Summary
Hier beschrijven we de intracraniële subarachnoïdale route van infectie bij muizen te bestuderen van de rollen van biofilms in Streptococcus suis meningitis. Deze infectie model is ook geschikt voor de studie van de pathogenese van andere bacteriële meningitis en werkzaamheid van nieuwe medicijnen tegen bacteriële meningitis.
Abstract
Streptococcus suis is niet alleen een grote bacteriële ziekteverwekker van varkens wereldwijd, maar ook een opkomende zoönoseverwekker. Bij mensen en varkens is meningitis een grote manifestatie van S. suis infecties. Een model geschikt infectie is een essentieel instrument om het begrijpen van de mechanismen van ziekten veroorzaakt door pathogenen. Verschillende routes van infectie in muizen hebben ontwikkeld om te bestuderen van de pathogenese van S. suis -infectie. De routes van het intraperitoneaal intranasale en intraveneuze van infectie zijn echter niet geschikt voor de studie van de rollen van S. suis oppervlakte componenten in meningitis direct in de hersenen, zoals de extracellulaire matrix van biofilms. Hoewel intracisternal inoculatie is gebruikt voor S. suis -infectie, is de precieze injectieplaats niet beschreven. Hier, werd de intracraniële subarachnoïdale route van infectie beschreven in een muismodel te onderzoeken van de rol van biofilms in S. suis meningitis. S. suis planktonische cellen of biofilm staat cellen werden direct geïnjecteerd in de subarachnoïdale ruimte van muizen via de injectieplaats ligt 3,5 mm rostraal van de bregma. Histopathologisch analyse en verhoogde mRNA uitdrukking van TLR2 en cytokinen van het hersenweefsel van muizen ingespoten met cellen van biofilm staat duidelijk aangegeven dat S. suis biofilm definitieve rollen in S. suis meningitis speelt. Deze route van infectie heeft duidelijke voordelen ten opzichte van andere routes van infectie, waardoor de studie van de gastheer-bacterie interactie. Bovendien, het maakt het mogelijk het effect van bacteriële onderdelen op de immuunrespons van de gastheer direct in de hersenen worden beoordeeld, en bootst bacteriële ingang in het centrale zenuwstelsel. Deze route van infectie kan worden uitgebreid voor het onderzoeken van de mechanismen van meningitis veroorzaakt door andere bacteriën. Daarnaast kan het ook worden gebruikt voor het testen van de werkzaamheid van geneesmiddelen tegen bacteriële meningitis.
Introduction
Streptococcus suis (S. suis) is een grote bacteriële ziekteverwekker van varkens wereldwijd, waardoor ernstige ziekten, met inbegrip van hersenvliesontsteking, longontsteking, septikemie, endocarditis en artritis1. Het is ook een opkomende zoönoseverwekker. Tot nu toe, is het gemeld dat negen serotypen infectie bij de mens veroorzaken kunnen, met inbegrip van serotypen 2, 4, 5, 9, 14, 16, 21, 24 en 312,3,4. Bij mensen en varkens is meningitis een van de belangrijkste klinische symptomen van S. suis infecties. In Vietnam en Thailand is S. suis de voornaamste oorzaak van meningitis in volwassenen5. Microbiële biofilms zijn micro-organismen die zich aan elkaar en zijn geconcentreerd op een interface; ze zijn essentieel voor bacteriële virulentie, overleven in uiteenlopende omgevingen en antibioticaresistentie5. Biofilms zijn meestal omringd door een extracellulaire matrix waarin over het algemeen polysacchariden, eiwitten en DNA-6. De laatste kan uitlokken host inflammatoire reacties en cytokine productie7. Biofilm vorming is gemeld te worden betrokken bij de streptokokken meningitis in eerdere studies. Biofilms bijdragen tot Streptococcus agalactiae meningitis in een model van de vis tilapia en biofilm vorming binnen de hersenen weefsels is geopenbaard en rond meningeal oppervlakken in vivo via intra-abdominale inoculatie8. Tijdens de meningitis, Streptococcus pneumoniae is in een biofilm-achtige toestand en bacteriën in een dergelijke biofilm staat waren effectiever in het inducerende meningitis in een muis besmetting model9. Daarnaast, in onze vorige bestuderen, de biofilm staat gekoppeld aan S. suis in muis hersenen draagt bij aan bacteriële virulentie door survival analyse10. Direct bewijs voor biofilm betrokkenheid bij S. suis meningitis moet echter verder onderzocht worden.
Dierlijke modellen van S. suis -infectie hebben ontwikkeld in muizen met behulp van de intraperitoneaal (i.p.)11, intranasale (i.n.)12, intraveneuze (i.v.)13en de intracisternal (IC) routes van infectie14, 15 , 16. de i.p. i.n. en i.v. routes van infectie zijn echter niet geschikt voor de studie van de rollen van S. suis oppervlakte componenten in meningitis direct in de hersenen. Het gaat hierbij om extracellulaire matrix van biofilms. Hoewel de i.c. inoculatie werd gebruikt voor S. suis -infectie, is de precieze injectieplaats niet beschreven in deze documenten. De stereotaxic coördinaten van de injectieplaats voor intracraniële subarachnoïdale inoculatie is daarentegen duidelijk beschreven in een eerdere studie17. Dit toegestaan eenvoudige erkenning van de inoculatie punt en meer simplistische experimenteel protocol. Bovendien, bootst de intracraniële subarachnoïdale route van infectie bacteriële ingang in het centrale zenuwstelsel van de sinussen of het middenoor17, en de relatie tussen het middenoor en meningitis veroorzaakt door S. suis Madsen et al.18heeft aangetoond. Bovendien, door toepassing van de intracraniële subarachnoïdale route van infectie in muizen, hebben wij aangetoond dat S. suis kleine RNA rss04 tot meningitis in onze eerdere studie10 bijdraagt.
In de huidige studie, de intracraniële subarachnoïdale route van infectie werd gebruikt in muizen te onderzoeken van de rol van biofilms in S. suis meningitis. Muizen werden besmet met planktonische cellen of biofilm staat cellen van S. suis door deze route van infectie. Histopathologische analyses en verhoogde mRNA uitdrukking van TLR2 en cytokines van hersenweefsel van muizen ingespoten met cellen van biofilm staat duidelijk aangegeven dat S. suis biofilm tot meningitis bijdraagt.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
De muis infectie experimenten werden goedgekeurd door het laboratorium dier Monitoring Commissie van de oostelijke provincie Jiangsu, China en uitgevoerd in het laboratorium dier Center van Nanjing Agricultural University (nummer staan: SYXK (Su) 2017-0007).
1. bereiding van bacteriën
Opmerking: S. suis serotype 2 virulente stam P1/7 werd geïsoleerd uit een zieke varkens met meningitis19. Stam P1/7 werd gekweekt in Todd-Hewitt Bouillon (THB, formule per liter THB: hart infusie, 3.1 g neopeptone, 20,0 g dextrose, 2.0 g; natriumchloride, 2.0 g, Dinatrium fosfaat, 0,4 g; natriumcarbonaat, 2,5 g) en vergulde op Todd-Hewitt agar (THA, formule per liter THA: Hart infusie, 3.1 g; neopeptone, 20,0 g; dextrose, 2.0 g; natriumchloride, 2.0 g; Dinatrium fosfaat, 0.4 g; natriumcarbonaat, 2,5 g; agar, 15,0 g) bij 37 ° C en 5% CO2.
- P1/7 planktonische cellen van de stam van de verzameling van
- 5 mL van de planktonische cellen ophalen halverwege log fase cultuur (OD600= 0.6), gedurende 3 min bij 8000 × g centrifugeren en daarna 3 keer wassen met PBS.
- Resuspendeer de cellen met 5 mL 25% glycerol in THB, aliquoot in 5 buizen, en sla bij-80 ° C.
- P1/7 biofilm staat cellen van de stam van de verzameling van
- Breng 20 mL van een overnachting cultuur en voeg 180 ml verse THB; Verdeel de verdunde cultuur in 10-ronde cultuur platen even, en zet dan de platen in een incubator bij 37 ° C in 5% CO2 gedurende 24 uur.
- Na incubatie, schud de plaat zachtjes om resuspendeer de bacteriën die er niet hebben gehouden aan de plaat, en verwijder vervolgens het supernatant door aspiratie.
Opmerking: Schud de plaat voorzichtig en Vermijd het sediment resuspending. - Voeg 5 mL PBS oogst biofilm staat cellen, het sediment volledig resuspendeer en breng het monster aan een nieuwe buis.
- Bewerk ultrasone trillingen ten de biofilm staat cellen van de laatste stap met de volgende parameters: 60 W, 4 cycli, 5 s op en 10 s af.
- Centrifugeer gedurende 3 min bij 8000 × g en bewaar het supernatant bij-80 ° C.
Opmerking: Het supernatant kan bevatten biofilm componenten en het kan worden gebruikt om resuspendeer de biofilm bacteriën voordat de infectie zoals beschreven in de dierproeven (stap 3). - Resuspendeer de sediment met 10 mL 25% glycerol in THB en sla de biofilm staat cellen bij-80 ° C.
2. scannen van elektronen microscoop (SEM) analyse
- Fix de verzamelde biofilm staat cellen en planktonische cellen met behulp van 4% paraformaldehyde voor 12-24 uur bij 4 ° C.
- Spoel de monsters snel met gedestilleerd water en uitdrogen van de monsters opeenvolgend met een toenemende concentratie van ethanol (25%, 50%, 70%, 90% en 100%) gedurende 30 min. in elke oplossing.
- De gedroogde monsters om metalen houders met dubbelzijdige tape en ten slotte jas hen in een verdamper met goud en palladium houden.
- Observeren van de monsters door een scannende elektronen microscoop met behulp van de volgende parameters: EHT (Extra hoge spanning) = 10 kV; WD (werkt afstand) = 7.0 of 8.0 mm; Vergroting = 5000 ×; Signaal A = SE1.
3. dier experimenten
- Gebruik SPF 6 weken oude vrouwelijke BALB/c muizen in deze studie. Besmetten alle muizen via de intracraniële subarachnoïdale route van infectie waarvan injectieplaats gelegen 3.5 mm rostraal van de bregma is. De stereotaxic coördinaten van de injectieplaats werden door Chiavolini et al.17duidelijk beschreven.
- Histopathologisch p.a., infecteren twee groepen muizen (5 muizen per groep) met behulp van de planktonische cellen of biofilm staat cellen bij een dosis van 3 × 107 kolonie-vormende eenheden (kve), en een andere 5 muizen werden ingespoten met PBS als een besturingselement.
- Voor detectie van mRNA uitdrukking van TLR2 en cytokinen in hersenen, infecteren twee extra groepen muizen (6 muizen per groep) cellen met behulp van de planktonische cellen of biofilm staat bij een dosis van 3 × 107 CFU.
- Bepaal het aantal levensvatbare bacteriën door seriële verdunningen naar THA plating.
- Euthanaseren alle muizen op 12u na infectie voor verder onderzoek.
Opmerking: Glycerol in het voorraad medium moet worden verwijderd voordat de infectie. Zowel de planktonische cellen en de biofilm staat cellen hersteld van-80 ° C worden gewassen 3 keer met PBS. Vervolgens zijn planktonische cellen geresuspendeerde met PBS en verdund tot de juiste dosering voor infectie; biofilm staat cellen zijn geresuspendeerde met het opgeslagen supernatant (uit stap 1.2.5) en verdund tot de juiste dosering voor infectie. Het volume voor infectie mag niet meer dan 50 µL.
- De uitdrukking van mRNA van TLR2 en cytokinen opsporen in hersenweefsel
- Het uittreksel van het totale RNA van hersenweefsel met behulp van een RNA extractie kit.
- Gebruik voor elke muis, hele hersenweefsel voor de extractie van RNA. Verdeel de hele hersenweefsel in 5 buizen. 100 mg hersenweefsel duren en voeg 1 mL lysis oplossing aan elke buis met de lysing matrix geboden door de kit.
- Verwerken van de buis in een homogenizer voor 40 s bij een instelling van 6.0, waarna centrifuge de buis bij 12000 × g- en 4 ° C gedurende 5 minuten.
- Na het centrifugeren, door de bovenste fase te overbrengen in een nieuwe microcentrifuge buis.
- Incubeer de overgedragen monster gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur; Voeg 300 µL van chloroform, vortex voor 10 s, en vervolgens gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur incuberen.
- Centrifugeer de buis op 12000 × g- en 4 ° C gedurende 5 min. de bovenste fase overbrengen in een nieuwe buis.
- 500 µL van koude absolute ethanol toevoegen aan de buis, voordat het voor 5 keer omkeren, en sla het monster bij-20 ° C gedurende ten minste 1 uur.
- Centrifugeer de buis op 12000 × g- en 4 ° C gedurende 15 minuten en verwijder de bovendrijvende substantie. Wassen van de pellet met 500 µL van koude 75% ethanol in RNase-vrije H2O.
- Verwijder de ethanol, lucht droog de pellet gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur, en resuspendeer de RNA in 100 µL van RNase-vrije H2O.
- Incubeer de RNA gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur en bepaal de concentratie van de RNA met behulp van een RNA-bioanalyzer.
- CDNA synthese, waaronder verwijdering van genomic DNA (gDNA), met behulp van een thermocycler met een omgekeerde transcriptie (RT) reagens kit uitvoeren
- 1 µg RNA toevoegen aan een buis met 2 µL van 5 x gDNA eliminatie buffer, 1 µL van gDNA eliminatie enzym en RNase-vrije H2O totdat het volume bereikt 10 µL. Incubeer gedurende 2 min op 42 ° C.
- Voeg 10 µL van master mix (1 µL van RT enzym Mix ik, 1 µL van RT Primer Mix, 4 µL van 5 x Buffer 2 en 4 µL van RNase-vrije H2O) aan de oplossing van de reactie van de laatste stap en meng voorzichtig. Meteen doorgaan met de RT-reactie: 37 ° C voor 15 min en vervolgens 85 ° C gedurende 5 s.
- De kwantitatieve real-time PCR (RT-qPCR) analyses met behulp van een Real-Time PCR-machine met een SYBR RT-qPCR kit uit te voeren. Voeg 10 µL van 2 x enzym, 0.8 µL van voorwaartse primer, 0.8 µL van omgekeerde primer, 0.4 µL van 50 x ROX referentie kleurstof II, 2 µL van cDNA sjabloon en RNase-vrije H2O tot een totaal volume van 20 µL.
- Elk monster lopen in drievoud met de volgende parameters van de thermische: 30 s bij 94 ° C, gevolgd door 40 cycli van 5 bij 95 ° C s en 34 bij 60 ° C, met een laatste fase van 15 s s bij 95 ° C, 1 minuut bij 60 ° C , en 15 s bij 95 ° C. Inleidingen voor RT-qPCR zijn vermeld in tabel 1. Huishouding genen B2m en 18s rRNA werden gebruikt als de interne controles.
- Bereken de verandering van de relatieve vouwen op basis van de 2-ΔΔCt -methode.
- Het uittreksel van het totale RNA van hersenweefsel met behulp van een RNA extractie kit.
-
Waarneming van histologische secties
- Na 24u fixatie met 10% formaline, reconstrueren de vaste hersenweefsel in passende maten van weefsel stukken op 2-3 mm.
- Zet de stukken weefsel in een insluiten cassette en onderdompelen in een nieuwe kleefpoeders oplossing voor uitdroging met een automatische vacuüm dehydrator.
- Neem het vaste weefsel en het sequentieel uitdrogen in toenemende concentraties van ethanol (70%, 80%, 95%, 95% en 100%) gedurende 30 min. in elke oplossing.
- Transparentize van het monster met xyleen gedurende 15 minuten, dompel het in vloeibare paraffine bij 60 ° C gedurende 90 min en vervolgens insluiten met behulp van een insluiten machine.
- Snijd de paraffine blok ingesloten weefsel in 3 µm plakjes, tegel van het segment op water bij 45 ° C en vervolgens drogen in de lucht.
- Incubeer de sectie gedurende 3 uur bij 60 ° C, vlek met behulp van de haematoxylin en eosine (HE) methode en zegel met het neutrale tandvlees.
- Observeer de histopathologische veranderingen van de hersenen met een optische Microscoop. Een vier-punts indeling systeem werd gebruikt voor het evalueren van histologische wijzigingen. Een ongepaard t -test gebruiken voor statistische analyse.
Congestie/bloeding: afwezig, score 0; klein gebied van focal congestie/bloeding, score 1; groot gebied van focal congestie/bloeding, of meerdere sites van kleine ruimte van focal congestie/bloeding, score 2; maximaal drie sites van de grote focale congestie/bloeding, score 3; diffuus congestie/bloeding, score 4.
Necrose: afwezig, score 0; focale necrose, score 1; optreden van 1-10 necrotische cellen verspreiden, score 2; Foci van confluente necrose, score 3; uitgebreide confluente necrose, score 4.
Inflammatoire cel infiltratie: afwezig, score 0; paar en focale infiltraties, score 1; multifocale infiltratie of infiltraties met vorming van aggregaten, score 2; tot drie aggregaten, score 3; en meer dan vier aggregaten, score 4.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
SEM analyse werd uitgevoerd om te onderzoeken van biofilm vorming onder de proefomstandigheden. Zoals blijkt uit Figuur 1, is er een significant verschil in de biofilm vorming tussen planktonische cellen (Figuur 1A) en biofilm staat cellen (Figuur 1B). SEM analyse toonde aan dat de biofilm bacteriën in klontjes waren en meerdere lagen en ze werden ingekapseld in de extracellulaire matrix, terwijl planktonische bacteriën veel minder dichte en vooral verspreide individueel waren.
De componenten van de extracellulaire matrix van biofilms, zoals DNA, kunnen uitlokken host inflammatoire reacties en cytokine productie. Sinds TLR2 en cytokinen CCL2, zijn IL-6 en TNF-α betrokken bij cerebrale inflammatoire reacties aan meningitis volgens eerdere studies10,11,20, de mRNA uitdrukking van deze genen werd vergeleken gerelateerde in vivo voor muizen geïnfecteerd met planktonische cellen en degenen die besmet zijn met biofilm staat cellen. Dit werd gedaan om het effect van biofilms verkennen op inflammatoire respons in lymfkliertest hersenweefsel. Zoals weergegeven in Figuur 2, op 12u na infectie, de uitdrukking van TLR2, CCL2, IL-6 en TNF-α van hersenen van geïnfecteerde muizen was aanzienlijk hoger voor biofilm staat cellen ten opzichte van planktonische cellen.
Muizen geïnfecteerd met biofilm bacteriën toonde veel ernstiger symptomen van meningitis (starre houding, ataxie of convulsies) dan degenen die besmet zijn met planktonische bacteriën. Histopathologisch onderzoek van het hersenweefsel van muizen geïnfecteerd met S. suis stam die P1/7 congestie/bloeding, necrose en inflammatoire cel infiltratie in de hersenvliezen, de hersenschors, de ventrikels, of de diencephalon (Figuur 3 toonde) . In vergelijking met muizen geïnfecteerd met planktonische bacteriën (Figuur 3E-H), op 12 h na infectie, veel meer ernstige pathologische veranderingen werden waargenomen in hersenweefsel van muizen geïnfecteerd met biofilm bacteriën (Figuur 3A-D), met inbegrip van grote gebieden van congestie/bloeding, necrose of intens inflammatoire cel infiltratie. De bruto pathologische veranderingen in de hersenen van muizen geïnfecteerd met plankton en biofilm bacteriën werd opgenomen in tabel 2. Noch de neurologische symptomen als de pathologische veranderingen werden waargenomen van muizen geïnjecteerd met PBS. Samen genomen, tonen deze gegevens duidelijk aan dat S. suis biofilms aan inductie van meningitis bijdragen.
Figuur 1: SEM beelden van stam P1/7 planktonische cellen en cellen staat de biofilm. Bacteriën werden gekweekt in THB medium. SEM analyse toonde aan dat planktonische cellen (A) waren veel minder dichte en vooral verspreide individueel, terwijl biofilm bacteriën (B) waren geclusterd in klontjes en meerdere lagen en ze werden ingekapseld in de extracellulaire matrix. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 2: Biofilms activeren de uitdrukking van mRNA van CCL2, IL-6, TNF-α en TLR2 in het hersenweefsel muis in vivo. Zes BALB/c muizen per groep waren elk geïnjecteerd door de intracraniële subarachnoïdale route van infectie met 3 × 107 CFU planktonische cellen of biofilm staat cellen. Muizen werden euthanized op 12u na infectie. De resultaten worden gepresenteerd als de vouw veranderen van mRNA uitdrukking in biofilm Braziliaanse cel-geïnfecteerde muizen met planktonische cel-geïnfecteerde muizen vergeleken. (A) het gen B2m werd gebruikt als het referentie-gen; (B) het gen 18s rRNA werd gebruikt als het referentie-gen. Een ongepaard t-test werd gebruikt voor statistische analyse. ** p ≤0.01, en * p-≤0.05. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 3: histologische analyse van het hersenweefsel van muizen geïnfecteerd met stam P1/7 planktonische bacteriën en biofilm staat bacteriën. A-D, monsters van de hersenen van muizen geïnfecteerd met biofilm staat bacteriën; E-H, de monsters van de hersenen van muizen geïnfecteerd met planktonische bacteriën. A, B, E en F: hersenvliezen en hersenschors; C en G: ventrikels; D en H: diencephalon. Δ, congestie/bloeding; □, necrose; ○: inflammatoire cel infiltratie. Vergroting = 200 X; schaal bar = 100 µm. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
| De naam van de primer | Volgorde (5' - 3') | Gene symbool |
| IL-6 vooruit | CTTCCATCCAGTTGCCTTCT | Il6 |
| IL-6 omgekeerde | CTCCGACTTGTGAAGTGGTATAG | Il6 |
| TLR2 vooruit | CACTATCCGGAGGTTGCATATC | Tlr2 |
| Omgekeerde TLR2 | GGAAGACCTTGCTGTTCTCTAC | Tlr2 |
| CCL2 vooruit | CTCACCTGCTGCTACTCATTC | Ccl2 |
| Omgekeerde CCL2 | ACTACAGCTTCTTTGGGACAC | Ccl2 |
| TNF-α vooruit | TTGTCTACTCCCAGGTTCTCT | TNF |
| TNF-α omgekeerde | GAGGTTGACTTTCTCCTGGTATG | TNF |
| Β2m vooruit | GGTCTTTCTGGTGCTTGTCT | B2m |
| Omgekeerde β2m | TATGTTCGGCTTCCCATTCTC | B2m |
| 18s vooruit | GTAACCCGTTGAACCCCATT | 18s rRNA |
| 18s omgekeerde | CCATCCAATCGGTAGTAGCG | 18s rRNA |
Tabel 1: Primers voor RT-qPCR.
Tabel 2: de bruto histopathologische veranderingen in de hersenen van muizen geïnfecteerd met S. suis stam P1/7. Een vier-punts indeling systeem werd gebruikt voor het evalueren van histologische wijzigingen, zoals beschreven in sectie 3.3.7 Protocol. De totale score werd berekend als de som van de scores uit verschillende histopathologische veranderingen. Het gemiddelde werd berekend door de totale score/aantal muizen. Een ongepaard t-test werd gebruikt voor statistische analyse. ** p ≤0.01.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
De intracraniële subarachnoïdale route van infectie beschreven hier heeft duidelijke voordelen ten opzichte van andere routes van infectie. Het staat de onderzoekers bestuderen de gastheer-bacterie interactie en het effect van bacteriële onderdelen op host immuunrespons direct in de hersenen, die na te bootsen van bacteriële ingang in het centrale zenuwstelsel. Dus, deze route van infectie kan worden uitgebreid voor het onderzoeken van de mechanismen van meningitis veroorzaakt door andere bacteriën. Daarnaast kan het ook worden gebruikt voor het testen van de werkzaamheid van geneesmiddelen tegen bacteriële meningitis.
Met het oog op een goede resultaten met behulp van dit model, zijn de volgende kritische stappen expliciete. Biofilm vorming moet worden onderzocht onder proefomstandigheden. In de huidige studie, werd onderzocht met behulp van Scannende Elektronen Microscoop analyse. Andere methoden kunnen ook worden gebruikt te bestuderen van de vorming van biofilms, zoals weefselkweek plaat methode en buis methode21. Een dag voordat de infectie, moeten aliquots van zowel de planktonische cellen en de biofilm staat cellen worden ontdooid van-80 ° C tot het bepalen van de CFU. De volgende dag, moeten bacteriën worden verdund tot de juiste dosis volgens de CFU voor infectie. De mock-geïnfecteerde controlegroep ingespoten met PBS moet worden opgenomen en de muizen uit de mock-geïnfecteerde controlegroep moet vertonen geen manifestaties tijdens de duur van het experiment van de infectie. Verschillende stammen wellicht verschillende infectieuze doses, dus een apart experiment sterk aanbevolen is om te bepalen van de juiste infectieuze dosis. In de huidige studie, werd een dosis van 3 × 107 CFU voor infectie gebruikt op basis van onze voorlopige experiment. Deze dosis van biofilm bacteriën kon veroorzaken ernstige tekenen van meningitis en daaropvolgende dood in alle 5 muizen 48 uur na infectie in het voorontwerp experiment.
De verstoring van de bloed-hersenen of de bloed-hersen vloeistof belemmeringen door S. suis zijn een belangrijke stap in het veroorzaken van meningitis22,23,24. De intracraniële subarachnoïdale route van infectie is niet geschikt voor de beoordeling van het vermogen van S. suis om deze barrières doorbreken. Andere routes van infectie, zoals i.p., i.v. of i.n., kunnen worden gebruikt om dit doel te bereiken.
Hier, we eerst laten zien dat S. suis biofilm bijdraagt tot de inductie van meningitis met behulp van de intracraniële subarachnoïdale route van infectie. Dit model van de infectie niet alleen helpt om de mechanismen van S. suis meningitis verder te begrijpen, maar is ook geschikt voor de studie van de pathogenese van meningitis veroorzaakt door andere bacteriën en de werkzaamheid van nieuwe medicijnen tegen bacteriële meningitis.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
Dit werk werd gesteund door subsidies van de nationale sleutel onderzoek en ontwikkeling programma van China [2017YFD0500102]; de Stichting nationale natuurwetenschappen van China [31572544]; de staat belangrijke laboratorium voor veterinaire etiologische biologie [SKLVEB2016KFKT005]; de Shanghai landbouw toegepast technologie ontwikkeling programma, China [G2016060201].
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Todd Hewitt Broth(THB) | Becton, Dickinson and Company | DF0492078 | Dissolve 30 g of the powder in 1 L of purified water. Autoclave at 121° for 15 min. |
| Agar | DSBIO | 16C0050 | Dissolve 15 g of the powder in 1 L of THB. Autoclave at 121° for 15 min. |
| Milli-Q Reference Water Purification System | Merck KGaA | Z00QSVCUS | Without Dnase/ Rnase |
| NaCl | Tianjin Kemiou Chemical Reagent Co., Ltd | 10019318 | Dissolve 8 g NaCl, 0.2 g KCl, 1.42 g Na2HPO3 , 0.27 g KH2PO4 in 1 L of purified water. Autoclave at 121° for 15 min. Use KOH to adjust pH to 7.4. |
| Na2HPO3 | Xilong Scientific Co., Ltd | 9009012-01-09 | Dissolve 8 g NaCl, 0.2 g KCl, 1.42 g Na2HPO3 , 0.27 g KH2PO4 in 1 L of purified water. Autoclave at 121° for 15 min. Use KOH to adjust pH to 7.4. |
| KCl | Xilong Scientific Co., Ltd | 9009017-01-09 | Dissolve 8 g NaCl, 0.2 g KCl, 1.42 g Na2HPO3 , 0.27 g KH2PO4 in 1 L of purified water. Autoclave at 121° for 15 min. Use KOH to adjust pH to 7.4. |
| KH2PO4 | Xilong Scientific Co., Ltd | 9009019-01-09 | Dissolve 8 g NaCl, 0.2 g KCl, 1.42 g Na2HPO3 , 0.27 g KH2PO4 in 1 L of purified water. Autoclave at 121° for 15 min. Use KOH to adjust pH to 7.4. |
| KOH | Xilong Scientific Co., Ltd | 9009014-01-09 | Dissolve 8 g NaCl, 0.2 g KCl, 1.42 g Na2HPO3 , 0.27 g KH2PO4 in 1 L of purified water. Autoclave at 121° for 15 min. Use KOH to adjust pH to 7.4. |
| Glycerol | Sionpharm Chemical Reagent Co., Ltd | 10010618 | Diluted with equal volumu of purified water, autoclave at 121° for 15 min |
| 4% paraformaldehyde | Sionpharm Chemical Reagent Co., Ltd | 80096675 | |
| 25% Glutaraldehyde | Sionpharm Chemical Reagent Co., Ltd | 30092436 | 10-fold diluted with purified water for fixation. |
| Ethanol | Sionpharm Chemical Reagent Co., Ltd | 10009218 | |
| Chloroform | Sionpharm Chemical Reagent Co., Ltd | 10006818 | |
| Spctrophotometre | DeNovix Inc. | DS-11+ | |
| Ultrasound cell crusher | NingBo Scientz Biotechnology Co.,Ltd | JY96-IIN | |
| Centrifuge | Hitachi Koki Co., Ltd | CT15RE | |
| Refrigerator | Aucma Co., Ltd | DW-86L500 | |
| Scanning electron microscope | Zeiss | EVO-LS10 | |
| FastRNA Pro Green Kit | MP Biomedicals | #6045-050 | |
| FastPrep-24 Instrument | MP Biomedicals | 116005500 | |
| Instrument for PCR | SensoQuest GmbH | 1124310110 | |
| QuantStudio 6 Flex | Thermo Fisher Scientific | 4485689 | |
| SYBR Premix Ex Taq II | Takara Biomedical Technology (Beijing) Co., Ltd | RR820A | |
| PrimeScript RT reagent kit with gDNA Eraser | Takara Biomedical Technology (Beijing) Co., Ltd | RR047A | |
| Fully Enclosed Tissue Processor | Leica Biosystems Nussloch GmbH | ASP200S | |
| Heated Paraffin Embedding Module | Leica Biosystems Nussloch GmbH | EG1150H | |
| Semi-Automated Rotary Microtome | Leica Biosystems Nussloch GmbH | RM2245 | |
| Water bath for paraffin sections | Leica Biosystems Nussloch GmbH | HI1210 | |
| Autostainer XL | Leica Biosystems Nussloch GmbH | ST5010 | |
| Agilent 2100 | Agilent Technologies | G2939A | |
| Optical microscope | Olympus | BX51 |
References
- Gottschalk, M., Xu, J., Calzas, C., Segura, M. Streptococcus suis: a new emerging or an old neglected zoonotic pathogen? Future Microbiology. 5, 371-391 (2010).
- Goyette-Desjardins, G., Auger, J. P., Xu, J., Segura, M., Gottschalk, M. Streptococcus suis, an important pig pathogen and emerging zoonotic agent-an update on the worldwide distribution based on serotyping and sequence typing. Emerging Microbes & Infections. 3 (6), e45 (2014).
- Kerdsin, A., et al. Emergence of Streptococcus suis serotype 9 infection in humans. Journal of Microbiology, Immunology and Infection. 50 (4), 545-546 (2017).
- Hatrongjit, R., et al. First human case report of sepsis due to infection with Streptococcus suis serotype 31 in Thailand. BMC Infect Diseases. 15, 392 (2015).
- Fittipaldi, N., Segura, M., Grenier, D., Gottschalk, M. Virulence factors involved in the pathogenesis of the infection caused by the swine pathogen and zoonotic agent Streptococcus suis. Future Microbiology. 7 (2), 259-279 (2012).
- Hall-Stoodley, L., Costerton, J. W., Stoodley, P. Bacterial biofilms: from the natural environment to infectious diseases. Nature Reviews Microbiology. 2 (2), 95-108 (2004).
- Fuxman Bass, J. I., et al. Extracellular DNA: a major proinflammatory component of Pseudomonas aeruginosa biofilms. Journal of Immunology. 184 (11), 6386-6395 (2010).
- Isiaku, A. I., et al. Biofilm is associated with chronic streptococcal meningoencephalitis in fish. Microbial Pathogenesis. 102, 59-68 (2017).
- Oggioni, M. R., et al. Switch from planktonic to sessile life: a major event in pneumococcal pathogenesis. Molecular Microbiology. 61 (5), 1196-1210 (2006).
- Xiao, G., et al. Streptococcus suis small RNA rss04 contributes to the induction of meningitis by regulating capsule synthesis and by inducing biofilm formation in a mouse infection model. Veterinary Microbiology. 199, 111-119 (2017).
- Dominguez-Punaro, M. C., et al. Streptococcus suis serotype 2, an important swine and human pathogen, induces strong systemic and cerebral inflammatory responses in a mouse model of infection. Journal of Immunology. 179 (3), 1842-1854 (2007).
- Seitz, M., et al. A novel intranasal mouse model for mucosal colonization by Streptococcus suis serotype 2. Journal of Medical Microbiology. 61 (Pt 9), 1311-1318 (2012).
- Busque, P., Higgins, R., Caya, F., Quessy, S. Immunization of pigs against Streptococcus suis serotype 2 infection using a live avirulent strain. Canadian Journal of Veterinary Research. 61 (4), 275-279 (1997).
- Williams, A. E., Blakemore, W. F. Pathology of Streptococcal meningitis following intravenous intracisternal and natural routes of infection. Neuropathology and Applied Neurobiology. 4 (4), 345-356 (1990).
- Dominguez-Punaro, M. C., et al. Severe cochlear inflammation and vestibular syndrome in an experimental model of Streptococcus suis infection in mice. European Journal of Clinical Microbiology & Infectious Diseases. 31 (9), 2391-2400 (2012).
- Auger, J. P., Fittipaldi, N., Benoit-Biancamano, M. O., Segura, M., Gottschalk, M. Virulence Studies of Different Sequence Types and Geographical Origins of Streptococcus suis Serotype 2 in a Mouse Model of Infection. Pathogens. 5 (3), (2016).
- Chiavolini, D., et al. Method for inducing experimental pneumococcal meningitis in outbred mice. BMC Microbiology. 4, 36 (2004).
- Madsen, L. W., Svensmark, B., Elvestad, K., Jensen, H. E. Otitis interna is a frequent sequela to Streptococcus suis meningitis in pigs. Veterinary Pathology. 38 (2), 190-195 (2001).
- Holden, M. T., et al. Rapid evolution of virulence and drug resistance in the emerging zoonotic pathogen Streptococcus suis. PLoS One. 4 (7), e6072 (2009).
- Dominguez-Punaro Mde, L., et al. In vitro characterization of the microglial inflammatory response to Streptococcus suis, an important emerging zoonotic agent of meningitis. Infection and Immunity. 78 (12), 5074-5085 (2010).
- Hassan, A., et al. Evaluation of different detection methods of biofilm formation in the clinical isolates. Brazilian Journal of Infectious Diseases. 15 (4), 305-311 (2011).
- Vanier, G., et al. New putative virulence factors of Streptococcus suis involved in invasion of porcine brain microvascular endothelial cells. Microbial Pathogenesis. 46 (1), 13-20 (2009).
- Takeuchi, D., et al. The contribution of suilysin to the pathogenesis of Streptococcus suis meningitis. Journal of Infectious Diseases. 209 (10), 1509-1519 (2014).
- Tenenbaum, T., et al. Polar bacterial invasion and translocation of Streptococcus suis across the blood-cerebrospinal fluid barrier in vitro. Cellular Microbiology. 11 (2), 323-336 (2009).
