Summary
Aqui, descrevemos a rota intracraniana optou de infecção em camundongos para estudar funções de biofilmes de Streptococcus suis meningite. Este modelo de infecção também é adequado para estudar a patogênese das outra meningite bacteriana e a eficácia de novas drogas contra meningite bacteriana.
Abstract
Streptococcus suis é não só um importante patógeno bacteriano de suínos no mundo, mas também um agente zoonótico emergente. Em humanos e suínos, a meningite é uma grande manifestação de S. suis infecções. Um modelo apropriado de infecção é uma ferramenta essencial para compreender os mecanismos das doenças causadas por agentes patogénicos. Várias rotas de infecção em camundongos foram desenvolvidas para estudar a patogênese da infecção por S. suis . No entanto, as rotas intraperitoneal, intranasais e intravenosa de infecção não são adequadas para estudar as funções dos componentes de superfície S. suis em meningite diretamente no cérebro, tais como a matriz extracelular de biofilmes. Embora intracisternal inoculação tem sido usada para infecção de S. suis , o site precisa de injeção não foi descrito. Aqui, na rota de infecção intracraniana optou foi descrita em um modelo do rato para investigar os papéis de biofilmes em S. suis meningite. S. suis planctônicos nas células ou biofilme estado foram diretamente injetado no espaço subaracnoide dos ratos através do site de injeção localizado 3,5 mm rostral do bregma. A análise histopatológica e aumento da expressão do mRNA de TLR2 e citocinas do tecido cerebral dos ratos injetados com células de biofilme estado claramente indicaram que o S. suis biofilme tem um papel definitivo na meningite S. suis . Esta rota de infecção tem óbvias vantagens sobre outras vias de infecção, permitindo o estudo da interação hospedeiro-bactéria. Além disso, ele permite que o efeito de componentes bacterianas no anfitrião respostas imunes diretamente no cérebro para ser avaliado e imita a entrada de bactérias no sistema nervoso central. Esta via de infecção pode ser estendida para investigar os mecanismos de meningite causada por outras bactérias. Além disso, ele também pode ser usado para testar a eficácia das drogas contra meningite bacteriana.
Introduction
Streptococcus suis (S. suis) é um importante patógeno bacteriano de suínos no mundo, causando doenças graves, incluindo meningite, pneumonia, septicemia, endocardite e artrite1. É também um agente zoonótico emergente. Até agora, tem sido relatado que nove sorotipos podem causar infecção nos seres humanos, incluindo os sorotipos 2, 4, 5, 9, 14, 16, 21, 24 e 31,2,3,4. Em humanos e suínos, a meningite é um dos principais sinais clínicos de S. suis infecções. No Vietnã e Tailândia, o S. suis é a principal causa de meningite em adultos5. Biofilmes microbianos são microorganismos que aderem-se uns aos outros e se concentram em uma interface; Eles são essenciais para a virulência bacteriana, sobrevivência em diversos ambientes e a resistência aos antibióticos5. Biofilmes são tipicamente rodeados por uma matriz extracelular que geralmente contém polissacarídeos, proteínas e DNA6. O último é capaz de eliciar respostas inflamatórias do hospedeiro e a produção de citocinas7. Formação de biofilme foi relatada para ser envolvido em meningite estreptocócica em estudos anteriores. Biofilmes contribuam para meningite Streptococcus agalactiae em um modelo de peixe tilápia e formação de biofilmes foi revelada dentro de tecidos do cérebro e ao redor meníngea superfícies na vivo através de de inoculação intra-abdominal8. Durante a meningite, Streptococcus pneumoniae está em um estado de biofilme e bactérias em um biofilme estado foram mais eficazes na indução de meningite em um rato infecção modelo9. Além disso, no nosso anterior estudo, o estado de biofilme associado S. suis em cérebro de rato contribui para a virulência bacteriana por sobrevivência análise10. No entanto, a evidência direta para envolvimento de biofilme em S. suis meningite requer mais investigação.
Foram desenvolvidos modelos animais de infecção de S. suis em ratos usando o intraperitoneal (i.p.)11, intranasal (óssea)12, intravenosa (i.v.)13e as intracisternal (i.c.) rotas de infecção14, 15 , 16. no entanto, os i.p., óssea e i.v. rotas de infecção não são adequadas para estudar as funções dos componentes de superfície S. suis em meningite diretamente no cérebro. Estes incluem matriz extracelular de biofilmes. Mas a inoculação de i.c. foi usada para infecção de S. suis , o site precisa de injeção não foi descrito os jornais. Em contraste, as coordenadas estereotáxicos do local da injeção para inoculação intracraniana optou claramente tem sido descrita em um anterior estudo17. Isto permitiu o fácil reconhecimento do ponto de inoculação e mais simplista protocolo experimental. Além disso, na rota de infecção intracraniana optou imita a entrada de bactérias no sistema nervoso central dos seios do face ou do ouvido médio,17e a relação entre o ouvido médio e a meningite causada por S. suis tem sido demonstrado por Madsen et al.18. Além disso, aplicando-se a rota intracraniana optou de infecção em camundongos, demonstrámos que o S. suis pequeno RNA rss04 contribui para meningite em nosso anterior de estudo10.
No presente estudo, na rota de infecção intracraniana optou foi usada em ratos para investigar os papéis de biofilmes em meningite S. suis . Camundongos foram infectados com células planctônicas ou biofilme estado de S. suis por esta via de infecção. A análise histopatológica e aumento da expressão do mRNA de TLR2 e citocinas do tecido de cérebro de ratos injetados com células de biofilme estado claramente indicaram que o S. suis biofilme contribui para a meningite.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Os experimentos de infecção do mouse foram aprovados pelo laboratório Animal monitoramento Comité da província de Jiangsu, China e interpretados no laboratório Animal centro de Nanjing Agricultural University (de licença: SYXK (Su) 2017-0007).
1. preparação de bactérias
Nota: Cepa virulenta de S. suis sorotipo 2 P1/7 foi isolada de um porco doente com meningite19. Estirpe P1/7 foi cultivado em caldo Todd-Hewitt (THB, fórmula por litro de THB: infusão de coração, 3,1 g neopeptone, 20,0 g de dextrose, 2,0 g; cloreto de sódio, 2,0 g; fosfato dissódico, 0,4 g;, 2,5 g de carbonato de sódio) e chapeado em ágar de Todd-Hewitt (THA, fórmula por litro de THA: Infusão de coração, 3,1 g; neopeptone, 20,0 g; dextrose, 2,0 g; cloreto de sódio, 2,0 g; fosfato dissódico, 0,4 g; carbonato de sódio, 2,5 g; ágar-ágar, 15,0 g) a 37 ° C e 5% de CO2.
- Coleção de estirpe células planctônicas P1/7
- Coletar 5 mL de células planctônicas de cultura fase log de mid (OD600= 0,6), centrifugar durante 3 min a 8000 × g e em seguida lavar 3 vezes com PBS.
- Ressuspender as células com 5 mL de glicerol de 25% no THB, alíquota para 5 tubos e em seguida, armazenar a-80 ° C.
- Coleção de estirpe P1/7 células de estado de biofilme
- Recolher 20 mL de uma cultura da noite e adicionar a 180 mL de THB fresco; dividir a cultura diluída em 10 placas de cultura redondo e em seguida, colocar as placas na incubadora a 37 ° C em 5% de CO2 por 24 h.
- Após a incubação, agitar a placa suavemente para Ressuspender as bactérias que não aderiram à placa e em seguida, descartar o sobrenadante por aspiração.
Nota: Agitar a placa com cuidado e evite resuspending do sedimento. - Adicione 5 mL de PBS para colher células-estado biofilme, Ressuspender o sedimento completamente e em seguida, transferir a amostra para um tubo novo.
- Proceda à sonicação células biofilme estado da última etapa com os seguintes parâmetros: 60 W, 4 ciclos, 5 s s no e 10 fora.
- Centrifugar por 3 min em 8000 × g e armazenar o sobrenadante a-80 ° C.
Nota: O sobrenadante pode conter componentes de biofilme e pode ser usada para Ressuspender as bactérias do biofilme antes da infecção, conforme descrito nas experiências com animais (etapa 3). - Ressuspender o sedimento com 10 mL 25% glicerol no THB e armazenar as células de estado de biofilme a-80 ° C.
2. análise de microscopia eletrônica de varredura (MEV) de digitalização
- Corrigir o biofilme coletadas células de estado e células planctônicas usando paraformaldeído 4% para 12-24 h a 4 ° C.
- Lavar as amostras rapidamente com água destilada e desidratar as amostras sequencialmente com uma crescente concentração de etanol (25%, 50%, 70%, 90% e 100%) por 30 min em cada solução.
- Aderir as amostras secas para titulares com fita dupla-face de metal e, finalmente, revesti-los em um evaporador com ouro e paládio.
- Observar as amostras por um microscópio eletrônico de varredura usando os seguintes parâmetros: EHT (Extra alta tensão) = 10 kV; WD (distância de trabalho) = 7.0 ou 8.0 mm; Ampliação = 5000 ×; A um sinal = SE1.
3. animal experimentos
- Usar o SPF 6 semanas camundongos BALB/c fêmeas neste estudo. Infectar todos os mouses através da rota intracraniana optou de infecção cujo local de injeção é localizada 3,5 mm rostral do bregma. As coordenadas estereotáxicos do local da injeção foram claramente descritas por Chiavolini et al.17.
- Para a análise histopatológica, dois grupos de ratos (5 ratos por grupo) de infectar células de estado usando células planctônicas ou biofilme na dose de 3 × 107 formadoras unidades (CFU), e outro 5 ratos foram injetados com PBS como um controle.
- Para a deteção de expressão de RNAm de TLR2 e citocinas no cérebro, infectar dois grupos adicionais de ratos (6 ratos por grupo) usando células planctônicas ou biofilme estado células na dose de 3 × 107 UFC.
- Determine o número de bactérias viáveis por chapeamento diluições em série para THA.
- Eutanásia em todos os ratos a pós-infecção de 12 h para futuras pesquisas.
Nota: O glicerol em meio de estoque deve ser removido antes da infecção. Ambas as células planctônicas e células de estado de biofilme recuperadas de-80 ° C são lavadas 3 vezes com PBS. Em seguida, células planctônicas são resuspended com PBS e diluídas para a dose adequada para a infecção; biofilme estado células são resuspended com o sobrenadante armazenado (da etapa 1.2.5) e diluídas para a dose adequada para a infecção. O volume de infecção não deve ser mais de 50 µ l.
- Detectando a expressão de RNAm de TLR2 e citocinas no tecido cerebral
- Extrai o RNA total do tecido cerebral usando um kit de extração de RNA.
- Para cada rato, use tecido de cérebro inteiro para extração de RNA. Divida o tecido de cérebro inteiro em 5 tubos. Ocupam de tecido cerebral de 100mg e adicionar 1 mL de solução de Lise para cada tubo que contém a matriz lysing fornecida pelo kit.
- Processar o tubo em um homogeneizador para 40 s em uma configuração de 6.0 e em seguida centrifugar o tubo a 12000 × g e 4 ° C por 5 min.
- Após a centrifugação, transferi a fase superior para um novo tubo de microcentrifugadora.
- Incubar a amostra transferida durante 5 min à temperatura ambiente; Adicionar 300 µ l de clorofórmio, vórtice para 10 s e então incubar durante 5 min à temperatura ambiente.
- Centrifugar o tubo a 12000 × g e 4 ° C por 5 min. transferir a fase superior para um novo tubo.
- Adicionar 500 µ l de etanol absoluto frio para o tubo, antes invertendo por 5 vezes e em seguida armazenar a amostra a-20 ° C durante pelo menos 1 h.
- Centrifugar o tubo a 12000 × g e 4 ° C por 15 min e retirar o sobrenadante. Lave o pellet com 500 µ l de etanol frio de 75% em livre de RNase H2O.
- Remover o etanol, o ar seco a pelota durante 5 min à temperatura ambiente e ressuspender o RNA em 100 µ l de RNase-livre H2O.
- Incubar o RNA durante 5 min à temperatura ambiente e determinar a concentração de RNA usando um bioanalyzer RNA.
- Realize a síntese do cDNA, incluindo eliminação de DNA genômico (gDNA), usando um thermocycler com um kit de reagente de transcrição reversa (RT).
- Adicionar 1 µ g de RNA para um 2 µ l contendo de tubo de buffer de eliminação de x gDNA 5, 1 µ l de enzima de eliminação gDNA e livre de RNase H2O, até que o volume atinge 10 µ l. incube durante 2 min a 42 ° C.
- Adicionar 10 µ l de mistura de mestre (1 µ l da enzima RT Mix I, 1 µ l do Mix de Primer RT, 4 µ l de 5x Buffer 2 e 4 µ l de RNase-livre H2O) para a solução de reação da última etapa e, em seguida, misture delicadamente. Proceder imediatamente com a reação de RT: 37 ° C por 15 min e, em seguida, 85 ° C por 5 s.
- Realizar a análise quantitativa de PCR (RT-qPCR) em tempo real usando uma máquina de PCR em tempo real com um kit SYBR RT-qPCR. Adicione 10 µ l de 2 x enzima, 0,8 µ l de cartilha para a frente, 0,8 µ l de primer reverso, 0,4 µ l de 50 x ROX referência tintura II, 2 µ l de modelo do cDNA e livre de RNase H2O, até um volume total de 20 µ l.
- Executar cada amostra em triplicata, utilizando os seguintes parâmetros térmicos: 30 s a 94 ° C, seguida de 40 ciclos de 5 s a 95 ° C e 34 s a 60 ° C, com uma fase final de 15 s a 1 min a 60 ° C, 95 ° C e 15 s a 95 ° C. Primers para RT-qPCR estão listados na tabela 1. Genes de limpeza B2m e 18s rRNA foram usados como controles internos.
- Calcule a variação da dobra relativo baseada no método 2-ΔΔCt .
- Extrai o RNA total do tecido cerebral usando um kit de extração de RNA.
-
Observação de cortes histológicos
- Após a fixação de 24 h com formol a 10%, reconstrua o tecido cerebral fixa em tamanhos adequados de pedaços de tecido em 2-3 mm.
- Coloque os pedaços de tecido em uma gaveta de encastre e mergulhe em uma nova solução fixador para desidratação com um desidratador de vácuo automático.
- Retire o tecido fixo e desidratá-lo sequencialmente em concentrações crescentes de etanol (70%, 80%, 95%, 95% e 100%) por 30 min em cada solução.
- Transparentize a amostra com xilol durante 15 min, mergulhá-lo em parafina líquida a 60 ° C por 90 min e em seguida incorporar usando uma máquina de encastre.
- Corte o tecido de bloco incorporado de parafina em fatias de 3 µm, telha a fatia na água a 45 ° C e em seguida secá-lo no ar.
- Incubar a seção para 3h a 60 ° C, manchá-la usando a hematoxilina e eosina (HE) método e selá-lo com a goma neutra.
- Observe as alterações histopatológicas do cérebro com microscópio óptico. Um sistema de classificação de quatro pontos foi usado para avaliar as alterações histológicas. Utilize um teste pareado t para análise estatística.
Congestão/hemorragia: ausente, Pontuação 0; pequena área de congestão/hemorragia focal, escore 1; grande área de congestão/hemorragia focal, ou vários locais de pequena área de congestão/hemorragia focal, pontuação 2; até três sites grandes congestionamentos focal/hemorragia, marcar 3; difusa de congestionamento/hemorragia, marcar 4.
Necrose: ausente, Pontuação 0; necrose focal, escore 1; difundir a ocorrência de 1-10 células necróticas, pontuação 2; focos de necrose confluente, pontuação de 3; extensa necrose confluente, marcar 4.
Infiltração de células inflamatórias: ausente, Pontuação 0; focais e algumas infiltrações, escore 1; infiltração multifocal ou infiltrações com formação de agregados, pontuação 2; até três agregados, marcar 3; e mais de quatro agregados, marcar 4.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
SEM análise foi realizada para examinar a formação de biofilmes nas condições experimentais. Como mostrado na Figura 1, há uma diferença significativa na formação de biofilme entre células planctônicas (Figura 1A) e células de estado de biofilme (Figura 1B). SEM a análise mostrou que as bactérias do biofilme foram aos montes e múltiplas camadas e eles foram encerrados na matriz extracelular, enquanto bactérias planctônicas foram muito menos densa e principalmente dispersos individualmente.
Os componentes da matriz extracelular de biofilmes, tais como o DNA, são capazes de eliciar respostas inflamatórias do hospedeiro e a produção de citocinas. Desde TLR2 e citocinas CCL2, IL-6 e TNF-α estão envolvidos em respostas inflamatórias cerebrais relacionadas com meningite segundo anteriores estudos10,11,20, o mRNA foi comparado a expressão destes genes vivo em de camundongos infectados com células planctônicas e os infectados com células de estado de biofilme. Isso foi feito para explorar o efeito de biofilmes na resposta inflamatória no tecido cerebral murino. Como mostrado na Figura 2, a pós-infecção 12 h, a expressão de TLR2, CCL2, IL-6, e TNF-α de cérebros de ratos infectados foi significativamente maior para as células de estado de biofilme em comparação com células planctônicas.
Camundongos infectados com bactérias biofilme mostraram sinais mais graves de meningite (postura rígida, ataxia ou convulsões) do que os infectados com bactérias planctônicas. Exame histológico do tecido cerebral de camundongos infectados com a cepa de S. suis que P1/7 mostrou congestão/hemorragia, necrose e infiltração de células inflamatórias nas meninges, córtex cerebral, ventrículos, o diencéfalo (Figura 3) . Em comparação com camundongos infectados com bactérias planctônicas (Figura 3E-H), às 12 h, foram observadas alterações patológicas pós infecção, muito mais graves no tecido cerebral de camundongos infectados com bactérias biofilme (Figura 3A-D), incluindo grandes áreas de congestionamento/hemorragia, necrose ou infiltração celular inflamatória intensa. As brutas alterações patológicas no cérebro de ratos infectados com planctônicos e bactérias do biofilme registou-se na tabela 2. As alterações patológicas nem sintomas neurológicos foram observados de ratos injetados com PBS. Tomados em conjunto, estes dados mostram claramente que o S. suis biofilmes contribuam para indução de meningite.
Figura 1: imagens SEM de estirpe P1/7 células planctônicas e células de biofilme estado. As bactérias foram cultivadas em meio THB. SEM análise mostrou que células planctônicas (A) eram muito menos densa e principalmente dispersos individualmente, enquanto bactérias biofilme (B) foram agrupadas em aglomerados e múltiplas camadas e eles foram encerrados na matriz extracelular. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: biofilmes ativar a expressão de RNAm de CCL2, IL-6, TNF-α e TLR2 no tecido de cérebro de rato na vivo. Seis camundongos BALB/c por grupo cada um foram injetados pela rota de infecção com 3 × 107 UFC de células planctônicas ou biofilme estado optou intracraniana. Os ratos foram sacrificados na pós-infecção 12 h. Os resultados são apresentados como a dobra de alteração da expressão do mRNA em estado de biofilme ratos infectados por célula em comparação com camundongos infectados por célula planctônicos. (A) o gene B2m foi usado como o gene de referência; (B) o gene 18s rRNA foi usado como o gene de referência. Um unpaired t-teste foi utilizado para a análise estatística. * * p ≤0.01, e * ≤0.05 p. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3: análise histológica do tecido cerebral de camundongos infectados com a cepa P1/7 bactérias planctônicas e biofilme estado bactérias. A-D, amostras de cérebro de camundongos infectados com bactérias de estado de biofilme; Amostras de cérebro E-H, de camundongos infectados com bactérias planctônicas. A, B, E e f: meninges e córtex cerebral; C e g: ventrículos; D e h: diencéfalo. Δ, congestão/hemorragia; □, necrose; ○: infiltração de células inflamatórias. Ampliação = 200 X; barra de escala = 100 µm. clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
| Nome da primeira demão | Sequência (5' - 3') | Símbolo do gene |
| IL-6 para a frente | CTTCCATCCAGTTGCCTTCT | Il6 |
| Reversa de IL-6 | CTCCGACTTGTGAAGTGGTATAG | Il6 |
| TLR2 para a frente | CACTATCCGGAGGTTGCATATC | Tlr2 |
| TLR2 reversa | GGAAGACCTTGCTGTTCTCTAC | Tlr2 |
| CCL2 para a frente | CTCACCTGCTGCTACTCATTC | Ccl2 |
| CCL2 reversa | ACTACAGCTTCTTTGGGACAC | Ccl2 |
| TNF-α em frente | TTGTCTACTCCCAGGTTCTCT | FLONA do Tapajós |
| Reversa de TNF-α | GAGGTTGACTTTCTCCTGGTATG | FLONA do Tapajós |
| Β2m para a frente | GGTCTTTCTGGTGCTTGTCT | B2m |
| Β2m reversa | TATGTTCGGCTTCCCATTCTC | B2m |
| 18 anos para a frente | GTAACCCGTTGAACCCCATT | 18S rRNA |
| 18s reversa | CCATCCAATCGGTAGTAGCG | 18S rRNA |
Tabela 1: Primers para RT-qPCR.
Tabela 2: as alterações histopatológicas brutas no cérebro de camundongos infectados com S. suis Coe P1/7. Um sistema de classificação do quatro-ponto foi utilizado para avaliar as alterações histológicas, conforme descrito no protocolo seção 3.3.7. A pontuação total foi calculada como a soma das pontuações de diferentes alterações histopatológicas. A média foi calculada como o escore total/número de ratos. Um unpaired t-teste foi utilizado para a análise estatística. * * p ≤0.01.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
A rota intracraniana optou de infecção descrita aqui tem óbvias vantagens sobre outras vias de infecção. Ele permite que os investigadores a estudar a interação hospedeiro-bactéria e o efeito de componentes bacterianas em respostas imunes host diretamente no cérebro, que imitam a entrada de bactérias no sistema nervoso central. Assim, esta via de infecção pode ser estendida para investigar os mecanismos de meningite causada por outras bactérias. Além disso, ele também pode ser usado para testar a eficácia das drogas contra meningite bacteriana.
A fim de obter bons resultados usando este modelo, as seguintes etapas críticas são explícitas. Formação de biofilmes precisa ser examinado sob condições experimentais. No presente estudo, examinou-se usando análise de microscópio eletrônico de varredura. Outros métodos também podem ser usados para examinar a formação de biofilme, tais como método e tubo método21placa de cultura de tecidos. Um dia antes da infecção, alíquotas de ambas as células planctônicas e células de estado de biofilme precisam ser descongelados de-80 ° C para determinar o UFC. No dia seguinte, a bactéria deve ser diluída para a dose adequada de acordo com o UFC para infecção. O grupo de controle mock-infectados injetado com PBS precisa ser incluído e os ratos do grupo controle de simulação-infectados não deve exibir nenhuma manifestação durante a duração do experimento infecção. Diferentes cepas podem ter diferentes doses infecciosas, assim uma experiência preliminar é altamente recomendável para determinar a dose adequada de infecciosa. No presente estudo, utilizou-se uma dose de 3 × 107 UFC para infecção com base na nossa experiência preliminar. Esta dose de biofilme de bactérias foi capaz de induzir sinais graves de meningite e subsequente morte em todos os 5 ratos 48 h após a infecção no experimento preliminar.
A interrupção do sangue-cérebro ou barreiras fluidas cerebrospinal de sangue por S. suis constituem um passo importante em causar meningite22,23,24. Na rota de infecção intracraniana optou não é adequada para avaliar a capacidade de S. suis romper essas barreiras. Outras vias de infecção, tais como o i.p., i.v. ou óssea, podem ser usadas para atingir esse objetivo.
Aqui, nós primeiro demonstrar que S. suis biofilme contribui para a indução de meningite usando a rota intracraniana optou de infecção. Este modelo de infecção não só ajuda a entender os mecanismos de S. suis meningite, mas também é adequado para estudar a patogênese da meningite causada por outras bactérias e a eficácia de novas drogas contra meningite bacteriana.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Os autores não têm nada para divulgar.
Acknowledgments
Este trabalho foi apoiado por subsídios da pesquisa nacional de chave e programa de desenvolvimento da China [2017YFD0500102]; a Fundação Nacional de ciências naturais da China [31572544]; o laboratório estadual chave de veterinária etiológico biologia [SKLVEB2016KFKT005]; a agricultura de Shanghai aplicada tecnologia desenvolvimento programa, China [G2016060201].
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Todd Hewitt Broth(THB) | Becton, Dickinson and Company | DF0492078 | Dissolve 30 g of the powder in 1 L of purified water. Autoclave at 121° for 15 min. |
| Agar | DSBIO | 16C0050 | Dissolve 15 g of the powder in 1 L of THB. Autoclave at 121° for 15 min. |
| Milli-Q Reference Water Purification System | Merck KGaA | Z00QSVCUS | Without Dnase/ Rnase |
| NaCl | Tianjin Kemiou Chemical Reagent Co., Ltd | 10019318 | Dissolve 8 g NaCl, 0.2 g KCl, 1.42 g Na2HPO3 , 0.27 g KH2PO4 in 1 L of purified water. Autoclave at 121° for 15 min. Use KOH to adjust pH to 7.4. |
| Na2HPO3 | Xilong Scientific Co., Ltd | 9009012-01-09 | Dissolve 8 g NaCl, 0.2 g KCl, 1.42 g Na2HPO3 , 0.27 g KH2PO4 in 1 L of purified water. Autoclave at 121° for 15 min. Use KOH to adjust pH to 7.4. |
| KCl | Xilong Scientific Co., Ltd | 9009017-01-09 | Dissolve 8 g NaCl, 0.2 g KCl, 1.42 g Na2HPO3 , 0.27 g KH2PO4 in 1 L of purified water. Autoclave at 121° for 15 min. Use KOH to adjust pH to 7.4. |
| KH2PO4 | Xilong Scientific Co., Ltd | 9009019-01-09 | Dissolve 8 g NaCl, 0.2 g KCl, 1.42 g Na2HPO3 , 0.27 g KH2PO4 in 1 L of purified water. Autoclave at 121° for 15 min. Use KOH to adjust pH to 7.4. |
| KOH | Xilong Scientific Co., Ltd | 9009014-01-09 | Dissolve 8 g NaCl, 0.2 g KCl, 1.42 g Na2HPO3 , 0.27 g KH2PO4 in 1 L of purified water. Autoclave at 121° for 15 min. Use KOH to adjust pH to 7.4. |
| Glycerol | Sionpharm Chemical Reagent Co., Ltd | 10010618 | Diluted with equal volumu of purified water, autoclave at 121° for 15 min |
| 4% paraformaldehyde | Sionpharm Chemical Reagent Co., Ltd | 80096675 | |
| 25% Glutaraldehyde | Sionpharm Chemical Reagent Co., Ltd | 30092436 | 10-fold diluted with purified water for fixation. |
| Ethanol | Sionpharm Chemical Reagent Co., Ltd | 10009218 | |
| Chloroform | Sionpharm Chemical Reagent Co., Ltd | 10006818 | |
| Spctrophotometre | DeNovix Inc. | DS-11+ | |
| Ultrasound cell crusher | NingBo Scientz Biotechnology Co.,Ltd | JY96-IIN | |
| Centrifuge | Hitachi Koki Co., Ltd | CT15RE | |
| Refrigerator | Aucma Co., Ltd | DW-86L500 | |
| Scanning electron microscope | Zeiss | EVO-LS10 | |
| FastRNA Pro Green Kit | MP Biomedicals | #6045-050 | |
| FastPrep-24 Instrument | MP Biomedicals | 116005500 | |
| Instrument for PCR | SensoQuest GmbH | 1124310110 | |
| QuantStudio 6 Flex | Thermo Fisher Scientific | 4485689 | |
| SYBR Premix Ex Taq II | Takara Biomedical Technology (Beijing) Co., Ltd | RR820A | |
| PrimeScript RT reagent kit with gDNA Eraser | Takara Biomedical Technology (Beijing) Co., Ltd | RR047A | |
| Fully Enclosed Tissue Processor | Leica Biosystems Nussloch GmbH | ASP200S | |
| Heated Paraffin Embedding Module | Leica Biosystems Nussloch GmbH | EG1150H | |
| Semi-Automated Rotary Microtome | Leica Biosystems Nussloch GmbH | RM2245 | |
| Water bath for paraffin sections | Leica Biosystems Nussloch GmbH | HI1210 | |
| Autostainer XL | Leica Biosystems Nussloch GmbH | ST5010 | |
| Agilent 2100 | Agilent Technologies | G2939A | |
| Optical microscope | Olympus | BX51 |
References
- Gottschalk, M., Xu, J., Calzas, C., Segura, M. Streptococcus suis: a new emerging or an old neglected zoonotic pathogen? Future Microbiology. 5, 371-391 (2010).
- Goyette-Desjardins, G., Auger, J. P., Xu, J., Segura, M., Gottschalk, M. Streptococcus suis, an important pig pathogen and emerging zoonotic agent-an update on the worldwide distribution based on serotyping and sequence typing. Emerging Microbes & Infections. 3 (6), e45 (2014).
- Kerdsin, A., et al. Emergence of Streptococcus suis serotype 9 infection in humans. Journal of Microbiology, Immunology and Infection. 50 (4), 545-546 (2017).
- Hatrongjit, R., et al. First human case report of sepsis due to infection with Streptococcus suis serotype 31 in Thailand. BMC Infect Diseases. 15, 392 (2015).
- Fittipaldi, N., Segura, M., Grenier, D., Gottschalk, M. Virulence factors involved in the pathogenesis of the infection caused by the swine pathogen and zoonotic agent Streptococcus suis. Future Microbiology. 7 (2), 259-279 (2012).
- Hall-Stoodley, L., Costerton, J. W., Stoodley, P. Bacterial biofilms: from the natural environment to infectious diseases. Nature Reviews Microbiology. 2 (2), 95-108 (2004).
- Fuxman Bass, J. I., et al. Extracellular DNA: a major proinflammatory component of Pseudomonas aeruginosa biofilms. Journal of Immunology. 184 (11), 6386-6395 (2010).
- Isiaku, A. I., et al. Biofilm is associated with chronic streptococcal meningoencephalitis in fish. Microbial Pathogenesis. 102, 59-68 (2017).
- Oggioni, M. R., et al. Switch from planktonic to sessile life: a major event in pneumococcal pathogenesis. Molecular Microbiology. 61 (5), 1196-1210 (2006).
- Xiao, G., et al. Streptococcus suis small RNA rss04 contributes to the induction of meningitis by regulating capsule synthesis and by inducing biofilm formation in a mouse infection model. Veterinary Microbiology. 199, 111-119 (2017).
- Dominguez-Punaro, M. C., et al. Streptococcus suis serotype 2, an important swine and human pathogen, induces strong systemic and cerebral inflammatory responses in a mouse model of infection. Journal of Immunology. 179 (3), 1842-1854 (2007).
- Seitz, M., et al. A novel intranasal mouse model for mucosal colonization by Streptococcus suis serotype 2. Journal of Medical Microbiology. 61 (Pt 9), 1311-1318 (2012).
- Busque, P., Higgins, R., Caya, F., Quessy, S. Immunization of pigs against Streptococcus suis serotype 2 infection using a live avirulent strain. Canadian Journal of Veterinary Research. 61 (4), 275-279 (1997).
- Williams, A. E., Blakemore, W. F. Pathology of Streptococcal meningitis following intravenous intracisternal and natural routes of infection. Neuropathology and Applied Neurobiology. 4 (4), 345-356 (1990).
- Dominguez-Punaro, M. C., et al. Severe cochlear inflammation and vestibular syndrome in an experimental model of Streptococcus suis infection in mice. European Journal of Clinical Microbiology & Infectious Diseases. 31 (9), 2391-2400 (2012).
- Auger, J. P., Fittipaldi, N., Benoit-Biancamano, M. O., Segura, M., Gottschalk, M. Virulence Studies of Different Sequence Types and Geographical Origins of Streptococcus suis Serotype 2 in a Mouse Model of Infection. Pathogens. 5 (3), (2016).
- Chiavolini, D., et al. Method for inducing experimental pneumococcal meningitis in outbred mice. BMC Microbiology. 4, 36 (2004).
- Madsen, L. W., Svensmark, B., Elvestad, K., Jensen, H. E. Otitis interna is a frequent sequela to Streptococcus suis meningitis in pigs. Veterinary Pathology. 38 (2), 190-195 (2001).
- Holden, M. T., et al. Rapid evolution of virulence and drug resistance in the emerging zoonotic pathogen Streptococcus suis. PLoS One. 4 (7), e6072 (2009).
- Dominguez-Punaro Mde, L., et al. In vitro characterization of the microglial inflammatory response to Streptococcus suis, an important emerging zoonotic agent of meningitis. Infection and Immunity. 78 (12), 5074-5085 (2010).
- Hassan, A., et al. Evaluation of different detection methods of biofilm formation in the clinical isolates. Brazilian Journal of Infectious Diseases. 15 (4), 305-311 (2011).
- Vanier, G., et al. New putative virulence factors of Streptococcus suis involved in invasion of porcine brain microvascular endothelial cells. Microbial Pathogenesis. 46 (1), 13-20 (2009).
- Takeuchi, D., et al. The contribution of suilysin to the pathogenesis of Streptococcus suis meningitis. Journal of Infectious Diseases. 209 (10), 1509-1519 (2014).
- Tenenbaum, T., et al. Polar bacterial invasion and translocation of Streptococcus suis across the blood-cerebrospinal fluid barrier in vitro. Cellular Microbiology. 11 (2), 323-336 (2009).
