Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Medicine
Click here for the English version

Medicine

Diyabetik Farelerde Kronik Yaralar Oluşturma Protokolü

Published: September 25, 2019 doi: 10.3791/57656
Automatic Translation
1, 1
1Department of Molecular, Cell and Systems Biology, University of California, Riverside

Summary

Kronik yaralar, tam kalınlıkta kutanöz bir yaradan sonra yüksek düzeyde oksidatif stres emilerek diyabetik fare modelindeki akut yaralardan gelişir. Yara katalaz ve glutatyon peroksidaz inhibitörleri ile tedavi edilir, cilt mikrobiyom mevcut bakteriler tarafından bozulmuş iyileşme ve biyofilm gelişimi ile sonuçlanan.

Abstract

Kronik yaralar, uygun iyileşme ile ilgili bir veya daha fazla karmaşık hücresel ve moleküler süreçlerde kusurlu düzenleme sonucu gelişir. Onlar etkisi ~ 6.5M kişi ve maliyet ~ $ 40B / yıl SADECE ABD'de. Kronik yaraların insanlarda nasıl geliştiğini anlamak için önemli bir çaba harcanmış olsa da, temel sorular cevapsız kalmıştır. Son zamanlarda, insan kronik yaraların birçok özelliği olan diyabetik kronik yaralar için yeni bir fare modeli geliştirdi. Db/db-/- farekullanarak, yaradan hemen sonra yara dokusunda yüksek düzeyde oksidatif stres (OS) üreterek, antioksidan enzimlere özgü inhibitörlerle tek seferlik bir tedavi yöntemi yle kronik yaralar oluşturabilir ve glutatyon peroksidaz. Bu yaralar işletim sistemi yüksek düzeyde, doğal olarak biyofilm geliştirmek, tedaviden sonra 20 gün içinde tamamen kronik hale ve 60 günden fazla açık kalabilir. Bu yeni model insanlarda diyabetik kronik yaraların birçok özelliği vardır ve bu nedenle önemli ölçüde yaraların kronik hale nasıl temel anlayış ilerleyen katkıda bulunabilir. Bu büyük bir atılımdır, çünkü insanlardaki kronik yaralar hastalara önemli ölçüde acı ve sıkıntı yatır ve çözülmemişse ampütasyona neden olur. Ayrıca, bu yaralar çok pahalı ve tedavi etmek için zaman alıcı, ve hastalara kişisel gelir önemli kaybına yol açar. Bizim kronik yara modeli nin kullanımı ile çalışmanın bu alanda gelişmeler önemli ölçüde bu zayıflatıcı durum altında muzdarip milyonlarca sağlık artırabilir. Bu protokolde, akut yaraların kronikleşmesine neden olan ve daha önce yapılmamış olan prosedürü ayrıntılı olarak açıklıyoruz.

Introduction

Yara iyileşmesi, bağışıklık yanıtı ve vasküler dahil ancak bunlarla sınırlı olmamak üzere birçok farklı hücre tipini içeren sıralı ve üst üste gelen evrelerde düzenlenmiş, zamansal ve mekansal olarak düzenlenmiş karmaşık hücresel ve moleküler süreçleri içerir. sistem1. Hemen sonra cilt bir yaralanma sürdürür, faktörler ve kan hücreleri yara bölgesine agrega ve pıhtı oluşturmak için pıhtılaşma kaskad başlatın. Homeostazı sağlandıktan sonra, kan damarları yara bölgesine oksijen, besin, enzim, antikor ve kemotaktik faktörlere izin vermek için genişledi. 2. Aktif trombositler yara kenarındaki keratinositleri uyarmak için çeşitli büyüme faktörleri salgılar ve yaralı bölgeyi yeniden epitelize eder. Yara bölgesine alınan monositler, fagositoz bakteri ve ölü nötrofillerin makrofajlar halinde ayırt edilmesi ve keratinosit proliferatif ve pro-migratory sinyalleri korumak için ek faktörler salgılar. Proliferasyon aşamasında, yeniden epitelizasyon devam ederken, fibroblastlar oluşan yeni granülasyon dokusu, monositler / makrofajlar, lenfositler, ve endotel hücreleri yeniden inşa süreci devam2. Anjiyogenez endotel hücre çoğalması ve göç teşvik ederek uyarılır, yeni damar gelişimi ile sonuçlanan. Hücre dışı matrisin epitelizasyonu ve yeniden biçimlendirilmesi çevreye karşı bir bariyer oluşturur. Yara iyileşir ve granülasyon dokusu bir yara dönüşür gibi, apoptoz ek doku hasarına neden olmadan inflamatuar hücreleri ortadan kaldırır, fibroblastlar, ve endotel hücreleri. Dokunun çekme mukavemeti, kollajen gibi hücre dışı matriksin çeşitli bileşenlerini yeniden şekillendiren fibroblastlar tarafından geliştirilmiştir, böylece yeni oluşan doku neredeyse yaralanmamışderi2 kadar güçlü ve esnektir.

Yara kapanmasına doğru bu son derece uyumlu ilerleme herhangi bir sapma bozulmuş ve / veya kronik yaralara yol açar3. Kronik yaralar artmış oksidatif stres, kronik inflamasyon, hasarlı mikrovaskületür ve yarada anormal kollajen matriks ile karakterizedir4. Oksidatif stres, özellikle yara, yara kapanmasıgeciktirebilir 2,5. Yara iyileşmesinin ilk aşamasında, inflamatuar faz düzensiz hale geldiğinde, konak doku sitotoksik enzimler, serbest oksijen radikalleri bir artış serbest bırakmak inflamatuar hücrelerin sürekli akını5 nedeniyle geniş hasar varsayar ve düzensiz inflamatuar mediatörler, hücre ölümü ile sonuçlanan6,7.

Bu yıkıcı mikroortamda, biyofilm oluşturan bakteriler konak besinlerden yararlanır ve konak dokusunun hasarına katkıda bulunur2. Bu biyofilmlerin kontrol edilmesi ve çıkarılması zordur, çünkü proteinler, DNA, RNA ve polisakkaritlerden oluşan sulu ekstrasellüler polimerik maddeler, içinde barındırılan bakterilerin konvansiyonel antibiyotik tedavilere karşı toleranslı olmasını ve konakçının doğuştan gelen ve adaptif bağışıklık yanıtı2,8,9.

Onlar etkisi ~ 6.5 milyon kişi ve maliyet çünkü kronik yaralar çalışma çok önemlidir ~ ABD'de yılda ~ 40 milyar dolar tek başına10. Diyabetli hastalar enfeksiyon yayılmasını kontrol altına almak için ampütasyon gerektiren kronik yaralar geliştirme riskleri artmıştır. Bu hastalar,diyabetinpatofizyoloji mekanizmasına atfedilen amputasyondan sonraki 5 yıl içinde %50 mortalite riskine sahiptir. Kronik yaraların sonuçları, çözülmemiş ise, amputasyon ve ölüm12dahil çünkü konağın bağışıklık sistemi ve yara iyileşmesi mikrobiyom arasındaki ilişki devam eden araştırma hayati bir konudur.

Kronik yaraların insanlarda nasıl geliştiğini anlamak için önemli bir çaba harcanmış olsa da, kronik yaraların nasıl ve neden oluştuğu hala belirsizdir. Bozulmuş iyileşme mekanizmalarını incelemek için deneyler insanlarda yapmak zordur, ve yara iyileşme uzmanları sadece zaten haftalarca aylarca kronikliğe ulaşmış kronik yaraları olan hastalar bakın. Böylece, uzmanlar kronik2haline gelişmeye yara yol hangi süreçlerin yanlış gitti çalışma yapamıyoruz. İnsan kronik yaralarının karmaşıklığını özetleyen hayvan modellerinin eksikliği vardır. Modelimiz geliştirilene kadar kronik yara çalışmaları için bir model yoktu.

Kronik yara modeli leptin reseptörü mutasyonu olan farelerde geliştirilmiştir (db/db-/-)13. Bu fareler obez, diyabetik, ve iyileşme bozukluğu var ama kronik yaralar geliştirmek yok14. Kan şekeri düzeyleri ortalama 200 mg/dL civarındadır, ancak 400 mg/dL15'ekadar çıkabilir. Yara dokusunda yüksek oksidatif stres (OS) düzeyleri yaralandıktan hemen sonra indüklendiğinde, yara kronikolur 16. DB/db-/- yaralar 20 gün kronik olarak kabul edilir ve 60 gün veya daha fazla açık kalır. Bakteriler tarafından üretilen biyofilm, yaralanmadan üç gün sonra gelişirken görülebilir; olgun bir biyofilm yaralamadan 20 gün sonra görülebilir ve her iki yara kapanana kadar devam eder. Bu farelerde bulduğumuz biyofilm oluşturan bakteriler insan diyabetik kronik yaralarda da bulunur.

Oksidatif stres antioksidan enzimler, katalaz ve glutatyon peroksidaz, hidrojen peroksit yıkmak için kapasitesi ile iki enzimiki inhibitörleri ile yaraların tedavisinde indüklenir. Hidrojen peroksit reaktif bir oksijen türüdür ve proteinlerin, lipidlerin ve DNA'nın oksidasyonu yoluyla hücresel hasara neden olabilir. Katalaz daha az zararlı kimyasallar oksijen ve su içine hidrojen peroksit ayrışması katalizler. 3-Amino-1,2,4-triazole (ATZ) özellikle ve kovalent enzimin aktif merkezine bağlanarak katalaz inhibe,inaktive 17,18,19. ATZ katalaz inhibisyonu yoluyla hem in vitro ve in vivo oksidatif stresetkilerini incelemek için kullanılmıştır20,21,22,23,24. Glutatyon peroksidaz antioksidan yoluyla hidrojen peroksit azaltılması katalizler, glutatyon, ve oksidatif strese karşı hücre koruyan önemli bir enzimdir25. Merkaptosuçinksinik asit (MSA) tiyol ile enzimin selnosistein aktif bölgeye bağlanarak glutatyon peroksidaz inhibe,inaktive 26. MSA in vitro ve in vivo oksidatif stresin etkilerini incelemek için de kullanılmıştır20,27,28.

Kronik yaraların bu yeni modeli, insan diyabetik kronik yaralarda gözlenen aynı özelliklerin birçoğunu paylaştığı için, artmış işletim sistemi ve cilt mikrobiyomlarından kaynaklanan doğal biyofilm oluşumundan kaynaklanan uzun süreli inflamasyon da dahil olmak üzere, çalışmak için güçlü bir modeldir. Yaralardermal-epidermal etkileşim, anormal matriks birikimi, kötü anjiyogenez ve hasarlı vaskülatür bozulmuştur. Kronik yaralar hem erkek hem de dişi farelerde gelişecektir, bu nedenle her iki cins de kronik yaraları incelemek için kullanılabilir. Bu nedenle, kronik yara modeli bu tür yaraların nasıl başladığını temel anlayış ilerlemek için önemli ölçüde katkıda bulunabilir. Bu kronik yara modelinin kullanılması, bozulmuş yara iyileşmesi nin fizyolojisi ve konağın mikrobiyomu sayesinde kronikliğin nasıl başlatılabildiği/elde edildiği ile ilgili temel sorulara yanıt verebilir.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Tüm deneyler federal düzenlemelere uygun olarak tamamlanmıştır ve University of California politikası ve prosedürleri University of California, Riverside IACUC tarafından onaylanmıştır.

1. Hayvan

  1. Diyabetik ve obez B6 kullanın. Kronik yara modeli içinLeprdb/J fareler. Satın alma seçenekleri üreme için heterozigotlar veya doğrudan deneyler için homozigotlar içerir.
  2. Üreme heterozigot erkek ve dişiler yavru üretmek için. Çöp sadece dörtte biri, istatistiksel olarak, diyabetik ve obez olmak için büyüyecek(db / db-/-).
  3. Wean ve ev db/db-/- fareler doğumdan 3 hafta sonra çöp arkadaşları ile birlikte. Db/db-/- fareler doğumdan 5 hafta sonra çöp arkadaşlarından ayrı olarak ve diğer db/db-/- fareler ile 5-6 aylık olana kadar ve kronik yara modeli için kullanılabilir. Bu süre zarfında, olgun ve karmaşık bir cilt mikrobiyomu gelişebilir.
    NOT: DB/db-/- fareler 3-5 haftalık arasında çöp yavrularından kolayca tespit edilebilir. Db/db-/- fareler obezdir, diyabetiktir ve yabani tip ve heterozigot çöplerden çok daha büyük ve yuvarlak tır. Karınları biraz daha pembe ve kalçaları daha büyük görünebilir. Artan ağırlık ameliyattan önce teyit edilmelidir. Ayrıca, leptin reseptöründeki mutasyonu doğrulamak için kandaki yüksek glikoz düzeylerini ölçmek ve fareyi genotip lemek mümkündür.

2. Vivarium ve Hayvancılık

  1. Db/db-/- geleneksel bir vivarium'daki ev db/db-/- fareler (bariyer/spesifik patojensiz tesis değil) böylece db/db-/- farelerin derisinde mikroflora kurulabilir. Özellikle kronik yaralar muzdarip insanlar modellemek için, patojenlere maruz önlemek için özel önlemler almayın.
  2. Canlılık içinde enfeksiyonun yayılmasını en aza indirmek için mikro izolatör üstleri ile kafesleri koruyun. Yeni yatak takımları ile haftada iki kez kafesdeğiştirin ve düzenli vivarium chow ile fareler beslemek. Yatak takımlarını ya da yiyeceği otoklavlamayın.
  3. Oda sıcaklığını 21 ile 24 °C arasında, yılın zamanına bağlı olarak küçük dalgalanmalarla ayarlayın. İklim ve konumu yansıtan nem oranı %19 ile %70 arasında değişmektedir.

3. Kronik Yaraların Gelişimi İçin Gereksinimler

  1. Kronik yaraların gelişimi için fenotipik obez, diyabetik ve en az 5-6 aylık olan sadece erkek ve dişi fareler kullanın. Bu farelerin ağırlığı 40-80 g arasında, yaklaşık 60 g civarında ortalama arasında olmalıdır.
  2. Obez olarak kabul edilen ancak 50 g'dan hafif fareler kullanmayın.
    NOT: Bu protokolde belirtilen tüm fareler aksi belirtilmedikçe burada açıklanan nitelikleri geçerler.

4. Tüy Dökücü Losyonun Tıraşı ve Uygulaması

NOT: Yaralanmadan önce farenin dorsumüzerindeki istenmeyen tüyleri çıkarın. Ameliyattan bir gün önce anestezi altında olmayan canlı db/db-/- farelerde aşağıdaki işlem yapılır. Stresi ve hayvana zarar vermemek için önlemler alın.

  1. Tıraş
    1. Fareyi temiz bir yüzeye yerleştirin ve farenin konumunu sabitlemek için farenin kuyruğunun tabanını başparmak ve ikinci parmakla tutun. Fare atlayabilir veya ani hareketler yapabilir; eğer olursa, hızlı bir şekilde yanıt ve yaralanmayı önlemek için makas geri çekin.
    2. Bir saç makası ile farenin saç tıraş(Şekil 1A, 1B). Bıçağı farenin derisine paralel konumlandırın ve şeffaf bir film pansumanı yerleştirmek için yeterince geniş bir yüzey alanına izin vermek için tüm arkayı boyundan kuyruk kuyruğuna kadar tıraş edin (Bkz. Malzeme Tablosu). En verimli kesim için bıçağı saç büyüme yönüne karşı hafifçe çalıştırın. (Şekil 1B).
      1. Bıçakla cilde derinden bastırmayın, çünkü morarma veya kesme ile cilde zarar verebilir.
  2. Tüy dökücü losyon uygulaması
    NOT: Şeffaf sos sıkıca yapışabilir, böylece çok pürüzsüz bir cilt elde etmek için tüy dökücü losyon kullanın.
    1. Zaten kesilmiş kılları cilde karşı ıslatmak için yeterince basınçla, ıslatılmış bir kağıt mendilin tıraşedilmiş cilde hafifçe bastırarak kimyasal yanıkları önlemek için farenin derisini suyla ıslatın.
    2. Cilt ıslak iken, hafifçe 15-20 s(Şekil 1C, 1D)için tüy dökücü losyon küçük bir topak ile farenin deri ovmak . Saç kısa kesilmiş olan her yere tamamen losyon yayıldı. Fare daha büyükse daha fazla losyon kullanın.
    3. Farenin kulaklarına, kuyruğuna veya yüze yakın herhangi bir yere losyon uygulamayın. Losyon kulaklara veya kuyrukta yer alırsa, durulayana kadar ıslak kağıt silme ile silin. Losyon farenin yüzüne çıkarsa, göz, burun ve ağızzarar görmesini önlemek için hemen çalışan musluk veya deiyonize su altında fareyi yıkayın.
    4. Uygulamadan sonra ek bir 20-45 s için saç ile reaksiyona losyon bırakın.
    5. Durulamadan önce, çeşitli yerlerdeki(Şekil 1E)losyonu eldivenli bir parmak veya ince bir metal spatula ile deriden hafifçe silerek tüy dökücü reaksiyonun tamamlanıncaya bakın. Siyah saç varlığı olmadan cilt pembe ise reaksiyon tamamlanır. Hızlı bir şekilde saç aslında erken durulama daha durulama önce kaldırılmış ve daha sonra tekrar losyon uygulamak zorunda olup olmadığını kontrol etmek en iyisidir.
  3. Durulama
    NOT: Epilasyon reaksiyonu tamamlandıktan sonra, tüy dökücü losyonu çıkarmak ve kimyasal yanıkları önlemek için fareyi çalışan musluk veya deiyonize su ile yıkayın.
    1. Fareyi sol eldivenli ele yerleştirin ve farenin hareket etmesini önlemek için kuyruğun tabanını sol başparmakla avuç içine bastırın. Farenin ısırmasını önlemek için sol parmakların geri kalanını kapatın ve düzdüze.
    2. Fareyi konumlandırın, böylece yüz/kafa bölgesi su akışından uzak kalır ve ılık su akışı başın arkasına ve sadece arkada düşebilir. Hızlı ama yavaşça losyonu temizlemek için sağ eldivenli el ile farenin arka ovmak.
    3. Farenin derisi losyondan kurtulduktan sonra, suyun çoğunu emmek için fareyi kağıt havluyla hızlıca silin(Şekil 1F).
  4. Tıraş ve epilasyon sonrası bakım
    1. Islak kağıt mendil ile kulakve kuyrukta kalabilecek artık tüy dökücü losyonu kontrol edin ve temizleyin.
    2. Fareyi kendi kafesine geri yerleştirin ve kafesi yaklaşık 30 dakika boyunca bir ısıtma yastığına (40-45 °C) yerleştirin. Fare normal davranışa geri dönmeli, koşuşturmalı ve birkaç dakika içinde kendini damat etmelidir.
    3. Deneme süresince her fareyi ayrı bir kafeste barındırın. Farelerin derisi artık korunmuyor ve diğer fareler tarafından kolayca çizilip ısırılabiliyor.
    4. Tüy dökücü losyon, yara iyileşme sürecini etkileyebilecek veya değiştirebilecek hafif tahriş edici etkilere sahip olabileceğinden, fare derisinin sakinleşmesini ve farenin sırtındaki saç eksikliğine uyum sağlaması için ameliyattan önce 18-24 saat bekleyin.
  5. Koyu Pigmentasyon ile Ciltten Saç Çıkarma
    NOT: Bazı db/db-/- farelerpotansiyel olarak bu yamalar olmadan deriden daha hızlı ve daha güçlü saç geri büyüyen olacak ciltte koyu lekeler olacaktır. (Şekil 2A). Cildin bu koyu alanlar orta geç anajen sahne saç folikülleri ve / veya pigment inkontinans29,30nedeniyle renk koyu görünür.
    1. Koyu lekeler fark edilirse, tekrar tüy dökücü losyon uygulayın, ancak sadece bu alanlarda, ve adım 4.2 ve 4.3 tekrarlayın(Şekil 2B, 2C).
      NOT: Cildin koyu lekeleri deney süresince saçları daha hızlı uzatır, bu nedenle gerektiğinde her 3-5 günde bir saçı kısa yayıltın. Yaranın istenilen yerden bir ya da iki yama kabul edilebilir. Farenin arka önemli ölçüde bu koyu yamalar ile kaplı ise, kronik yara modeli için bu fare kullanmayın.

5. Reaktif Kurulumu

NOT: Db/db-/- farelerde kronik yaraların gelişimi katalaz ve glutatyon peroksidaz, 3-amino-1,2,4-triazol (ATZ) ve mercaptosuccinik asit (MSA) için spesifik inhibitörleri ile tedavi ile gerçekleştirilir16 . Aşağıdaki prosedür, farenin ağırlığına göre analjezi ve inhibitörlerin dozve yönetimini ayrıntılarıyla anlatır.

  1. Ağrı kesici Bupreneks intraperitoneally 0.05 mg / kg fare steril PBS enjekte. Ameliyattan yaklaşık 30 dakika önce 60 g fare için 120 μL hacim enjekte edin. Ameliyattan sonra 6 saat daha doz uygulayın. Gerektiğinde ekstra bir doz verilebilir.
  2. ATZ intraperitoneally 1 g/kg fare steril PBS enjekte. Ameliyattan yaklaşık 20 dk önce 60 g fare için 480 μL hacim enjekte edin. Hacmin yarısını karın sol tarafına, diğer yarısını da sağ tarafa enjekte edin.
  3. Steril PBS'de 150 mg/kg farede şeffaf pansuman ile yara dokusu arasındaki yaranın üzerine topikal olarak MSA yatırın. Ameliyattan sonra 10 dakika içinde 60 g fare için 60 μL hacim uygulayın.

6. Cerrahi

NOT: Kronik yara modelinin başarısı steril olmayan durumlara dayanır. Bu fareler mikrop içermez ve geleneksel bir vivarium içinde yer almaktadır. Deride bulunan bakteri mikrobiyomu, anti-oksidan enzimlerin inhibitörleri ile tedavi üzerine kronik yaraların sonraki başlatılması ve gelişimi için çok önemlidir. Bu nedenle, sitenin geleneksel cerrahi öncesi hazırlık kontra-endikedir.

  1. İntraperitoneal Enjeksiyon
    1. Fareyi kafes rafının eğimli kısmına sabitle ve farenin başını farenin gövdesinden daha aşağıda rahatça sabittesiyle kuyruğu tutun. Bu, iç organları enjeksiyon noktasından mümkün olduğunca uzağa taşımaya çalışmamızı sağlar.
    2. Mesane veya diğer karın organlarıiçine enjeksiyon önlemek için karın sağ alt kadranda iğne yerleştirin.
    3. İğneden önce iğneyi aspire edin.
  2. Tedavi ve Anestezi
    1. Buprenex 30 dk ve ATZ 20 dk ameliyattan önce, Adım 5.1 ve 5.2'de açıklandığı gibi uygulayın.
    2. Fareyi, Şekil 3A'da yaklaşık 15-20 dakika boyunca gösterildiği gibi sıcak bir ısıtma yastığının üzerine küçük bir plastik kapta yerleştirin.
    3. Isıyı daha iyi kontrol altına almak için küçük kabın üzerine kağıt mendil veya kağıt havlu yerleştirin. Fare ısındıkça sakinleşmelidir. Şekil 3 B ameliyat için gerekli malzemeleri gösterir.
    4. Fareyi, açık bir sistem kullanıyorsanız kimyasal kaputtaki isofluran evaporize bağlı kapalı bir kapta yerleştirin.
    5. Açık bir sistemde, 2-3,5 L/dk akış hızında 1-2 dakika boyunca %5 izofluran uygulayın.
      1. Fare baygın hale gelen veya artık hareket etmedikten sonra fareyi beyaz bir cerrahi pedin üzerine yerleştirin ve ameliyat sırasında isofluranın sürekli uygulanmasına izin vermek için buharlaştırıcıya sabitlenmiş bir burun konisi ile baş ın üzerine yerleştirin.
    6. Açık bir sistemde, ameliyat sırasında aynı akış hızında % 2-3 isofluran uygulayın ve anestezi derinliğini korumak için isofluran akışına ayarlayın.
    7. Ameliyat sırasında uygulanan isofluranın konsantrasyonu ve süresini en aza indirin. db/db -/- fareler anesteziye karşı çok hassastır, bu yüzden en iyisi isofluranmaruziyetini minimumda tutmaktır. Fare hala% 5 isoflurane 2 dakika sonra yanıt ise, burun konisi güvenli ve ameliyatbaşlamadan önce 15-30 s için% 3-5 isoflurane uygulayın.
      1. Yaralanmadan önce uygun anesteziyi onaylayın. Anestezi derinliği güçlü parmak sıkışması gibi fiziksel uyaranlara yanıt eksikliği ile doğrulanır. İnhale anestezi altında farenin süresi 5 dk altında olduğundan gözlere veteriner merhemi uygulanmaz.
  3. Yaralama
    1. Sprey% 70 etanol veya klinik etanol havlu ile bir kağıt silme ve yara sitenin alanı temizlemek için farenin arka silin. Yatak, gıda veya deriden gelen toz, pansumanın düzgün yapışmasını önleyebildiği için, şeffaf pansuman sıkıca yapışabilsin diye cilt yüzeyini temizleyin(Şekil 4A). Aşırı silmeyin, yoksa deride bulunan bakterileri öldürme riski olacaktır.
    2. Yara bölgesinin konumunu belirleyin. Yarayı gerçekleştirmek için en iyi yer farenin sırt tarafında, ortalanmış ve daha yüksek pigmentasyon ile cilt yamalar uzak.
      NOT: Tecrübelerimize göre bu fareler sadece bir yaranın yüküne dayanabilirler.
    3. 7 mm deri biyopsisi zımba, cımbız ve cerrahi makas kullanarak 30-45 s içinde bir yara oluşturun. Biyopsi yumruğuna istenilen yara bölgesine hafifçe bastırın ve yumruğun hafif bir izlenimbırakarak yeterince derine doğru bükün(Şekil 4B). Cımbız ile yumruk merkezi yukarı çekerek ve cerrahi makas(Şekil 4C-4E)ile anahat boyunca keserek özetlenen cilt excise .
    4. Yarayı şeffaf film pansumanının yarısı (6 cm x 3,5 cm) sıkıca kapatın.
    5. Fareye %2 izofluran uygulaması durdurun (Şekil 4F).

7. Ameliyat Sonrası Tedavi ve Kurtarma

  1. Ameliyat tan sonra MSA tedavisi yapılır ve Adım 5.3'te açıklandığı gibi şeffaf pansuman uygulanır. MSA'yı pansumanın altındaki yara bölgesine yatırın.
  2. Kurtarma ile yardımcı olmak için 30 dakika boyunca ısıtma pedi üzerinde küçük bir kap ta fare geri yerleştirin. Fare ısındıktan sonra fareyi kafesine geri koyun. Isoflurane etkisi geçicidir ve fare kısa bir süre sonra hareket olmalıdır.
  3. Fareler sternal recumbency korumak için yeterli bilinç kazanmış kadar fareler gözetimsiz bırakmayın ve vivarium onları iade etmeyin.
    NOT: Bu farelerle çalışırken tercih edilen anestezi, hızlı indüksiyonu ve anesteziden sonra ortaya çıkması nedeniyle tam olarak isoflurane'dir.
    1. Bir farenin diğerinin kronik yarasına müdahale etmesini önlemek için tek tek ameliyat olan ev fareleri. Yukarıda belirtildiği gibi, tamamen iyileşene kadar vivarium'a dönmezler.
  4. Ameliyattan sonra Bupreneks 6 saat ikinci doz uygulayın.
  5. Ameliyattan sonra ilk 48 saat boyunca fareleri dikkatlice gözlemleyin.
    NOT: Ameliyat, kronik yara oluşturmak için inhibitörleri ile birleştiğinde, zaten diyabetik ve obez olan hayvan üzerinde çok stresli. Ameliyattan sonraki ilk birkaç gün hayatta olan fareler genellikle deney süresince hayatta kalırlar.

8. Veri Toplama, Hayatta Kalma Stratejileri, Yaraladıktan Sonra Farelerin Kullanımı ve Ek İpuçları

  1. Veri toplama
    1. Ameliyattan hemen sonra fotoğraf çek. Biyofilmler yaralanmadan sonra 5-10 gün arasında ve 3 gün kadar erken bir yerde görülür.
    2. Bakteriler analizin odak noktası ysa, 10-15 s. -80 °C'de kültürden bağımsız sıralama analizi için herhangi bir ortam olmadan kalıb veya kuru için uygun bir dondurucu ortamda, 10-15 s. Için yaranın etrafında hafif basınçla steril bir takas yapın. Bir mikrocentrifuge tüp içine steril bir metal spatula ile ekstrasellüler polimerik maddeler toplamak ve analiz öncesi -80 °C'de saklayın.
    3. Biyofilm toplama veya fotoğraf çekme işlemlerini sırasında fareye anestezi uygulamayın. Bu işlemler sırasında, fareyi sakinleştirmek ve kaçmasını önlemek için farenin önüne bir parça yiyecek yerleştirin. Çoğu fare yiyeceğin üstüne tırmanır, üzerine oturacak ve hareket etmeyecek.
  2. Fare düzgün hareket etmiyorsa veya pansuman doğru uygulanmazsa ikincil enfeksiyonlar ve istenmeyen kronik yaralar veya ülserler gelişebileceğinden, düzenli olarak farenin ve ventral tarafın yaralarını kontrol edin. Deri ve ıslak yatak takımları arasındaki sürtünme(db/db-/- fareler poliüriktir) kafesler sık sık değiştirilmezse cildi rahatsız edebilir.
    NOT: Pansumanın altında sıvı birikme, yapıştırıcının yapışkanlığını kaybetmesine ve sıvının sızdırılmasına neden olabilir. Ölü deri hücresi, yatak ve dışkı sonra cilt üzerine sopa ve sertleşmek. Bu kurutulmuş yamalar ve cilt üzerinde agregalar ikincil bir enfeksiyonu önlemek için derhal temizlenmelidir.
  3. Fareler arka ayakları üzerinde durur veya otursalar, bu fareleri yiyecek ve suya erişimin çok daha düşük olduğu bir kafese taşıyın. Kafesteki yiyecek ve suyun konumu yüksekse, fare ona ulaşmak için arka ayaklarıüzerinde durabilir veya oturabilir. Çoğu fare, ameliyattan önce bunu yapabilseler yeme ve içme sorunu olmaz, ancak bazı farelerin sırtlarına dönme olasılığı vardır. Bu "flippers" onlar yardım ve daha fazla izleme gerekir bu yüzden üzerinde dönüm büyük zorluk olabilir.
  4. Cilt enkaz, pul gibi cilt ve saç temiz ise 20 güne kadar cilt üzerinde şeffaf pansuman bırakın. Bunlardan herhangi biri ciltte oluşursa, eski pansuman çıkarın ve yeni bir parça uygulayın.
    1. Pansumançıkarmak için, hafifçe başın arkasında doğrudan deri çimdik, sonra tek bir düzgün hareketle baş pansuman çekin.
    2. Güvenli bir şekilde pansuman bir parça yerleştirmek için, fare mümkün olduğunca hareketsiz kalmasını sağlamak. Cildin temiz ve pul pul ölü deri hücrelerinden, yatak kalıbından gelen tozlardan ve yiyecek parçalarından arınması önemlidir. Yerleştirin ve daha sonra güvenli hale getirmek için yara etrafında deri içine pansuman basın.
    3. Farenin önüne bir parça yiyecek yerleştirmek hareketlerini sınırlamıyorsa, fareyi tel kafesin üzerine yerleştirin. Fare kafeste bir ray kavradı ktan sonra, kuyruğu vücuda mümkün olduğunca yakın tutun ve en az güçle çekin. Fare öne doğru çekerken, kolay uygulama için arka gerilecek ve düzleşir; bu noktada güvenli bir şekilde pansuman yerleştirin.
    4. Asla eski bir sosu tekrar kullanma. Her zaman en büyük yapışma için arka yeni pansuman uygulayın.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Şekil 5, yara kapatmaya doğru ilerleyen inhibitörlerin tedavisi olmayan bir yara ve kronikliğe doğru ilerleyen inhibitörlerin tedavisi ile bir yara örneği dir. Biyofilm ve sıvı birikiminin görülebilmeleri için kronik yaranın üzerine şeffaf pansuman bırakılmıştır.

Kronik yara inisiyasyonu en az 6 saat içinde gerçekleşir ve yara marjı oksidatif stresten gözle görülür şekilde değişir. Bu yara marjının histolojik kanıtları dokunun nekrotik olduğunu ve yara iyileşmesine katılmayacağını ortaya koymaktadır. Yaradaki biyofilm oluşturan bakteriler daha sonra biyofilm üretmek için besin ve yapısal bileşenlerin kaynağı olarak bu nekrotik dokuyu kullanabilirler. Kronik bir yara açık kalır, ilk yara ile karşılaştırıldığında genişlemiş, biyofilm içeren (EPS artı patojenik bakteriyel insan kronik yaralar bulundu) ve önleyici biyofilm miktarına ve içeriğine bağlı olarak iyileşmek için ay veya yıl sürer bir yaradır normal çözülmesinden kaynaklanan yara. Kronik yara modelinde, tam kroniklik ameliyattan 20 gün sonra ayarlanır, çünkü inhibitörlerle tedavi edilmeyen yaralar bu süre içinde kapanır(Şekil 5). İyileşme genellikle > 60 gün sürer ve zaman yarada bulunan primer patojenik bakterilere bağlıdır. Bazen fareler, Pseudomonasgibi daha agresif biyofilm oluşturan bakteriler yaranın baskın olduğu durumlarda enfeksiyona yenik düşebilirler. Böylece kronik bir yara, 20 gün içinde kapanmayan, iyileşmesi 60 günden fazla süren ve yaraüzerinde biyofilm bulunan bir yara olarak tanımlanır.

Cinsiyet farklılıkları db/db-/- fare modeli32,33dahil olmak üzere çeşitli diyabet modellerinde bulunmuştur. Bu tür farklılıklar mevcut olmakla birlikte, kronik yaraların gelişiminde önemli bir faktör olmadığı için seksin gözlenmiştir. Erkek ve dişi farelerde kronik yaralar benzer ölçüde gelişir, bu nedenle her iki cins de kronik yaraları incelemek için kullanılabilir. Bu nedenle, insan kronik yaralar hem erkek hem de kadın diyabetik hastalarda bulunabilir beri bu modeli kullanarak avantajlıdır.

Figure 1
Şekil 1 . Tıraş ve tüy dökücü işlem. (A) Tıraş olmadan önce fare. (B) Farenin derisi, arkadaki saçın çoğunu çıkarmak için tıraş edilir. (C) Bir parmağın ucunda tüy dökücü losyon bir topak. Fare daha büyükse daha fazla kullanılır. (D) Farenin arkası tüy dökücü losyon ile kaplıdır ve tepki vermek için bırakılır. (E) Bir spatula saç kaldırıldı olup olmadığını görmek için losyon bazı kazımak için kullanılır. Saç herhangi bir varlığı olmadan parlak pembe cilt epilasyon tamamlandı göstergesidir. (F) Sırttaki losyon akan su ile çıkarılır. Farenin derisi biraz pembe olmalıdır. Bu rakam Kim ve Martins-Green31'dendeğiştirilmiştir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Figure 2
Şekil 2 . Koyu ten küçük yamalar saç çıkarmadan. (A) Fare zaten bir kez tedavi edilmiş ve yanıkları önlemek için cilt tekrar ıslak. (B) Tüy dökücü losyon sadece koyu ve yoğun saç olan cilt yama üzerine uygulanır. (C) Losyon, tüysüz cildin koyu yamasını ortaya çıkarmak için reaksiyondan sonra yıkanır. Bu rakam Kim ve Martins-Green31'dendeğiştirilmiştir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Figure 3
Şekil 3 . Ameliyat öncesi kuruldu. (A) Yaralanacak fareler, ısıtma yastığının üzerine küçük plastik kaplara yerleştirilir. (B) Ameliyatta kullanılan bazı malzemeler gösterilmiştir. Cerrahi makas, kesildiğinde cildin ezilmediğinden emin olmak için keskin olmalıdır. Şeffaf pansuman ikiye bölünür. Bu rakam Kim ve Martins-Green31'dendeğiştirilmiştir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Figure 4
Şekil 4 . Eksizyon yarası yapıyor. (A) Fare anestezi altında kaldıktan sonra farenin arkası bir kez %70 etanol ile silinir. (B) Deri biyopsisi yumruğu farenin arkasına yerleştirilir ve bir izlenim bırakacak kadar sert bastırılır. Biyopsi yumruğu sığ bir kesi yapmak için döndürülebilir. (C) Ana hatlarıyla bölgenin ortası cımbızla sıkıştırılır ve ilk kesi yapmak için keskin bir cerrahi makas kullanılır. (D) Cerrahi makas biyopsi yumruğu ile yapılan anahat boyunca kesmek için manevra vardır. (E) Biyopsi pompası ile özetlenen deri bölgesi başarıyla çıkar. (F) Şeffaf pansuman farenin arkasına yerleştirilmiş ve sabitlenir. Bu rakam Kim ve Martins-Green31'dendeğiştirilmiştir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Figure 5
Şekil 5 . Yara resimleri. (A) Ameliyat tan sonra bir fareüzerindeki yara ameliyat gününden itibaren kronikliğe doğru ilerler. Biyofilm 5. Yara, 20. (B) İnsan kronik yaralar örnekleri, özellikle diyabetik ayak ülseri. Bu rakam Kim ve Martins-Green31'dendeğiştirilmiştir. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Farelerde kronik yaralar oluşturulduktan sonra, model kronikliğin başlatılmasında rol oynayan bozulmuş yara iyileşme süreçlerini incelemek için kullanılabilir. Model aynı zamanda kronik yara gelişimi ve bozulmuş iyileşme tersine çevirebilir ve yara kapatma ve iyileşme yol kimyasalları ve ilaçların geniş bir yelpazede etkinliğini test etmek için kullanılabilir. Kronikliğin başlangıcından sonra farklı zaman noktaları incelenebilir: örneğin, gün 1-5 kroniklik erken başlangıçlı için yara dan sonra ve gün 20 ve tam güç kronik yaralar için ötesinde.

Kronik yara modeli de yara iyileşmesi ve biyoyük ve kaşeksi gibi komplikasyonların çeşitli yönlerini incelemek için güçlü bir modeldir. Bioburden sadece bu modelde çalışılabilir kronik yaraların birçok yönlerinden biridir, aynı zamanda insan kronik yaraları etkiler gibi. Prosedürlerimiz ve Hayvan Kullanım Protokolümüz, tanımlanmış bir izleme programıyla birlikte izlenecek semptomolojiyi açıkça tanımlar. Hastalıklı olarak tanımlanan hayvanlar, Yoğun Bakım Onaylı kriterlere göre, önemli acılardan kaçınmak için ötenaziye geçirilir. Buna ek olarak, bazı semptoyolojiler ortaya çıktığında Kampüs Veteriner ve Hayvan Sağlığı Teknisyeni'ne danışılır ve kriterlerin değerlendirilmesinde destekleyici rehberlik sağlar.

Protokol deki kritik adımlar arasında db/db-/- farelerin konvansiyonel bir vivarium'da barınması, tüy dökücü losyonlu saçların çıkarılması ve isoflurane uygulamasından önce ısıtma yer almaktadır. Kronik yara modelinde kronik yaraların gelişimi steril olmayan durumlara ve uygulamalara dayanır. Bu fareler mikrop içermez ve çok temiz vivariums büyümek yok. Deride bulunan mikroflora anti-oksidan enzimler için inhibitörleri ile tedavi üzerine kronik yaraların sonraki başlatılması ve gelişimi için çok önemlidir. Bu db/db-/- fareler hem kommensal hem de patojen bakteri içeren bir ortama maruz kalmalıdır. Cilt temizlenir ve deri "sterilize" için ameliyat öncesi iyot veya diğer antiseptik yöntemlerle dezenfekte edilirse, yara kronik olmayabilir. Deri mikrobiyombakteri oluşumu ve biyofilm gelişimi için gerekli olan, ve iyileşme ve yara kapanması geciktirmek. Klinikte, bir yarada biyofilm bulunması yaranın iyileşme sürecini daha da karmaşık hale getirir ve yaradaki enfeksiyon kontrol altına alınmadığı takdirde insanlarda ampütasyon riskini artırır.

Tüy dökücü losyon ile saç çıkarmadan fazla saç kaldırmak ve şeffaf pansuman sıkıca yapışmasını için pürüzsüz ve temiz bir yüzey sağlamak için önemli bir adımdır. Bu protokolde kullanılan tüy dökücü losyon yanıkları en aza indirmek için ilave aloe ile kimyasal bir tüy dökücüdür. Bu ürün cildin morfolojisini değiştirmenin yanı sıra cilt mikrobiyomu korumada da çok azdır. Malzeme Tablosu'nda listelenen ürün, ciltte daha fazla yanabilir ve römorkör ve / veya cilt mikrobiyomu öldürmek fiziksel ve mekanik depilatories (balmumu ve ticari epilatörler) dahil olmak üzere diğer saç kaldırma ürünleri, üzerinde tavsiye edilir. Bu kimyasal tüy dökücü fiziksel olarak nazik olsa da, hala biraz cildi tahriş edebilir, yara iyileşme süreçlerini değiştirebilir bir etki. Bu nedenle cildin ameliyattan sonra iyileşmesini sağlamak ve cildin ve yaranın bundan etkilenmemesini sağlamak için ameliyattan önce 18-24 saat beklemek en etkilidir.

Bu fareler son derece uysal ve strese yanıt vermiyor. Onlar anestezi olmadan işlemek için çok kolaydır. Onlar bir avuç üzerine ya da bir bankın üstüne kaçmadan yerleştirmek için yeterince sakin. Farenin kuyruğunun tabanı başparmak ve ikinci parmakla sabitlenirse, fare büyük göbek boyutları nedeniyle kaçamaz veya ısırmak için geri dönemez. Daha da önemlisi, deneyimlerimize göre, bu fareler anesteziye karşı son derece hassastırlar, özellikle de homeostaz kaybı yla ilgili olduğu için. Böylece, IACUC ile istişare içinde, daha iyi bir seçenek anestezi kınırlık yönetimi sınırlamak için tespit edilmiştir.

Bu modelin temel amacı sırtında büyük bir iyileşmemiş yara oluşturmaktır, bu yüzden bir kez bir yara yapılır, geleneksel ek bupreneks veya diğer kimyasal tedavilerip IP enjeksiyonları yapmak için geleneksel bir fare tutarak periyodik olarak imkansızdır. Fareyi sırt derisinden tutmak, fare nin geleneksel bir şekilde tutulması durumunda farenin çok fazla rahatsızlık ve büyük olasılıkla acıya neden olur; böylece, dört ayak üzerinde dururken fare sağ tarafı ile tüm enjeksiyon. Db/db-/- suş kullanan diğer deneyler de bu fareleri daha gençken kullanır lar ve çok ağır değildirler, bu nedenle geleneksel IP enjeksiyonu yapma şekli kullanılabilir. Kronik yara modeli 6 aya kadar fareler kullandığından ve bu fareler 80 g'a kadar ağırlayabildiği için, geleneksel yöntem en uygun değildir ve fareye zarar verebilir. Biz bir fare bu obez için yukarıda açıklanan yöntemi kullandık ve başarılı aspirasyon ile bu yöntem enjekte edildiğinde herhangi bir olumsuz sonuç gözlenmemiştir.

Daha önce ketamin ve ksilazin gibi enjektabl anestezi kullanılmıştır; ancak db/db-/- farelerle kullanımı zor oldu. Toplam çalışma süresi 5 dakikadan az olan uzun indüksiyon ve kurtarma süresi deneyin amaçları için gerekli değildi. Isofluran kolay uygulama ve titrasyon, hızlı başlangıç ve iyileşme ve yeterli anestezi derinliği nedeniyle bu işlem için anestezi daha iyi bir seçim olarak belirlenmiştir. Ayrıca, isofluran minimal kardiyak depresyon neden olur ve BP çok iyi korur34. Yani, kronik yara modeli için prosedürde önemli bir değişiklik tercih edilen anestezi olarak isoflurane kullanmak oldu.

Ameliyat öncesi ısıtma, ameliyattan sonraki 2-3 gün içinde mortalitenin önlenmesi açısından önemlidir. Bu fareler önemli ölçüde daha düşük çekirdek vücut ısısıvar 35 ve etkili genetik manipülasyon nedeniyle kendi çekirdek vücut ısısını kontrol etmek mümkün değildir, bu yüzden bir dış ısıtma kaynağı ameliyattan önce karşı korumak için sağlanır anestezi ile indüklenen çekirdek vücut ısısında ek düşüş. Ameliyat öncesi, sırasında ve ameliyat sonrası ısıtma yastığı ihtiyacını değerlendirdik. Db/db-/- farelerin olağandışı fizyolojik tepkilere sahip olduğunu belirtmek önemlidir. Ampirik olarak, bu farelerin ameliyat öncesi ve sonrası ısı desteği ile en etkili şekilde korunduğunu gördük. Anesteziyerine isofluran'ı alarak, beş dakikadan kısa bir süre boyunca vücut ısısının önemli ölçüde düşmediğini ölçtük ve belirledik. Cerrahi öncesi ve sonrası ısı desteğinin bu fareler için kritik olduğunu bulsak da, cerrahi ısı desteğinin etkili olduğunu bulamadık. IACUC Başkanı'nın rehberlik yaptığı ve sıcaklık ve anestezik etkilerle ilgili testlerimizi izlediği unutulmamalıdır. Bu yöntemi iletirken, prosedürün başarısı için neyin gerekli olduğunu belirtmeyi önemli buluyoruz.

Bu yöntemin biyofilm gelişimini incelemek için kullanılmasının bir sınırlaması, yarada bulunan ve biyofilm üreten bakterilerin kontrol altına alınmamasıdır. Belirli bir biyofilm oluşturan bakteri incelenecekse, bu model iyot veya diğer antiseptik yöntemlerle yaralanmadan önce yerli mikrobiyom kaldırılabilirse yararlı olabilir. Oksidatif stresaşırı düzeyde yanıt olarak, deri mikrobiyom anahtar patojenik bakteriler biyofilm oluşumunu başlatmak için uyarılır. Kronik yaralarımızda, biyofilm oluşturan bakteriler dahil, ancak bunlarla sınırlı değildir, Pseudomonas aeruginosa36,37,38,39, Enterobacter cloacae37, 38.000 , 39, ve çeşitli Staphylococcus40,41 ve Corynebacterium türleri41,42,43,44, 45, hepsi insan kronik yaralar bulunabilir. Çeşitli kronik yara mikrobiyom çalışmaları bakteriler için insan kronik yaralar üzerinde yapılmıştır39,40,41,43,44,45 , vemantarlar 46,47 topluluk, kötü iyileşme ile ilişkili uzunlamasına anketler de dahil olmak üzere48,49. Bu doğanın uzunlamasına çalışmaları da kronik yara modeli ile takip edilebilir.

DB/db-/- fareler için vivaria koşulları, sarf malzemeleri ve ekipmanları, satıcıları ve kaynak kolonileri farklılıkları nedeniyle farklı sonuçlar elde edilebilen kabul etmek önemlidir. Bu tür farklılıkları en aza indirmek için, protokolsağlanan tam fare çeşitliliği ve kronik yara deneyi için kullanılan kaynaktır. Bu farelerin yetiştiriciliği için, tam yatak ve gıda markaları değişkenliği sınırlamak için Malzemeler Tablosu'nda sağlanmıştır. Deneylerimizde, fareler konvansiyonel bir canlılık içinde barındırılabildiği ve bakterilere maruz kaldığı sürece, yüksek oksidatif stresin bu farelerde kronik yaralar oluşturmak için gerekli ve yeterli olduğunu görüyoruz. Bakteri popülasyonları ve toplulukları vivaria ile farklılık gösterebilir; ancak, mikropsuz bir tesis fareleri barındırmak için kullanılmadığı sürece, saç ve deride ikamet edecek kadar kommensal ve patojenik bakteriye sahip olmalıdırlar.

Sadece oksidatif stres düzeyleri deneysel olarak önemli ölçüde değiştiğinden, bu protokolde kronik yaralar oluşturma yöntemi kronik yaraları ve bozulmuş yara iyileşmesini incelemek için önemlidir. Oksidatif stres normal yara iyileşme süreçleri için gereklidir2. Bu zamanında düzenleme ve yara iyileşmesi için gerekli hücrelerin işlevselliği önemli bir bileşeni için önemlidir5. Ancak, oksidatif stres düzeyleri kontrol edilmezse, reaktif oksijen türleri endotel hücrelerine zarar verebilir, keratinosit işlevselliğini inhibe, ve gecikme yara kapatma2,5. İnsan kronik yaralar oksidatif stres yüksek düzeyde var50. Fare modeli yüksek kan şekeri ve zaten morbidite nedeniyle oksidatif stres düzeyleri artmıştır. Bu özellikler diyabet ile yaşayan insanlar ile paylaşılır ve yaralanma50sürdürülmesi sonra kroniklik için elverişli bir mikroçevre sağlar. İnsanlar da cilt de dahil olmak üzere vücudun birçok yerde çeşitli ve karmaşık mikrobiyota ev sahipliği, bu yüzden karmaşık, ama doğal, mikrobiyom farenin cilt üzerinde geliştirmek için izin verilir.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Yazarlar hiçbir rakip mali çıkarları olduğunu beyan.

Acknowledgments

Yazarların hiçbir takdiri yok.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
B6.BKS(D)-Leprdb/J  The Jackson Laboratory  00697 Homozygotes and heterozygotes available 
Nair Hair Remover Lotion with Soothing Aloe and Lanolin Nair a chemical depilatory
Buprenex (buprenorphine HCl) Henry Stein Animal Health 059122 0.3 mg/ml, Class 3
3-Amino-1,2,4-triazole (ATZ) TCI A0432
Mercaptosuccinic acid (MSA) Aldrich 88460
Phosphate buffer solution (PBS) autoclave steriled
Isoflurane Henry Schein Animal Health 029405 NDC 11695-6776-2
Oxygen Tank must be compatible with vaporizing system
Isoflurane vaporizer JA Baulch & Associates 
Wahl hair clipper Wahl Lithium Ion Pro
Acu Punch 7mm skin biopsy punches Acuderm Inc. P750
Tegaderm  3M Ref: 1624W Transparent film dressing (6 cm x 7 cm)
Heating pad Conair Moist Dry Heating Pad
Insulin syringes BD 329461 0.35 mm (28G) x 12.7 mm (1/2")
70% ethanol
Kimwipes
Tweezers
Sharp surgical scissors
Thin metal spatula
Tubing
Mouse nose cone
Gloves
small plastic containers

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Singer, A. J., Clark, R. A. F. Cutaneous wound healing. New England Journal of Medicine. 341 (10), 738-746 (1999).
  2. Nouvong, A., Ambrus, A. M., Zhang, E. R., Hultman, L., Coller, H. A. Reactive oxygen species and bacterial biofilms in diabetic wound healing. Physiological Genomics. 48 (12), 889-896 (2016).
  3. MacLeod, A. S., Mansbridge, J. N. The innate immune system in acute and chronic wounds. Advanced Wound Care. 5 (2), 65-78 (2016).
  4. Zhao, G., et al. Biofilms and Inflammation in Chronic Wounds. Advanced Wound Care. 2 (7), 389-399 (2013).
  5. Wlaschek, M., Scharffetter-Kochanek, K. Oxidative stress in chronic venous leg ulcers. Wound Repair and Regeneration. 13 (5), 452-461 (2005).
  6. Stadelmann, W. K., Digenis, A. G., Tobin, G. R. Physiology and healing dynamics of chronic cutaneous wounds. American Journal of Surgery. 176 (2), 26-38 (1998).
  7. Loots, M. A., Lamme, E. N., Zeegelaar, J., Mekkes, J. R., Bos, J. D., Middelkoop, E. Differences in cellular infiltrate and extracellular matrix of chronic diabetic and venous ulcers versus acute wounds. Journal of Investigative Dermatology. 111 (5), 850-857 (1998).
  8. Costerton, W., Veeh, R., Shirtliff, M., Pasmore, M., Post, C., Ehrlich, G. The application of biofilm science to the study and control of chronic bacterial infections. Journal of Clinical Investigation. 112 (10), 1466-1477 (2003).
  9. Fux, C. A., Costerton, J. W., Stewart, P. S., Stoodley, P. Survival strategies of infectious biofilms. Trends in Microbiology. 13 (1), 34-40 (2005).
  10. Sen, C. K., et al. Human skin wounds: A major and snowballing threat to public health and the economy. Wound Repair and Regeneration. 17 (6), 763-771 (2009).
  11. Armstrong, D. G., Wrobel, J., Robbins, J. M. Are diabetes-related wounds and amputations worse than cancer. International Wound Journal. 4 (4), 286-287 (2007).
  12. James, G. A., et al. Biofilms in chronic wounds. Wound Repair and Regeneration. 16 (1), 37-44 (2008).
  13. Chen, H., et al. Evidence that the diabetes gene encodes the leptin receptor: Identification of a mutation in the leptin receptor gene in db/db mice. Cell. 84 (3), 491-495 (1996).
  14. Coleman, D. L. Obese and diabetes: Two mutant genes causing diabetes-obesity syndromes in mice. Diabetologia. 14 (3), 141-148 (1978).
  15. Garris, D. R., Garris, B. L. Genomic modulation of diabetes (db/db) and obese (ob/ob) mutation-induced hypercytolipidemia: cytochemical basis of female reproductive tract involution. Cell Tissue Research. 316 (2), 233-241 (2014).
  16. Dhall, S., et al. Generating and reversing chronic wounds in diabetic mice by manipulating wound redox parameters. Journal of Diabetes Research. , 2014, Article ID 562625 (2014).
  17. Feinstein, R. N., Berliner, S., Green, F. O. Mechanism of inhibition of catalase by 3-amino-1,2,4-triazole. Archives of Biochemistry and Biophysics. 76 (1), 32-44 (1958).
  18. Margoliash, E., Novogrodsky, A. A study of the inhibition of catalase by 3-amino-1:2:4:-triazole. Biochemical Journal. 68 (3), 468-475 (1958).
  19. Margoliash, E., Novogrodsky, A., Schejter, A. Irreversible reaction of 3-amino-1:2:4-triazole and related inhibitors with the protein of catalase. Biochemical Journal. 74 (2), 339-348 (1960).
  20. Shiba, D., Shimamoto, N. Attenuation of endogenous oxidative stress-induced cell death by cytochrome P450 inhibitors in primary cultures of rat hepatocytes. Free Radical Biology and Medicine. 27 (9-10), 1019-1026 (1999).
  21. Ishihara, Y., Shimamoto, N. Critical role of exposure time to endogenous oxidative stress in hepatocyte apoptosis. Redox Report. 12 (6), 275-281 (2007).
  22. Valenti, V. E., de Abreu, L. C., Sato, M. A., Ferreira, C. ATZ (3-amino-1,2,4-triazole) injected into the fourth cerebral ventricle influences the Bezold-Jarisch reflex in conscious rats. Clinics. 65 (12), 1339-1343 (2010).
  23. Welker, A. F., Campos, E. G., Cardoso, L. A., Hermes-Lima, M. Role of catalase on the hypoxia/reoxygenation stress in the hypoxia-tolerant Nile tilapia. American Journal of Physiology. Regulatory, Integrative and Comparative Physiology. 302 (9), 1111-1118 (2012).
  24. Bagnyukova, T. V., Vasylkiv, O. Y., Storey, K. B., Lushchak, V. I. Catalase inhibition by amino triazole induces oxidative stress in goldfish brain. Brain Research. 1052 (2), 180-186 (2005).
  25. Falck, E., Karlsson, S., Carlsson, J., Helenius, G., Karlsson, M., Klinga-Levan, K. Loss of glutathione peroxidase 3 expression is correlated with epigenetic mechanisms in endometrial adenocarcinoma. Cancer Cell International. 10 (46), (2010).
  26. Chaudiere, J., Wilhelmsen, E. C., Tappel, A. L. Mechanism of selenium-glutathione peroxidase and its inhibition by mercaptocarboxylic acids and other mercaptans. Journal of Biological Chemistry. 259 (2), 1043-1050 (1984).
  27. Dunning, S., et al. Glutathione and antioxidant enzymes serve complementary roles in protecting activated hepatic stellate cells against hydrogen peroxide-induced cell death. Biochimica et Biophysica Acta. 1832 (12), 2027-2034 (2013).
  28. Franco, J. L., et al. Methylmercury neurotoxicity is associated with inhibition of the antioxidant enzyme glutathione peroxidase. Free Radical Biology and Medicine. 47 (4), 449-457 (2009).
  29. Sundberg, J. P., Silva, K. A. What color is the skin of a mouse. Veterinary Pathology. 49 (1), 142-145 (2012).
  30. Curtis, A., Calabro, K., Galarneau, J. R., Bigio, I. J., Krucker, T. Temporal variations of skin pigmentation in C57BL/6 mice affect optical bioluminescence quantitation. Molecular Imaging & Biology. 13 (6), 1114-1123 (2011).
  31. Kim, J. H., Martins-Green, M. Protocol to create chronic wounds in diabetic mice. Nature Protocols Exchange. , (2016).
  32. Aasum, E., Hafstad, A. D., Severson, D. L., Larsen, T. S. Age-dependent changes in metabolism, contractile function, and ischemic sensitivity in hearts from db/db mice. Diabetes. 52 (2), 434-441 (2003).
  33. Vannucci, S. J., et al. Experimental stroke in the female diabetic, db/db, mouse. Journal of Cerebral Blood Flow & Metabolism. 21 (1), 52-60 (2001).
  34. Janssen, B. J., et al. Effects of anesthetics on systemic hemodynamics in mice. American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology. 287 (4), 1618-1624 (2004).
  35. Osborn, O., et al. Metabolic characterization of a mouse deficient in all known leptin receptor isoforms. Cellular and Molecular Neurobiology. 30 (1), 23 (2010).
  36. Scales, B. S., Huffnagle, G. B. The microbiome in wound repair and tissue fibrosis. Journal of Pathology. 229 (2), 323-331 (2013).
  37. Gjødsbøl, K., et al. No need for biopsies: Comparison of three sample techniques for wound microbiota determination. International Wound Journal. 9 (3), 295-302 (2012).
  38. Wolcott, R. D., et al. Analysis of the chronic wound microbiota of 2,963 patients by 16S rDNA pyrosequencing. Wound Repair Regeneration. 24 (1), 163-174 (2016).
  39. Gjødsbøl, K., Christensen, J. J., Karlsmark, T., Jørgensen, B., Klein, B. M., Krogfelt, K. A. Multiple bacterial species reside in chronic wounds: a longitudinal study. International Wound Journal. 3 (3), 225-231 (2006).
  40. Dowd, S. E., et al. Survey of bacterial diversity in chronic wounds using Pyrosequencing, DGGE, and full ribosome shotgun sequencing. BMC Microbiology. 8 (43), (2008).
  41. Price, L. B., et al. Community analysis of chronic wound bacteria using 16S rrna gene-based pyrosequencing: Impact of diabetes and antibiotics on chronic wound microbiota. PLoS One. 4 (7), 6462 (2009).
  42. Scales, B. S., Huffnagle, G. B. The microbiome in wound repair and tissue fibrosis. Journal of Pathology. 229 (2), 323-331 (2013).
  43. Dowd, S. E., et al. Polymicrobial nature of chronic diabetic foot ulcer biofilm infections determined using bacterial tag encoded FLX amplicon pyrosequencing (bTEFAP). PLoS One. 3 (10), 3326 (2008).
  44. Price, L. B., et al. Macroscale spatial variation in chronic wound microbiota: A cross-sectional study. Wound Repair and Regeneration. 19 (1), 80-88 (2011).
  45. Gontcharova, V., Youn, E., Sun, Y., Wolcott, R. D., Dowd, S. E. Comparison of bacterial composition in diabetic ulcers and contralateral intact skin. Open Microbiology Journal. 4, 8-19 (2010).
  46. Smith, K., et al. One step closer to understanding the role of bacteria in diabetic foot ulcers: characterising the microbiome of ulcers. BMC Microbiologyogy. 16 (54), (2016).
  47. Gardner, S. E., Hillis, S. L., Heilmann, K., Segre, J. A., Grice, E. A. The Neuropathic diabetic foot ulcer microbiome is associated with clinical factors. Diabetes. 62 (3), 923-930 (2013).
  48. Loesche, M., et al. Temporal stability in chronic wound microbiota is associated with poor healing. Journal of Investigative Dermatology. 137 (1), 237-244 (2017).
  49. Kalan, L., et al. Redefining the chronic-wound microbiome: Fungal communities are prevalent, dynamic, and associated with delayed healing. MBio. 7 (5), 01058-01116 (2016).
  50. Blakytny, R., Jude, E. The molecular biology of chronic wounds and delayed healing in diabetes. Diabetic Medicine. 23 (6), 594-608 (2006).

Tags

Tıp Sayı 151 Yara iyileşmesi kronik yara bozulmuş iyileşme diyabetik ayak ülseri oksidatif stres biyofilm
Diyabetik Farelerde Kronik Yaralar Oluşturma Protokolü
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Kim, J. H., Martins-Green, M.… More

Kim, J. H., Martins-Green, M. Protocol to Create Chronic Wounds in Diabetic Mice. J. Vis. Exp. (151), e57656, doi:10.3791/57656 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter