Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Immunology and Infection

Внутричерепная Subarachnoidal маршрут инфекции для расследования роли Streptococcus suis биоплёнки в менингита в мышиной модели инфекции

Published: July 1, 2018 doi: 10.3791/57658

Summary

Здесь мы описать маршрут внутричерепного subarachnoidal инфекции у мышей для изучения роли биопленки в Streptococcus suis менингита. Эта инфекция модель подходит также для изучения патогенеза других бактериальный менингит и эффективность новых препаратов против бактериального менингита.

Abstract

Streptococcus suis -это не только основных бактериальной патогена свиней во всем мире, но и возникающих зоонозные агента. В организме человека и свиньи менингит является основным проявлением инфекции S. suis . Модель подходит инфекции является важным инструментом для понимания механизмов заболеваний, вызванных патогенами. Для изучения патогенеза S. suis инфекции были разработаны несколько маршрутов инфекции у мышей. Однако внутрибрюшинного, интраназально и внутривенного маршруты инфекции не подходят для изучения роли S. suis поверхности компонентов в менингита непосредственно в мозг, например внеклеточная матрица от биопленки. Хотя intracisternal прививка была использована для S. suis инфекции, точные укола не были описаны. Здесь внутричерепной subarachnoidal маршрут инфекции был описан в мышиной модели для изучения роли биопленки в S. suis менингита. S. suis планктонных клетки или клетки состояние биопленки непосредственно вводили в субарахноидальное пространство мышей через инъекции расположен 3,5 мм ростральной от bregma. Гистопатологические анализ и увеличение выражение mRNA TLR2 и цитокины ткани мозга от мышей, вводится с биопленки состояние клетки четко S. suis биопленки играет окончательный ролей в S. suis менингита. Этот маршрут инфекции имеет очевидные преимущества над другими путями инфекции, позволяя изучение взаимодействия хост бактерии. Кроме того, он позволяет эффект бактериальных компонентов на хост иммунные реакции непосредственно в мозг, чтобы быть оценены и имитирует бактериальных вход в центральной нервной системе. Этот маршрут инфекции может быть продлено расследование механизмов менингита, вызванного другими бактериями. Кроме того она может также использоваться для проверки эффективности препаратов против бактериального менингита.

Introduction

Streptococcus suis (S. suis) является основных бактериальной патогена свиней во всем мире, вызывая тяжелые заболевания, включая менингит, пневмония, сепсис, эндокардит и артрит1. Это также возникающих зоонозные агент. До настоящего времени сообщалось, что девять серотипов может привести к инфекции в организме человека, в том числе серотипов, 2, 4, 5, 9, 14, 16, 21, 24 и 312,3,4. В организме человека и свиньи менингит является одним из основных клинических признаков инфекции S. suis . Во Вьетнаме и Таиланде S. suis является главной причиной менингита в5взрослых. Микробные биоплёнки являются микроорганизмы, которые соответствуют друг другу и сосредоточены на интерфейс; они крайне важны для вирулентности бактерий, выживание в различных средах и антибиотикорезистентности5. Биоплёнки обычно окружены внеклеточного матрикса, который обычно содержит полисахариды, белков и ДНК6. Последний имеет возможность пребывания воспалительных реакций и цитокина производства7. Участвовать в стрептококков менингита в предыдущих исследованиях сообщалось биопленки. Биопленки способствует Streptococcus agalactiae менингита в модели рыбы тиляпии и биопленки обнаружено в тканях мозга и вокруг менингеальные поверхностей в естественных условиях путем внутрибрюшного прививка8. При менингите пневмококк находится в состоянии биопленки как и бактерии в таком состоянии биопленки были более эффективным в стимулировании менингита в мыши инфекции модель9. Кроме того, в нашем предыдущем исследовании, биопленки состояние, связанное с S. suis в мозг мыши способствует бактериальной вирулентности, выживание анализ10. Однако прямых доказательств участия биопленки в S. suis менингита требует дальнейшего расследования.

Животные модели S. suis инфекции были разработаны в мышей, используя внутрибрюшинного (и.п.)11, интраназально (и.н.)12, внутривенные (и.в.)13и маршруты intracisternal (i.c.) инфекции14, 15 , 16. Однако, и.п., и.н. и и.в. маршруты инфекции не подходят для изучения роли S. suis поверхности компонентов в менингита непосредственно в мозг. К ним относятся внеклеточная матрица от биопленки. Хотя i.c. прививка была использована для S. suis инфекции, точные укола не был описан в этих документах. В отличие от стереотаксического координаты инъекции для прививки внутричерепного subarachnoidal явно были описаны в предыдущем исследовании17. Это позволило легко признание прививка точки и более упрощенным экспериментальный протокол. Кроме того маршрут внутричерепного subarachnoidal инфекции имитирует бактериальных вход в центральной нервной системе из пазухи или среднего уха17и отношения между среднего уха и менингита, вызванного S. suis была продемонстрирована Мадсен et al18. Кроме того применяя внутричерепного subarachnoidal маршрут инфекции в мышей, мы продемонстрировали, что S. suis малых РНК rss04 способствует менингита в наших предыдущих исследования10.

В настоящем исследовании, внутричерепной subarachnoidal маршрут инфекции был использован в мышей для расследования роли биопленки в S. suis менингита. Мышей были инфицированы планктонных клетки или биопленки состояние клеток S. suis по этому маршруту инфекции. Гистопатологические анализ и увеличение выражение mRNA TLR2 и цитокинов из ткани мозга мышей, вводится с биопленки состояние клетки четко указывается, что S. suis биопленки способствует менингита.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Мыши инфекции экспериментов были утверждены на лабораторных животных мониторинга Комитета провинции Цзянсу, Китая и выступал в лабораторных животных центр от Нанкин аграрный университет (номер разрешения: SYXK (Su) 2017-0007).

1. Подготовка бактерий

Примечание: S. suis серотипа 2 вирулентным штаммом P1/7 был изолирован от больных свиней с менингитом19. Штамм P1/7 был выращен в бульоне Тодд-Хьюитт (THB, формула литр THB: сердце инфузии, 3.1 g neopeptone, 20,0 г декстрозы, 2.0 g; 2,0 г, натрия хлорида; 0,4 г, динатрия фосфата; карбонат натрия, 2,5 г) и покрытием на Тодд-Хьюитт агар (THA, формула за литр THA: Сердце инфузии, 3,1 г; neopeptone, 20,0 г; декстроза, 2,0 г; натрия хлорид, 2,0 г; динатрия фосфат, 0,4 г; карбонат натрия, 2,5 г; агар, 15,0 g) при 37 ° C и 5% CO2.

  1. Коллекция из штамма планктонных клетки P1/7
    1. Собирать 5 мл планктонных клеток от середины журнала фазы культуры (OD600= 0,6), центрифуги для 3 мин на 8000 × g и затем смывают 3 раза с PBS.
    2. Ресуспензируйте клетки с 5 мл 25% глицерина в THB, аликвота в 5 трубок и затем хранить при температуре-80 ° C.
  2. Коллекция из штамма P1/7 биопленки состояние клетки
    1. 20 мл на ночь культуры и добавить к 180 мл свежего THB; Разделите разреженных культуры на 10 раунда культуры пластин одинаково и затем поместить пластины в инкубаторе при 37 ° C в 5% CO2 на 24 часа.
    2. После инкубации shake пластины нежно ресуспензируйте бактерии, которые еще не присоединились к пластине и затем удалить супернатант путем аспирации.
      Примечание: Осторожно встряхнуть пластину и избежать resuspending отложений.
    3. Добавьте 5 мл PBS урожай биопленки состояние клетки, полностью Ресуспензируйте отложений и затем передать образец новой трубки.
    4. Sonicate биопленки состояние клетки от последнего шага со следующими параметрами: 60 Вт, 4 циклов, 5 s на и 10 s выкл.
    5. Центрифуга для 3 мин на 8000 × g и хранить супернатант в-80 ° C.
      Примечание: Супернатант могут содержать компоненты биопленки и может использоваться для Ресуспензируйте биопленки бактерий до заражения, как описано в подопытных животных (шаг 3).
    6. Ресуспензируйте отложений с 10 мл 25% глицерина в THB и затем сохранить состояние клетки биопленки на-80 ° C.

2. сканирование электронная микроскопия (SEM) анализ

  1. Исправить собранных биопленки состояние клетки и планктонные клетки с помощью параформальдегида 4% для 12-24 ч при 4 ° C.
  2. Промойте образцы быстро с дистиллированной водой и обезвоживанию образцы последовательно с растущей концентрации этанола (25%, 50%, 70%, 90% и 100%), за 30 мин в каждом решении.
  3. Придерживайтесь высушенных образцов металлические держатели с двухсторонней ленты и наконец пальто их в испаритель с золота и палладия.
  4. Наблюдать за образцы от сканирующий электронный микроскоп, используя следующие параметры: EHT (дополнительные высокого напряжения) = 10 кв; WD (рабочее расстояние) = 7.0 и 8.0 мм; Увеличение = 5000 ×; Сигнал A = SE1.

3. животных эксперименты

  1. Использовать SPF 6 week-old самок мышей BALB/c в настоящем исследовании. Заразить всех мышей через трассу внутричерепного subarachnoidal инфекции, чьи инъекции является расположен 3,5 мм, Ростральные от bregma. Стереотаксическая координаты инъекции были четко описаны Chiavolini et al17.
    1. Для гистопатологические анализа, заразить две группы мышей (5 мышей каждой группы) с помощью планктонных клетки или биопленки состояние клеток в дозе 3 × 107 образуя колонии единиц (CFU), и еще 5 мышей вводили с PBS как элемент управления.
    2. Для выявления экспрессии мРНК TLR2 и цитокинов в мозге, заразить две дополнительные группы мышей (6 мышей на группу) с помощью планктонных клетки или биопленки состояние клеток в дозе 3 × 107 кое.
    3. Определите количество жизнеспособных бактерий, покрытие серийных разведений на THA.
    4. Усыпить всех мышей на 12 ч после инфекции для дальнейших исследований.
      Примечание: Глицерин в средстве акций должны быть удалены перед инфекцией. Как планктонных и биопленки состояние клетки оправился от-80 ° C 3 раза промывают PBS. Затем планктонные клетки высокомобильна с PBS и разбавляют до соответствующей дозы для инфекции; биопленки состояние клетки высокомобильна с сохраненной супернатант (от шага 1.2.5) и разбавляют до соответствующей дозы для инфекции. Объем для инфекции не должно быть более чем 50 мкл.
  2. Обнаружение выражение mRNA TLR2 и цитокинов в ткани мозга
    1. Извлечь общее РНК из ткани мозга, используя набор для извлечения РНК.
      1. Для каждой мыши Используйте весь мозг ткани для извлечения РНК. Весь мозг ткани делят на 5 трубок. Занять до 100 мг мозговой ткани и добавьте 1 мл раствора лизис каждая трубка, содержащая лизировать матрицы, предоставляемый в комплект.
      2. Процесс трубку в гомогенизатор для 40 s при настройке 6.0, а затем центрифуги трубки на 12000 х g и 4 ° C за 5 мин.
      3. После центрифугирования передавать новые пробки microcentrifuge Верхний этап.
      4. Инкубировать переданного образца за 5 мин при комнатной температуре; 300 мкл хлороформ, вихревые для 10 s и затем инкубировать в течение 5 мин при комнатной температуре.
      5. Центрифуга для трубки на 12000 × g и 4 ° C для 5 минут передать новой трубки Верхний этап.
      6. 500 мкл холодной абсолютного этанола на трубу, прежде чем переворачивать его в 5 раз и затем сохраните образец при-20 ° C для по крайней мере 1 час.
      7. Центрифуга для трубки на 12000 × g и 4 ° C на 15 мин и удалить супернатант. Помыть лепешка с 500 мкл холодной 75% этанола в свободный РНКазы H2O.
      8. Удаление этанола, сухой воздух Пелле за 5 мин при комнатной температуре и Ресуспензируйте РНК в 100 мкл РНКазы свободный H2O.
      9. Инкубировать РНК в течение 5 мин при комнатной температуре и определения концентрации РНК, с помощью bioanalyzer РНК.
    2. Выполните синтез cDNA, включая ликвидацию геномной ДНК (геномная ДНК), используя Термоциклер с комплект реагентов обратной транскрипции (RT).
      1. Добавить 1 мкг РНК содержащие 2 мкл трубки 5 x gDNA ликвидации буфера, 1 мкл геномная ДНК ликвидации фермента и свободный РНКазы H2O до тех пор, пока объем достигает 10 мкл. Инкубируйте 2 мин при 42 ° C.
      2. 10 мкл главный микс (1 мкл RT фермента Mix, 1 мкл RT грунтовка смеси, 4 мкл 5 x 2 буфера и 4 мкл РНКазы свободный H2O) в реакции решение от последний шаг и затем осторожно перемешать. Немедленно приступить к реакции RT: 37 ° C 15 мин и затем 85 ° C за 5 s.
      3. Выполните количественный анализ в реальном времени PCR (RT-ПЦР) с помощью ПЦР в реальном времени машина с комплектом SYBR RT-ПЦР. Добавьте 10 мкл 2 x фермента, 0,8 мкл вперед грунт, 0,8 мкл обратный грунт, 0.4 мкл 50 x ROX ссылка краситель II, 2 мкл cDNA шаблон, и свободный РНКазы H2O до общего объема 20 мкл.
      4. Запуск каждого образца в трех экземплярах, с использованием следующих параметров тепловой: 30 s на 94 ° C, а затем 40 циклов 5 s при 95 ° C и 34 s при 60 ° C, с заключительной стадии 15 s при 95 ° C, 1 мин при 60 ° C и 15 s при 95 ° C. Праймеры для RT-ПЦР, перечислены в таблице 1. Уборка генов B2m и 18s рРНК были использованы в качестве механизмов внутреннего контроля.
    3. Расчет изменения относительной фолд, основанный на методе 2-ΔΔCt .
  3. Наблюдение за Гистологические срезы
    1. После фиксации 24 h с 10% формалина реконструировать фиксированной мозговой ткани в соответствующих размеров кусков ткани на 2-3 мм.
    2. Положите кусочки ткани в внедрения кассету и погрузиться в новом решении фиксирующие для обезвоживания автоматические вакуумные осушителя.
    3. Возьмите фиксированной ткани и обезвоживает он последовательно в повышении концентрации этанола (70%, 80%, 95%, 95% и 100%), за 30 мин в каждом решении.
    4. Transparentize образца с ксилол 15 мин, окуните его в жидкий парафин при 60 ° C 90 мин и затем внедрить с помощью внедрения машины.
    5. Нарезать ломтиками 3 мкм парафин блок встроенных ткани, плитка срез на воде при температуре 45 ° C и затем высушить на воздухе.
    6. Инкубировать в разделе 3 ч, при 60 ° C, пятно с помощью гематоксилин и эозином (он) метод и запечатать его с нейтральной десен.
    7. Наблюдать гистопатологические изменения головного мозга с помощью оптического микроскопа. Четыре точки системы классификации была использована для оценки гистологических изменений. Использование непарных t -тест для статистического анализа.
      Заторов/кровотечения: отсутствует, оценка 0; небольшая область фокуса заторов/кровотечения, Оценка 1; большие области фокуса заторов/кровотечения, или несколько небольших участков фокуса заторов/кровотечения, Оценка 2; до трех больших фокуса заторов/кровотечения сайтов Оценка 3; Диффузный заторов/кровотечения, Оценка 4.
      Некроз: отсутствует, оценка 0; некроз, Оценка 1; Диффузный появления некротических клеток 1-10, Оценка 2; очагов некроза вырожденная, Оценка 3; обширные вырожденная некроз, Оценка 4.
      Воспалительных клеток инфильтрата: отсутствует, оценка 0; несколько и фокуса инфильтратов, Оценка 1; Мультифокальные проникновения или проникновения с образованием агрегатов, Оценка 2; до трех агрегатов Оценка 3; и более чем четырех агрегатов, Оценка 4.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Был проведен анализ SEM для изучения биопленки в экспериментальных условиях. Как показано на рисунке 1, существует значительная разница в биопленки между планктонных клеток (рис. 1А) и биопленки состояние клеток (рис. 1Б). SEM анализ показал, что биопленки бактерий в кусты и несколько слоев и они были помещены в внеклеточного матрикса, в то время как планктонных бактерии были гораздо менее плотной и главным образом дисперсной индивидуально.

Компоненты внеклеточного матрикса биопленки, такие как ДНК, способны разместить воспалительных реакций и производство цитокинов. Начиная с TLR2 и цитокинов CCL2 ИЛ-6, ФНО α занимаются и церебрального воспалительных реакций, связанных с менингитом согласно предыдущих исследований10,11,20, мРНК, которые сравнивали экспрессии этих генов в естественных условиях для мышей, инфицированных клеток планктонных и инфицированных биопленки состояние клеток. Это было сделано, чтобы исследовать эффект биопленки на воспалительный процесс в тканях мозга мышиных. Как показано на рисунке 2, в 12 ч после инфекции, выражение TLR2, CCL2, Ил-6, и ФНО α от мозги зараженных мышей был значительно выше для биопленки состояние клетки, по сравнению с планктонных клеток.

Мышей, инфицированных биопленки бактерий показали гораздо более серьезные признаки чем инфицированных планктонных бактерии менингита (жесткие поза, атаксия или судороги). Гистологическое исследование ткани мозга от мышей, инфицированных S. suis штамм, проявленные P1/7 заторов/кровотечения, некроз и воспалительных клеток инфильтрата в мозговых оболочек, коре, желудочки или таламус (рис. 3) . По сравнению с мышей, инфицированных планктонных бактерий (Рисунок 3E-H), в 12 ч, послеоперационные инфекции, гораздо более серьезные патологические изменения наблюдались в ткани мозга от мышей, инфицированных биопленки бактерий (рис. 3А-D), включая большие площади заторов/кровотечения, некроз или интенсивным воспалительных клеток инфильтрата. Грубых патологических изменений в головном мозге от мышей, инфицированных планктонных и биопленки бактерий был записан в таблице 2. Патологические изменения ни неврологической симптоматики наблюдались от мышей, вводится с PBS. Взятые вместе, эти данные ясно показывают, что S. suis биопленки способствует индукции менингита.

Figure 1
Рисунок 1: SEM изображения из штамма P1/7 планктонных клетки и клетки состояние биопленки. Бактерии были культивировали в THB среде. SEM анализ показал, что планктонные клетки (A) были гораздо менее плотной и главным образом дисперсной индивидуально, в то время как биопленки бактерий (B) были объединены в кусты и несколько слоев и они были помещены в внеклеточного матрикса. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Figure 2
Рисунок 2: биоплёнки активировать экспрессии мРНК CCL2, ФНО α, Ил-6 и TLR2 в ткани мозга мыши в vivo. Каждый шесть мышей BALB/c каждой группы вводили через маршрут внутричерепного subarachnoidal инфекции с 3 × 107 кое планктонных клетки или клетки состояние биопленки. Мышей были умерщвлены в 12 ч после инфекции. Результаты представлены как раз изменение экспрессии мРНК в состоянии биопленки, мышей, инфицированных клеток по сравнению с планктонных мышей, инфицированных клеток. (A ген B2m был использован как ссылка ген; (B гена 18s рРНК был использован как ссылка ген. Непарные t-тест был использован для статистического анализа. ** p ≤0.01, и * p ≤0.05. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Figure 3
Рисунок 3: гистологический анализ ткани мозга мышей, инфицированных штамм P1/7 планктонных бактерий и биопленки бактерий государства. A-D, образцы мозга от мышей, инфицированных бактериями биопленки государства; E-H, образцов мозга от мышей, инфицированных планктонных бактерий. A, B, E и F: мозговых оболочек и коры головного мозга; C и G: желудочков; D и H: таламус. Δ, заторов/кровотечения; □, некроз; ○: воспалительных клеток инфильтрата. Увеличение = 200 X; шкалы бар = 100 µm. пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.

Грунтовка имя Последовательность (5' - 3') Джин символ
IL-6 вперед CTTCCATCCAGTTGCCTTCT Il6
IL-6 реверс CTCCGACTTGTGAAGTGGTATAG Il6
TLR2 вперед CACTATCCGGAGGTTGCATATC Tlr2
TLR2 обратный GGAAGACCTTGCTGTTCTCTAC Tlr2
CCL2 вперед CTCACCTGCTGCTACTCATTC Ccl2
CCL2 обратный ACTACAGCTTCTTTGGGACAC Ccl2
ФНО α вперед TTGTCTACTCCCAGGTTCTCT ФНО
Реверс ФНО α GAGGTTGACTTTCTCCTGGTATG ФНО
Β2m вперед GGTCTTTCTGGTGCTTGTCT B2M
Β2m обратный TATGTTCGGCTTCCCATTCTC B2M
18s вперед GTAACCCGTTGAACCCCATT 18S рРНК
18s обратный CCATCCAATCGGTAGTAGCG 18S рРНК

Таблица 1: Грунты для RT-ПЦР.

Table 1
Таблица 2: валовой гистопатологические изменения в мозге от мышей, инфицированных S. suis штамма P1/7. Четыре точки системы классификации была использована для оценки гистологические изменения, как описано в протоколе раздел 3.3.7. Общая оценка была рассчитана как сумма баллов от различных гистопатологические изменения. Средняя была рассчитана как общая оценка/количество мышей. Непарные t-тест был использован для статистического анализа. ** p ≤0.01.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Маршрут внутричерепного subarachnoidal инфекции, описанные здесь имеет очевидные преимущества над другими путями заражения. Это позволяет следователей для изучения взаимодействия хост бактерии и эффект бактериальных компонентов на хост иммунные реакции непосредственно в мозге, которые имитируют бактериальной вход в центральной нервной системе. Таким образом этот маршрут инфекции может быть продлено расследование механизмов менингита, вызванного другими бактериями. Кроме того она может также использоваться для проверки эффективности препаратов против бактериального менингита.

Чтобы получить хорошие результаты, используя эту модель, следующие критические шаги являются явными. Биопленки необходимо рассматривать в экспериментальных условиях. В настоящем исследовании был рассмотрен, с помощью сканирующего электронного микроскопа анализа. Другие методы могут также использоваться для изучения биопленки, такие, как культура ткани пластины метод и трубки метод21. Один день перед инфекцией, аликвоты как планктонных и биопленки состояние клетки нужно разморозить от-80 ° C для определения кое. Следующий день, бактерии должны быть ослаблены соответствующие дозы согласно кое для инфекции. Макет инфицированных контрольной группе вводили с PBS должна быть включена и мышей от МОК инфицированных контрольной группы должны exhibit без проявлений во время эксперимента инфекции. Различные штаммы могут иметь различные инфекционные дозах, поэтому предварительного эксперимента настоятельно рекомендуется определить соответствующие инфекционных дозы. В настоящем исследовании был использован дозе 3 × 107 кое для инфекции, на основе нашего предварительного эксперимента. Эта доза биопленки бактерий был в состоянии вызвать серьезные признаки менингита и последующей смерти всех 5 мышей 48 ч после инфекции в предварительном эксперимент.

Разрушение мозга крови или кровь цереброспинальный жидкости барьеров, S. suis являются важным шагом в вызывая менингита22,23,24. Внутричерепная subarachnoidal маршрут инфекции не подходит для оценки способности S. suis прорваться через эти барьеры. Другие маршруты инфекции, такие как и.п., и.в. или и.н., может использоваться для достижения этой цели.

Здесь мы сначала продемонстрировать, что S. suis биопленки способствует индукции менингита, используя маршрут внутричерепного subarachnoidal инфекции. Эта модель инфекции не только помогает для более глубокого понимания механизмов S. suis менингита, но также подходит для изучения патогенеза менингита, вызванного другими бактериями и эффективность новых препаратов против бактериального менингита.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Авторы не имеют ничего сообщать.

Acknowledgments

Эта работа была поддержана гранты национальных ключевых исследований и развития программа Китая [2017YFD0500102]; Национальный природный науки фонд Китая [31572544]; Государственный ключевой Лаборатория ветеринарной этиологические биологии [SKLVEB2016KFKT005]; в Шанхае сельского хозяйства применяется технология развития программы, Китай [G2016060201].

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Todd Hewitt Broth(THB) Becton, Dickinson and Company DF0492078 Dissolve 30 g of the powder in 1 L of purified water. Autoclave at 121° for 15 min.
Agar DSBIO 16C0050 Dissolve 15 g of the powder in 1 L of THB. Autoclave at 121° for 15 min.
Milli-Q Reference Water Purification System Merck KGaA Z00QSVCUS Without Dnase/ Rnase
NaCl Tianjin Kemiou Chemical Reagent Co., Ltd 10019318 Dissolve 8 g NaCl, 0.2 g KCl, 1.42 g Na2HPO3 , 0.27 g KH2PO4 in 1 L of purified water. Autoclave at 121° for 15 min. Use KOH to adjust pH to 7.4.
Na2HPO3 Xilong Scientific Co., Ltd 9009012-01-09 Dissolve 8 g NaCl, 0.2 g KCl, 1.42 g Na2HPO3 , 0.27 g KH2PO4 in 1 L of purified water. Autoclave at 121° for 15 min. Use KOH to adjust pH to 7.4.
KCl Xilong Scientific Co., Ltd 9009017-01-09 Dissolve 8 g NaCl, 0.2 g KCl, 1.42 g Na2HPO3 , 0.27 g KH2PO4 in 1 L of purified water. Autoclave at 121° for 15 min. Use KOH to adjust pH to 7.4.
KH2PO4 Xilong Scientific Co., Ltd 9009019-01-09 Dissolve 8 g NaCl, 0.2 g KCl, 1.42 g Na2HPO3 , 0.27 g KH2PO4 in 1 L of purified water. Autoclave at 121° for 15 min. Use KOH to adjust pH to 7.4.
KOH Xilong Scientific Co., Ltd 9009014-01-09 Dissolve 8 g NaCl, 0.2 g KCl, 1.42 g Na2HPO3 , 0.27 g KH2PO4 in 1 L of purified water. Autoclave at 121° for 15 min. Use KOH to adjust pH to 7.4.
Glycerol Sionpharm Chemical Reagent Co., Ltd 10010618 Diluted with equal volumu of purified water, autoclave at 121° for 15 min
4% paraformaldehyde Sionpharm Chemical Reagent Co., Ltd 80096675
25% Glutaraldehyde Sionpharm Chemical Reagent Co., Ltd 30092436 10-fold diluted with purified water for fixation.
Ethanol Sionpharm Chemical Reagent Co., Ltd 10009218
Chloroform Sionpharm Chemical Reagent Co., Ltd 10006818
Spctrophotometre DeNovix Inc. DS-11+
Ultrasound cell crusher NingBo Scientz Biotechnology Co.,Ltd JY96-IIN
Centrifuge Hitachi Koki Co., Ltd CT15RE
Refrigerator Aucma Co., Ltd DW-86L500
Scanning electron microscope Zeiss EVO-LS10
FastRNA Pro Green Kit MP Biomedicals #6045-050
FastPrep-24 Instrument MP Biomedicals 116005500
Instrument for PCR SensoQuest GmbH 1124310110
QuantStudio 6 Flex Thermo Fisher Scientific 4485689
SYBR Premix Ex Taq II Takara Biomedical Technology (Beijing) Co., Ltd RR820A
PrimeScript RT reagent kit with gDNA Eraser Takara Biomedical Technology (Beijing) Co., Ltd RR047A
Fully Enclosed Tissue Processor Leica Biosystems Nussloch GmbH ASP200S
Heated Paraffin Embedding Module Leica Biosystems Nussloch GmbH EG1150H
Semi-Automated Rotary Microtome Leica Biosystems Nussloch GmbH RM2245
Water bath for paraffin sections Leica Biosystems Nussloch GmbH HI1210
Autostainer XL Leica Biosystems Nussloch GmbH ST5010
Agilent 2100 Agilent Technologies G2939A
Optical microscope Olympus BX51

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Gottschalk, M., Xu, J., Calzas, C., Segura, M. Streptococcus suis: a new emerging or an old neglected zoonotic pathogen? Future Microbiology. 5, 371-391 (2010).
  2. Goyette-Desjardins, G., Auger, J. P., Xu, J., Segura, M., Gottschalk, M. Streptococcus suis, an important pig pathogen and emerging zoonotic agent-an update on the worldwide distribution based on serotyping and sequence typing. Emerging Microbes & Infections. 3 (6), e45 (2014).
  3. Kerdsin, A., et al. Emergence of Streptococcus suis serotype 9 infection in humans. Journal of Microbiology, Immunology and Infection. 50 (4), 545-546 (2017).
  4. Hatrongjit, R., et al. First human case report of sepsis due to infection with Streptococcus suis serotype 31 in Thailand. BMC Infect Diseases. 15, 392 (2015).
  5. Fittipaldi, N., Segura, M., Grenier, D., Gottschalk, M. Virulence factors involved in the pathogenesis of the infection caused by the swine pathogen and zoonotic agent Streptococcus suis. Future Microbiology. 7 (2), 259-279 (2012).
  6. Hall-Stoodley, L., Costerton, J. W., Stoodley, P. Bacterial biofilms: from the natural environment to infectious diseases. Nature Reviews Microbiology. 2 (2), 95-108 (2004).
  7. Fuxman Bass, J. I., et al. Extracellular DNA: a major proinflammatory component of Pseudomonas aeruginosa biofilms. Journal of Immunology. 184 (11), 6386-6395 (2010).
  8. Isiaku, A. I., et al. Biofilm is associated with chronic streptococcal meningoencephalitis in fish. Microbial Pathogenesis. 102, 59-68 (2017).
  9. Oggioni, M. R., et al. Switch from planktonic to sessile life: a major event in pneumococcal pathogenesis. Molecular Microbiology. 61 (5), 1196-1210 (2006).
  10. Xiao, G., et al. Streptococcus suis small RNA rss04 contributes to the induction of meningitis by regulating capsule synthesis and by inducing biofilm formation in a mouse infection model. Veterinary Microbiology. 199, 111-119 (2017).
  11. Dominguez-Punaro, M. C., et al. Streptococcus suis serotype 2, an important swine and human pathogen, induces strong systemic and cerebral inflammatory responses in a mouse model of infection. Journal of Immunology. 179 (3), 1842-1854 (2007).
  12. Seitz, M., et al. A novel intranasal mouse model for mucosal colonization by Streptococcus suis serotype 2. Journal of Medical Microbiology. 61 (Pt 9), 1311-1318 (2012).
  13. Busque, P., Higgins, R., Caya, F., Quessy, S. Immunization of pigs against Streptococcus suis serotype 2 infection using a live avirulent strain. Canadian Journal of Veterinary Research. 61 (4), 275-279 (1997).
  14. Williams, A. E., Blakemore, W. F. Pathology of Streptococcal meningitis following intravenous intracisternal and natural routes of infection. Neuropathology and Applied Neurobiology. 4 (4), 345-356 (1990).
  15. Dominguez-Punaro, M. C., et al. Severe cochlear inflammation and vestibular syndrome in an experimental model of Streptococcus suis infection in mice. European Journal of Clinical Microbiology & Infectious Diseases. 31 (9), 2391-2400 (2012).
  16. Auger, J. P., Fittipaldi, N., Benoit-Biancamano, M. O., Segura, M., Gottschalk, M. Virulence Studies of Different Sequence Types and Geographical Origins of Streptococcus suis Serotype 2 in a Mouse Model of Infection. Pathogens. 5 (3), (2016).
  17. Chiavolini, D., et al. Method for inducing experimental pneumococcal meningitis in outbred mice. BMC Microbiology. 4, 36 (2004).
  18. Madsen, L. W., Svensmark, B., Elvestad, K., Jensen, H. E. Otitis interna is a frequent sequela to Streptococcus suis meningitis in pigs. Veterinary Pathology. 38 (2), 190-195 (2001).
  19. Holden, M. T., et al. Rapid evolution of virulence and drug resistance in the emerging zoonotic pathogen Streptococcus suis. PLoS One. 4 (7), e6072 (2009).
  20. Dominguez-Punaro Mde, L., et al. In vitro characterization of the microglial inflammatory response to Streptococcus suis, an important emerging zoonotic agent of meningitis. Infection and Immunity. 78 (12), 5074-5085 (2010).
  21. Hassan, A., et al. Evaluation of different detection methods of biofilm formation in the clinical isolates. Brazilian Journal of Infectious Diseases. 15 (4), 305-311 (2011).
  22. Vanier, G., et al. New putative virulence factors of Streptococcus suis involved in invasion of porcine brain microvascular endothelial cells. Microbial Pathogenesis. 46 (1), 13-20 (2009).
  23. Takeuchi, D., et al. The contribution of suilysin to the pathogenesis of Streptococcus suis meningitis. Journal of Infectious Diseases. 209 (10), 1509-1519 (2014).
  24. Tenenbaum, T., et al. Polar bacterial invasion and translocation of Streptococcus suis across the blood-cerebrospinal fluid barrier in vitro. Cellular Microbiology. 11 (2), 323-336 (2009).

Tags

Иммунология и инфекции выпуск 137 Streptococcus suis внутричерепной subarachnoidal биопленки менингит инфекции модель мыши вирулентности бактерий
Внутричерепная Subarachnoidal маршрут инфекции для расследования роли <em>Streptococcus suis</em> биоплёнки в менингита в мышиной модели инфекции
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Zhang, S., Gao, X., Xiao, G., Lu,More

Zhang, S., Gao, X., Xiao, G., Lu, C., Yao, H., Fan, H., Wu, Z. Intracranial Subarachnoidal Route of Infection for Investigating Roles of Streptococcus suis Biofilms in Meningitis in a Mouse Infection Model. J. Vis. Exp. (137), e57658, doi:10.3791/57658 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter