Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Medicine
Click here for the English version

Medicine

Protokol til at skabe kroniske sår i diabetiske mus

Published: September 25, 2019 doi: 10.3791/57656
Automatic Translation
1, 1
1Department of Molecular, Cell and Systems Biology, University of California, Riverside

Summary

Kroniske sår er udviklet fra akutte sår på en diabetisk musemodel ved at inducerende høje niveauer af oxidativt stress efter en fuld-tykkelse kutane sår. Såret er behandlet med hæmmere for katalase og glutathion peroxidase, hvilket resulterer i nedsat heling og biofilm udvikling af bakterier til stede i hudens mikrobiome.

Abstract

Kroniske sår udvikler sig som følge af defekt regulering i en eller flere komplekse cellulære og molekylære processer, der er involveret i korrekt heling. De påvirker ~ 6,5 M mennesker og koster ~ $40B/år i USA alene. Selv om der er investeret en betydelig indsats i at forstå, hvordan kroniske sår udvikler sig i mennesker, forbliver grundlæggende spørgsmål ubesvarede. For nylig har vi udviklet en roman musemodel for diabetiske kroniske sår, der har mange karakteristika af menneskelige kroniske sår. Ved hjælp af DB/DB-/- mus kan vi generere kroniske sår ved at inducere høje niveauer af oxidativt stress (os) i sårvævet umiddelbart efter at have såret, ved hjælp af en engangs behandling med hæmmere, der er specifikke for antioxidant enzymerne katalase og Glutathion peroxidase. Disse sår har høje niveauer af OS, udvikler biofilm naturligt, bliver fuldt kronisk inden for 20 dage efter behandling og kan forblive åben mere i mere end 60 dage. Denne nye model har mange funktioner af diabetiske kroniske sår hos mennesker og kan derfor bidrage væsentligt til at fremme grundlæggende forståelse af, hvordan sår bliver kronisk. Dette er et stort gennembrud, fordi kroniske sår hos mennesker forårsager betydelig smerte og angst for patienter og resultere i amputation, hvis uløste. Desuden er disse sår er meget dyre og tidskrævende at behandle, og føre til betydelige tab af personlig indkomst til patienter. Fremskridt inden for dette område af undersøgelsen gennem brug af vores kroniske sår model kan betydeligt forbedre sundhedspleje for millioner, der lider under denne invaliderende tilstand. I denne protokol beskriver vi i detaljer proceduren for at forårsage akutte sår for at blive kroniske, hvilket ikke er sket før.

Introduction

Sårheling involverer komplekse cellulære og molekylære processer, der er timeligt og rumligt reguleret, organiseret i sekventielle og overlappende stadier, der involverer mange forskellige celletyper, herunder men ikke begrænset til immunresponset og det vaskulære system1. Umiddelbart efter huden opretholder en skade, faktorer og blodlegemer aggregeret til sårstedet og indlede koagulations kaskade til dannelse af en blodprop. Efter homeostase er opnået, blodkarrene spile til at lade ind i sårstedet ilt, næringsstoffer, enzymer, antistoffer og kemiske faktorer, der chemoattract polymorphonukleocytter at rydde sårsengen af fremmedlegemer og udskille Proteolytiske enzymer 2. aktiverede trombocytter udskiller en række vækstfaktorer for at stimulere keratinocytterne ved sårkanten for at re-epitelialisere det sårede område. Monocytter rekrutteret til sårstedet differentiere i makrofager som fagocytose bakterier og døde neutrofiler og udskiller yderligere faktorer for at opretholde keratinocyt proliferativ og promigrerende signaler. I sprednings fasen, mens re-epitelialisering fortsætter, nye granulations vævet består af fibroblaster, monocytter/makrofager, lymfocytter, og endotelceller fortsætter genopbygningen2. Angiogenese stimuleres ved at fremme endotelcelleproliferation og migration, hvilket resulterer i ny fartøjs udvikling. Epitelialisering og Remodeling af den ekstracellulære matrix konstruere en barriere mod miljøet. Da såret heler og granulering væv udvikler sig til et ar, apoptose eliminerer inflammatoriske celler, fibroblaster, og endotelceller uden at forårsage yderligere vævsskade. Den trækstyrke af vævet forstærkes af fibroblaster remodeling forskellige komponenter i den ekstracellulære matrix, ligesom kollagen, således at den nydannede væv er næsten lige så stærk og fleksibel som usåret hud2.

Enhver afvigelse fra denne stærkt samordnede progression mod sårlukning fører til forringet og/eller kroniske sår3. Kroniske sår er karakteriseret ved øget oxidativt stress, kronisk inflammation, beskadiget microvaskulatur, og unormal kollagen matrix i såret4. Oxidativ stress, især i såret, kan forsinke sårlukningen2,5. Når, i den første fase af sårheling, den inflammatoriske fase bliver ureguleret, værts vævet antager omfattende skader på grund af en kontinuerlig tilstrømning af inflammatoriske celler5 , der frigiver cytotoksiske enzymer, en stigning i frie ilt radikaler, og ureguleret inflammatoriske mediatorer, resulterer i celledød6,7.

I denne destruktive mikromiljø, biofilm-dannende bakterier drage fordel af vært næringsstoffer og bidrage til skaden af værts vævet2. Disse biofilmer er svære at kontrollere og fjerne, fordi de hydrerede ekstracellulære polymere stoffer, der består af proteiner, DNA, RNA og polysaccharider, gør det muligt for bakterier, der harkede sig, at være tolerante over for konventionelle antibiotika behandlinger og unddrage sig værtens medfødte og adaptive immunrespons2,8,9.

Studere kroniske sår er afgørende, fordi de påvirker ~ 6.500.000 mennesker og koste ~ $40.000.000.000 pr. år i USA alene10. Patienter med diabetes har øget risiko for at udvikle kroniske sår, der kræver amputation for at dæmme op for spredningen af infektion. Disse patienter har en dødelighed på 50% inden for 5 år af amputation, der tilskrives Patofysiologi mekanismen for diabetes11. Forholdet mellem værtens immunsystem og mikrobiomet i sårheling er et vigtigt emne for igangværende forskning, fordi følgerne af kroniske sår, hvis de ikke er løst, omfatter amputation og død12.

Selv om en betydelig indsats er blevet investeret i at forstå, hvordan kroniske sår udvikle sig i mennesker, det er stadig uklart, hvordan og hvorfor kroniske sår form. Eksperimenter til at studere mekanismerne i forringet healing er vanskeligt at foretage i mennesker, og sårheling specialister kun se patienter med kroniske sår, der allerede har nået kronisk i uger til måneder. Således, specialister er ude af stand til at studere, hvad processer gik galt, der fører såret til at udvikle sig til at blive kronisk2. Der er mangel på dyremodeller, der rekapitulerer kompleksiteten af menneskelige kroniske sår. Indtil vores model blev udviklet, fandtes der ingen model for kroniske sårstudier.

Den kroniske sårmodel blev udviklet i mus, der har en mutation i leptin receptoren (DB/DB-/-)13. Disse mus er fede, diabetisk, og har nedsat heling, men ikke udvikler kroniske sår14. Blodglukose niveauer gennemsnit omkring 200 mg/dL, men kan være så højt som 400 mg/dL15. Når høje niveauer af oxidativt stress (OS) i sårvævet induceres umiddelbart efter såret, bliver såret kronisk16. DB/DB-/- sår betragtes som kroniske ved 20 dage og forbliver åben i 60 dage eller mere. Biofilm produceret af bakterier kan ses udvikle begynder tre dage efter at have såret; en moden biofilm kan ses 20 dage efter såret og fortsætter indtil enten sår lukning. De biofilm-dannende bakterier, vi finder i disse mus, findes også i humane diabetiske kroniske sår.

Oxidativ stress induceres ved at behandle sårene med to hæmmere af antioxidant enzymer, katalase og glutathion peroxidase, to enzymer med kapacitet til at nedbryde hydrogenperoxid. Hydrogenperoxid er en reaktiv oxygen art og kan forårsage cellulære skader gennem oxidation af proteiner, lipider, og DNA. Catalase katalyserer nedbrydningen af hydrogenperoxid i mindre skadelige kemikalier ilt og vand. 3-amino-1, 2, 4-triazol (Atz) hæmmer katalase ved binding specifikt og kovalent til det aktive centrum af enzymet, inaktivere det17,18,19. Atz er blevet anvendt til at undersøge virkningerne af oxidativ stress både in vitro og in vivo gennem hæmning af katalase20,21,22,23,24. Glutathion peroxidase katalyserer reduktionen af hydrogenperoxid gennem antioxidant, glutathion, og er et vigtigt enzym, der beskytter cellen mod oxidativt stress25. Mercaptosuccininsyre (MSA) hæmmer glutathionperoxidase ved binding til det selenocystein aktive sted af enzymet med thiol, inaktivere det26. MSA er blevet anvendt til at undersøge virkningerne af oxidativt stress in vitro og in vivo samt20,27,28.

Denne nye model af kroniske sår er en kraftfuld model til at studere, fordi det deler mange af de samme funktioner observeret i humane diabetiske kroniske sår, herunder langvarig inflammation fra øget OS og naturlige biofilm dannelse fra huden mikrobiom. Sårene har svækket dermal-epidermal interaktion, unormal matrix deposition, dårlig angiogenese og beskadiget vaskulatur. Kroniske sår vil udvikle sig i både mandlige og kvindelige mus, så begge køn kan bruges til at studere kroniske sår. Derfor kan den kroniske sårmodel bidrage væsentligt til at fremme grundlæggende forståelse af, hvordan sådanne sår begynder. Ved hjælp af denne kroniske sår model kan give svar på grundlæggende spørgsmål om, hvordan forløb initieres/opnås gennem bidrag fra fysiologi af forringet sårheling og mikrobiome af værten.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Alle eksperimenter blev afsluttet i overensstemmelse og overholdelse af føderale regler og University of California politik og procedurer er blevet godkendt af University of California, Riverside IACUC.

1. animalske

  1. Brug diabetisk og fede B6. BKS (D)-LeprDB/J mus til den kroniske sårmodel. Købsmulighederne omfatter enten heterozygoter til avl eller homozygoter direkte til eksperimenter.
  2. Race heterozygote mænd og kvinder til at producere afkom. Kun en fjerdedel af Strøelsen, statistisk, vil vokse til at blive diabetisk og fede (DB/DB-/-).
  3. WEAN og House DB/DB-/- mus sammen med deres littermates 3 uger efter fødslen. Separate DB/DB-/- mus fra deres littermates 5 uger efter fødslen og hus med andre DB/DB-/- mus, indtil de er 5-6 måneder gamle og kan bruges til den kroniske sårmodel. I denne periode kan der udvikles et modent og komplekst hudmikrobiom.
    Bemærk: DB/DB-/- musene identificeres let visuelt fra littermates mellem 3-5 ugers alderen. DB/DB-/- mus er fede, er diabetisk, og vil være betydeligt større og rundere end den vilde type og heterozygot littermates. Deres mave kan forekomme lidt Pinker og deres hofter større. Øget vægt bør bekræftes før operationen. Det er også muligt at måle høje niveauer af glukose i blodet og genotype musen for at bekræfte mutationen i leptin receptoren.

2. vivarium og husdyrhold

  1. Hus DB/DB-/- mus i en konventionel vivarium (ikke en barriere/specifik patogen fri facilitet), således at en mikroflora kan etableres på huden af DB/DB-/- mus. For specifikt at modellere mennesker, der lider af kroniske sår, skal du ikke tage særlige forholdsregler for at forhindre udsættelse for patogener.
  2. Beskyt bure med Micro isolator toppe for at minimere spredningen af infektion i vivarium. Skift bure to gange om ugen med nyt sengetøj og fodre musene med regelmæssig vivarium Chow. Du må ikke autoklave hverken strøelse eller mad.
  3. Indstil rumtemperaturen til mellem 21 og 24 °C med mindre udsving afhængigt af tidspunktet på året. Fugtigheden, reflekterende af klimaet og placering, vil variere mellem 19 og 70%.

3. krav til udvikling af kroniske sår

  1. Brug kun mandlige og hunmus, der er phenotypisk fede, diabetisk, og mindst 5-6 måneder for udviklingen af kroniske sår. Vægten af disse mus bør variere mellem 40-80 g, gennemsnit omkring 60 g.
  2. Brug ikke mus, der anses for fede, men vejer mindre end 50 g.
    Bemærk: alle mus, der henvises til i denne protokol, videregiver de her beskrevne kvalifikationer, medmindre andet er angivet.

4. barbering og anvendelse af Depilatory lotion

Bemærk: Fjern uønsket hår på dorsum af musen, før wounding. Følgende procedure er udført på Live DB/DB-/- mus, der ikke er under anæstesi dagen før operationen. Tag forholdsregler for at forebygge stress og skade på dyret.

  1. Barbering
    1. Placer musen på en ren overflade og tag fat i bunden af halen af musen med tommelfingeren og anden finger for at sikre placeringen af musen. Musen kan hoppe eller gøre pludselige bevægelser; Hvis det gør, hurtigt reagere og trække tilbage klippers for at forhindre skade.
    2. Barberer håret af musen med en hårklipper (figur 1a, 1B). Placer klingen parallelt med huden på musen og barberer hele ryggen fra halsen til halen, herunder hele halen, for at give mulighed for en stor nok overfladeareal til at placere en transparent film dressing (Se tabel over materialer). Let køre bladet mod retningen af hårvækst for den mest effektive snit. (Figur 1B).
      1. Tryk ikke kniven dybt ind i huden, da den kan beskadige huden ved at blå mærker eller skære.
  2. Anvendelse af depilatory lotion
    Bemærk: Brug depilatory lotion til at opnå en meget glat hud, så den gennemsigtige dressing kan holde fast.
    1. Sug huden på musen med vand for at forhindre kemiske forbrændinger ved let at trykke på en drenched papirserviet mod den barberede hud med tilstrækkeligt tryk til at våd det allerede klippede hår ned mod huden.
    2. Mens huden er våd, let gnide huden af musen med en lille klat af depilatory lotion (Se tabel over materialer) for 15-20 s (figur 1C, 1d). Spred lotion helt over, hvor håret er blevet skåret kort. Brug mere lotion, hvis musen er større.
    3. Anvend ikke lotion på ørerne af musen, halen, eller hvor som helst i nærheden af ansigtet. Hvis lotion kommer på ørerne eller halen, skal du blot tørre med en våd papirserviet indtil skylning. Hvis lotion kommer på forsiden af musen, straks vaske musen under rindende Tap eller deioniseret vand for at forhindre skader på øjne, næse, og mund.
    4. Lad lotion reagere med håret for yderligere 20-45 s efter påføring.
    5. Før skylning, kontrollere færdiggørelsen af den depilatory reaktion ved let at tørre væk lotion fra huden på forskellige steder (figur 1E) med en dykket finger eller en tynd metalspatel. Reaktionen er komplet, hvis huden er lyserød uden tilstedeværelsen af sort hår. Det er bedst at hurtigt kontrollere, at håret faktisk er blevet fjernet før skylning end skylning for tidligt og derefter at skulle anvende lotion igen.
  3. Skylning
    Bemærk: når afslutningen af hårfjernings reaktionen er blevet verificeret, skal du vaske musen med rindende Tap eller deioniseret vand for at fjerne depilatory lotion og forhindre kemiske forbrændinger.
    1. Placer musen på venstre hånende hånd og tryk på bunden af halen mod håndfladen med venstre tommelfinger for at forhindre musen i at bevæge sig rundt. Luk og ret resten af de venstre fingre for at forhindre, at musen bier.
    2. Placer musen, så ansigtet/hoved regionen er væk fra strømmen af vand og strømmen af lunkent vand kan falde bag hovedet og kun på bagsiden. Hurtigt, men forsigtigt gnide bagsiden af musen med højre håndet hånd for at vaske væk lotion.
    3. Når huden af musen er fri for lotion, hurtigt tørre musen med en papir håndklæde til at absorbere det meste af vandet (figur 1F).
  4. Pleje efter barbering og hårfjerning
    1. Kontrollér og rengør eventuelle resterende depilatory lotion, der kan forblive på ørerne og halen med en våd papirserviet.
    2. Placer musen tilbage i sit individuelle bur og Placer buret på en varmepude (40-45 °C) i ca. 30 min. Musen skal vende tilbage til normal opførsel, Scurry rundt, og brudgom sig inden for et par minutter.
    3. Hus hver mus i en separat bur i hele varigheden af forsøget. Huden på musene er ikke længere beskyttet og kan let ridses og bidt af andre mus.
    4. Da depilatory lotion kan have små irriterende virkninger, der kan forstyrre eller ændre sårhelingsprocessen, skal du vente 18-24 h før operationen for at tillade muse huden at falde ned og musen til at tilpasse sig den manglende hår på ryggen.
  5. Fjernelse af hår fra huden med mørk pigmentering
    Bemærk: nogle DB/DB-/- mus vil potentielt have mørke pletter i huden, der vil have håret vokser tilbage hurtigere og stærkere end huden uden disse patches. (Figur 2A). Disse mørke områder af huden synes mørkere i farve på grund af Mid-Late Anagen fase hårsækkene og/eller pigment inkontinens29,30.
    1. Hvis mørke pletter er bemærket, anvende depilatory lotion igen, men kun i disse områder, og Gentag trin 4,2 og 4,3 (figur 2b, 2c).
      Bemærk: de mørke pletter af huden vil vokse håret hurtigere gennem hele eksperimentets varighed, så klip håret kort hver 3-5 dage, når det er nødvendigt. En patch eller to væk fra den ønskede placering af såret er acceptabelt. Hvis bagsiden af musen er væsentligt dækket af disse mørke pletter, skal du ikke bruge denne mus til den kroniske sår model.

5. opsætning af reagens

Bemærk: udviklingen af kroniske sår i DB/DB-/- mus opnås ved behandling med specifikke hæmmere for katalase og glutathionperoxidase, 3-amino-1, 2, 4-triazol (Atz) og mercaptosuccininsyre (MSA), henholdsvis16 . Følgende procedure beskriver dosis og administration af analgesi og hæmmere baseret på vægten af musen.

  1. Injicer Smertelindringen buprenex intraperitonealt på 0,05 mg/kg mus i steril PBS. Injicér et volumen på 120 μL for en 60 g mus ca. 30 minutter før operationen. Giv en anden dosis 6 timer efter operationen. Der kan gives en ekstra dosis efter behov.
  2. Injicer Atz intraperitonealt ved 1 g/kg mus i steril PBS. Injicér et volumen på 480 μL for en 60 g mus ca. 20 minutter før operationen. Injicer halvdelen af lydstyrken på venstre side af maven og den anden halvdel på højre side.
  3. Indbetal MSA topisk på såret mellem den gennemsigtige dressing og sårvævet ved 150 mg/kg mus i steril PBS. Giv et volumen på 60 μL til en 60 g mus inden for 10 minutter efter operationen.

6. kirurgi

Bemærk: succesen med den kroniske sårmodel er afhængig af ikke-sterile forhold. Disse mus er ikke kimfri og har til huse i et konventionelt vivarium. Bakterie mikrobiomet, der bor i huden, er afgørende for den efterfølgende initiering og udvikling af kroniske sår ved behandling med hæmmere af anti-oxidant enzymer. Derfor er traditionel prækirurgisk forberedelse af stedet kontraindiceret.

  1. Intraperitoneal injektion
    1. Fastgør musen på skrå del af buret rack og hold halen med musen komfortabelt stående med hovedet lavere end kroppen af musen. Dette sikrer, at vi forsøger at flytte de indre organer så langt væk fra injektionsstedet muligt.
    2. Indsæt nålen i nederste højre kvadrant af maven for at undgå injektion i blæren, eller andre abdominale organer.
    3. Aspirer kanylen før injektion.
  2. Behandling og anæstesi
    1. Giv Buprenex 30 min og ATZ 20 min før operationen, som beskrevet i trin 5,1 og 5,2.
    2. Placer musen i en lille plastikbeholder oven på en varm varmepude som vist i figur 3a i ca. 15-20 min. ved at give varme støtte forud for proceduren beskyttes mod potentiel dødelighed.
    3. Placer en papirserviet eller papirhåndklæde over toppen af den lille beholder for bedre at dæmme op for varmen. Musen skal falde til ro, da det varmer. Figur 3 B viser materialer, som er nødvendige for kirurgi.
    4. Placer musen i en lukket beholder, der er hooked op til isofluran vaporizer i den kemiske hætte, hvis du bruger et åbent system.
    5. I et åbent system, administrere 5% isofluran for 1-2 min ved en strømningshastighed på 2-3.5 L/min. løbende overvåge status for musen.
      1. Når musen er bevidstløs eller ikke længere bevæger sig, skal du placere musen på en hvid kirurgisk pad og passe hovedet med en næse kegle, der er fastgjort til vaporizer at tillade kontinuerlig administration af isofluran under operationen.
    6. I et åbent system administreres 2-3% isofluran med samme strømningshastighed under operationen og justeres til strømmen af isofluran for at opretholde dybden af anæstesi.
    7. Reducere både koncentrationen og varigheden af isofluran Administreret under operationen. DB/DB -/- mus er meget følsomme over for anæstesi, så det er bedst at holde isofluran eksponering til et minimum. Hvis musen stadig reagerer efter 2 min ved 5% isofluran, fastgør næse keglen og giv 3-5% isofluran til 15-30 s før påbegyndelse af operationen.
      1. Bekræft korrekt bedøvelse før wounding. Dybde af anæstesi er bekræftet af manglende respons på fysiske stimuli såsom stærk tå knivspids. Længden af tid af musen under inhaleret anæstesi er under 5 min så ingen dyrlæge salve påføres øjnene.
  3. Såret
    1. Spray en papirserviet med 70% ethanol eller en klinisk ethanol serviet og tør bagsiden af musen for at rense området af såret site. Rengør hudens overflade, så den gennemsigtige dressing kan holde fast, da støv fra strøelse, mad eller hud kan forhindre bandagen i at stikke ordentligt (figur 4A). Må ikke tørres overdrevent, eller der vil være en risiko for at dræbe bakterier til stede på huden.
    2. Bestem positionen af sårstedet. Det bedste sted at udføre såret er på Rygsiden af musen, centreret og væk fra pletter af huden med højere pigmentering.
      Bemærk: vi har af erfaring bestemt, at disse mus kun kan modstå byrden af et sår.
    3. Opret et sår inden for 30-45 s ved hjælp af en 7 mm hud biopsi punch, pincet og kirurgisk saks. Tryk let på biopsi punch på det ønskede sårsted og drej punch rundt lige dybt nok til at efterlade et lille indtryk af punch (figur 4B). Punktafgifts den skitserede hud ved at trække op i midten af punch med pincet og skære langs dispositionen med kirurgisk saks (figur 4c-4E).
    4. Dække såret fast med halvdelen af et stykke transparent film dressing (6 cm x 3,5 cm).
    5. Stop administration af 2% isofluran til musen (figur 4F).

7. behandling og nyttiggørelse efter operationen

  1. Administration af MSA-behandling efter operationen er afsluttet, og den gennemsigtige dressing anvendes som beskrevet i trin 5,3. Indbetal MSA på sårområdet under bandagen.
  2. Placer musen tilbage i den lille beholder på varmepuden i 30 minutter for at hjælpe med genopretning. Når musen er varmet op, sætte musen tilbage i sit bur. Virkningen af isofluran er midlertidig, og musen skal bevæge sig rundt kort tid derefter.
  3. Efterlad ikke mus uden opsyn eller returner dem til vivarium, indtil musene har genvundet tilstrækkelig bevidsthed til at opretholde brystbenet recumbency.
    Bemærk: anæstesi af valg, når du arbejder med disse mus er isofluran netop på grund af sin hurtige induktion og efterfølgende fremkomsten af anæstesi.
    1. House mus, der har gennemgået kirurgi individuelt for at undgå en mus forstyrre den kroniske sår i en anden. Som anført ovenfor, de ikke vende tilbage til vivarium indtil fuldt tilbagebetalt.
  4. Den anden dosis af Buprenex 6 timer administreres efter operationen.
  5. Observere musene omhyggeligt for den første 48 h efter operationen.
    Bemærk: operationen, kombineret med inhibitorer til at skabe den kroniske sår, er meget stressende på dyret, der allerede er både diabetisk og fede. Mus, der overlever de første par dage efter operationen, vil normalt overleve varigheden af eksperimentet.

8. data indsamling, overlevelse strategier, håndtering af mus efter at have såret, og yderligere tips

  1. Data indsamling
    1. Tag billeder så tidligt som umiddelbart efter operationen. Biofilms observeres overalt mellem 5-10 dage efter at have såret, og så tidligt som 3 dage.
    2. Hvis bakterier er fokus for analyse, rulle en steril swap med let tryk omkring såret for 10-15 s. Opbevar vatpind i et passende fryse medie til dyrkning eller tørring uden nogen medier til kultur uafhængig Sekvensanalyse ved-80 °C. Saml ekstracellulære polymere stoffer via en steril metalspatel i et mikrocentrifuge glas og opbevar ved-80 °C før analyse.
    3. Giv ikke anæstesi til musen under håndtering for biofilm indsamling eller billede tager. Under disse procedurer, placere et stykke mad foran musen for at berolige musen ned og forhindre det i at løbe ud. De fleste mus vil klatre på toppen af maden, sidde på det, og ikke flytte.
  2. Da sekundære infektioner og utilsigtede kroniske sår eller sår kan udvikle sig, hvis musen ikke er korrekt bevægende, eller hvis bandagen ikke anvendes korrekt, periodisk kontrollere aktiviteten af musen og ventrale side for sår. Friktion mellem hud og vådt strøelse (DB/DB-/- mus er polyuric) kan forstyrre huden, hvis burene ikke ændres hyppigt.
    Bemærk: væskeophobning under bandagen kan få klæbemidlet til at miste sin klæbrighed og lade væsken lække. Døde hudceller, strøelse, og fækale stof kan derefter holde sig på huden og hærde. Disse tørrede pletter og aggregater på huden skal straks ryddes for at forhindre en sekundær infektion.
  3. Hvis musene står eller sidder på bagbenene, skal du flytte disse mus til et bur, hvor adgang til mad og vand er meget lavere. Hvis placeringen af mad og vand i buret er høj, kan musen stå eller sidde på bagbenene for at nå den. De fleste mus vil ikke have et problem at spise og drikke, hvis de kunne gøre det før operationen, selv om der er en mulighed for, at nogle mus kan bladre over på ryggen. Disse "flipper" kan have store problemer med at vende sig over, så de får brug for assistance og yderligere overvågning.
  4. Lad den gennemsigtige dressing på huden i op til 20 dage, hvis huden er fri for snavs, skællet hud og hår. Hvis nogen af disse opstår på huden, fjerne den gamle dressing og anvende et nyt stykke.
    1. For at tage af dressing, let knibe huden direkte bag hovedet, derefter trække dressing væk fra hovedet i en glat bevægelse.
    2. Hvis du vil placere et stykke dressing på sikker, skal du holde musen så stadig som muligt. Det er vigtigt, at huden er ren og fri for flaky døde hudceller, støv fra strøelse, og stykker af mad. Placer og tryk derefter Forbindingen ind i huden omkring såret for at sikre.
    3. Hvis placere et stykke mad foran musen ikke begrænser dens bevægelser, derefter placere musen på toppen af trådbur. Når musen har grebet en skinne på buret, holde halen så tæt på kroppen som muligt og trække med minimal kraft. Som musen trækker fremad ryggen vil strække og glatte for nem anvendelse; Placer bandagen sikkert på dette tidspunkt.
    4. Genbrug aldrig en gammel dressing. Anvend altid ny dressing på bagsiden for den største vedhæftning.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Figur 5 viser et eksempel på et sår uden behandling af inhibitorer, der skrider frem mod sårlukning og et sår med behandling af inhibitorer, som udvikler sig mod kronisk toksicitet. Den gennemsigtige dressing er blevet tilbage på plads på det kroniske sår, så biofilm og væskeophobning kan ses.

Kronisk sårinitiering finder sted på mindre end 6 timer, og sårmargenen er synligt ændret fra oxidativt stress. Histologiske beviser for denne sårmargen afslører, at vævet er nekrotisk og ikke vil deltage i sårheling. De biofilm-dannende bakterier i såret kan senere bruge dette nekrotiske væv som en kilde til næringsstoffer og strukturelle komponenter til fremstilling af biofilm. Et kronisk sår er et sår, der forbliver åbent, forstørret i forhold til det oprindelige sår, indeholder biofilm (EPS plus patogene bakterier fundet i humane kroniske sår) og tager måneder eller år at helbrede afhængigt af mængden og indholdet af biofilm, der forhindrer såret i at løse normalt. I den kroniske sårmodel er fuld kronicitet indstillet til > 20 dage efter operationen, fordi de sår, der ikke er behandlet med inhibitorer, vil lukke ved dette tidspunkt (figur 5). Healing tager typisk > 60 dage, og tiden afhænger af de primære patogene bakterier, som findes i såret. Nogle gange kan musene bukke under for infektion, når mere aggressive biofilm-dannende bakterier, såsom Pseudomonas, dominerer i såret. Således er et kronisk sår defineret som et sår, der ikke vil lukke inden for 20 dage, tager mere end 60 dage til at helbrede, og har biofilm til stede på såret.

Kønsforskelle er blevet fundet i forskellige diabetes modeller, herunder DB/DB-/- musemodel32,33. Mens sådanne forskelle findes, har vi observeret sex ikke at være en væsentlig faktor i udviklingen af kroniske sår. Kroniske sår i mandlige og hunmus udvikler sig i samme omfang, så begge køn kan bruges til at studere kroniske sår. Således, udnytte denne model er fordelagtigt, da humane kroniske sår kan findes på både mandlige og kvindelige diabetikere patienter.

Figure 1
Figur 1 . Barbering og depilatory proces. (A) musen før barbering. (B) huden på musen er barberet at fjerne det meste af håret på bagsiden. (C) en klat af depilatory lotion på spidsen af en finger. Mere bruges, hvis musen er større. (D) bagsiden af musen er dækket med depilatory lotion og venstre til at reagere. (E) en spatel bruges til at skrabe nogle af lotion for at se, om håret er blevet fjernet. Bright pink hud uden nogen tilstedeværelse af hår er vejledende, at hårfjerning er komplet. (F) lotion på bagsiden fjernes med rindende vand. Huden af musen skal være lidt lyserød. Dette tal er blevet modificeret fra Kim og Martins-Green31. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 2
Figur 2 . Fjernelse af hår fra mindre pletter af mørk hud. (A) musen er allerede blevet behandlet én gang, og huden er våd igen for at forhindre forbrændinger. (B) depilatory lotion påføres kun på plasteret på huden, der er mørk og har tæt hår. (C) lotion vaskes efter reaktionen for at afsløre den mørke plet af huden uden hår. Dette tal er blevet modificeret fra Kim og Martins-Green31. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 3
Figur 3 . Præ-kirurgi oprettet. A) de mus, der skal være sårede, anbringes i små plastikbeholdere oven på en varmepude. (B) nogle af de materialer, der anvendes i kirurgi er vist. Den kirurgiske saks skal være skarp for at sikre, at huden ikke knuses, når den skæres. Den gennemsigtige dressing er skåret i halve. Dette tal er blevet modificeret fra Kim og Martins-Green31. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 4
Figur 4 . At gøre excision sår. (A) efter at musen er under bedøvelse, er bagsiden af musen udslettet med 70% ethanol en gang. (B) huden biopsi punch er placeret på bagsiden af musen og presset hårdt nok til at efterlade et indtryk. Biopsi punch kan drejes for at gøre en overfladisk incision. (C) midten af det skitserede område erklemtmed pincet og en skarp kirurgisk saks bruges til at gøre den indledende incision. (D) den kirurgiske saks manøvreret til at skære langs dispositionen lavet af biopsi punch. E) en hudregion, der er skitseret af biopsi pumpen, er med succes fjernet. (F) den gennemsigtige dressing er placeret på bagsiden af musen og sikret. Dette tal er blevet modificeret fra Kim og Martins-Green31. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 5
Figur 5 . Billeder af sår. (A) såret på en mus på hinanden følgende tidspunkter efter operationen, da det skrider frem i kronologisk rækkefølge fra operationsdagen. Biofilm kan ses så tidligt som dag 5 og opdages så tidligt som dag 3. Såret er fuldt kronisk med stærk biofilm på dag 20. (B) eksempler på humane kroniske sår, specifikt diabetisk fodsår. Dette tal er blevet modificeret fra Kim og Martins-Green31. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Når kroniske sår er skabt på musene, modellen kan bruges til at studere forringet sårheling processer involveret i indledningen af kronicitet. Modellen kan også bruges til at teste effekten af en bred vifte af kemikalier og lægemidler, der kan vende kronisk sårudvikling og forringet heling og føre til sårlukning og healing. Forskellige tidspunkter efter starten af forløb kan undersøgt: f. eks, dage 1-5 efter at have såret for tidlig indtræden af kronicitet og dage 20 og derover for fuld styrke kroniske sår.

Den kroniske sår model er også en kraftfuld model til at studere forskellige aspekter af sårheling og komplikationer såsom biobyrde og kakeksi. Bioburden er blot en af mange facetter af kroniske sår, der kan undersøgt i denne model, da det også påvirker humane kroniske sår. Vores procedurer og dyre brug protokol klart identificere symptomologi, der skal overvåges, sammen med en defineret overvågning tidsplan. Dyr, der er identificeret som morbid, og som er baseret på iacuc-godkendte kriterier, er aflives for at undgå betydelig lidelse. Desuden er campus dyrlæge og Dyresundhed tekniker høres, når visse symptomologier opstår og give støttende vejledning i vurdering af kriterier.

Kritiske trin i protokollen omfatter at huse DB/DB-/- mus i en konventionel vivarium, fjerne hår med depilatory lotion, og opvarmning før isofluran administration. Udviklingen af kroniske sår i den kroniske sårmodel er afhængig af ikke-sterile forhold og praksis. Disse mus er ikke kimfri og vokser ikke i meget rene vivariums. Den mikroflora, der bor i huden er afgørende for den efterfølgende initiering og udvikling af kroniske sår ved behandling med hæmmere for anti-oxidant enzymer. Disse DB/DB-/- mus skal udsættes for et miljø, der indeholder bakterier, både kommensal og sygdomsfremkaldende. Hvis huden rengøres og dis-inficeret med jod eller andre antiseptiske metoder før kirurgi for at "sterilisere" huden, kan såret ikke blive kronisk. Bakterierne i hudens mikrobiom er nødvendige for dannelsen og udviklingen af biofilm og forsinker heling og sårlukning. I klinikken komplicerer tilstedeværelsen af biofilm i et sår yderligere sårhelings processerne og øger risikoen for amputation hos mennesker, hvis infektionen i såret ikke styres.

Fjernelse af hår med depilatory lotion er et vigtigt skridt til at fjerne overskydende hår og give en glat og ren overflade til den gennemsigtige dressing til at holde fast. Den depilatory lotion, der anvendes i denne protokol er en kemisk depilatory med tilsat Aloe for at minimere forbrændinger. Dette produkt er minimal i at ændre morfologien af huden samt bevare hudens mikrobiom. Det produkt, der er anført i tabellen over materialer anbefales frem for andre hårfjerning produkter, herunder fysiske og mekaniske haarfjerningsmidler (voks og kommercielle Epilatorer), der kan yderligere brænde og slæbebåd på huden og/eller dræbe hudens mikrobiom. Selv om denne kemiske depilatory er fysisk blid, det kan stadig irritere huden lidt, en effekt, der kan ændre sårheling processer. Således er det mest effektivt at vente 18-24 timer før operationen for at tillade huden at komme sig efter proceduren og sikre, at huden og såret ikke påvirkes af det.

Disse mus er ekstremt føjeligt og ikke reagerer på stressorer. De er meget nemme at håndtere uden anæstesi. De er rolige nok til at placere på en håndflade eller på toppen af en bænk uden at løbe væk. Hvis bunden af halen af musen er sikret med tommelfingeren og anden finger, vil musen ikke være i stand til at løbe væk eller vende tilbage til bid på grund af deres store mave størrelse. Vigtigere, i vores erfaring, disse mus er ekstremt følsomme over for anæstesi, især da det vedrører tab af homøostase. I samråd med vores IACUC blev det således fastslået, at den bedste løsning er at begrænse bedøvelses administrationen.

Hovedformålet med denne model er at skabe en stor uhelbredende sår på ryggen, så når et sår er lavet, holde en mus konventionelt at gøre IP injektioner af yderligere buprenex eller andre kemiske behandlinger periodisk er umuligt. Holde musen ved rygskind forårsager musen en masse ubehag og ganske muligvis smerte, hvis musen holdes på en sådan traditionel måde; således alle injektion med musen højre side op, mens den står på alle fire fødder. Andre eksperimenter udnytte DB/DB-/- stamme bruge disse mus, når de er yngre og ikke vejer så meget, derfor den traditionelle måde at udføre en IP-injektion kan anvendes. Da den kroniske sårmodel udnytter mus op til 6 måneders alderen, og disse mus kan veje op til 80 g, den konventionelle metode er ikke optimal og kan potentielt såre musen. Vi har udnyttet den metode, der er beskrevet ovenfor for en mus denne fede og har ikke observeret nogen negative resultater, når injiceres med denne metode med vellykket aspiration.

Tidligere, injicerbar anæstesi såsom ketamin og xylazine, blev anvendt; de viste sig dog at være svære at bruge med DB/DB-/- mus. Med en samlet operationstid på mindre end 5 minutter var den lange induktions-og restitutionstid ikke nødvendig i forbindelse med forsøget. Isoflurane var fast besluttet på at være det bedre valg af anæstesi til denne procedure på grund af nem administration og titrering, hurtig debut og nyttiggørelse, og tilstrækkelig bedøvelses dybde. Også, isofluran forårsager minimal hjerte depression og vedligeholder BP meget godt34. Så en større ændring i proceduren for kronisk sårmodel var at bruge isofluran som den foretrukne anæstesi.

Opvarmningen før operationen er vigtig for at forebygge dødelighed i 2-3 dage efter operationen. Disse mus har signifikant lavere kernetemperatur35 og er ikke i stand til at styre deres kerne kropstemperatur effektivt på grund af deres genetiske manipulation, så en ekstern varme kilde leveres før operationen for at beskytte mod yderligere fald i kroppens kernetemperatur induceret af anæstesi. Vi har vurderet behovet for en varmepude før, under og efter operationen. Det er vigtigt at bemærke, at DB/DB-/- mus har usædvanlige fysiologiske reaktioner. Empirisk har vi fundet disse mus til at være mest effektivt beskyttet med præ-og post-kirurgisk varme støtte. Ved at erstatte isofluran som bedøvelse målte og fastsatte vi, at kernetemperaturen ikke var faldet markant i løbet af de mindre end fem minutter af operationen. Mens vi har fundet den præ-og post-kirurgisk varme støtte til at være kritisk for disse mus, har vi ikke fundet kirurgisk varme støtte til at have en effekt. Det skal bemærkes, at IACUC stolen gav vejledning og overvågede vores tests relateret til temperatur og bedøvelses effekter. Da vi kommunikerer denne metode, finder vi det vigtigt at angive, hvad der er nødvendigt for procedurens succes.

En begrænsning af at anvende denne metode til at studere biofilm udvikling er det faktum, at de bakterier, der findes på såret og producerer biofilm, ikke styres. Hvis en specifik biofilm-dannende bakterie skal undervises, kan denne model være nyttig, hvis det oprindelige mikrobiome kan afskaffes, før det går gennem jod eller andre antiseptiske metoder. Som reaktion på høje niveauer af oxidativt stress stimuleres de vigtigste sygdomsfremkaldende bakterier i hudens mikrobiome til at initiere biofilm dannelse. I vores kroniske sår omfatter biofilm-dannende bakterier, men er ikke begrænset til, Pseudomonas aeruginosa36,37,38,39, Enterobacter cloacae37, 38 , 39og forskellige Staphylococcus40-,41 -og Corynebacterium -arter41,42,43,44, 45, som alle kan findes i humane kroniske sår. Flere undersøgelser af kronisk sårmikrobiom er blevet udført på humane kroniske sår for bakterierne39,40,41,43,44,45 , og svampe46,47 samfund, herunder longitudinel undersøgelser forbundet med dårlig healing48,49. Longitudinale undersøgelser af denne art kan også følges op med den kroniske sårmodel.

Det er vigtigt at erkende, at forskellige resultater kan opnås på grund af forskelle i vivaria betingelser, forsyninger, og udstyr, leverandører, og kilde kolonier for DB/DB-/- mus. For at minimere sådanne forskelle, forudsat i protokollen er den nøjagtige mus sort og kilde, der anvendes til kronisk såreksperiment. Til opdræt af disse mus, den nøjagtige strøelse og fødevarer mærker er blevet givet i tabellen over materialer til at begrænse variabilitet. I vores eksperimenter finder vi, at høj oxidativ stress er nødvendig og tilstrækkelig til at skabe kroniske sår i disse mus, så længe musene er anbragt i en konventionel vivarium og udsat for bakterier. Bakterier populationer og samfund kan afvige med vivaria; men så længe en kimfri facilitet ikke bruges til at huse musene, bør de have nok bakterier, både kommensal og sygdomsfremkaldende, til at opholde sig på håret og huden.

Denne metode til at skabe kroniske sår i denne protokol er signifikant at studere kroniske sår og forringet sårheling, fordi kun oxidativ stress niveauer er væsentligt ændret eksperimentelt. Oxidativ stress er nødvendig for normale sårheling processer2. Det er vigtigt for rettidig regulering og en afgørende komponent i funktionaliteten af celler, der er nødvendige for sårheling5. Men, når niveauerne af oxidativ stress ikke er kontrolleret, reaktive ilt arter kan beskadige endothelia celler, hæmme keratinocytproliferation funktionalitet, og forsinke sårlukning2,5. Humane kroniske sår har høje niveauer af oxidativ stress50. Musemodellen har forhøjet blodglucose og allerede forhøjede niveauer af oxidativt stress på grund af dets sygelighed. Disse egenskaber er delt med mennesker, der lever med diabetes og giver et mikromiljø befordrende for kronisk efter opretholdelse af skade50. Mennesker er også vært for forskelligartede og komplekse mikrobiota i mange steder på kroppen, herunder huden, så et komplekst, men naturligt, mikrobiom er tilladt at udvikle sig på huden af musen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne erklærer, at de ikke har konkurrerende finansielle interesser.

Acknowledgments

Forfatterne har ingen bekræftelser.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
B6.BKS(D)-Leprdb/J  The Jackson Laboratory  00697 Homozygotes and heterozygotes available 
Nair Hair Remover Lotion with Soothing Aloe and Lanolin Nair a chemical depilatory
Buprenex (buprenorphine HCl) Henry Stein Animal Health 059122 0.3 mg/ml, Class 3
3-Amino-1,2,4-triazole (ATZ) TCI A0432
Mercaptosuccinic acid (MSA) Aldrich 88460
Phosphate buffer solution (PBS) autoclave steriled
Isoflurane Henry Schein Animal Health 029405 NDC 11695-6776-2
Oxygen Tank must be compatible with vaporizing system
Isoflurane vaporizer JA Baulch & Associates 
Wahl hair clipper Wahl Lithium Ion Pro
Acu Punch 7mm skin biopsy punches Acuderm Inc. P750
Tegaderm  3M Ref: 1624W Transparent film dressing (6 cm x 7 cm)
Heating pad Conair Moist Dry Heating Pad
Insulin syringes BD 329461 0.35 mm (28G) x 12.7 mm (1/2")
70% ethanol
Kimwipes
Tweezers
Sharp surgical scissors
Thin metal spatula
Tubing
Mouse nose cone
Gloves
small plastic containers

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Singer, A. J., Clark, R. A. F. Cutaneous wound healing. New England Journal of Medicine. 341 (10), 738-746 (1999).
  2. Nouvong, A., Ambrus, A. M., Zhang, E. R., Hultman, L., Coller, H. A. Reactive oxygen species and bacterial biofilms in diabetic wound healing. Physiological Genomics. 48 (12), 889-896 (2016).
  3. MacLeod, A. S., Mansbridge, J. N. The innate immune system in acute and chronic wounds. Advanced Wound Care. 5 (2), 65-78 (2016).
  4. Zhao, G., et al. Biofilms and Inflammation in Chronic Wounds. Advanced Wound Care. 2 (7), 389-399 (2013).
  5. Wlaschek, M., Scharffetter-Kochanek, K. Oxidative stress in chronic venous leg ulcers. Wound Repair and Regeneration. 13 (5), 452-461 (2005).
  6. Stadelmann, W. K., Digenis, A. G., Tobin, G. R. Physiology and healing dynamics of chronic cutaneous wounds. American Journal of Surgery. 176 (2), 26-38 (1998).
  7. Loots, M. A., Lamme, E. N., Zeegelaar, J., Mekkes, J. R., Bos, J. D., Middelkoop, E. Differences in cellular infiltrate and extracellular matrix of chronic diabetic and venous ulcers versus acute wounds. Journal of Investigative Dermatology. 111 (5), 850-857 (1998).
  8. Costerton, W., Veeh, R., Shirtliff, M., Pasmore, M., Post, C., Ehrlich, G. The application of biofilm science to the study and control of chronic bacterial infections. Journal of Clinical Investigation. 112 (10), 1466-1477 (2003).
  9. Fux, C. A., Costerton, J. W., Stewart, P. S., Stoodley, P. Survival strategies of infectious biofilms. Trends in Microbiology. 13 (1), 34-40 (2005).
  10. Sen, C. K., et al. Human skin wounds: A major and snowballing threat to public health and the economy. Wound Repair and Regeneration. 17 (6), 763-771 (2009).
  11. Armstrong, D. G., Wrobel, J., Robbins, J. M. Are diabetes-related wounds and amputations worse than cancer. International Wound Journal. 4 (4), 286-287 (2007).
  12. James, G. A., et al. Biofilms in chronic wounds. Wound Repair and Regeneration. 16 (1), 37-44 (2008).
  13. Chen, H., et al. Evidence that the diabetes gene encodes the leptin receptor: Identification of a mutation in the leptin receptor gene in db/db mice. Cell. 84 (3), 491-495 (1996).
  14. Coleman, D. L. Obese and diabetes: Two mutant genes causing diabetes-obesity syndromes in mice. Diabetologia. 14 (3), 141-148 (1978).
  15. Garris, D. R., Garris, B. L. Genomic modulation of diabetes (db/db) and obese (ob/ob) mutation-induced hypercytolipidemia: cytochemical basis of female reproductive tract involution. Cell Tissue Research. 316 (2), 233-241 (2014).
  16. Dhall, S., et al. Generating and reversing chronic wounds in diabetic mice by manipulating wound redox parameters. Journal of Diabetes Research. , 2014, Article ID 562625 (2014).
  17. Feinstein, R. N., Berliner, S., Green, F. O. Mechanism of inhibition of catalase by 3-amino-1,2,4-triazole. Archives of Biochemistry and Biophysics. 76 (1), 32-44 (1958).
  18. Margoliash, E., Novogrodsky, A. A study of the inhibition of catalase by 3-amino-1:2:4:-triazole. Biochemical Journal. 68 (3), 468-475 (1958).
  19. Margoliash, E., Novogrodsky, A., Schejter, A. Irreversible reaction of 3-amino-1:2:4-triazole and related inhibitors with the protein of catalase. Biochemical Journal. 74 (2), 339-348 (1960).
  20. Shiba, D., Shimamoto, N. Attenuation of endogenous oxidative stress-induced cell death by cytochrome P450 inhibitors in primary cultures of rat hepatocytes. Free Radical Biology and Medicine. 27 (9-10), 1019-1026 (1999).
  21. Ishihara, Y., Shimamoto, N. Critical role of exposure time to endogenous oxidative stress in hepatocyte apoptosis. Redox Report. 12 (6), 275-281 (2007).
  22. Valenti, V. E., de Abreu, L. C., Sato, M. A., Ferreira, C. ATZ (3-amino-1,2,4-triazole) injected into the fourth cerebral ventricle influences the Bezold-Jarisch reflex in conscious rats. Clinics. 65 (12), 1339-1343 (2010).
  23. Welker, A. F., Campos, E. G., Cardoso, L. A., Hermes-Lima, M. Role of catalase on the hypoxia/reoxygenation stress in the hypoxia-tolerant Nile tilapia. American Journal of Physiology. Regulatory, Integrative and Comparative Physiology. 302 (9), 1111-1118 (2012).
  24. Bagnyukova, T. V., Vasylkiv, O. Y., Storey, K. B., Lushchak, V. I. Catalase inhibition by amino triazole induces oxidative stress in goldfish brain. Brain Research. 1052 (2), 180-186 (2005).
  25. Falck, E., Karlsson, S., Carlsson, J., Helenius, G., Karlsson, M., Klinga-Levan, K. Loss of glutathione peroxidase 3 expression is correlated with epigenetic mechanisms in endometrial adenocarcinoma. Cancer Cell International. 10 (46), (2010).
  26. Chaudiere, J., Wilhelmsen, E. C., Tappel, A. L. Mechanism of selenium-glutathione peroxidase and its inhibition by mercaptocarboxylic acids and other mercaptans. Journal of Biological Chemistry. 259 (2), 1043-1050 (1984).
  27. Dunning, S., et al. Glutathione and antioxidant enzymes serve complementary roles in protecting activated hepatic stellate cells against hydrogen peroxide-induced cell death. Biochimica et Biophysica Acta. 1832 (12), 2027-2034 (2013).
  28. Franco, J. L., et al. Methylmercury neurotoxicity is associated with inhibition of the antioxidant enzyme glutathione peroxidase. Free Radical Biology and Medicine. 47 (4), 449-457 (2009).
  29. Sundberg, J. P., Silva, K. A. What color is the skin of a mouse. Veterinary Pathology. 49 (1), 142-145 (2012).
  30. Curtis, A., Calabro, K., Galarneau, J. R., Bigio, I. J., Krucker, T. Temporal variations of skin pigmentation in C57BL/6 mice affect optical bioluminescence quantitation. Molecular Imaging & Biology. 13 (6), 1114-1123 (2011).
  31. Kim, J. H., Martins-Green, M. Protocol to create chronic wounds in diabetic mice. Nature Protocols Exchange. , (2016).
  32. Aasum, E., Hafstad, A. D., Severson, D. L., Larsen, T. S. Age-dependent changes in metabolism, contractile function, and ischemic sensitivity in hearts from db/db mice. Diabetes. 52 (2), 434-441 (2003).
  33. Vannucci, S. J., et al. Experimental stroke in the female diabetic, db/db, mouse. Journal of Cerebral Blood Flow & Metabolism. 21 (1), 52-60 (2001).
  34. Janssen, B. J., et al. Effects of anesthetics on systemic hemodynamics in mice. American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 287 (4), 1618-1624 (2004).
  35. Osborn, O., et al. Metabolic characterization of a mouse deficient in all known leptin receptor isoforms. Cellular and Molecular Neurobiology. 30 (1), 23 (2010).
  36. Scales, B. S., Huffnagle, G. B. The microbiome in wound repair and tissue fibrosis. Journal of Pathology. 229 (2), 323-331 (2013).
  37. Gjødsbøl, K., et al. No need for biopsies: Comparison of three sample techniques for wound microbiota determination. International Wound Journal. 9 (3), 295-302 (2012).
  38. Wolcott, R. D., et al. Analysis of the chronic wound microbiota of 2,963 patients by 16S rDNA pyrosequencing. Wound Repair Regeneration. 24 (1), 163-174 (2016).
  39. Gjødsbøl, K., Christensen, J. J., Karlsmark, T., Jørgensen, B., Klein, B. M., Krogfelt, K. A. Multiple bacterial species reside in chronic wounds: a longitudinal study. International Wound Journal. 3 (3), 225-231 (2006).
  40. Dowd, S. E., et al. Survey of bacterial diversity in chronic wounds using Pyrosequencing, DGGE, and full ribosome shotgun sequencing. BMC Microbiology. 8 (43), (2008).
  41. Price, L. B., et al. Community analysis of chronic wound bacteria using 16S rrna gene-based pyrosequencing: Impact of diabetes and antibiotics on chronic wound microbiota. PLoS One. 4 (7), 6462 (2009).
  42. Scales, B. S., Huffnagle, G. B. The microbiome in wound repair and tissue fibrosis. Journal of Pathology. 229 (2), 323-331 (2013).
  43. Dowd, S. E., et al. Polymicrobial nature of chronic diabetic foot ulcer biofilm infections determined using bacterial tag encoded FLX amplicon pyrosequencing (bTEFAP). PLoS One. 3 (10), 3326 (2008).
  44. Price, L. B., et al. Macroscale spatial variation in chronic wound microbiota: A cross-sectional study. Wound Repair and Regeneration. 19 (1), 80-88 (2011).
  45. Gontcharova, V., Youn, E., Sun, Y., Wolcott, R. D., Dowd, S. E. Comparison of bacterial composition in diabetic ulcers and contralateral intact skin. Open Microbiology Journal. 4, 8-19 (2010).
  46. Smith, K., et al. One step closer to understanding the role of bacteria in diabetic foot ulcers: characterising the microbiome of ulcers. BMC Microbiologyogy. 16 (54), (2016).
  47. Gardner, S. E., Hillis, S. L., Heilmann, K., Segre, J. A., Grice, E. A. The Neuropathic diabetic foot ulcer microbiome is associated with clinical factors. Diabetes. 62 (3), 923-930 (2013).
  48. Loesche, M., et al. Temporal stability in chronic wound microbiota is associated with poor healing. Journal of Investigative Dermatology. 137 (1), 237-244 (2017).
  49. Kalan, L., et al. Redefining the chronic-wound microbiome: Fungal communities are prevalent, dynamic, and associated with delayed healing. MBio. 7 (5), 01058-01116 (2016).
  50. Blakytny, R., Jude, E. The molecular biology of chronic wounds and delayed healing in diabetes. Diabetic Medicine. 23 (6), 594-608 (2006).

Tags

Medicin sårheling kronisk sår nedsat heling diabetisk fodsår oxidativt stress biofilm
Protokol til at skabe kroniske sår i diabetiske mus
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Kim, J. H., Martins-Green, M.… More

Kim, J. H., Martins-Green, M. Protocol to Create Chronic Wounds in Diabetic Mice. J. Vis. Exp. (151), e57656, doi:10.3791/57656 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter