db/db-/-小鼠一起，直到它们5-6个月大，可用于慢性伤口模型。在此期间，成熟和复杂的皮肤微生物群可以发展。
注： db/db-/-小鼠很容易从3-5周之间的垃圾伴侣中直观地识别。db/db-/-小鼠肥胖，患有糖尿病，并且会比野生型和杂物类小杂物大得多和圆。他们的腹部可能显得稍微粉红，他们的臀部更大。增加的重量应在手术前确认。此外，还可以测量血液中的高血糖水平，并测量小鼠的基因型，以确认瘦素受体的突变。
2. 活体和畜牧业
- 房子db/db-/-小鼠在传统的活体（不是屏障/特定的病原体无设施），以便可以在db/db-/-小鼠的皮肤上建立微生物群落。要特别模拟长期受伤的人类，不要采取特别预防措施来防止接触病原体。
- 用微型隔离器顶部保护笼子，以尽量减少感染在活体内的传播。每周用新床上用品换两次笼子，用常规的活体饲料给老鼠喂食。请勿将床上用品或食物高压灭菌。
- 将室温设置为 21 至 24°C 之间，根据一年中的时间有轻微波动。湿度，反映气候和位置，将介于19至70%之间。
3. 慢性伤口发展的要求
- 只使用雄性小鼠和雌性小鼠，其表象型肥胖，糖尿病，和至少5-6个月大，为慢性伤口的发展。这些小鼠的重量应在40-80克之间变化，平均约60克。
- 不要使用被认为肥胖但体重小于50克的小鼠。
注：除非另有说明，否则此协议中提及的所有小鼠均通过此处描述的资格。
4. 脱毛化妆水的剃须与应用
注意：在受伤前，在鼠标的两头去除不需要的头发。以下程序在手术前一天未处于麻醉状态的活db/db---小鼠上完成。采取预防措施，以防止压力和伤害动物。
- 剃 须
- 将鼠标放在干净的表面上，用拇指和第二根手指抓住鼠标尾部，以固定鼠标的位置。鼠标可能会跳跃或突然移动;如果是，请迅速做出响应，并拉回夹子以防止受伤。
- 用剪发器剪下鼠标的头发 （图1A， 1B）。将刀片与鼠标皮肤平行放置，并将整个背部从颈部到尾部（包括尾部周围）进行整次刀切，以留出足够大的表面面积，以放置透明的薄膜敷料（参见材料表）。轻轻运行刀片对头发生长的方向，为最有效的切割。（图1B）
- 请勿将刀片深压到皮肤中，因为它可能会因擦伤或割伤而损坏皮肤。
- 脱毛化妆水的应用
注：使用脱毛化妆水获得非常光滑的皮肤，以便透明敷料可以牢固地粘附。- 用水浸泡小鼠皮肤，防止化学烧伤，轻轻按一个浸湿的纸擦拭到被刮过的皮肤上，用足够的压力将已经剪掉的头发湿到皮肤上。
- 当皮肤是湿的，轻轻擦鼠标的皮肤与一个小娃娃脱毛化妆水（见材料表）15-20s（图1C，1D）。将化妆水完全铺在头发剪短的地方。如果鼠标较大，请使用更多化妆水。
- 请勿在鼠标、尾巴或面部附近的任何位置涂抹化妆水。如果化妆水耳朵或尾巴上，只需用湿纸擦拭，直到下皮。如果化妆水在鼠标表面，请立即在水龙头下清洗鼠标或去离子水，以防止对眼睛、鼻子和嘴的损害。
- 应用后，让化妆水与头发发生反应20-45s。
- 在进行下皮之前，用戴手套的手指或细金属铲轻轻擦去不同部位皮肤上的化妆水（图1E），检查脱毛反应的完成情况。如果皮肤是粉红色的，没有黑头发，反应是完整的。最好在洗头之前快速检查头发是否已被去除，而不是过早洗去，然后不得不再次涂抹化妆水。
- 冲洗
注：一旦完成脱毛反应，验证后，用运行水龙头或去离子水清洗鼠标，以去除脱毛化妆水并防止化学烧伤。- 将鼠标放在左侧戴手套的手上，用左手拇指将尾巴底部按在手掌上，以防止鼠标四处移动。关闭并拉直左指的其余部分，以防止鼠标咬住。
- 放置鼠标，使脸/头区域远离水流，温水流可能落在头部后面，只能落在后面。快速但轻轻地用右手戴手套擦鼠标的背面，以洗去化妆水。
- 一旦鼠标的皮肤没有化妆水，用纸巾快速擦拭鼠标以吸收大部分水（图1F）。
- 剃须和脱毛后护理
- 用湿纸擦拭检查并清洁可能留在耳朵和尾部的任何残留脱毛化妆水。
- 将鼠标放回其单独的笼子中，并将笼子放在加热垫（40-45 °C）上约 30 分钟。鼠标应该回到正常的行为，匆匆忙忙，并整理自己在几分钟内。
- 在整个实验过程中，将每只老鼠关在一个单独的笼子里。老鼠的皮肤不再受到保护，很容易被其他老鼠咬伤和咬伤。
- 由于脱毛化妆水可能具有轻微的刺激性作用，可能会干扰或改变伤口愈合过程，在手术前等待 18-24 小时，让小鼠皮肤平静下来，让小鼠适应背部缺乏毛发。
- 去除皮肤与深色色素去除头发
注意：一些db/db-/-小鼠在皮肤上可能有暗斑，使头发比没有这些斑块的皮肤长得更快、更强壮。（图2A）这些黑暗的皮肤区域显得较暗的颜色，由于中晚期的发泡和/或色素失禁29，30。- 如果发现暗斑，请再次应用脱毛化妆水，但仅在这些区域，并重复步骤 4.2 和 4.3（图 2B，2C）。
注意：在实验期间，皮肤的深色斑块会更快地长出头发，因此，必要时，每3-5天剪一次短发。一两个补丁远离伤口的所需位置是可以接受的。如果鼠标的背面明显被这些暗斑覆盖，请勿将鼠标用于慢性伤口模型。
- 如果发现暗斑，请再次应用脱毛化妆水，但仅在这些区域，并重复步骤 4.2 和 4.3（图 2B，2C）。
5. 试剂设置
注：db/db-/-小鼠的慢性伤口发展是通过治疗催化酶和谷胱甘肽过氧化物酶、3-氨基-1，2，4-三甲酶（ATZ）和甲氨基辛酸（MSA）的特异性抑制剂来完成的，分别16.以下程序详细说明了根据小鼠重量的麻醉和抑制剂的剂量和给药。
- 在无菌PBS中，在0.05mg/kg小鼠中注射止痛剂Buprenex。在手术前约30分钟为60克小鼠注射120μL的体积。手术后6小时施用另一剂。根据需要可以给予额外的剂量。
- 在无菌PBS中，在1克/千克小鼠下注射ATZ内腹。在手术前约20分钟为60克小鼠注射480μL的体积。将一半的体积注入腹部左侧，另一半在右侧。
- 在无菌PBS中，以150mg/kg小鼠在透明敷料和伤口组织之间的伤口上局部地沉积MSA。手术后10分钟内，为60克小鼠管理60μL的体积。
6. 外科
注：慢性伤口模型的成功依赖于非无菌条件。这些小鼠不是无细菌的，被安置在传统的活体室中。在使用抗氧化剂酶抑制剂治疗后，存在于皮肤中的细菌微生物群对慢性伤口的后续启动和发展至关重要。因此，传统的手术前准备是相反的。
- 腹内注射
- 将鼠标固定在笼架倾斜部分，用鼠标舒适地站立，头部低于鼠标主体，握住尾巴。这确保我们尝试将内部器官尽可能远离注射点。
- 将针头插入腹部右下象限，以避免注射到膀胱或其他腹部器官。
- 注射前吸气针头。
- 治疗和麻醉
- 如步骤 5.1 和 5.2 所述，在手术前 30 分钟管理 Buprenex 和 ATZ 20 分钟。
- 如图3A所示，将鼠标放在一个小塑料容器中，放在暖加热垫的顶部约15-20分钟。
- 将纸巾或纸巾放在小容器顶部，以更好地控制热量。老鼠在变暖时应该冷静下来。图 3B显示手术所需的材料。
- 如果使用开放式系统，将鼠标放在连接到化学罩中的子烟气蒸发器的封闭容器中。
- 在开放式系统中，以 2-3.5 L/min 的流速管理 5% 的异常鲁兰 1-2 分钟。
- 一旦小鼠失去知觉或不再移动，将鼠标放在白色手术垫上，用鼻锥固定到蒸发器上，以便在手术期间持续给地胶进行给放。
- 在开放式系统中，在手术过程中以相同的流速施用2-3%异苯二苯，并调整异苯二苯的流量以保持麻醉深度。
- 尽量减少手术期间施用的胶质的浓度和持续时间。db/db-/-小鼠对麻醉非常敏感，因此最好将异常接触保持在最低限度。如果小鼠在5%的分子胶2分钟后仍然有反应，在开始手术前固定鼻锥并施用3-5%的分糖。
- 在受伤前确认适当的麻醉。麻醉深度因对身体刺激（如强脚趾捏）缺乏反应而得到证实。吸入麻醉小鼠的时间长度低于5分钟，因此没有兽医药膏应用于眼睛。
- 伤
- 用70%乙醇或临床乙醇毛巾喷洒纸巾，擦拭鼠标背面，清洁伤口部位。清洁皮肤表面，使透明敷料能够牢固地粘附，因为床上用品、食物或皮肤的灰尘可以防止敷料正确粘附（图4A）。不要过度擦拭，否则会有杀死皮肤上细菌的风险。
- 确定伤口部位的位置。最好的伤口表现的地方是在鼠标的背侧，居中，远离具有较高色素沉着的皮肤斑块。
注：根据经验，我们确定这些小鼠只能承受一个伤口的负担。 - 使用 7 mm 皮肤活检冲床、钳子和手术剪刀在 30-45 秒内创建伤口。轻轻将活检冲压到所需的伤口部位，将冲孔拧到足够深处，以留下对冲孔的轻微印象（图 4B）。用钳子拉起拳头的中心，用手术剪刀沿着轮廓切割轮廓，从而去除轮廓的皮肤（图4C-4E）。
- 用半块透明薄膜敷料（6 厘米 x 3.5 厘米）牢固地盖住伤口。
- 停止给鼠标使用 2% 的分路胶（图 4F）。
7. 术后治疗和恢复
- 手术后进行MSA治疗，并如步骤5.3所述应用透明敷料。将 MSA 沉积到敷料下的伤口区域。
- 将鼠标放回加热垫上的小容器中 30 分钟，以帮助恢复。一旦鼠标预热，将鼠标放回笼子。胶质的作用是暂时的，不久之后鼠标应该会移动。
- 不要让老鼠无人看管，也不要将它们送回活体室，直到小鼠恢复足够的意识以维持严重性。
注：与这些小鼠一起工作时选择的麻醉是除胶，正是因为其快速诱导和随后出现麻醉。- 单独接受手术的室内小鼠，以避免一只老鼠干扰另一只老鼠的慢性伤口。如上所述，在完全恢复之前，它们不会返回活体室。
- 手术后6小时，施用第二剂布普伦ex。
- 手术后前48小时仔细观察小鼠。
注：手术，加上产生慢性伤口的抑制剂，对已经患有糖尿病和肥胖的动物来说压力很大。手术后头几天存活的老鼠通常会在实验期间存活下来。
8. 数据收集、生存策略、受伤后处理小鼠和其他提示
- 数据采集
- 手术后尽早拍照。生物膜在伤人后5-10天和3天之间观察到。
- 如果细菌是分析的重点，在-80°C时，用轻压在伤口周围滚动无菌交换，将拭子储存在适当的冷冻介质中，用于培养或干燥，无需任何培养基分析培养。通过无菌金属铲将细胞外聚合物物质收集到微离心管中，并在-80°C下储存，然后再进行分析。
- 在处理生物膜收集或拍照时，请勿给小鼠进行麻醉。在这些过程中，在鼠标前面放置一块食物，使鼠标平静下来，防止它跑掉。大多数老鼠会爬到食物上面，坐在食物上，不动。
- 由于继发性感染和意外的慢性伤口或溃疡可以发展，如果小鼠没有正确移动或如果敷料未正确应用，定期检查小鼠和腹腔侧的疼痛活动。皮肤和湿床上用品之间的摩擦（db/db-/-小鼠是多尿）可能会干扰皮肤，如果笼子不经常更换。
注：敷料下的液体积聚会导致胶粘剂失去粘性，使液体泄漏。死皮细胞、床上用品和粪便物质可以粘在皮肤上并变硬。皮肤上的这些干燥的斑块和骨料应及时清除，以防止继发感染。 - 如果老鼠站立或坐在后腿上，将这些老鼠移到笼子里，在那里获得食物和水的机会要低得多。如果笼子里的食物和水的位置很高，老鼠可以站立或坐在后腿上到达它。大多数老鼠在手术前进食和饮水不会有问题，尽管有些老鼠有可能翻到背上。这些"翻盘者"可能很难翻身，因此他们需要帮助和进一步监测。
- 如果皮肤没有碎屑、薄片皮肤和头发，则将透明敷料留在皮肤上长达 20 天。如果其中任何一种发生在皮肤上，请取下旧敷料并涂抹新敷料。
- 要脱下敷料，请轻轻捏紧头部后面的皮肤，然后以平稳的动作将敷料从头部拉开。
- 要牢固地放置一块敷料，请让鼠标尽可能静止。重要的是，皮肤是干净的，没有片状的死皮细胞，灰尘从床上用品，和食物片。放置，然后将敷料压入伤口周围的皮肤以固定。
- 如果把一块食物放在鼠标前面不限制其运动，那么将鼠标放在铁丝笼的顶部。一旦鼠标抓住笼子上的栏杆，将尾巴尽可能靠近身体，以最小的力拉住。当鼠标向前拉时，背部将伸展和拉直，便于应用;此时，将敷料牢固地放置。
- 切勿重复使用旧敷料。始终在背面应用新修整，以获得最大的附着力。
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Representative Results
图5描述了一个伤口的例子，即没有治疗抑制剂进入伤口闭合状态，而治疗抑制剂的伤口则走向慢性。透明敷料留在慢性伤口上，以便可以看到生物膜和液体积累。
慢性伤口启动发生在不到6小时，伤口边缘明显改变从氧化应激。这种伤口边缘的组织学证据表明，组织是坏死的，不会参与伤口愈合。伤口中形成生物膜的细菌以后可以利用这种坏死组织作为营养源和结构成分来生产生物膜。慢性伤口是一种保持开放的伤口，与最初的伤口相比扩大，含有生物膜（EPS加上人类慢性伤口中的致病细菌），需要一个月或几年的时间才能愈合，具体取决于防止生物膜的量和含量伤口从正常解决。在慢性伤口模型中，完全慢性设置为手术后20天，因为未用抑制剂治疗的伤口将在此时间关闭（图5）。愈合通常需要超过60天，时间取决于伤口中存在的主要致病菌。有时，当更具攻击性的生物膜形成细菌（如伪多尼丝）在伤口中占主导地位时，老鼠可能会屈服于感染。因此，慢性伤口被定义为在20天内不会愈合的伤口，需要60天以上才能愈合，伤口上存在生物膜。
性别差异已经发现在各种糖尿病模型，包括db/db-/-小鼠模型32，33。虽然存在这种差异，但我们发现性不是慢性伤口发展的一个重要因素。雄性小鼠和雌性小鼠的慢性伤口发展程度相似，因此两性都可用于研究慢性伤口。因此，利用这个模型是有利的，因为人类慢性伤口可以在男性和女性糖尿病患者身上找到。
图 1.剃须和脱毛过程。（A） 剃须前的鼠标.（B） 将鼠标的皮肤进行毛光，以去除背部的大部分毛发。（C） 指尖上化妆水的脱毛。如果鼠标较大，则使用更多。（D） 鼠标的背面覆盖着脱毛化妆水，并留下作出反应。（E） 用铲子刮掉一些化妆水，看头发是否被拔掉。明亮的粉红色皮肤没有任何头发的存在表明脱毛是完整的。（F） 背面的化妆水用自来水去除。鼠标的皮肤应略为粉红色。这个数字已由金和马丁斯-格林31修改。请点击此处查看此图的较大版本。
图 2.去除黑皮肤小补丁的头发。（A） 老鼠已经治疗过一次，皮肤又湿了，以防烫伤。（B） 脱毛化妆水只涂抹在皮肤的暗、有浓密头发的皮肤上。（C） 化妆水在反应后被洗掉，露出没有头发的皮肤黑斑。这个数字已由金和马丁斯-格林31修改。请点击此处查看此图的较大版本。
图 3.手术前设置。（A） 受伤的老鼠被放置在加热垫顶部的小塑料容器中。（B） 显示一些用于手术的材料。手术剪刀需要锋利，以确保皮肤在切割时不会被压碎。透明敷料切成两半。这个数字已由金和马丁斯-格林31修改。请点击此处查看此图的较大版本。
图 4.使切除伤口。（A） 小鼠麻醉后，用70%乙醇擦拭一次鼠标的背部。（B） 皮肤活检打孔放在鼠标背面，按得足够用力，给人留下深刻印象。活检冲孔可以旋转，使一个浅切口。（C） 轮廓区域的中间用钳子夹住，用锋利的手术剪刀进行初始切口。（D）手术剪刀纵，沿活检冲床的轮廓切割。（E） 活检泵所勾勒的皮肤区域被成功切除.（F） 透明敷料位于鼠标背面并固定。这个数字已由金和马丁斯-格林31修改。请点击此处查看此图的较大版本。
图 5.伤口的照片（A） 手术后，小鼠的伤口在手术后连续进入慢性状态。生物膜最早可在第5天看到，最早在第3天就检测到。伤口完全慢性与强大的生物膜在第20天。（B） 人类慢性伤口的例子，特别是糖尿病足溃疡。这个数字已由金和马丁斯-格林31修改。请点击此处查看此图的较大版本。
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Discussion
一旦在小鼠身上形成慢性伤口，该模型可用于研究慢性开始过程中受损的伤口愈合过程。该模型还可用于测试各种化学品和药物的疗效，这些化学物质和药物可以逆转慢性伤口发育和受损愈合，并导致伤口闭合和愈合。可以研究慢性发病后的不同时间点：例如，在慢性早期发病后受伤的第1-5天，以及20天及以后的全身性慢性伤口。
慢性伤口模型也是研究伤口愈合和并发症（如生物负担和隐匿性）的有力模型。生物负担只是慢性伤口的许多方面之一，可以在这个模型中研究，因为它也影响人类慢性伤口。我们的程序和动物使用协议清楚地确定了要监测的症状，以及定义的监测计划。根据IACUC核准的标准，被确定为病态的动物被安乐死，以避免重大痛苦。此外，当出现某些症状时，请咨询校园兽医和动物卫生技术员，并在评估标准时提供支持性指导。
协议中的关键步骤包括将db/db-/-小鼠安置在常规活体中，用脱毛化妆水去除头发，并在非脱胶给给之前加热。慢性伤口模型中慢性伤口的发展依赖于非无菌条件和做法。这些小鼠没有细菌，不会在非常干净的活体中生长。使用抗氧化酶抑制剂治疗后，存在于皮肤中的微生物群对于慢性伤口的后续启动和发育至关重要。这些db/db-/-小鼠必须暴露于含有细菌的环境，包括共体细菌和致病性细菌。如果在手术前用碘或其他防腐剂方法清洁和消毒皮肤，以便"消毒"皮肤，伤口可能不会成为慢性。皮肤微生物群中的细菌是生物膜形成和发展所必需的，延缓愈合和伤口闭合。在诊所中，伤口中生物膜的存在使伤口愈合过程更加复杂，如果伤口感染得不到控制，则增加人类截肢的风险。
去除脱毛化妆水的头发是去除多余的头发，使透明敷料保持光滑和干净的表面的重要一步。该协议中使用的脱毛化妆水是一种化学脱毛，添加了芦荟，以尽量减少烧伤。本产品在改变皮肤形态以及保存皮肤微生物群方面起码。材料表中列出的产品推荐比其他脱发产品，包括物理和机械脱毛剂（蜡和商业脱毛剂），可以进一步烧伤和拖拽皮肤和/或杀死皮肤微生物群。即使这种化学脱毛是物理温和的，它仍然可以轻微刺激皮肤，一个效果，可能会改变伤口愈合过程。因此，在手术前等待18-24小时，让皮肤从手术中恢复，并确保皮肤和伤口不受手术影响，这是最有效的。
这些小鼠非常温顺，对压力无反应。它们很容易处理没有麻醉。他们足够冷静，可以放在手掌上或长凳上，而不会逃跑。如果用拇指和第二根手指固定鼠标的尾部，则由于腹部尺寸较大，小鼠将无法逃跑或回头咬人。重要的是，根据我们的经验，这些小鼠对麻醉极其敏感，特别是因为它与平衡的丧失有关。因此，与我们的IACUC协商，确定更好的选择是限制麻醉管理。
此模型的主要目的是在其背部创建一个无法愈合的大伤口，因此，一旦伤口被制成，通常握住鼠标，使 IP 注射额外的 buprenex 或其他化学治疗定期是不可能的。如果以这种传统方式握住鼠标，则靠背皮握住鼠标会引起很多不适，而且很可能疼痛;因此，所有注射与鼠标右侧向上，而它是站在所有四英尺。其他利用db/db-/-菌株的实验使用这些小鼠，当它们年轻且重量不重时，可以使用传统的 IP 注射方式。由于慢性伤口模型利用6个月以下的小鼠，这些小鼠可以重达80克，传统的方法不是最佳方法，并可能伤害小鼠。我们已经使用上述方法小鼠这种肥胖，并没有观察到任何不良的结果，当注射这种方法与成功的愿望。
以前，使用注射麻醉剂，如氯胺酮和西拉津;然而，他们证明很难与db/db-/-小鼠一起使用。总操作时间少于5分钟时，对于实验来说，不需要长时间的感应和恢复时间。由于易于给药和滴定、快速发病和恢复以及足够的麻醉深度，异曲氏被确定为此种手术的麻醉选择。此外，二苯还引起最小的心脏抑郁，并保持BP非常好34。因此，慢性伤口模型的一个主要变化是使用无卢兰作为首选麻醉。
手术前的加热对于预防手术后2-3天的死亡率非常重要。这些小鼠的核心体温明显降低35，由于基因操作，无法有效控制其核心体温，因此在手术前提供了外部加热源，以预防麻醉引起的核心体温进一步下降。在手术之前、期间和手术后，我们评估了是否需要加热垫。需要注意的是，db/db-/-小鼠有不寻常的生理反应。经验上，我们发现这些小鼠在手术前和手术后的热支持下得到最有效的保护。通过用异二苯代替麻醉剂，我们测量并确定在手术不到五分钟内核心体温没有明显下降。虽然我们发现手术前和手术后的热支持对这些小鼠至关重要，但我们尚未发现手术热支持有效果。应当指出，IACUC主席提供了指导和监测我们与温度和麻醉效果有关的测试。当我们传达此方法时，我们发现指出该过程成功所需的内容非常重要。
利用这种方法研究生物膜发育的一个局限性是伤口上存在的细菌和生物膜的产生不受控制。如果要研究特定的生物膜形成细菌，如果可以通过碘或其他防腐剂方法在伤人之前消灭原生微生物群，则该模型可能很有用。为了应对过高的氧化应激，刺激皮肤微生物群中的关键致病菌启动生物膜形成。在我们的慢性伤口中，生物膜形成细菌包括但不限于，伪多莫纳斯阿鲁吉诺萨36，37，38，39，肠杆菌37， 38,39，和各种葡萄球菌40，41和哥林杆菌物种41，42，43，44，45，所有这些都可以在人类慢性伤口中找到。已对细菌39、40、41、43、44、45的人类慢性伤口进行了若干慢性伤口微生物学研究，和真菌46，47个社区，包括纵向调查与不良愈合48，49。这种性质的纵向研究也可以通过慢性伤口模型进行。
重要的是要承认，由于数据库条件、供应品和设备、供应商和db/db-/-小鼠的来源殖民地的不同，可能会获得不同的结果。为了尽量减少这种差异，协议中提供了用于慢性伤口实验的小鼠的确切种类和来源。对于这些小鼠的饲养，在材料表中提供了确切的床上用品和食品品牌，以限制变异性。在我们的实验中，我们发现高氧化应激是必要的，并且足以在这些小鼠中造成慢性伤口，只要这些小鼠被安置在常规的活体中并暴露于细菌中。细菌种群和社区可能因活体而异;然而，只要没有无菌设施不用来容纳小鼠，它们就应该有足够的细菌，包括共体和致病菌，以存在于头发和皮肤上。
此协议中这种创建慢性伤口的方法对于研究慢性伤口和受损的伤口愈合具有重要意义，因为只有氧化应激水平在实验中显著改变。正常伤口愈合过程2需要氧化应激。它是重要的及时调节和细胞的功能，必要的伤口愈合5的关键组成部分。然而，当氧化应激水平不受控制时，活性氧物种会损害内皮细胞，抑制角蛋白细胞功能，并延缓伤口闭合2、5。人类慢性伤口有高水平的氧化应激50。小鼠模型具有高血糖，并且由于其发病率，氧化应激水平已经增加。这些特征与糖尿病患者共同使用，并提供一个微环境，有利于慢性后，受伤50。人类在身体的许多部位，包括皮肤，也携带各种复杂的微生物群，因此，在小鼠的皮肤上可以形成复杂但自然的微生物群。
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Disclosures
提交人宣称，他们没有相互竞争的经济利益。
Acknowledgments
作者没有承认。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| B6.BKS(D)-Leprdb/J | The Jackson Laboratory | 00697 | Homozygotes and heterozygotes available |
| Nair Hair Remover Lotion with Soothing Aloe and Lanolin | Nair | a chemical depilatory | |
| Buprenex (buprenorphine HCl) | Henry Stein Animal Health | 059122 | 0.3 mg/ml, Class 3 |
| 3-Amino-1,2,4-triazole (ATZ) | TCI | A0432 | |
| Mercaptosuccinic acid (MSA) | Aldrich | 88460 | |
| Phosphate buffer solution (PBS) | autoclave steriled | ||
| Isoflurane | Henry Schein Animal Health | 029405 | NDC 11695-6776-2 |
| Oxygen | Tank must be compatible with vaporizing system | ||
| Isoflurane vaporizer | JA Baulch & Associates | ||
| Wahl hair clipper | Wahl | Lithium Ion Pro | |
| Acu Punch 7mm skin biopsy punches | Acuderm Inc. | P750 | |
| Tegaderm | 3M | Ref: 1624W | Transparent film dressing (6 cm x 7 cm) |
| Heating pad | Conair | Moist Dry Heating Pad | |
| Insulin syringes | BD | 329461 | 0.35 mm (28G) x 12.7 mm (1/2") |
| 70% ethanol | |||
| Kimwipes | |||
| Tweezers | |||
| Sharp surgical scissors | |||
| Thin metal spatula | |||
| Tubing | |||
| Mouse nose cone | |||
| Gloves | |||
| small plastic containers |
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