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Immunology and Infection

Intracranial Subarachnoidal एक माउस संक्रमण मॉडल में दिमागी बुखार में स्ट्रेप्टोकोकस सुईस की भूमिकाओं की जांच के लिए संक्रमण का मार्ग

Published: July 1, 2018 doi: 10.3791/57658
Automatic Translation
1,2,3, 1,2,3, 1,2,3,4, 1,2,3, 1,2,3, 1,2,3,5, 1,2,3
1College of Veterinary Medicine, Nanjing Agricultural University, 2Key Lab of Animal Bacteriology, Ministry of Agriculture, 3OIE Reference Lab for Swine Streptococcosis, 4School of Medicine, Tsinghua University, 5Jiangsu Co-innovation Center for Prevention and Control of Important Animal Infectious Diseases and Zoonoses

Summary

यहां, हम चूहों में संक्रमण के intracranial subarachnoidal मार्ग का वर्णन स्ट्रेप्टोकोकस सुईस दिमागी बुखार में फिल्म की भूमिकाओं का अध्ययन करने के लिए । इस संक्रमण मॉडल भी अन्य बैक्टीरियल दिमागी बुखार के रोगजनन का अध्ययन और बैक्टीरियल दिमागी बुखार के खिलाफ नई दवाओं की प्रभावकारिता के लिए उपयुक्त है ।

Abstract

स्ट्रेप्टोकोकस सुईस न केवल दुनिया भर में सूअरों की एक प्रमुख जीवाणु रोगज़नक़ लेकिन यह भी एक उभरते पशुजन्य एजेंट है । मनुष्यों और सूअरों में, दिमागी बुखार एस सुईस संक्रमण की एक प्रमुख अभिव्यक्ति है । एक उपयुक्त संक्रमण मॉडल रोगजनकों की वजह से रोगों के तंत्र को समझने के लिए एक आवश्यक उपकरण है । एस सुईस इंफेक्शन के रोगजनन का अध्ययन करने के लिए चूहों में इंफेक्शन के कई रूट डेवलप किए गए हैं । हालांकि, intraperitoneal, intranasal, और नसों में संक्रमण के मार्गों मस्तिष्क में सीधे दिमागी बुखार में एस सुईस सतह घटकों की भूमिकाओं का अध्ययन करने के लिए उपयुक्त नहीं हैं, इस तरह के extracellular मैट्रिक्स के रूप में । हालांकि intracisternal टीका एस सुईस संक्रमण के लिए इस्तेमाल किया गया है, सटीक इंजेक्शन साइट नहीं बताया गया है । इधर, संक्रमण के intracranial subarachnoidal मार्ग के एस. सुईस दिमागी बुखार में हुई फिल्म की भूमिकाओं की जांच करने के लिए माउस मॉडल में बताया गया । एस सुईस planktonic कोशिकाओं या फिल्मी राज्य कोशिकाओं सीधे bregma से ३.५ मिमी rostral स्थित इंजेक्शन साइट के माध्यम से चूहों के अवजालतनिका अंतरिक्ष में इंजेक्शन थे. Histopathological विश्लेषण और TLR2 की वृद्धि हुई mRNA अभिव्यक्ति और मस्तिष्क ऊतक के साइटोकिंस के साथ इंजेक्शन चूहों से फिल्म राज्य कोशिकाओं को स्पष्ट रूप से संकेत दिया कि एस सुईस फिल्म सुईस दिमागी बुखार में निश्चित भूमिकाओं निभाता है । संक्रमण के इस मार्ग के संक्रमण के अंय मार्गों पर स्पष्ट लाभ है, मेजबान-जीवाणु बातचीत के अध्ययन की अनुमति । इसके अलावा, यह मेजबान प्रतिरक्षा प्रतिक्रियाओं पर जीवाणु घटकों के प्रभाव सीधे मस्तिष्क में परमिट का मूल्यांकन करने के लिए अनुमति देता है, और केंद्रीय तंत्रिका तंत्र में बैक्टीरियल प्रवेश नकल । संक्रमण का यह मार्ग अन्य बैक्टीरिया की वजह से दिमागी बुखार के तंत्र की जांच के लिए बढ़ाया जा सकता है । इसके अलावा, यह भी बैक्टीरियल दिमागी बुखार के खिलाफ दवाओं की प्रभावकारिता का परीक्षण किया जा सकता है ।

Introduction

स्ट्रेप्टोकोकस सुईस (एस सुईस) दुनिया भर में सूअरों की एक प्रमुख जीवाणु रोगज़नक़ है, दिमागी बुखार, निमोनिया, सेप्टीसीमिया, अन्तर्हृद्शोथ, और गठिया1सहित गंभीर रोगों के कारण । यह भी एक उभरते पशुजन्य एजेंट है । अब तक यह बताया गया है कि नौ serotypes मनुष्यों में संक्रमण का कारण बन सकते हैं, जिनमें serotypes 2, 4, 5, 9, 14, 16, 21, 24, और 312,3,4शामिल हैं । मनुष्यों और सूअरों में, दिमागी बुखार एस सुईस संक्रमण के प्रमुख नैदानिक संकेतों में से एक है । वियतनाम और थाईलैंड में, एस सुईस 5वयस्कों में दिमागी बुखार का प्रमुख कारण है । माइक्रोबियल फिल्मों एक दूसरे का पालन करें और एक अंतरफलक पर केंद्रित कर रहे हैं कि सूक्ष्मजीवों कर रहे हैं; वे जीवाणु डाह के लिए आवश्यक हैं, विविध वातावरण में अस्तित्व, और एंटीबायोटिक प्रतिरोध5। आमतौर पर एक extracellular मैट्रिक्स है कि आम तौर पर polysaccharides, प्रोटीन होते हैं, और6डीएनए से घिरा हुआ है । बाद के लिए मेजबान भड़काऊ प्रतिक्रियाओं और cytokine उत्पादन7में लाना करने में सक्षम है । फिल्म निर्माण पिछले अध्ययनों में स्त्रेप्तोकोच्कल दिमागी बुखार में शामिल होने की सूचना दी गई है । एक tilapia मछली मॉडल और फिल्म निर्माण में स्ट्रेप्टोकोकस agalactiae दिमागी बुखार में योगदान करने के लिए, मस्तिष्क के ऊतकों के भीतर और मस्तिष्कावरणीय सतहों के आसपास अंतर पेट टीका8के माध्यम से vivo में पता चला है । दिमागी बुखार के दौरान, स्ट्रेप्टोकोकस निमोनिया एक फिल्म की तरह है और इस तरह के एक फिल्म राज्य में बैक्टीरिया एक माउस संक्रमण मॉडल9में दिमागी बुखार उत्प्रेरण में अधिक प्रभावी थे । इसके अलावा, हमारे पिछले अध्ययन, में माउस मस्तिष्क में एस सुईस के साथ जुड़े फिल्म राज्य अस्तित्व विश्लेषण10से बैक्टीरियल डाह के लिए योगदान देता है । हालांकि, एस सुईस दिमागी बुखार में फिल्म के शामिल होने के लिए प्रत्यक्ष सबूत आगे की जांच की आवश्यकता है ।

एस सुईस संक्रमण के पशु मॉडल intraperitoneal (आईएफसआई)11, intranasal (i.n.)12, नसों (i.v.)13, और intracisternal (आईसी) संक्रमण 14 के मार्गों का उपयोग चूहों में विकसित किया गया है, 15 , 16. हालांकि, आईएफसआई, i.n., और संक्रमण के i.v. मार्गों मस्तिष्क में सीधे दिमागी बुखार में एस सुईस सतह घटकों की भूमिकाओं का अध्ययन करने के लिए उपयुक्त नहीं हैं । इनमें extracellular मैट्रिक्स से लेकर फिल्म तक शामिल हैं । यद्यपि आईसी टीका एस सुईस संक्रमण के लिए इस्तेमाल किया गया था, सटीक इंजेक्शन साइट उन कागजों में वर्णित नहीं किया गया है । इसके विपरीत, intracranial subarachnoidal टीका के लिए इंजेक्शन स्थल का stereotaxic निर्देशांक स्पष्ट रूप से पिछले एक अध्ययन में वर्णित किया गया है17. यह टीका बिंदु और अधिक सरलीकृत प्रायोगिक प्रोटोकॉल की आसान मांयता की अनुमति दी । इसके अलावा, संक्रमण के intracranial subarachnoidal मार्ग साइनस या मध्य कान17से केंद्रीय तंत्रिका तंत्र में बैक्टीरियल प्रवेश की नकल, और मध्य कान और एस सुईस के कारण दिमागी बुखार के बीच संबंध Madsen एट अल18द्वारा प्रदर्शन किया गया है । इसके अलावा, चूहों में संक्रमण के intracranial subarachnoidal मार्ग को लागू करने से, हमने दिखा दिया है कि एस सुईस लघु आरएनए rss04 हमारे पिछले अध्ययन10में दिमागी बुखार के लिए योगदान देता है ।

वर्तमान अध्ययन में, संक्रमण के intracranial subarachnoidal मार्ग चूहों में एस सुईस दिमागी बुखार में फिल्म की भूमिकाओं की जांच करने के लिए इस्तेमाल किया गया था । चूहों के संक्रमण के इस मार्ग द्वारा planktonic कोशिकाओं या एस सुईस की फिल्म राज्य कोशिकाओं से संक्रमित थे । Histopathological विश्लेषण और TLR2 की वृद्धि हुई mRNA अभिव्यक्ति और चूहों के मस्तिष्क के ऊतकों से साइटोकिंस फिल्म राज्य कोशिकाओं के साथ इंजेक्शन स्पष्ट रूप से संकेत दिया कि एस सुईस फिल्म दिमागी बुखार के लिए योगदान देता है ।

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Protocol

माउस संक्रमण प्रयोगों Jiangsu प्रांत, चीन की प्रयोगशाला पशु निगरानी समिति द्वारा अनुमोदित किया गया और नानजिंग कृषि विश्वविद्यालय के प्रयोगशाला पशु केंद्र में प्रदर्शन किया (परमिट संख्या: SYXK (सु) 2017-0007) ।

1. बैक्टीरिया की तैयारी

नोट: एस सुईस सीरोटाइप 2 विषमय तनाव P1/7 दिमागी बुखार के साथ एक रोगग्रस्त सुअर से अलग किया गया था19। तनाव P1/7 टोड में उगाया गया था-हेविट शोरबा (THB, THB के प्रति लीटर फार्मूला: हार्ट इन्फ्यूश़न, ३.१ g; neopeptone, २०.० g; डेक्सट्रोज, २.० g; सोडियम क्लोराइड, २.० g; disodium फॉस्फेट, ०.४ जी; सोडियम कार्बोनेट, २.५ ग्राम) और टोड पर चढ़ाया-हेविट आगर (THA, फॉर्मूला प्रति लीटर THA: हार्ट इन्फ्यूश़न, ३.१ g; neopeptone, २०.० छ; डेक्सट्रोज, २.० छ; सोडियम क्लोराइड, २.० ग्राम; disodium फॉस्फेट, ०.४ g; सोडियम कार्बोनेट, २.५ g; आगर, १५.० g) पर ३७ ° c और 5% सह2.

  1. तनाव P1/7 planktonic कोशिकाओं का संग्रह
    1. मध्य लॉग चरण संस्कृति से planktonic कोशिकाओं के 5 मिलीलीटर लीजिए (आयुध डिपो६००= ०.६), ८००० × जी में 3 मिनट के लिए केंद्रापसारक, और फिर धो 3 पंजाबियों के साथ बार ।
    2. THB में 25% ग्लिसरॉल के 5 मिलीलीटर, 5 ट्यूबों में aliquot के साथ कोशिकाओं reसस्पेंड, और फिर पर स्टोर-८० ° c ।
  2. तनाव P1/7 फिल्म राज्य कोशिकाओं का संग्रह
    1. एक रात संस्कृति के 20 मिलीलीटर ले लो और ताजा THB के १८० मिलीलीटर में जोड़ें; 10 दौर संस्कृति प्लेटों में पतला संस्कृति विभाजित समान रूप से, और फिर एक मशीन में 5% सह2 में ३७ डिग्री सेल्सियस में प्लेटें डाल 24 घंटे के लिए ।
    2. मशीन के बाद, प्लेट धीरे से हिला बैक्टीरिया है कि थाली का पालन नहीं किया है reसस्पेंड करने के लिए, और फिर आकांक्षा द्वारा supernatant त्यागें ।
      नोट: प्लेट धीरे से हिला और तलछट reसस्पैंड से बचें ।
    3. फसल के लिए पंजाब के 5 मिलीलीटर जोड़ें, फिल्मी राज्य कोशिकाओं, तलछट पूरी तरह से reसस्पेंड, और फिर एक नई ट्यूब के लिए नमूना हस्तांतरण ।
    4. Sonicate निंनलिखित मापदंडों के साथ पिछले कदम से फिल्म राज्य कोशिकाओं: ६० डब्ल्यू, 4 चक्र, 5 एस पर और 10 एस बंद ।
    5. ८००० × जी में 3 मिनट के लिए केंद्रापसारक और-८० डिग्री सेल्सियस पर supernatant की दुकान ।
      नोट: supernatant में शामिल हो सकते है और यह प्रयोग किया जा सकता है के रूप में पशु प्रयोगों (चरण 3) में वर्णित संक्रमण से पहले इस फिल्म बैक्टीरिया reसस्पेंड करने के लिए ।
    6. THB में 10 मिलीलीटर 25% ग्लिसरॉल के साथ तलछट reसस्पेंड और फिर-८० ° c पर फिल्म राज्य कोशिकाओं की दुकान ।

2. स्कैनिंग इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी (SEM) विश्लेषण

  1. 4 डिग्री सेल्सियस पर 12-24 ज के लिए 4% paraformaldehyde का उपयोग कर एकत्र की गई फिल्म राज्य कोशिकाओं और planktonic कोशिकाओं को ठीक करें ।
  2. आसुत पानी के साथ जल्दी से नमूने कुल्ला और एक समाधान में 30 मिनट के लिए इथेनॉल के एक बढ़ती एकाग्रता के साथ क्रमिक रूप से नमूनों निर्जलीकरण (25%, ५०%, ७०%, ९०%, और १००%) ।
  3. डबल पक्षीय टेप के साथ धातु धारकों के लिए सूखे नमूनों का पालन करें और अंत में उंहें सोने और पैलेडियम के साथ एक वाष्पकर्ता में कोट ।
  4. निम्नलिखित मापदंडों का उपयोग कर एक स्कैनिंग इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोप द्वारा नमूनों का निरीक्षण: EHT (अतिरिक्त उच्च तनाव) = 10 केवी; WD (कार्य दूरी) = ७.० या ८.० मिमी; आवर्धन = ५००० ×; सिग्नल A = SE1.

3. पशु प्रयोग

  1. इस अध् ययन में SPF 6 सप् ताह की मादा बालब/ संक्रमण के intracranial subarachnoidal मार्ग के माध्यम से सभी चूहों को संक्रमित जिसका इंजेक्शन साइट bregma से ३.५ mm rostral स्थित है । इंजेक्शन साइट के stereotaxic निर्देशांक स्पष्ट रूप से Chiavolini एट अल17द्वारा वर्णित किए गए थे ।
    1. histopathological विश्लेषण के लिए, चूहों के दो समूहों (समूह प्रति 5 चूहों) संक्रमित 3 × 107 कॉलोनी बनाने इकाइयों (CFU) की एक खुराक पर planktonic कोशिकाओं या फिल्म राज्य कोशिकाओं का उपयोग कर, और एक और 5 चूहों एक नियंत्रण के रूप में पंजाबियों के साथ इंजेक्शन थे.
    2. मस्तिष्क में TLR2 और साइटोकिंस की mRNA अभिव्यक्ति का पता लगाने के लिए, चूहों के दो अतिरिक्त समूहों (प्रति समूह 6 चूहों) संक्रमित 3 × 107 CFU की एक खुराक में planktonic कोशिकाओं या फिल्म राज्य कोशिकाओं का उपयोग कर.
    3. THA पर धारावाहिक कमजोर पड़ने चढ़ाना द्वारा व्यवहार्य बैक्टीरिया की संख्या निर्धारित करते हैं ।
    4. आगे के शोध के लिए 12 एच के बाद सभी चूहों Euthanize संक्रमण ।
      नोट: स्टॉक माध्यम में ग्लिसरॉल संक्रमण से पहले हटाया जाना चाहिए । -८० डिग्री से बरामद दोनों planktonic कोशिकाओं और फिल्मी राज्य कोशिकाओं को पंजाबियों के साथ 3 बार धोया जाता है । उसके बाद, planktonic कोशिकाओं को पंजाबियों के साथ reसस्पैंड कर रहे हैं और संक्रमण के लिए उपयुक्त खुराक के लिए पतला; फिल्म राज्य कोशिकाओं (कदम 1.2.5 से) संग्रहीत supernatant के साथ reसस्पैंड कर रहे हैं और संक्रमण के लिए उपयुक्त खुराक के लिए पतला. संक्रमण के लिए मात्रा ५० µ से अधिक नहीं होनी चाहिए l
  2. मस्तिष्क ऊतक में TLR2 और साइटोकिंस की mRNA अभिव्यक्ति का पता लगाने
    1. एक आरएनए निष्कर्षण किट का उपयोग कर मस्तिष्क के ऊतकों से कुल आरएनए निकालें ।
      1. प्रत्येक माउस के लिए, आरएनए निकालने के लिए पूरे मस्तिष्क ऊतक का उपयोग करें. 5 ट्यूबों में पूरे मस्तिष्क ऊतक विभाजित । १०० मिलीग्राम मस्तिष्क ऊतक तक ले लो और प्रत्येक किट द्वारा प्रदान की lysing मैट्रिक्स युक्त ट्यूब के लिए lysis समाधान के 1 मिलीलीटर जोड़ें ।
      2. प्रक्रिया ४० के लिए एक homogenizer में ट्यूब ६.० की स्थापना पर एस, और फिर १२००० × जी और 4 ° c पर ट्यूब 5 मिनट के लिए केंद्रापसारक ।
      3. केंद्रापसारक के बाद, एक नया microcentrifuge ट्यूब के लिए ऊपरी चरण हस्तांतरण ।
      4. कमरे के तापमान पर 5 मिनट के लिए स्थानांतरित नमूना मशीन; जोड़ें ३०० के लिए क्लोरोफॉर्म, भंवर के µ एल, 10 एस, और फिर कमरे के तापमान पर 5 मिनट के लिए मशीन ।
      5. १२००० × जी और 4 ° c 5 मिनट के लिए पर ट्यूब केंद्रापसारक एक नई ट्यूब के लिए ऊपरी चरण स्थानांतरण ।
      6. ट्यूब के लिए ठंडा निरपेक्ष इथेनॉल के ५०० µ एल जोड़ें, यह 5 बार के लिए पलटने से पहले, और फिर पर नमूना स्टोर-20 ° c के लिए न्यूनतम 1 ज.
      7. १२००० × जी और 15 मिनट के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर ट्यूब केंद्रापसारक और supernatant हटा दें । RNase में ठंडा ७५% इथेनॉल के ५०० µ एल के साथ गोली धो-मुफ्त एच2ओ ।
      8. इथेनॉल निकालें, हवा कमरे के तापमान पर 5 मिनट के लिए गोली सूखी, और RNase के १०० µ एल में आरएनए reसस्पेंड-नि: शुल्क एच2ओ ।
      9. कमरे के तापमान पर 5 मिनट के लिए आरएनए मशीन और एक शाही सेना के विश्लेषक का उपयोग कर आरएनए एकाग्रता का निर्धारण ।
    2. सीडीएनए संश्लेषण, जीनोमिक डीएनए (gDNA) के उंमूलन सहित, एक रिवर्स प्रतिलेखन (आरटी) एजेंट किट के साथ एक thermocycler का उपयोग कर प्रदर्शन ।
      1. एक ट्यूब के लिए आरएनए के 1 µ जी जोड़ें 5x gDNA उन्मूलन बफर के 2 µ l युक्त, 1 µ एल के gDNA उन्मूलन एंजाइम और RNase-free एच2ओ जब तक मात्रा ४२ डिग्री सेल्सियस पर 2 मिनट के लिए 10 µ एल मशीन तक पहुँचता है.
      2. मास्टर मिश्रण के 10 µ एल जोड़ें (आरटी एंजाइम मिक्स मैं, आरटी प्राइमर मिश्रण के 1 µ एल, 5x बफर 2 के 4 µ एल, और µ के 4 RNase एल-मुक्त एच2ओ) पिछले कदम से प्रतिक्रिया समाधान के लिए और फिर धीरे मिश्रण । आर टी प्रतिक्रिया के साथ तुरंत आगे बढ़ें: 15 मिनट के लिए ३७ ° c और उसके बाद ८५ ° c 5 एस के लिए
      3. SYBR RT-qPCR किट के साथ रीयल-टाइम पीसीआर मशीन का उपयोग करके मात्रात्मक रीयल-टाइम पीसीआर (RT-qPCR) विश्लेषण निष्पादित करें । 2x एंजाइम के 10 µ एल जोड़ें, फॉरवर्ड प्राइमर के ०.८ µ एल, रिवर्स प्राइमर के ०.८ µ एल, ०.४ µ एल के 50x ROX संदर्भ डाई द्वितीय, µ टेंपलेट के 2 सीडीएनए एल, और RNase-मुक्त एच2ओ की कुल मात्रा तक 20 µ एल ।
      4. निम्नलिखित थर्मल मापदंडों का उपयोग कर तपसिल में प्रत्येक नमूना भागो: 30 एस पर ९४ ° c, ९५ डिग्री सेल्सियस पर 5 एस के ४० चक्र के बाद, और ३४ एस ६० डिग्री सेल्सियस पर, 15 एस के अंतिम चरण के साथ ९५ डिग्री सेल्सियस पर, 1 मिनट में ६० डिग्री सेल्सियस , और 15 एस ९५ डिग्री सेल्सियस पर । आरटी के लिए प्राइमर-qPCR तालिका 1में सूचीबद्ध हैं । गृह व्यवस्था जीन बी2एम और 18s rRNA आंतरिक नियंत्रण के रूप में इस्तेमाल किया गया ।
    3. 2-ΔΔCt पद्धति पर आधारित सापेक्ष फ़ोल्ड परिवर्तन की गणना करें ।
  3. ऊतकवैज्ञानिक वर्गों का अवलोकन
    1. 10% formalin के साथ 24 एच निर्धारण के बाद, 2-3 mm पर ऊतक टुकड़े के उचित आकार में फिक्स्ड मस्तिष्क ऊतक पुनर्निर्माण ।
    2. एक एंबेडिंग कैसेट में ऊतक टुकड़े रखो और एक स्वत: वैक्यूम निर्जलीकरण के साथ निर्जलीकरण के लिए एक नया निर्धारण समाधान में विसर्जित कर दिया ।
    3. बाहर तय ऊतक ले लो और यह क्रमिक रूप से इथेनॉल की सांद्रता बढ़ाने में (७०%, ८०%, ९५%, ९५%, और प्रत्येक समाधान में 30 मिनट के लिए १००%) ।
    4. Transparentize 15 मिनट के लिए xylene के साथ नमूना, ९० मिनट के लिए ६० डिग्री सेल्सियस पर तरल तेल में डुबकी, और फिर एक एंबेडिंग मशीन का उपयोग कर एंबेड ।
    5. आयल ब्लॉक एंबेडेड ऊतक 3 µm स्लाइस में काटें, ४५ ° c पर पानी पर स्लाइस टाइल, और फिर इसे हवा में सूखी ।
    6. ६० डिग्री सेल्सियस पर 3 एच के लिए खंड मशीन, यह दाग haematoxylin और eosin (वह) विधि का उपयोग कर, और तटस्थ गम के साथ इसे सील ।
    7. एक ऑप्टिकल माइक्रोस्कोप के साथ मस्तिष्क के histopathological परिवर्तन का निरीक्षण । ऊतकवैज्ञानिक परिवर्तन का मूल्यांकन करने के लिए चार सूत्रीय ग्रेडिंग सिस्टम का उपयोग किया गया । सांख्यिकीय विश्लेषण के लिए एक ख़राब t परीक्षण का उपयोग करें ।
      भीड़/रक्तस्त्राव: अनुपस्थित, 0 स्कोर; फोकल भीड़ के छोटे क्षेत्र/रक्तस्त्राव, 1 स्कोर; फोकल भीड़ के बड़े क्षेत्र/रक्तस्त्राव, या फोकल भीड़ के छोटे क्षेत्र के कई स्थलों/रक्तस्त्राव, 2 स्कोर; तीन बड़े फोकल भीड़/रक्तस्त्राव साइटों, स्कोर 3; प्रसार भीड़/रक्तस्त्राव, 4 स्कोर ।
      परिगलन: अनुपस्थित, स्कोर 0; फोकल परिगलन, स्कोर 1; 1-10 गल कोशिकाओं की घटना फैलाना, स्कोर 2; धाराप्रवाह परिगलन, स्कोर 3 के घावों; व्यापक धाराप्रवाह परिगलन, 4 स्कोर ।
      भड़काऊ सेल घुसपैठ: अनुपस्थित, 0 स्कोर; कुछ और फोकल घुसपैठ, 1 स्कोर; multifocal घुसपैठ या घुसपैठ समुच्चय के गठन के साथ, 2 स्कोर; तीन समुच्चय तक, स्कोर 3; और चार समुच्चय से अधिक, 4 स्कोर ।

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Representative Results

SEM विश्लेषण प्रयोगात्मक शर्तों के तहत फिल्म निर्माण की जांच करने के लिए प्रदर्शन किया गया । जैसा चित्र 1में दिखाया गया है, planktonic कोशिकाओं (चित्रा 1ए) और फिल्म राज्य कोशिकाओं (चित्रा 1बी) के बीच फिल्म निर्माण में एक महत्वपूर्ण अंतर है । SEM विश्लेषण से पता चला कि फिल्म बैक्टीरिया का झुरमुट और कई परतों में थे और वे extracellular मैट्रिक्स में डिब्बे में थे, जबकि planktonic बैक्टीरिया बहुत कम घने थे और मुख्य रूप से व्यक्तिगत रूप से फैलाया ।

ऐसे डीएनए के रूप में, इस तरह के extracellular मैट्रिक्स के घटकों, मेजबान भड़काऊ प्रतिक्रियाओं और cytokine उत्पादन में कामयाब रहे हैं । चूंकि TLR2 और साइटोकिंस CCL2, आईएल-6, और TNF-α पिछले अध्ययनों के अनुसार मस्तिष्क संबंधी भड़काऊ प्रतिक्रियाओं में शामिल हैं10,11,20, इन जीनों की mRNA अभिव्यक्ति तुलना की गई थी planktonic कोशिकाओं से संक्रमित चूहों के लिए vivo में और उन में से संक्रमित के साथ फिल्म राज्य कोशिकाओं. यह murine मस्तिष्क ऊतक में भड़काऊ प्रतिक्रिया पर फिल्म के प्रभाव का पता लगाने के लिए किया गया था । के रूप में चित्रा 2में दिखाया गया है, 12 ज के बाद संक्रमण, TLR2 की अभिव्यक्ति, CCL2, IL-6, और संक्रमित चूहों के दिमाग से TNF-α काफी अधिक था planktonic कोशिकाओं के साथ तुलना में फिल्म राज्य कोशिकाओं के लिए ।

जीवाणुओं से संक्रमित चूहों ने planktonic बैक्टीरिया से संक्रमित लोगों की तुलना में दिमागी बुखार (कठोर आसन, गतिभंग, या आक्षेप) के ज्यादा गंभीर लक्षण दिखाई दिए । एस सुईस तनाव P1/7 से संक्रमित चूहों से मस्तिष्क के ऊतकों की ऊतकवैज्ञानिक परीक्षा मेनिन्जेस, सेरेब्रल प्रांतस्था, निलय, या diencephalon (चित्रा 3) में भीड़/रक्तस्त्राव, परिगलन, और भड़काऊ कोशिका घुसपैठ दिखाया . planktonic बैक्टीरिया (चित्रा 3ई एच), 12 एच के बाद संक्रमण से संक्रमित चूहों के साथ तुलना में, कहीं अधिक गंभीर रोग परिवर्तन से मस्तिष्क के ऊतकों में देखा गया चूहों से संक्रमित फिल्म बैक्टीरिया (चित्रा 3ए-डी), भीड़ के बड़े क्षेत्रों सहित रक्तस्त्राव, परिगलन, या तीव्र भड़काऊ कोशिका घुसपैठ । planktonic और फिल्म बैक्टीरिया से संक्रमित चूहों से मस्तिष्क में सकल रोग परिवर्तन तालिका 2में दर्ज किया गया था । न तो रोग परिवर्तन और न ही स्नायविक लक्षण चूहों पंजाबियों के साथ इंजेक्शन से मनाया गया । एक साथ लिया, इन आंकड़ों को स्पष्ट रूप से पता चलता है कि एस सुईस फिल्म दिमागी बुखार की प्रेरण में योगदान ।

Figure 1
चित्रा 1: तनाव P1/7 planktonic कोशिकाओं और फिल्म राज्य कोशिकाओं की SEM छवियां । THB मध्यम में बैक्टीरिया संस्कृति थे । SEM विश्लेषण से पता चला है कि planktonic कोशिकाओं (एक) बहुत कम घने थे और मुख्य रूप से व्यक्तिगत रूप से फैलाया, जबकि फिल्म बैक्टीरिया (ख) झुरमुट और कई परतों में clustered थे और वे extracellular मैट्रिक्स में डिब्बे में थे । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 2
चित्रा 2: CCL2, IL-6, TNF-α, और vivo में माउस मस्तिष्क ऊतक में TLR2 की mRNA अभिव्यक्ति सक्रिय करें। छह बालब/सी प्रति समूह चूहों एक संक्रमण के intracranial subarachnoidal मार्ग के माध्यम से 3 × 107 planktonic कोशिकाओं या फिल्म राज्य कोशिकाओं के CFU के माध्यम से इंजेक्शन थे । चूहों को संक्रमण के 12 ज पद पर euthanized गया । परिणाम planktonic कोशिका के साथ संक्रमित चूहों की तुलना में, mRNA अभिव्यक्ति के फिल्मी राज्य कोशिका में संक्रमित चूहों के गुना परिवर्तन के रूप में प्रस्तुत कर रहे हैं । (क) जीन B2m का संदर्भ जीन के रूप में प्रयोग किया गया; (ख) जीन 18s rRNA का संदर्भ जीन के रूप में उपयोग किया गया था. सांख्यिकीय विश्लेषण के लिए एक ख़राब टी-टेस्ट का इस्तेमाल किया गया । * * p ≤ ०.०१, और * p ≤ ०.०५. कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 3
चित्रा 3: तनाव P1/7 planktonic बैक्टीरिया और फिल्मी राज्य बैक्टीरिया से संक्रमित चूहों के मस्तिष्क के ऊतकों के ऊतकवैज्ञानिक विश्लेषण । A-D, मस्तिष्क के नमूने से संक्रमित चूहों के साथ फिल्म राज्य बैक्टीरिया; ई एच, planktonic बैक्टीरिया से संक्रमित चूहों से मस्तिष्क के नमूने. A, B, E, और F: मेनिन्जेस and सेरेब्रल प्रांतस्था; सी और जी: निलय; डी और एच: diencephalon । Δ, भीड़/रक्तस्त्राव; □, परिगलन; ○: भड़काऊ सेल घुसपैठ । आवर्धन = 200X; स्केल बार = १०० µm. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

प्राइमरी का नाम अनुक्रम (5 '-3 ') जीन प्रतीक
आईएल-6 फॉरवर्ड CTTCCATCCAGTTGCCTTCT Il6
आईएल-6 रिवर्स CTCCGACTTGTGAAGTGGTATAG Il6
आगे TLR2 CACTATCCGGAGGTTGCATATC Tlr2
TLR2 उलटे GGAAGACCTTGCTGTTCTCTAC Tlr2
आगे CCL2 CTCACCTGCTGCTACTCATTC Ccl2
CCL2 उलटे ACTACAGCTTCTTTGGGACAC Ccl2
TNF-α आगे TTGTCTACTCCCAGGTTCTCT Tnf
TNF-α रिवर्स GAGGTTGACTTTCTCCTGGTATG Tnf
आगे β2m GGTCTTTCTGGTGCTTGTCT B2m
β2m उलटे TATGTTCGGCTTCCCATTCTC B2m
आगे 18s GTAACCCGTTGAACCCCATT 18s rRNA
18s उलटे CCATCCAATCGGTAGTAGCG 18s rRNA

तालिका 1: आरटी के लिए प्राइमर-qPCR ।

Table 1
तालिका 2: से संक्रमित चूहों से मस्तिष्क में सकल histopathological परिवर्तन एस सुईस तनाव P1 7/ ऊतकवैज्ञानिक परिवर्तन का मूल्यांकन करने के लिए एक चार-पॉइंट ग्रेडिंग सिस्टम का उपयोग किया गया था, जैसा कि प्रोटोकॉल अनुभाग 3.3.7 में वर्णित है । कुल स्कोर अलग histopathological परिवर्तन से स्कोर के योग के रूप में गणना की गई थी । औसत की गणना चूहों की कुल स्कोर/ सांख्यिकीय विश्लेषण के लिए एक ख़राब टी-टेस्ट का इस्तेमाल किया गया । * * p ≤ ०.०१.

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Discussion

यहां वर्णित संक्रमण के intracranial subarachnoidal मार्ग संक्रमण के अंय मार्गों पर स्पष्ट लाभ है । यह जांचकर्ताओं मेजबान-जीवाणु बातचीत और मस्तिष्क में सीधे मेजबान प्रतिरक्षा प्रतिक्रियाओं पर बैक्टीरियल घटकों के प्रभाव का अध्ययन करने की अनुमति देता है, जो केंद्रीय तंत्रिका तंत्र में बैक्टीरियल प्रवेश की नकल । इस प्रकार, संक्रमण के इस मार्ग अंय बैक्टीरिया की वजह से दिमागी बुखार के तंत्र की जांच के लिए बढ़ाया जा सकता है । इसके अलावा, यह भी बैक्टीरियल दिमागी बुखार के खिलाफ दवाओं की प्रभावकारिता का परीक्षण किया जा सकता है ।

इस मॉडल का उपयोग करके अच्छे परिणाम प्राप्त करने के लिए, निम्न महत्वपूर्ण चरण स्पष्ट हैं. फिल्म निर्माण के लिए प्रायोगिक शर्तों के तहत जांच की जरूरत है । वर्तमान अध्ययन में यह स्कैनिंग इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोप विश्लेषण के प्रयोग से जांच की गई । अंय तरीकों को भी इस तरह के ऊतक संस्कृति प्लेट विधि और ट्यूब विधि21के रूप में, फिल्म निर्माण की जांच करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है । संक्रमण से एक दिन पहले, दोनों planktonic कोशिकाओं के aliquots और फिल्मी राज्य कोशिकाओं को CFU निर्धारित करने के लिए-८० डिग्री सेल्सियस से गल जाने की जरूरत है । अगले दिन, जीवाणु संक्रमण के लिए CFU के अनुसार उपयुक्त खुराक को पतला किया जाना चाहिए । नकली संक्रमित नियंत्रण समूह पंजाबियों के साथ इंजेक्शन शामिल किया जाना चाहिए और नकली संक्रमित नियंत्रण समूह से चूहों संक्रमण प्रयोग की अवधि के दौरान कोई अभिव्यक्तियों प्रदर्शन करना चाहिए. अलग उपभेदों अलग संक्रामक खुराक हो सकता है, तो एक प्रारंभिक प्रयोग दृढ़ता से उचित संक्रामक खुराक निर्धारित करने के लिए सिफारिश की है. वर्तमान अध्ययन में, संक्रमण के लिए 3 × 107 CFU की एक खुराक हमारे प्रारंभिक प्रयोग के आधार पर इस्तेमाल किया गया था । फिल्म बैक्टीरिया की यह खुराक प्रारंभिक प्रयोग में संक्रमण के बाद सभी 5 चूहों ४८ ज में दिमागी बुखार और बाद में मौत के गंभीर लक्षण पैदा करने में सक्षम था ।

एस सुईस द्वारा रक्त-मस्तिष्क या रक्त-मस्तिष्कमेरु द्रव बाधाओं के विघटन22,23,24दिमागी बुखार के कारण में एक महत्वपूर्ण कदम हैं । संक्रमण का intracranial subarachnoidal मार्ग इन अवरोधों के माध्यम से तोड़ने के लिए एस. सुईस की क्षमता के मूल्यांकन के लिए उपयुक्त नहीं है. संक्रमण के अंय मार्गों, जैसे आईएफसआई, i.v., या i.n., इस लक्ष्य को प्राप्त करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है ।

यहां, हम पहले प्रदर्शित करता है कि एस सुईस फिल्म संक्रमण के intracranial subarachnoidal मार्ग का उपयोग कर दिमागी बुखार की प्रेरण के लिए योगदान देता है । इस संक्रमण मॉडल न केवल सुईस दिमागी बुखार के तंत्र को समझने में मदद करता है, लेकिन यह भी अन्य बैक्टीरिया और जीवाणु दिमागी बुखार के खिलाफ नई दवाओं की प्रभावकारिता की वजह से दिमागी बुखार के रोगजनन का अध्ययन करने के लिए उपयुक्त है ।

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Disclosures

लेखकों का खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।

Acknowledgments

यह काम चीन के राष्ट्रीय प्रमुख अनुसंधान और विकास कार्यक्रम [2017YFD0500102] से अनुदान द्वारा समर्थित था; चीन के राष्ट्रीय प्राकृतिक विज्ञान फाउंडेशन [३१५७२५४४]; पशु चिकित्सा Etiological जीवविज्ञान की राज्य प्रमुख प्रयोगशाला [SKLVEB2016KFKT005]; शंघाई कृषि एप्लाइड प्रौद्योगिकी विकास कार्यक्रम, चीन [G2016060201] ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Todd Hewitt Broth(THB) Becton, Dickinson and Company DF0492078 Dissolve 30 g of the powder in 1 L of purified water. Autoclave at 121° for 15 min.
Agar DSBIO 16C0050 Dissolve 15 g of the powder in 1 L of THB. Autoclave at 121° for 15 min.
Milli-Q Reference Water Purification System Merck KGaA Z00QSVCUS Without Dnase/ Rnase
NaCl Tianjin Kemiou Chemical Reagent Co., Ltd 10019318 Dissolve 8 g NaCl, 0.2 g KCl, 1.42 g Na2HPO3 , 0.27 g KH2PO4 in 1 L of purified water. Autoclave at 121° for 15 min. Use KOH to adjust pH to 7.4.
Na2HPO3 Xilong Scientific Co., Ltd 9009012-01-09 Dissolve 8 g NaCl, 0.2 g KCl, 1.42 g Na2HPO3 , 0.27 g KH2PO4 in 1 L of purified water. Autoclave at 121° for 15 min. Use KOH to adjust pH to 7.4.
KCl Xilong Scientific Co., Ltd 9009017-01-09 Dissolve 8 g NaCl, 0.2 g KCl, 1.42 g Na2HPO3 , 0.27 g KH2PO4 in 1 L of purified water. Autoclave at 121° for 15 min. Use KOH to adjust pH to 7.4.
KH2PO4 Xilong Scientific Co., Ltd 9009019-01-09 Dissolve 8 g NaCl, 0.2 g KCl, 1.42 g Na2HPO3 , 0.27 g KH2PO4 in 1 L of purified water. Autoclave at 121° for 15 min. Use KOH to adjust pH to 7.4.
KOH Xilong Scientific Co., Ltd 9009014-01-09 Dissolve 8 g NaCl, 0.2 g KCl, 1.42 g Na2HPO3 , 0.27 g KH2PO4 in 1 L of purified water. Autoclave at 121° for 15 min. Use KOH to adjust pH to 7.4.
Glycerol Sionpharm Chemical Reagent Co., Ltd 10010618 Diluted with equal volumu of purified water, autoclave at 121° for 15 min
4% paraformaldehyde Sionpharm Chemical Reagent Co., Ltd 80096675
25% Glutaraldehyde Sionpharm Chemical Reagent Co., Ltd 30092436 10-fold diluted with purified water for fixation.
Ethanol Sionpharm Chemical Reagent Co., Ltd 10009218
Chloroform Sionpharm Chemical Reagent Co., Ltd 10006818
Spctrophotometre DeNovix Inc. DS-11+
Ultrasound cell crusher NingBo Scientz Biotechnology Co.,Ltd JY96-IIN
Centrifuge Hitachi Koki Co., Ltd CT15RE
Refrigerator Aucma Co., Ltd DW-86L500
Scanning electron microscope Zeiss EVO-LS10
FastRNA Pro Green Kit MP Biomedicals #6045-050
FastPrep-24 Instrument MP Biomedicals 116005500
Instrument for PCR SensoQuest GmbH 1124310110
QuantStudio 6 Flex Thermo Fisher Scientific 4485689
SYBR Premix Ex Taq II Takara Biomedical Technology (Beijing) Co., Ltd RR820A
PrimeScript RT reagent kit with gDNA Eraser Takara Biomedical Technology (Beijing) Co., Ltd RR047A
Fully Enclosed Tissue Processor Leica Biosystems Nussloch GmbH ASP200S
Heated Paraffin Embedding Module Leica Biosystems Nussloch GmbH EG1150H
Semi-Automated Rotary Microtome Leica Biosystems Nussloch GmbH RM2245
Water bath for paraffin sections Leica Biosystems Nussloch GmbH HI1210
Autostainer XL Leica Biosystems Nussloch GmbH ST5010
Agilent 2100 Agilent Technologies G2939A
Optical microscope Olympus BX51

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References

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इम्यूनोलॉजी और संक्रमण अंक १३७ स्ट्रेप्टोकोकस सुईस intracranial subarachnoidal फिल्म दिमागी बुखार माउस संक्रमण मॉडल बैक्टीरियल डाह
Intracranial Subarachnoidal एक माउस संक्रमण मॉडल में दिमागी बुखार में <em>स्ट्रेप्टोकोकस सुईस</em> की भूमिकाओं की जांच के लिए संक्रमण का मार्ग
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Zhang, S., Gao, X., Xiao, G., Lu, C., Yao, H., Fan, H., Wu, Z. Intracranial Subarachnoidal Route of Infection for Investigating Roles of Streptococcus suis Biofilms in Meningitis in a Mouse Infection Model. J. Vis. Exp. (137), e57658, doi:10.3791/57658 (2018).

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