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Protocollo per creare ferite croniche nei topi diabetici

Published: September 25, 2019 doi: 10.3791/57656
Automatic Translation
1, 1
1Department of Molecular, Cell and Systems Biology, University of California, Riverside

Summary

Le ferite croniche sono sviluppate da ferite acute su un modello di topo diabetico inducendo alti livelli di stress ossidativo dopo una ferita cutanea a tutto spessore. La ferita viene trattata con inibitori per catalasi e glutathione peroxidasi, con conseguente alterazione della guarigione e sviluppo di biofilm da parte di batteri presenti nel microbioma cutaneo.

Abstract

Le ferite croniche si sviluppano a seguito di una regolazione difettosa in uno o più processi cellulari e molecolari complessi coinvolti in una corretta guarigione. Hanno un impatto sulle persone di 6,5 milioni di dollari e costano 40 miliardi di dollari all'anno solo negli Stati Uniti. Anche se è stato investito uno sforzo significativo per capire come si sviluppano le ferite croniche negli esseri umani, le domande fondamentali rimangono senza risposta. Recentemente, abbiamo sviluppato un nuovo modello murino per le ferite croniche diabetiche che hanno molte caratteristiche delle ferite croniche umane. Utilizzando topi db/db-/-, possiamo generare ferite croniche inducendo alti livelli di stress ossidativo (OS) nel tessuto della ferita immediatamente dopo la ferita, utilizzando un trattamento una tantum con inibitori specifici per gli enzimi antiossidanti catalasi e perossidasi glutathione. Queste ferite hanno alti livelli di OS, sviluppano biofilm naturalmente, diventano completamente croniche entro 20 giorni dal trattamento e possono rimanere aperte per più di 60 giorni. Questo nuovo modello ha molte caratteristiche delle ferite croniche diabetiche negli esseri umani e quindi può contribuire in modo significativo ad far progredire la comprensione fondamentale di come le ferite diventano croniche. Questo è un importante passo avanti perché le ferite croniche negli esseri umani causano dolore significativo e angoscia ai pazienti e provocano l'amputazione se irrisolto. Inoltre, queste ferite sono molto costose e dispendiose in termini di tempo per il trattamento e portano a una significativa perdita di reddito personale per i pazienti. I progressi in questo campo di studio attraverso l'uso del nostro modello di ferita cronica possono migliorare significativamente l'assistenza sanitaria per milioni di persone che soffrono in questa condizione debilitante. In questo protocollo, descriviamo in dettaglio la procedura per far sì che le ferite acute diventino croniche, cosa che non è mai stata fatta prima.

Introduction

La guarigione delle ferite comporta complessi processi cellulari e molecolari regolati temporalmente e spazialmente, organizzati in fasi sequenziali e sovrapposte che coinvolgono molti tipi di cellule diverse, tra cui, ma non solo, alla risposta immunitaria e alla vascolare sistema1. Immediatamente dopo che la pelle subisce una lesione, fattori e cellule del sangue si aggregano al sito della ferita e avviano la cascata di coagulazione per formare un coagulo. Dopo l'omeostasi raggiunta, i vasi sanguigni si dilatano per far entrare nel sito della ferita ossigeno, sostanze nutritiche, enzimi, anticorpi e fattori chemiotattici che chemoattrale polimorfonucleociti per eliminare il letto della ferita da detriti estranei e enzimi proteolitici secerneri 2. Le piastrine attivate secernono una varietà di fattori di crescita per stimolare i cheratinociti sul bordo della ferita per epitecarizzare nuovamente l'area ferita. I monociti reclutati nel sito della ferita si differenziano in macrofagi che fagocitosi batteri e neutrofili morti e secernono ulteriori fattori per mantenere i segnali cheratinociti proliferanti e pro-migranti. Nella fase di proliferazione, mentre la riepitelializzazione continua, nuovo tessuto di granulazione composto da fibroblasti, monociti/macrofagi, linfociti e cellule endoteliali continua il processo di ricostruzione2. L'angiogenesi viene stimolata promuovendo la proliferazione e la migrazione delle cellule endoteliali, con conseguente sviluppo di nuovi vasi. L'epitelizzazione e il rimodellamento della matrice extracellulare costruiscono una barriera contro l'ambiente. Come la ferita guarisce e tessuto di granulazione si evolve in una cicatrice, l'apoptosi elimina le cellule infiammatorie, fibroblasti, e le cellule endoteliali senza causare ulteriori danni ai tessuti. La resistenza alla tensione del tessuto è esaltata dai fibroblasti che rimodellano vari componenti della matrice extracellulare, come il collagene, in modo che il tessuto appena formato sia quasi forte e flessibile come la pelle non leato2.

Qualsiasi deviazione da questa progressione altamente concertata verso la chiusura delle ferite porta a ferite alterate e/o croniche3. Le ferite croniche sono caratterizzate da un aumento dello stress ossidativo, infiammazione cronica, microvascolatura danneggiata e matrice anormale del collagene nella ferita4. Lo stress ossidativo, soprattutto nella ferita, può ritardare la chiusura della ferita2,5. Quando, nella prima fase di guarigione delle ferite, la fase infiammatoria diventa non regolamentata, il tessuto ospite assume danni estesi a causa di un afflusso continuo di cellule infiammatorie5 che rilasciano enzimi citotossici, un aumento dei radicali liberi di ossigeno, e mediatori infiammatori non regolamentati, con conseguente morte cellulare6,7.

In questo microambiente distruttivo, i batteri che formano biofilm sfruttano i nutrienti dell'ospite e contribuiscono al danno del tessuto ospite2. Questi biofilm sono difficili da controllare e rimuovere perché le sostanze polimeriche extracellulari idratate composte da proteine, DNA, RNA e polisaccaridi consentono ai batteri ospitati all'interno di essere tolleranti alle terapie antibiotiche convenzionali ed eludere il risposta immunitaria innata e adattativa dell'ospite2,8,9.

Studiare le ferite croniche è fondamentale perché hanno un impatto su 6,5 milioni di dollari di persone ed costano 40 miliardi di dollari all'anno solo negli Stati Uniti10. I pazienti con diabete hanno aumentato i rischi per lo sviluppo di ferite croniche che richiedono amputazioni per contenere la diffusione dell'infezione. Questi pazienti hanno un rischio di mortalità del 50% entro 5 anni dall'amputazione attribuita al meccanismo di fisiopatologia del diabete11. La relazione tra il sistema immunitario dell'ospite e il microbioma nella guarigione delle ferite è un argomento vitale della ricerca in corso perché le conseguenze delle ferite croniche, se irrisolte, includono l'amputazione e la morte12.

Anche se uno sforzo significativo è stato investito nella comprensione di come si sviluppano le ferite croniche negli esseri umani, non è ancora chiaro come e perché si formano le ferite croniche. Gli esperimenti per studiare i meccanismi di guarigione alterata sono difficili da condurre negli esseri umani, e gli specialisti di guarigione delle ferite vedono solo i pazienti con ferite croniche che hanno già raggiunto la cronicità per settimane o mesi. Così, gli specialisti non sono in grado di studiare quali processi sono andati male che portano la ferita a svilupparsi per diventare cronica2. Mancano modelli animali che riassumono la complessità delle ferite croniche umane. Fino a quando non è stato sviluppato il nostro modello, non esisteva alcun modello per gli studi sulle ferite croniche.

Il modello della ferita cronica è stato sviluppato nei topi che hanno una mutazione nel recettore della leptina (db/db-/-)13. Questi topi sono obesi, diabetici e hanno problemi di guarigione ma non sviluppano ferite croniche14. Livelli di glucosio nel sangue media intorno 200 mg/dL, ma può essere alto come 400 mg/dL15. Quando alti livelli di stress ossidativo (OS) nel tessuto della ferita vengono indotti immediatamente dopo la ferita, la ferita diventa cronica16. Le ferite db/db-/- sono considerate croniche entro 20 giorni e rimangono aperte per 60 giorni o più. I biofilm prodotti dai batteri possono essere visti in via di sviluppo a partire da tre giorni dopo la ferita; un biofilm maturo può essere visto 20 giorni dopo il ferimento e persiste fino alla chiusura della ferita. I batteri che formano i biofilm che troviamo in questi topi si trovano anche nelle ferite croniche diabetiche umane.

Lo stress ossidativo è indotto dal trattamento delle ferite con due inibitori di enzimi antiossidanti, catalasi e glutathione perossidasi, due enzimi con la capacità di abbattere il perossido di idrogeno. Il perossido di idrogeno è una specie reattiva di ossigeno e può causare danni cellulari attraverso l'ossidazione di proteine, lipidi e DNA. Catalase catalizza la decomposizione del perossido di idrogeno in ossigeno e acqua chimici meno nocivi. 3-Amino-1,2,4-triazole (TT) inibisce la catalasi legando specificamente e covalentmente al centro attivo dell'enzima, inattivandolo17,18,19. L'ATA è stato utilizzato per studiare gli effetti dello stress ossidativo sia in vitro che in vivo attraverso l'inibizione della catalise20,21,22,23,24. Glutathione perossidase catalizza la riduzione del perossido di idrogeno attraverso l'antiossidante, glutathione, ed è un enzima importante che protegge la cellula contro lo stress ossidativo25. L'acido mercaptosuccinico (MSA) inibisce la glutathione peroxidasi legandosi al sito attivo selenocisteine dell'enzima con tiol, inattivandolo26. MSA è stato utilizzato per studiare gli effetti dello stress ossidativo in vitro e in vivo così come20,27,28.

Questo nuovo modello di ferite croniche è un modello potente da studiare perché condivide molte delle stesse caratteristiche osservate nelle ferite croniche diabetiche umane, tra cui l'infiammazione prolungata da un aumento del sistema operativo e la formazione di biofilm naturale dal microbioma cutaneo. Le ferite hanno alterate l'interazione dermicaia, deposizione anomala di matrice, scarsa angiogenesi e vascolatura danneggiata. Le ferite croniche si svilupperanno sia nei topi maschi che in quella femminile, quindi entrambi i sessi possono essere utilizzati per studiare le ferite croniche. Pertanto, il modello di ferita cronica può contribuire in modo significativo a far progredire la comprensione fondamentale di come iniziano tali ferite. L'utilizzo di questo modello di ferita cronica può fornire risposte a domande fondamentali su come la cronicità viene iniziata / ottenuta attraverso i contributi della fisiologia della guarigione alterata delle ferite e del microbioma dell'ospite.

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Protocol

Tutti gli esperimenti sono stati completati in conformità e il rispetto delle normative federali e la politica e le procedure dell'Università della California sono state approvate dall'Università della California, Riverside IACUC.

1. Animale

  1. Utilizzare diabetico e obesi B6. BKS(D)-Mouse Leprdb/J per il modello di ferita cronica. Le opzioni di acquisto includono eterozigoti per l'allevamento o omozigoti direttamente per esperimenti.
  2. Alleva maschi e donne eterozigoti per produrre prole. Solo un quarto dei rifiuti abbandonati, statisticamente, crescerà fino a diventare diabetico e obeso (db/db-/--).
  3. Topi di svelto e casadb/db/- insieme ai loro compagni di cucciolata 3 settimane dopo la nascita. Separare i topi db/db-/- dai loro compagni di cucciolata 5 settimane dopo la nascita e la casa con altri topi db/db/- fino a quando non hanno 5-6 mesi e possono essere utilizzati per il modello di ferita cronica. Durante questo periodo, può svilupparsi un microbioma cutaneo maturo e complesso.
    NOTA: I topi db/db-/- sono facilmente identificabili visivamente dai littermates tra 3-5 settimane di età. I topi db/db -/- sono obesi, sono diabetici e saranno significativamente più grandi e più rotondi rispetto al tipo selvaggio e ai compagni di lettiera eterozigosia. Il loro addome può apparire leggermente più rosa e i fianchi più grandi. L'aumento di peso deve essere confermato prima dell'intervento chirurgico. Inoltre, è possibile misurare alti livelli di glucosio nel sangue e genotipo del topo per confermare la mutazione nel recettore della leptina.

2. Vivarium e marito

  1. Casa db /db-/- topi in un vivaio convenzionale (non una barriera / struttura specifica patogeno libero) in modo che una microflora può essere stabilita sulla pelle di db / db-/- topi. Per modellare specificamente gli esseri umani che soffrono di ferite croniche, non prendere precauzioni speciali per prevenire l'esposizione a agenti patogeni.
  2. Proteggere le gabbie con piani di micro isolatore per ridurre al minimo la diffusione dell'infezione all'interno del vivaio. Cambia le gabbie due volte a settimana con nuove lenzuola e dai da mangiare ai topi con un normale vivarium. Non autoclave sia la biancheria da letto o il cibo.
  3. Impostare la temperatura ambiente a distanza compresa tra 21 e 24 gradi centigradi, con piccole fluttuazioni a seconda del periodo dell'anno. L'umidità, riflettente del clima e della posizione, varia tra il 19 e il 70%.

3. Requisiti per lo sviluppo di ferite croniche

  1. Utilizzare solo topi maschi e femmine che sono fenotipicamente obesi, diabetici, e almeno 5-6 mesi di età per lo sviluppo di ferite croniche. Il peso di questi topi dovrebbe variare tra 40-80 g, in media circa 60 g.
  2. Non utilizzare topi considerati obesi ma pesano meno di 50 g.
    NOTA: A tutti i topi a cui si fa riferimento in questo protocollo passano le qualifiche qui descritte se non diversamente specificato.

4. Rasatura e applicazione della Lozione Depilatoria

NOTA: Rimuovere i capelli indesiderati sul dorsum del mouse prima di ferire. La seguente procedura viene eseguita su topi db/db-/- dal vivo che non sono in anestesia il giorno prima dell'intervento chirurgico. Prendere precauzioni per prevenire lo stress e danni all'animale.

  1. truciolo
    1. Posizionare il mouse su una superficie pulita e afferrare la base della coda del mouse con il pollice e il secondo dito per fissare la posizione del mouse. Il mouse può saltare o fare movimenti improvvisi; in caso affermativo, rispondere rapidamente e tirare indietro i clipper per evitare lesioni.
    2. Rasare i capelli del mouse con un tagliacapelli (Figure 1A, 1B). Posizionare la lama parallela alla pelle del mouse e radere l'intera schiena dal collo alla coda, compreso tutto intorno alla coda, per consentire una superficie sufficientemente grande per posizionare una pellicola trasparente medicazione (vedere Tabella dei materiali). Eseguire leggermente la lama contro la direzione di crescita dei capelli per il taglio più efficiente. (Figura 1B).
      1. Non premere la lama profondamente nella pelle, poiché può danneggiare la pelle da lividi o taglio.
  2. Applicazione della lozione depilatoria
    NOTA: Utilizzare lozione depilatoria per ottenere una pelle molto liscia in modo che la medicazione trasparente possa aderire saldamente.
    1. Immergere la pelle del topo con acqua per evitare ustioni chimiche premendo leggermente una salvietta di carta inzuppata contro la pelle rasata con una pressione sufficiente a bagnare i capelli già tagliati contro la pelle.
    2. Mentre la pelle è bagnata, strofinare leggermente la pelle del topo con un piccolo ciuffo di lozione depilatoria (vedi Tabella dei materiali) per 15-20 s ( Figure1C, 1D). Stendere completamente la lozione ovunque i capelli siano stati tagliati corti. Utilizzare più lozione se il mouse è più grande.
    3. Non applicare lozione sulle orecchie del mouse, della coda o in qualsiasi punto vicino al viso. Se la lozione arriva sulle orecchie o sulla coda, basta pulire con una salvietta di carta bagnata fino al risciacquo. Se la lozione arriva sul viso del mouse, lavare immediatamente il mouse sotto rubinetto in esecuzione o acqua divinizzata per evitare danni agli occhi, al naso e alla bocca.
    4. Lasciare la lozione per reagire con i capelli per un ulteriore 20-45 s dopo l'applicazione.
    5. Prima di risciacquare, controllare il completamento della reazione depilatoria asciugando leggermente la lozione dalla pelle in varie posizioni (Figura 1E) con un dito guantato o una spatola metallica sottile. La reazione è completa se la pelle è rosa senza la presenza di capelli neri. È meglio controllare rapidamente che i capelli siano stati effettivamente rimossi prima del risciacquo che risciacquare prematuramente e poi dover applicare di nuovo la lozione.
  3. Risciacquo
    NOTA: Una volta verificato il completamento della reazione di rimozione dei peli, lavare il mouse con rubinetto o acqua dionizzata per rimuovere la lozione depilatoria e prevenire ustioni chimiche.
    1. Posizionare il mouse sulla mano guantata sinistra e premere la base della coda contro il palmo con il pollice sinistro per evitare che il mouse si muova. Chiudere e raddrizzare il resto delle dita sinistre per evitare che il mouse morda.
    2. Posizionare il mouse in modo che la regione faccia / testa è lontano dal flusso d'acqua e il flusso di acqua tiepida può cadere dietro la testa e solo sul retro. Strofinare rapidamente ma delicatamente la parte posteriore del mouse con la mano guantata destra per lavare via la lozione.
    3. Una volta che la pelle del mouse è libera dalla lozione, pulire rapidamente il mouse con un tovagliolo di carta per assorbire la maggior parte dell'acqua (Figura 1F).
  4. Cura dopo la rasatura e la depilazione
    1. Controllare e pulire qualsiasi lozione depilatoria residua che può rimanere sulle orecchie e sulla coda con una salvietta di carta bagnata.
    2. Riposizionare il mouse nella sua gabbia individuale e posizionarla su una piastra di riscaldamento (40-45 gradi centigradi) per circa 30 min. Il mouse dovrebbe tornare al comportamento normale, correre intorno, e lo sposo stesso entro pochi min.
    3. Casa ogni topo in una gabbia separata per tutta la durata dell'esperimento. La pelle dei topi non è più protetta e può essere facilmente graffiata e morsa da altri topi.
    4. Dal momento che la lozione depilatoria può avere lievi effetti irritanti che possono interferire con o alterare il processo di guarigione della ferita, attendere 18-24 h prima dell'intervento chirurgico per consentire alla pelle del mouse di calmarsi e il mouse per adattarsi alla mancanza di capelli sulla schiena.
  5. Rimozione dei capelli dalla pelle con pigmentazione scura
    NOTA: Alcuni topi db/db-/- avranno potenzialmente macchie scure nella pelle che avranno i capelli che ricrescono più velocemente e più forte della pelle senza queste macchie. (Figura 2A). Queste aree scure della pelle appaiono di colore più scuro a causa di follicoli piliferi stadio anagen medio-tardi e/o incontinenza pigmento29,30.
    1. Se si notano macchie scure, applicare di nuovo lozione depilatoria, ma solo in queste aree, e ripetere i passaggi 4.2 e 4.3(Figura 2B, 2C).
      NOTA: Le macchie scure della pelle cresceranno i capelli più velocemente per tutta la durata dell'esperimento, in modo da ritagliare i capelli corti ogni 3-5 giorni, quando necessario. Un cerotto o due lontano dalla posizione desiderata della ferita è accettabile. Se la parte posteriore del mouse è significativamente coperta da queste macchie scure, non utilizzare questo mouse per il modello di ferita cronica.

5. Configurazione reagente

NOTA: Lo sviluppo di ferite croniche nei topi db/db-/- viene effettuato mediante trattamento con inibitori specifici per catalasi e glutathione peroxidase, 3-amino-1,2,4-triazole (AT) e acido mercaptosuccinico (MSA), rispettivamente16 . La seguente procedura descrive in dettaglio la dose e la somministrazione dell'analgesia e degli inibitori in base al peso del topo.

  1. Iniettare l'antidolorifico Buprenex intraperitonealmente a 0,05 mg/kg mouse in PBS sterile. Iniettare un volume di 120 o L per un topo da 60 g circa 30 min prima dell'intervento chirurgico. Somministrare un'altra dose 6 h dopo l'intervento chirurgico. Una dose supplementare può essere somministrata se necessario.
  2. Iniettare intraperitonelmente AT a 1 g/kg di mouse in PBS sterile. Iniettare un volume di 480 -L per un topo da 60 g circa 20 min prima dell'intervento chirurgico. Iniettare metà del volume sul lato sinistro dell'addome e l'altra metà sul lato destro.
  3. Depositare topicamente MSA sulla ferita tra la medicazione trasparente e il tessuto della ferita a 150 mg/kg di topo in PBS sterile. Amministrare un volume di 60 o L per un topo da 60 g entro 10 min dopo l'intervento chirurgico.

6. Chirurgia

NOTA: il successo del modello di ferita cronica si basa su condizioni non sterili. Questi topi non sono privi di germi e sono alloggiati in un vivaio convenzionale. Il microbioma batterico che risiede nella pelle è cruciale per la successiva avvio e sviluppo di ferite croniche al momento del trattamento con inibitori di enzimi antiossidanti. Pertanto, la preparazione pre-chirurgica tradizionale del sito è contro-indicata.

  1. Iniezione intraperitoneale
    1. Fissare il mouse sulla parte inclinata del rack gabbia e tenere la coda con il mouse comodamente in piedi con la testa inferiore al corpo del mouse. Questo assicura che cerchiamo di spostare gli organi interni il più lontano possibile dal punto di iniezione possibile.
    2. Inserire l'ago nel quadrante inferiore destro dell'addome per evitare l'iniezione nella vescica o in altri organi addominali.
    3. Aspirare l'ago prima dell'iniezione.
  2. Trattamento e anestesia
    1. Somministrare Buprenex 30 min e AT -20 min prima dell'intervento chirurgico, come descritto in Passaggi 5.1 e 5.2.
    2. Posizionare il mouse in un piccolo contenitore di plastica sopra un riscaldatore, come mostrato nella Figura 3A per circa 15-20 min. Fornire supporto termico prima della procedura protegge contro la mortalità potenziale.
    3. Posizionare una salvietta di carta o un tovagliolo di carta sopra la parte superiore del piccolo contenitore per contenere meglio il calore. Il mouse dovrebbe calmarsi mentre si riscalda. Figura 3 B mostra i materiali necessari per la chirurgia.
    4. Posizionare il mouse in un contenitore chiuso che è collegato al vaporizzatore isoflurano nel cofano chimico se si utilizza un sistema aperto.
    5. In un sistema aperto, amministrare 5% isoflurane per 1-2 min ad una portata di 2-3.5 L/min. Monitorare continuamente lo stato del mouse.
      1. Una volta che il mouse è incosciente o non è più in movimento, posizionare il mouse su un pad chirurgico bianco e montare la testa con un cono naso che è fissato al vaporizzatore per consentire la continua somministrazione di isoflurane durante l'intervento chirurgico.
    6. In un sistema aperto, somministrare il 2-3% dell'isoflurane alla stessa portata durante l'intervento chirurgico e adattarsi al flusso di isoflurane per mantenere la profondità dell'anestesia.
    7. Ridurre al minimo sia la concentrazione che la durata dell'isoflurane somministrato durante l'intervento chirurgico. db/db (db) -/- i topi sono molto sensibili all'anestesia, quindi è meglio ridurre al minimo l'esposizione agli isoflurani. Se il mouse è ancora reattivo dopo 2 min al 5% isoflurane, fissare il cono naso e somministrare 3-5% isoflurane per 15-30 s prima di iniziare l'intervento chirurgico.
      1. Confermare la corretta anestesizzazione prima di ferire. La profondità di anestesia è confermata dalla mancanza di risposta agli stimoli fisici come il forte pizzico delle dita dei dei dei diici. Il periodo di tempo del topo sotto l'anestesia inalata è inferiore a 5 min, quindi nessun unguento veterinario viene applicato agli occhi.
  3. che lascia il segno
    1. Spruzzare una salvietta di carta con 70% di etanolo o una towelette clinica di etanolo e pulire la parte posteriore del mouse per pulire l'area del sito della ferita. Pulire la superficie della pelle in modo che la medicazione trasparente possa aderire saldamente, poiché la polvere della biancheria da letto, del cibo o della pelle può impedire che la medicazione si attacchi correttamente (Figura 4A). Non pulire eccessivamente, o ci sarà il rischio di uccidere i batteri presenti sulla pelle.
    2. Determinare la posizione del sito della ferita. Il posto migliore per eseguire la ferita è sul lato dorsale del mouse, centrato e lontano da macchie di pelle con una maggiore pigmentazione.
      NOTA: Abbiamo stabilito per esperienza che questi topi possono sopportare solo il peso di una ferita.
    3. Creare una ferita entro 30-45 s utilizzando un punzone di biopsia della pelle di 7 mm, pinzette e forbici chirurgiche. Premere leggermente il punzone biopsia sul sito della ferita desiderata e ruotare il pugno abbastanza profondo da lasciare una leggera impressione del pugno (Figura 4B). Asciso la pelle delineata tirando su il centro del punzone con una pinzetta e tagliando lungo il contorno con forbici chirurgiche (Figure 4C-4E).
    4. Coprire saldamente la ferita con mezzo pezzo di pellicola trasparente (6 cm x 3,5 cm).
    5. Interrompere l'amministrazione del 2% isoflurane al mouse (Figura 4F).

7. Trattamento e recupero post-chirurgia

  1. Somministrare il trattamento MSA dopo l'intervento chirurgico completo e la medicazione trasparente viene applicata come descritto nel passaggio 5.3. Depositare MSA sull'area della ferita sotto la medicazione.
  2. Posizionare il mouse di nuovo nel piccolo contenitore sul pad di riscaldamento per 30 min per aiutare con il recupero. Una volta che il mouse si è riscaldato, rimettere il mouse nella sua gabbia. L'effetto dell'isoflurane è temporaneo e il topo dovrebbe muoversi poco dopo.
  3. Non lasciare i topi incustoditi né riportarli al vivaio fino a quando i topi non hanno ripreso conoscenza sufficiente per mantenere la recumbenza severa.
    NOTA: L'anestesia di scelta quando si lavora con questi topi è isoflurane proprio a causa della sua rapida induzione e successiva comparsa dall'anestesia.
    1. Topo di casa che hanno subito un intervento chirurgico individualmente per evitare che un topo interferisca con la ferita cronica di un altro. Come detto sopra, non ritornano al vivaio fino a completa ripresa.
  4. Somministrare la seconda dose di Buprenex 6 h dopo l'intervento chirurgico.
  5. Osservare attentamente i topi per le prime 48 h dopo l'intervento chirurgico.
    NOTA: L'intervento chirurgico, accoppiato con gli inibitori per creare la ferita cronica, è molto stressante per l'animale che è già sia diabetico che obeso. I topi che sopravvivono ai primi due giorni dopo l'intervento chirurgico di solito sopravvivono alla durata dell'esperimento.

8. Raccolta dei dati, strategie di sopravvivenza, gestione del mouse dopo il ferire e suggerimenti aggiuntivi

  1. Raccolta dati
    1. Scattare foto già dopo l'intervento chirurgico. I biofilm sono osservati ovunque tra 5-10 giorni dopo la ferita, e già 3 giorni.
    2. Se i batteri sono al centro dell'analisi, far rotolare uno swap sterile con la pressione della luce intorno alla ferita per 10-15 s. Conservare il tampone, in un congelatore appropriato per la coltura o asciugare senza alcun supporto per l'analisi del sequenziamento indipendente dalla cultura, a -80 gradi centigradi. Raccogliere le sostanze polimeriche extracellulari attraverso una spatola metallica sterile in un tubo di microcentrifuga e conservare a -80 gradi centigradi prima dell'analisi.
    3. Non somministrare l'anestesia al topo durante la manipolazione per la raccolta di biofilm o per scattare foto. Durante queste procedure, posizionare un pezzo di cibo davanti al mouse per calmare il mouse e impedirne l'esaurimento. La maggior parte dei topi salirà in cima al cibo, si siederà su di esso e non si muoverà.
  2. Poiché infezioni secondarie e ferite croniche o ulcere indesiderate possono svilupparsi se il topo non si muove correttamente o se la medicazione non viene applicata correttamente, controllare periodicamente l'attività del topo e il lato ventrale per le piaghe. L'attrito tra la pelle e la biancheria da letto bagnata (db/db-/- topi sono poliurici) può disturbare la pelle se le gabbie non vengono cambiate frequentemente.
    NOTA: L'accumulo di liquidi sotto la medicazione può causare la perdita dell'adesivo e la perdita del fluido. Cellule morte della pelle, biancheria da letto, e la materia fecale possono quindi attaccarsi alla pelle e indurire. Queste macchie secche e aggregati sulla pelle devono essere cancellati prontamente per prevenire un'infezione secondaria.
  3. Se i topi stanno in piedi o si siedono sulle zampe posteriori, spostare questi topi in una gabbia dove l'accesso al cibo e all'acqua è molto più basso. Se la posizione del cibo e dell'acqua nella gabbia è alta, il topo può stare in piedi o sedersi sulle zampe posteriori per raggiungerlo. La maggior parte dei topi non avrà problemi a mangiare e bere se potevano farlo prima dell'intervento chirurgico, anche se c'è la possibilità che alcuni topi potrebbero capovolgersi sulle loro schiene. Questi "flipper" possono avere grandi difficoltà a girarsi, quindi avranno bisogno di assistenza e di ulteriore monitoraggio.
  4. Lasciare la medicazione trasparente sulla pelle per un massimo di 20 giorni se la pelle è libera da detriti, pelle flakey e capelli. Se uno di questi si verifica sulla pelle, rimuovere la vecchia medicazione e applicare un nuovo pezzo.
    1. Per togliere il condimento, pizzicare leggermente la pelle direttamente dietro la testa, quindi allontanare la medicazione dalla testa in un movimento liscio.
    2. Per posizionare un pezzo di medicazione in modo sicuro, avere il mouse stare il più immobile possibile. È importante che la pelle sia pulita e priva di cellule morte traballanti della pelle, polvere dalla biancheria da letto e pezzi di cibo. Mettere e premere la medicazione nella pelle intorno alla ferita per fissare.
    3. Se mettere un pezzo di cibo davanti al mouse non limita i suoi movimenti, quindi posizionare il mouse sulla parte superiore della gabbia di filo. Una volta che il topo ha afferrato un rallo sulla gabbia, tenere la coda il più vicino possibile al corpo e tirare con la forza minima. Come il mouse tira in avanti la schiena si allungherà e raddrizzare per una facile applicazione; posizionare la medicazione in modo sicuro a questo punto.
    4. Non riutilizzare mai una vecchia medicazione. Applicare sempre una nuova medicazione sul retro per la massima adesione.

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Representative Results

La figura 5 illustra un esempio di una ferita senza trattamento degli inibitori che progrediscono verso la chiusura della ferita e una ferita con trattamento degli inibitori che progrediscono verso la cronicità. La medicazione trasparente è stata lasciata in posizione sulla ferita cronica in modo da poter vedere il biofilm e l'accumulo di liquidi.

L'avvio cronico della ferita avviene in meno di 6 ore e il margine della ferita è visibilmente alterato dallo stress ossidativo. Le prove istologiche di questo margine della ferita rivelano che il tessuto è necrotico e non parteciperà alla guarigione della ferita. I batteri che formano il biofilm nella ferita possono in seguito utilizzare questo tessuto necrotico come fonte di nutrienti e componenti strutturali per produrre biofilm. Una ferita cronica è una ferita che rimane aperta, ingrandita rispetto alla ferita iniziale, contiene biofilm (EPS più batteri patogeni trovati nelle ferite croniche umane) e richiede mesi o anni per guarire a seconda della quantità e del contenuto del biofilm che previene la ferita si risolve normalmente. Nel modello di ferita cronica, la cronicità completa è impostata su > 20 giorni dopo l'intervento chirurgico perché le ferite non trattate con gli inibitori si chiuderanno da questo momento (Figura 5). La guarigione in genere richiede > 60 giorni e il tempo dipende dai batteri patogeni primari presenti nella ferita. A volte i topi possono soccombere all'infezione quando batteri più aggressivi che formano biofilm, come Pseudomonas, sono predominanti nella ferita. Così, una ferita cronica è definita come una ferita che non si chiude entro 20 giorni, richiede più di 60 giorni per guarire e ha biofilm presente sulla ferita.

Differenze di sesso sono state trovate in vari modelli di diabete, tra cui il modello db/db-/- del topo32,33. Mentre tali differenze esistono, abbiamo osservato che il sesso non è un fattore significativo nello sviluppo di ferite croniche. Le ferite croniche nei topi maschi e femmine si sviluppano in misura simile, quindi entrambi i sessi possono essere utilizzati per studiare le ferite croniche. Pertanto, l'utilizzo di questo modello è vantaggioso in quanto le ferite croniche umane possono essere trovate sia sui pazienti diabetici maschi che su quella femminile.

Figure 1
Figura 1 . Rasatura e processo di depilatorio. (A) Il topo prima della rasatura. (B) La pelle del mouse è rasata per rimuovere la maggior parte dei capelli sul retro. (C) Un ciuffo di lozione depilatoria sulla punta di un dito. Più viene utilizzato se il mouse è più grande. (D) La parte posteriore del mouse è coperta da lozione depilatoria e lasciata reagire. (E) Una spatola viene utilizzata per raschiare parte della lozione per vedere se i capelli sono stati rimossi. Pelle rosa brillante senza alcuna presenza di capelli è indicativo che la depilazione è completa. (F) La lozione sul retro viene rimossa con acqua corrente. La pelle del topo dovrebbe essere leggermente rosa. Questa cifra è stata modificata da Kim e Martins-Green31. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 2
Figura 2 . Rimozione dei capelli da macchie più piccole di pelle scura. (A) Il topo è già stato trattato una volta e la pelle è di nuovo bagnata per prevenire ustioni. (B) La lozione depilatoria viene applicata solo sulla macchia di pelle che è scura e ha i capelli densi. (C) La lozione viene lavata via dopo la reazione per rivelare la macchia scura della pelle senza capelli. Questa cifra è stata modificata da Kim e Martins-Green31. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 3
Figura 3 . Pre-chirurgia istituito. (A) I topi che devono essere feriti sono collocati in piccoli contenitori di plastica sopra un pad di riscaldamento. (B) Alcuni dei materiali utilizzati in chirurgia sono mostrati. Le forbici chirurgiche devono essere affilate per garantire che la pelle non venga schiacciata quando viene tagliata. La medicazione trasparente è tagliata a metà. Questa cifra è stata modificata da Kim e Martins-Green31. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 4
Figura 4 . Fare la ferita da escissione. (A) Dopo che il mouse è sotto anestesia, la parte posteriore del mouse viene asciugata con 70% di etanolo una volta. (B) Il punzone di biopsia cutanea viene posizionato sul retro del mouse e premuto abbastanza forte da lasciare un'impressione. Il punzone biopsia può essere ruotato per fare un'incisione superficiale. (C) Il centro dell'area delineata è pizzicato con una pinzetta e una forbice chirurgica acuta viene utilizzata per fare l'incisione iniziale. (D) Le forbici chirurgiche vengono manovrate per tagliare lungo il contorno realizzato dal punzone biopsia. (E) Una regione della pelle delineata dalla pompa di biopsia viene assordata con successo. (F) La medicazione trasparente è posizionata sul retro del mouse e fissata. Questa cifra è stata modificata da Kim e Martins-Green31. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

Figure 5
Figura 5 . Immagini di ferite. (A) La ferita su un topo in tempi successivi dopo l'intervento chirurgico mentre progredisce nella cronicità a partire dal giorno dell'intervento chirurgico. Biofilm può essere visto già il giorno 5 e rilevato già il giorno 3. La ferita è completamente cronica con un forte biofilm il giorno 20. (B) Esempi di ferite croniche umane, in particolare ulcere del piede diabetico. Questa cifra è stata modificata da Kim e Martins-Green31. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.

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Discussion

Una volta che le ferite croniche vengono create sui topi, il modello può essere utilizzato per studiare i processi di guarigione delle ferite alterate coinvolti nell'avvio della cronicità. Il modello può anche essere utilizzato per testare l'efficacia di una vasta gamma di sostanze chimiche e farmaci che possono invertire lo sviluppo cronico delle ferite e la guarigione compromessa e portare alla chiusura e alla guarigione delle ferite. È possibile studiare diversi punti temporali dopo l'inizio della cronicità: ad esempio, giorni 1-5 dopo il ferimento per l'inizio precoce della cronicità e giorni 20 e oltre per le ferite croniche a piena forza.

Il modello di ferita cronica è anche un potente modello per studiare vari aspetti della guarigione delle ferite e complicazioni come bioburden e cachessia. Il bioburden è solo uno dei tanti aspetti delle ferite croniche che possono essere studiate in questo modello, in quanto colpisce anche le ferite croniche umane. Le nostre procedure e il protocollo di utilizzo degli animali identificano chiaramente la sintomatologia da monitorare, insieme a un programma di monitoraggio definito. Gli animali identificati come morbosi, sulla base di criteri approvati Da IACUC, sono eutanasia per evitare sofferenze significative. Inoltre, il Veterinario Universitario e il Tecnico della Salute Animale vengono consultati quando sorgono alcune sintomologie e forniscono una guida di supporto nella valutazione dei criteri.

I passaggi critici all'interno del protocollo includono l'alloggiamento dei topi db/db-/- in un vivaio convenzionale, la rimozione dei capelli con lozione depilatoria e il riscaldamento prima della somministrazione dell'isoflurane. Lo sviluppo di ferite croniche nel modello delle ferite croniche si basa su condizioni e pratiche non sterili. Questi topi non sono privi di germi e non crescono in vivai molto puliti. La microflora che risiede nella pelle è cruciale per la successiva avvio e sviluppo di ferite croniche al momento del trattamento con inibitori per gli enzimi antiossidanti. Questi topi db/db-/-- devono essere esposti a un ambiente che contiene batteri, sia commensali che patogeni. Se la pelle viene pulita e disinfettata con iodio o altri metodi antisettici prima dell'intervento chirurgico al fine di "sterilizzare" la pelle, la ferita non può diventare cronica. I batteri nel microbioma cutaneo sono necessari per la formazione e lo sviluppo di biofilm e ritardano la guarigione e la chiusura delle ferite. Nella clinica, la presenza di biofilm in una ferita complica ulteriormente i processi di guarigione della ferita e aumenta il rischio di amputazione negli esseri umani se l'infezione nella ferita non è controllata.

Rimuovere i capelli con lozione depilatoria è un passo importante per rimuovere i capelli in eccesso e consentire una superficie liscia e pulita per la medicazione trasparente per aderire saldamente. La lozione depilatoria utilizzata in questo protocollo è un depilatorio chimico con aloe aggiunto per ridurre al minimo le ustioni. Questo prodotto è minimo nell'alterare la morfologia della pelle e nel preservare il microbioma cutaneo. Il prodotto elencato nella Tabella dei Materiali è raccomandato rispetto ad altri prodotti per la rimozione dei capelli, compresi i depilatori fisici e meccanici (cere ed epilatori commerciali) che possono bruciare e tirare sulla pelle e/o uccidere il microbioma cutaneo. Anche se questo discurario chimico è fisicamente delicato, può ancora irritare leggermente la pelle, un effetto che potrebbe alterare i processi di guarigione della ferita. Così, è più efficace aspettare 18-24 ore prima dell'intervento chirurgico per consentire alla pelle di recuperare dalla procedura e garantire che la pelle e la ferita non sono influenzati da esso.

Questi topi sono estremamente docili e non rispondono ai fattori di stress. Sono molto facili da maneggiare senza anestesia. Non siamo riusciti a trovarti abbastanza velocemente! Se la base della coda del mouse è fissata con il pollice e il secondo dito, il mouse non sarà in grado di scappare o tornare indietro al morso a causa delle loro grandi dimensioni del ventre. È importante sottolineare che, nella nostra esperienza, questi topi sono estremamente sensibili all'anestesia, soprattutto in relazione alla perdita di omeostasi. Così, in consultazione con il nostro IACUC, è stato stabilito che l'opzione migliore è quella di limitare l'amministrazione anestetica.

Lo scopo principale di questo modello è quello di creare una grande ferita non curativa sulla schiena, quindi una volta che una ferita è fatta, tenendo un topo convenzionalmente per fare iniezioni IP di buprenex aggiuntivi o altri trattamenti chimici periodicamente è impossibile. Tenendo il mouse dalla pelle dorsale provoca al mouse un sacco di disagio e molto probabilmente dolore se il topo è tenuto in modo così tradizionale; così, tutta l'iniezione con il lato destro del mouse mentre è in piedi su tutti e quattro i piedi. Altri esperimenti che utilizzano il ceppo db/db-/- utilizzano questi topi quando sono più giovani e non pesano altrettanto, quindi il modo tradizionale di eseguire un'iniezione IP può essere utilizzato. Poiché il modello di ferita cronica utilizza topi fino a 6 mesi di età e questi topi possono pesare fino a 80 g, il metodo convenzionale non è ottimale e può potenzialmente danneggiare il mouse. Abbiamo utilizzato il metodo descritto sopra per un topo questo obesi e non hanno osservato alcun esito negativo quando iniettato con questo metodo con aspirazione di successo.

In precedenza, l'anestesia iniettabile come la chetamina e la xilola, sono stati utilizzati; tuttavia, si sono rivelati difficili da utilizzare con i mouse db/db -/--. Con un tempo di funzionamento totale inferiore a 5 minuti, il lungo tempo di induzione e recupero non era necessario ai fini dell'esperimento. L'Isoflurane era determinato per essere la migliore scelta di anestesia per questa procedura a causa di facile amministrazione e titolazione, rapido insorgenza e recupero, e adeguata profondità anestetica. Inoltre, isoflurane provoca depressione cardiaca minima e mantiene BP molto bene34. Quindi, un cambiamento importante nella procedura per il modello della ferita cronica è stato quello di utilizzare l'isoflurane come l'anestesia preferita.

Il riscaldamento prima dell'intervento chirurgico è importante per prevenire la mortalità nei 2-3 giorni successivi all'intervento chirurgico. Questi topi hanno una temperatura corporea significativamente più bassa35 e non sono in grado di controllare la loro temperatura corporea in modo efficace a causa della loro manipolazione genetica, quindi viene fornita una fonte di riscaldamento esterna prima dell'intervento chirurgico per proteggere contro il ulteriore calo della temperatura corporea del nucleo indotta dall'anestesia. Abbiamo valutato la necessità di un pad di riscaldamento prima, durante e dopo l'intervento chirurgico. È importante notare che i topi db/db-/- hanno risposte fisiologiche insolite. Empiricamente, abbiamo scoperto che questi topi sono protetti in modo più efficace con supporto termico pre e post-chirurgico. Sostituendo l'isoflurane come anestetico, abbiamo misurato e determinato che la temperatura corporea del nucleo non scendeva in modo significativo durante gli meno di cinque minuti di intervento chirurgico. Anche se abbiamo trovato il supporto termico pre e post-chirurgico come critico per questi topi, non abbiamo trovato il supporto chirurgico al calore per avere un effetto. Va notato che il presidente IACUC ha fornito indicazioni e monitorato i nostri test relativi alla temperatura e agli effetti anestetici. Mentre comunichiamo questo metodo, troviamo importante indicare ciò che è necessario per il successo della procedura.

Una limitazione dell'utilizzo di questo metodo per studiare lo sviluppo di biofilm è il fatto che i batteri presenti sulla ferita e la produzione del biofilm non sono controllati. Se si vuole studiare uno specifico batterio che forma biofilm, questo modello può essere utile se il microbioma nativo può essere abolito prima di ferire attraverso lo iodio o altri metodi antisettici. In risposta a livelli eccessivi di stress ossidativo, i batteri patogeni chiave nel microbioma cutaneo sono stimolati per avviare la formazione di biofilm. Nelle nostre ferite croniche, i batteri che formano biofilm includono, ma non sono limitati a, Pseudomonas aeruginosa36,37,38,39, Cloae Enterobacter37, 38 Mi lasa , 39, e vari Staphylococcus40,41 e specie di Corynebacterium 41,42,43,44, 45, tutti che possono essere trovati nelle ferite croniche umane. Diversi studi sul microbioma cronico sono stati condotti su ferite croniche umane per i batteri39,40,41,43,44,45 e funghi46,47 comunità, comprese le indagini longitudinali associate a scarsa guarigione48,49. Studi longitudinali di questo tipo possono anche essere seguiti con il modello di ferita cronica.

È importante riconoscere che si possono ottenere risultati diversi a causa delle differenze nelle condizioni, nelle forniture e nelle attrezzature, nelle attrezzature e nelle colonie di origine per i topi db/db-/-. Per ridurre al minimo tali differenze, a condizione nel protocollo è l'esatta varietà di topi e la fonte che viene utilizzata per l'esperimento della ferita cronica. Per l'allevamento di questi topi, i marchi esatti di biancheria da letto e cibo sono stati forniti nella Tabella dei Materiali per limitare la variabilità. Nei nostri esperimenti, troviamo che l'elevato stress ossidativo è necessario e sufficiente per creare ferite croniche in questi topi, purché i topi siano alloggiati in un vivaio convenzionale ed esposti ai batteri. Le popolazioni e le comunità batteriche possono differire con la vivia; tuttavia, fintanto che una struttura priva di germi non viene utilizzata per ospitare i topi, dovrebbero avere abbastanza batteri, sia commensici che patogeni, per risiedere sui capelli e sulla pelle.

Questo metodo di creazione di ferite croniche in questo protocollo è significativo per studiare le ferite croniche e la guarigione alterata delle ferite perché solo i livelli di stress ossidativo sono significativamente alterati sperimentalmente. Lo stress ossidativo è necessario per i normali processi di guarigione delle ferite2. È importante per la regolazione tempestiva e una componente cruciale nella funzionalità delle cellule necessarie per la guarigione delle ferite5. Tuttavia, quando i livelli di stress ossidativo non sono controllati, le specie reattive dell'ossigeno possono danneggiare le cellule endotelio, inibire la funzionalità cheratinocito e ritardare la chiusura della ferita2,5. Le ferite croniche umane hanno alti livelli di stress ossidativo50. Il modello murino ha glucosio nel sangue elevato e già aumentato i livelli di stress ossidativo a causa della sua morbilità. Queste caratteristiche sono condivise con gli esseri umani che convivono con il diabete e forniscono un microambiente favorevole alla cronicità dopo aver subito lesioni50. Gli esseri umani ospitano anche microbiota diversificato e complesso in molte posizioni del corpo, compresa la pelle, quindi un microbioma complesso, ma naturale, è permesso di svilupparsi sulla pelle del topo.

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Disclosures

Gli autori dichiarano di non avere interessi finanziari concorrenti.

Acknowledgments

Gli autori non hanno riconoscimenti.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
B6.BKS(D)-Leprdb/J  The Jackson Laboratory  00697 Homozygotes and heterozygotes available 
Nair Hair Remover Lotion with Soothing Aloe and Lanolin Nair a chemical depilatory
Buprenex (buprenorphine HCl) Henry Stein Animal Health 059122 0.3 mg/ml, Class 3
3-Amino-1,2,4-triazole (ATZ) TCI A0432
Mercaptosuccinic acid (MSA) Aldrich 88460
Phosphate buffer solution (PBS) autoclave steriled
Isoflurane Henry Schein Animal Health 029405 NDC 11695-6776-2
Oxygen Tank must be compatible with vaporizing system
Isoflurane vaporizer JA Baulch & Associates 
Wahl hair clipper Wahl Lithium Ion Pro
Acu Punch 7mm skin biopsy punches Acuderm Inc. P750
Tegaderm  3M Ref: 1624W Transparent film dressing (6 cm x 7 cm)
Heating pad Conair Moist Dry Heating Pad
Insulin syringes BD 329461 0.35 mm (28G) x 12.7 mm (1/2")
70% ethanol
Kimwipes
Tweezers
Sharp surgical scissors
Thin metal spatula
Tubing
Mouse nose cone
Gloves
small plastic containers

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