Summary
Aquí, describimos la ruta subaracnoidea intracraneal de la infección en ratones para estudiar el papel de los biofilms en Streptococcus suis meningitis. Este modelo de infección también es adecuado para el estudio de la patogenia de otra meningitis bacteriana y la eficacia de nuevos medicamentos contra la meningitis bacteriana.
Abstract
Streptococcus suis es no sólo un patógeno bacteriano importante de cerdos en todo el mundo, sino también un agente zoonótico emergente. En los seres humanos y cerdos, la meningitis es una manifestación importante de infecciones por S. suis . Un modelo adecuado de la infección es una herramienta esencial para comprender los mecanismos de las enfermedades causadas por patógenos. Varias rutas de la infección en ratones se han desarrollado para estudiar la patogenesia de la infección por S. suis . Sin embargo, las rutas de infección intraperitoneales, intranasales o intravenosas no son adecuadas para el estudio de las funciones de componentes superficiales de S. suis meningitis directamente en el cerebro, como la matriz extracelular de la biopelícula. Aunque la inoculación intracisternal se ha utilizado para la infección por S. suis , el sitio de inyección precisa no se ha descrito. Aquí, la ruta subaracnoidea intracraneal de la infección fue descrita en un modelo de ratón para investigar el papel de biofilms en meningitis S. suis . Células planctónicas de S. suis o biofilm estado fueron inyectadas directamente en el espacio subaracnoideo de los ratones a través del sitio de inyección, situado a 3,5 mm rostral de la bregma. El análisis histopatológico y mayor expresión del ARNm de TLR2 y citoquinas del tejido cerebral de los ratones inyectados con las células del biofilm estado indican claramente que biofilm de S. suis juega un papel definitivo en meningitis S. suis . Esta ruta de infección tiene evidentes ventajas sobre otras vías de infección, permitiendo el estudio de la interacción de la bacteria huésped. Además, permite el efecto de componentes bacterianos en las respuestas inmunitarias de host directamente en el cerebro para ser evaluados y simula la entrada de bacteria en el sistema nervioso central. Esta ruta de infección se puede extender para investigar los mecanismos de la meningitis causada por otras bacterias. Además, también puede ser utilizado para probar la eficacia de los medicamentos contra la meningitis bacteriana.
Introduction
Streptococcus suis (S. suis) es un importante patógeno bacteriano de los cerdos en todo el mundo, causando enfermedades graves como meningitis, neumonía, septicemia, endocarditis y artritis1. También es un agente zoonótico emergente. Hasta ahora, se ha informado que nueve serotipos pueden causar infección en seres humanos, incluyendo los serotipos 2, 4, 5, 9, 14, 16, 21, 24 y 312,3,4. En los seres humanos y cerdos, la meningitis es uno de los principales signos clínicos de infecciones por S. suis . En Vietnam y Tailandia, S. suis es la principal causa de meningitis en adultos5. Los biofilms microbianos son microorganismos que se adhieren entre sí y se concentra en una interfaz; son esenciales para la virulencia bacteriana, supervivencia en diversos ambientes y resistencia a los antibióticos5. Biofilms normalmente están rodeados por una matriz extracelular que generalmente contiene polisacáridos, proteínas y ADN6. Este último es capaz de provocar respuestas inflamatorias host y del cytokine producción7. Formación de biopelículas se ha divulgado en meningitis estreptocócica en estudios anteriores. Biofilms contribuyen a meningitis Streptococcus agalactiae en un modelo de pescado tilapia y formación de biopelículas se ha revelado dentro de los tejidos del cerebro y alrededor de meníngea superficies en vivo a través de inoculación intra abdominal8. Durante meningitis, estreptococo pneumoniae está en un estado similar al biofilm y bacterias en un biofilm estado fueron más efectivas en la inducción de meningitis en un modelo de infección del ratón9. Además, en nuestro anterior estudio, el estado de biofilm asociado con S. suis en cerebro de ratón contribuye a la virulencia bacteriana supervivencia análisis10. Sin embargo, la evidencia directa para la participación de biofilm de S. suis meningitis requiere más investigación.
Se han desarrollado modelos animales de infección por S. suis en ratones utilizando la intraperitoneal (i.p.)11, intranasal (i.n.)12, vía intravenosa (i.v.)13y las rutas intracisternal (i.c.) de infección14, 15 , 16. sin embargo, no son adecuadas para el estudio de las funciones de los componentes superficiales de S. suis en meningitis directamente en el cerebro las vías i.v., i.p. y i.n. de infección. Se trata de una matriz extracelular de la biopelícula. Aunque la inoculación de la i.c. se utilizó para la infección por S. suis , el sitio de inyección precisa no se ha descrito en estos documentos. En cambio, las coordenadas estereotáxicas del sitio de inyección para la inoculación intracraneal subaracnoidea se ha descrito claramente en un anterior estudio17. Esto permitió el fácil reconocimiento del punto de inoculación y más simplista protocolo experimental. Además, la ruta subaracnoidea intracraneal de la infección mímico bacteriano entrada en sistema nervioso central de los senos paranasales o el oído medio17y la relación entre el oído medio y la meningitis causada por S. suis ha sido demostrado por Madsen et al18. Por otra parte, mediante la aplicación de la ruta subaracnoidea intracraneal de la infección en ratones, hemos demostrado que S. suis pequeño RNA rss04 contribuye a la meningitis en nuestro anterior estudio10.
En el presente estudio, se utilizó la ruta subaracnoidea intracraneal de la infección en ratones para investigar el papel de los biofilms en meningitis de los suis de S. . Infectaron a ratones con células planctónicas o células de estado de biofilm de S. suis por esta vía de infección. El análisis histopatológico y mayor expresión del ARNm de TLR2 y citoquinas del tejido cerebral de ratones inyectados con las células del biofilm estado indican claramente que el biofilm de S. suis contribuye a la meningitis.
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Protocol
Los experimentos de infección del ratón fueron aprobados por el laboratorio Animal seguimiento Comité de la provincia de Jiangsu, China y realizados en el laboratorio Animal centro de Nanjing Universidad (número de permiso: SYXK (Su) 2017-0007).
1. preparación de las bacterias
Nota: Cepa virulenta de S. suis serotipo 2 P1/7 fue aislada de un cerdo enfermo con meningitis19. P1/7 cepa fue cultivada en caldo Todd-Hewitt (THB, fórmula por litro del TP: corazón infusión, 3,1 g neopeptone, 20,0 g dextrosa, 2,0 g; cloruro de sodio, 2.0 g, fosfato disódico, 0,4 g; carbonato de sodio, 2,5 g) y plateado en el agar de Todd-Hewitt (THA, fórmula por litro de THA: Corazón infusión, 3,1 g; neopeptone, 20,0 g; dextrosa, 2.0 g; cloruro de sodio 2,0 g; fosfato disódico, 0,4 g; carbonato de sodio, 2,5 g; Agar, 15,0 g) a 37 ° C y 5% CO2.
- Colección de tensión P1/7 células planctónicas
- Recoger 5 mL de las células planctónicas de la cultura de fase logarítmica media (OD600= 0,6), centrifugar durante 3 min a 8000 g × y luego lavar 3 veces con PBS.
- Resuspender las células con 5 mL de glicerol al 25% en THB, alícuota en tubos de 5 y luego almacenar a-80 ° C.
- Colección de tensión P1/7 células de estado de biofilm
- Tomar 20 mL de una cultura de la noche a la mañana y añadir a 180 mL de TP fresco; dividir la cultura diluida en 10 placas redondas igualmente y luego poner las placas en una incubadora a 37 ° C en 5% CO2 durante 24 h.
- Después de la incubación, agitar la placa suavemente para resuspender las bacterias que no se han adherido a la placa y luego desechar el sobrenadante por aspiración.
Nota: Agitar la placa suavemente y evitar Resuspender el sedimento. - Añadir 5 mL de PBS para cosechar las células estado de biofilm, Resuspender el sedimento completamente y luego transferir la muestra a un tubo nuevo.
- Someter a ultrasonidos las células estado de biofilm de la última etapa con los siguientes parámetros: 60 W, 4 ciclos, 5 s s on y 10 off.
- Centrifugar durante 3 min a 8000 g × y guarde el sobrenadante a-80 ° C.
Nota: El sobrenadante puede contener componentes de biofilm y puede ser utilizado para resuspender las bacterias del biofilm antes de la infección como se describe en la experimentación animal (paso 3). - Resuspender el sedimento con 10 mL 25% de glicerol en TP y luego almacenar las células de estado biofilm a-80 ° C.
2. Análisis análisis de microscopia electrónica (SEM)
- Fijar el biofilm recogidos estado células y células planctónicas con paraformaldehído al 4% para 12-24 h a 4 ° C.
- Enjuagar las muestras rápidamente con agua destilada y deshidratan las muestras secuencialmente con un aumento de la concentración de etanol (25%, 50%, 70%, 90% y 100%) por 30 min en cada solución.
- Se adhieren a las muestras secadas a titulares con cinta de doble cara de metal y finalmente los abrigo en un evaporador con oro y paladio.
- Observar las muestras por un microscopio electrónico de barrido usando los siguientes parámetros: EHT (Extra alta tensión) = 10 kV; WD (distancia de trabajo) = 7.0 o 8.0 mm; Magnificación = 5000 ×; A la señal = SE1.
3. el animal experimenta
- Uso de SPF de 6 semanas de edad hembra ratones BALB/c en este estudio. Infectar a todos los ratones por la ruta subaracnoidea intracraneal de la infección cuyo sitio de la inyección es 3.5mm situado rostral de la bregma. Las coordenadas estereotáxicas del sitio de inyección fueron descritas claramente por Chiavolini et al17.
- Para el análisis histopatológico, infectar a dos grupos de ratones (5 ratones por grupo) utilizando células planctónicas o biofilm estado las células a una dosis de 3 x 107 unidades formadoras de colonias (UFC), y otro 5 ratones fueron inyectados con PBS como un control.
- Para la detección de expresión del mRNA de TLR2 y citoquinas en el cerebro, infecta a dos grupos adicionales de ratones (6 mice por grupo) utilizando células planctónicas o biofilm estado células a una dosis de 3 × 107 CFU.
- Determinar el número de bacterias viables por diluciones seriadas a THA de la galjanoplastia.
- Eutanasia a todos los ratones a la infección después de 12 h para futuras investigaciones.
Nota: El glicerol en el medio de stock se debe retirar antes de la infección. Células planctónicas y biofilm células de estado recuperadas de-80 ° C se lavan 3 veces con PBS. Luego, las células planctónicas se resuspendió con PBS y diluidas en la dosis apropiada para la infección; biofilm estado las células se resuspendió con el sobrenadante almacenado (de paso 1.2.5) y diluidas en la dosis apropiada para la infección. El volumen de infección no debe ser más de 50 μl.
- Detección de la expresión del mRNA de TLR2 y citocinas en el tejido cerebral
- Extraer el ARN total de tejido cerebral utilizando un kit de extracción de RNA.
- Para cada ratón, utilice tejidos de todo el cerebro para la extracción de RNA. Tejido de todo el cerebro se dividen en 5 tubos. Toman al tejido cerebral de 100 mg y añadir 1 mL de solución de lisis para cada tubo que contiene la matriz lisis suministrada con el kit.
- Procesar el tubo en un homogeneizador para 40 s con un valor del 6.0 y, a continuación, centrifugar el tubo a 12000 x g y 4 ° C durante 5 minutos.
- Después de la centrifugación, transferir la fase superior a un tubo nuevo de microcentrífuga.
- Incubar la muestra transferida por 5 min a temperatura ambiente; Añadir 300 μL de cloroformo, vortex por 10 s y luego incubar 5 min a temperatura ambiente.
- Centrifugar el tubo a × 12000 g y 4 ° C por 5 min la transferencia de la fase superior a un tubo nuevo.
- Añadir 500 μl de etanol absoluto frío al tubo, antes de invertir por 5 veces y luego almacenar la muestra a-20 ° C durante al menos 1 h.
- Centrifugar el tubo a × 12000 g y 4 ° C por 15 minutos y eliminar el sobrenadante. Lavar el pellet con 500 μl de etanol 75% frío libre de Rnasa H2O.
- Eliminar el etanol, aire seco el precipitado durante 5 minutos a temperatura ambiente y el ARN resuspender en 100 μl de libre de Rnasa H2O.
- Incubar el ARN durante 5 minutos a temperatura ambiente y determinar la concentración de RNA utilizando un equipo bioanalyzer de RNA.
- Realizar síntesis de cDNA, incluyendo eliminación de DNA genómico (gDNA), utilizando un termociclador con un kit de reactivo de transcripción inversa (RT).
- Añadir 1 μg de RNA a un tubo conteniendo 2 μl de tampón de eliminación de 5 x gDNA, 1 μl de enzima de gDNA eliminación y libre de Rnasa H2O hasta que el volumen alcanza 10 μl. Incubar durante 2 min a 42 ° C.
- Añadir 10 μl de la master mix (mezcla de 1 μl de enzima RT I, 1 μl de mezcla de Primer RT, 4 μL de 5 x Buffer 2 y 4 μL de Rnasa free H2O) a la solución de reacción desde el último paso y luego mezclar suavemente. Proceder inmediatamente con la reacción de RT: 37 ° C por 15 min y luego 85 ° C durante 5 s.
- Realizar análisis cuantitativo de PCR (RT-qPCR) en tiempo real utilizando una máquina de PCR en tiempo real con un kit SYBR RT-qPCR. Añadir 10 μl de 2 x enzima, 0,8 μl de cebador forward, 0,8 μl de cebador reverso, 0,4 μL de 50 x ROX referencia tinte II, 2 μl de cDNA plantilla y libre de Rnasa H2O hasta un volumen total de 20 μl.
- Ejecutar cada muestra por triplicado usando los siguientes parámetros térmicos: 30 s a 94 ° C, seguido de 40 ciclos de 5 s a 95 ° C y 34 s a 60 ° C, con una etapa final de 15 s a 95 ° C, 1 min a 60 ° C y 15 s a 95 ° C. Cebadores para RT-qPCR se enumeran en la tabla 1. Genes de limpieza B2m y 18s rRNA fueron utilizados como los controles internos.
- Calcular el cambio relativo fold basado en el método 2-ΔΔCt .
- Extraer el ARN total de tejido cerebral utilizando un kit de extracción de RNA.
-
Observación de secciones histológicas
- Después de la fijación con formalina al 10% en 24 h, reconstruir el tejido cerebral fijo en tamaños adecuados de piezas de tejido en 2-3 mm.
- Poner las piezas de tejido en un cassette inclusión y sumerja en una solución fijadora nueva para la deshidratación con un deshidratador de vacío automático.
- Sacar el tejido fijo y deshidratar secuencialmente en el aumento de las concentraciones de etanol (70%, 80%, 95%, 95% y 100%) por 30 min en cada solución.
- Transparentize la muestra con xileno durante 15 min, sumergirla en parafina líquida a 60 º C durante 90 minutos y luego incrustar usando una máquina de empotrar.
- Cortar el tejido de bloque embebido de parafina 3 μm, azulejo de la rebanada en agua a 45 ° C y luego secar al aire.
- Incubar la sección durante 3 h a 60 ° C, método de la mancha con la hematoxilina y eosina (HE) y sellarlo con la goma neutral.
- Observar los cambios histopatológicos del cerebro con un microscopio óptico. Se utilizó un sistema de clasificación de cuatro puntos para evaluar cambios histológicos. Usar una prueba t para el análisis estadístico.
Congestión/hemorragia: ausente, puntuación 0; pequeña área de congestión focal/hemorragia, puntuación 1; gran zona de congestión/hemorragia focal o múltiples sitios de pequeña área de congestión focal/hemorragia, puntuación de 2; hasta tres lugares de gran congestión focal/hemorragia, puntuación de 3; difuso de congestión/hemorragia, puntuación 4.
Necrosis: ausente, puntuación 0; necrosis focal, puntuación de 1; difunden aparición de células necróticas de 1-10, puntuación 2; focos de necrosis confluente, puntuación de 3; extensa necrosis confluente, puntuación 4.
Infiltración de células inflamatorias: ausente, puntuación 0; infiltraciones de pocos y focal, puntuación 1; infiltración multifocal o infiltraciones con formación de agregados, puntuación de 2; hasta tres agregados, puntuación de 3; y agregados más de cuatro, 4.
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Representative Results
Análisis de SEM fue realizada para examinar la formación de biopelículas en las condiciones experimentales. Como se muestra en la figura 1, existe una diferencia significativa en la formación de biopelículas entre células planctónicas (figura 1A) y biofilm estado células (figura 1B). Análisis de SEM demostraban que las bacterias del biofilm en grupos y capas y múltiples fueron encajonados en la matriz extracelular, mientras que las bacterias planctónicas fueron mucho menos densa y principalmente dispersos individualmente.
Los componentes de la matriz extracelular de los biofilms, como ADN, son capaces de provocar respuestas inflamatorias host y producción del cytokine. Desde TLR2 y citoquinas CCL2, IL-6 y TNF-α participan en respuestas inflamatorias cerebrales relacionadas con meningitis según anteriores estudios10,11,20, el mRNA se comparó la expresión de estos genes en vivo de ratones infectados con células planctónicas y aquellos infectados con células estado de biofilm. Esto se realizó para explorar el efecto de los biofilms en la respuesta inflamatoria en el tejido cerebral de ratón. Como se muestra en la figura 2, en la infección después de 12 h, la expresión de TLR2, CCL2, IL-6, y TNF-α de cerebros de ratones infectados fue significativamente mayor para las celdas de estado de biofilm en comparación con las células planctónicas.
Ratones infectados con bacterias de la biopelícula mostraban signos mucho más graves de meningitis (postura rígida, ataxia y convulsiones) que las personas infectadas con bacterias planctónicas. Examinación histológica del tejido de cerebro de ratones infectados con la cepa de S. suis que P1/7 mostró congestión/hemorragia, necrosis y la infiltración celular inflamatoria en las meninges, corteza cerebral, ventrículos o diencéfalo (figura 3) . En comparación con ratones infectados con bacterias planctónicas (figura 3E-H), a las 12 h se observaron cambios patológicos post-infección, mucho más graves en el tejido cerebral de ratones infectados con bacterias de la biopelícula (figura 3A-D), incluyendo grandes áreas de congestión de la hemorragia, necrosis o la infiltración celular inflamatoria intensa. El brutos cambios patológicos en el cerebro de ratones infectaron con plancton y las bacterias del biofilm se registró en la tabla 2. Se observaron cambios patológicos ni síntomas neurológicos de los ratones inyectados con PBS. Tomados en conjunto, estos datos muestran claramente que biopelículas de S. suis contribuyen a la inducción de la meningitis.
Figura 1: imágenes de SEM de tensión P1/7 células planctónicas y biofilm estado. Las bacterias fueron cultivadas en medio TP. Análisis SEM demostró que las células planctónicas (A) eran mucho menos densa y dispersa principalmente individualmente, mientras que bacterias de la biopelícula (B) fueron agrupadas en grupos y capas y múltiples fueron encajonados en la matriz extracelular. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: Biofilms activar la expresión de mRNA de CCL2, IL-6, TNF-α y TLR2 en tejido de cerebro de ratón en vivo. Seis ratones BALB/c por grupo cada uno fueron inyectados por vía subaracnoidea intracraneal de la infección con 3 × 107 UFC de células planctónicas o biofilm estado. Ratones fueron sacrificados en la infección después de 12 h. Los resultados se presentan como el doble cambio de expresión del mRNA en biofilm estado ratones infectados de la célula en comparación con ratones infectados con células planctónicas. (A) el gen de la que B2m fue utilizado como el gen de referencia; (B) el gene 18s rRNA fue utilizado como el gen de referencia. Un impar t-test se utilizó para el análisis estadístico. ** p ≤0. 01, y * p ≤0. 05. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3: el análisis histológico del tejido cerebral de ratones infectados con la cepa P1/7 bacterias planctónicas y biofilm estado. A-D, las muestras de cerebro de ratones infectados con bacterias de la estado del biofilm; Muestras de E-H, cerebro de ratones infectados con bacterias planctónicas. A, B, E y F: meninges y la corteza cerebral; C y G: ventrículos; D y H: diencéfalo. Δ, congestión/hemorragia; □, necrosis; ○: infiltración inflamatoria de la célula. Magnificación = 200 X; barra de escala = 100 μm. haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
| Primer nombre | Secuencia (5' - 3') | Símbolo del gene |
| IL-6 hacia adelante | CTTCCATCCAGTTGCCTTCT | Il6 |
| Inversa de la IL-6 | CTCCGACTTGTGAAGTGGTATAG | Il6 |
| TLR2 adelante | CACTATCCGGAGGTTGCATATC | Tlr2 |
| TLR2 inversa | GGAAGACCTTGCTGTTCTCTAC | Tlr2 |
| CCL2 adelante | CTCACCTGCTGCTACTCATTC | Ccl2 |
| CCL2 inversa | ACTACAGCTTCTTTGGGACAC | Ccl2 |
| TNF-α hacia adelante | TTGTCTACTCCCAGGTTCTCT | TNF |
| Inversa de TNF-α | GAGGTTGACTTTCTCCTGGTATG | TNF |
| Β2m adelante | GGTCTTTCTGGTGCTTGTCT | B2m |
| Β2m inversa | TATGTTCGGCTTCCCATTCTC | B2m |
| de 18 hacia adelante | GTAACCCGTTGAACCCCATT | 18S rRNA |
| 18 años atrás | CCATCCAATCGGTAGTAGCG | 18S rRNA |
Tabla 1: Cebadores para RT-qPCR.
Tabla 2: los brutos cambios histopatológicos en el cerebro de ratones infectados con S. suis tensión P1/7. Un sistema de clasificación de cuatro puntos fue utilizado para evaluar los cambios histológicos, como se describe en el protocolo sección 3.3.7. La puntuación total se calculó como la suma de puntuaciones de diferentes cambios histopatológicos. Se calculó el promedio como la puntuación total de ratones. Un impar t-test se utilizó para el análisis estadístico. ** p ≤0. 01.
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Discussion
La ruta subaracnoidea intracraneal de la infección descrita aquí tiene evidentes ventajas sobre otras vías de infección. Permite a los investigadores a estudiar la interacción de la bacteria huésped y el efecto de componentes bacterianos en anfitrión inmunorespuestas directamente en el cerebro, que imitan la entrada bacteriana en el sistema nervioso central. Así, esta ruta de infección se puede extender para investigar los mecanismos de la meningitis causada por otras bacterias. Además, también puede ser utilizado para probar la eficacia de los medicamentos contra la meningitis bacteriana.
Para obtener buenos resultados usando este modelo, los siguientes pasos críticos son explícitos. Formación de biopelículas debe ser examinada bajo condiciones experimentales. En el presente estudio, se examinó mediante el análisis de microscopio electrónico de barrido. Otros métodos también pueden utilizarse para examinar la formación de biopelículas, como el cultivo de tejidos placa tubo y método método21. Un día antes de la infección, alícuotas de células planctónicas y las células de estado biofilm deben descongelarse de-80 ° C para determinar la UFC. Al día siguiente, las bacterias deben diluirse la dosis apropiada según la UFC para la infección. El grupo de control infectado mock inyectado con PBS deben ser incluidos y los ratones del grupo control infectado mock no debe exhibir ninguna manifestación durante la duración del experimento de la infección. Diferentes cepas pueden tener diferentes dosis infecciosas, por lo que recomienda un experimento preliminar para determinar la dosis apropiada de infecciosa. En el presente estudio, se utilizó una dosis de 3 × 107 UFC de infección basado en nuestra experiencia preliminar. Esta dosis de biofilm de bacterias fue capaz de inducir graves signos de meningitis y muerte en todos los 5 ratones 48 h después de la infección en el experimento preliminar.
La interrupción de la sangre-cerebro o barreras flúidas sangre-cerebroespinal por S. suis son un paso importante en la causa de la meningitis22,23,24. La ruta subaracnoidea intracraneal de la infección no es conveniente para la evaluación de la capacidad de S. suis para romper estas barreras. Otras rutas de infección, i.p., i.v. o i.n., pueden utilizarse para lograr este objetivo.
Aquí, en primer lugar demostramos que el biofilm de S. suis contribuye a la inducción de la meningitis por la ruta subaracnoidea intracraneal de la infección. Este modelo de infección no sólo ayuda a comprender aún más los mecanismos de S. suis meningitis pero también es adecuado para el estudio de la patogenia de la meningitis causada por otras bacterias y la eficacia de nuevos medicamentos contra la meningitis bacteriana.
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Disclosures
Los autores no tienen nada que revelar.
Acknowledgments
Este trabajo fue financiado por becas de la investigación clave y programa de desarrollo de China [2017YFD0500102]; la Fundación Nacional de Ciencias naturales de China [31572544]; el laboratorio estatal clave de Biología veterinaria etiológico [SKLVEB2016KFKT005]; la agricultura de Shanghai aplica programa de desarrollo de tecnología, China [G2016060201].
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Todd Hewitt Broth(THB) | Becton, Dickinson and Company | DF0492078 | Dissolve 30 g of the powder in 1 L of purified water. Autoclave at 121° for 15 min. |
| Agar | DSBIO | 16C0050 | Dissolve 15 g of the powder in 1 L of THB. Autoclave at 121° for 15 min. |
| Milli-Q Reference Water Purification System | Merck KGaA | Z00QSVCUS | Without Dnase/ Rnase |
| NaCl | Tianjin Kemiou Chemical Reagent Co., Ltd | 10019318 | Dissolve 8 g NaCl, 0.2 g KCl, 1.42 g Na2HPO3 , 0.27 g KH2PO4 in 1 L of purified water. Autoclave at 121° for 15 min. Use KOH to adjust pH to 7.4. |
| Na2HPO3 | Xilong Scientific Co., Ltd | 9009012-01-09 | Dissolve 8 g NaCl, 0.2 g KCl, 1.42 g Na2HPO3 , 0.27 g KH2PO4 in 1 L of purified water. Autoclave at 121° for 15 min. Use KOH to adjust pH to 7.4. |
| KCl | Xilong Scientific Co., Ltd | 9009017-01-09 | Dissolve 8 g NaCl, 0.2 g KCl, 1.42 g Na2HPO3 , 0.27 g KH2PO4 in 1 L of purified water. Autoclave at 121° for 15 min. Use KOH to adjust pH to 7.4. |
| KH2PO4 | Xilong Scientific Co., Ltd | 9009019-01-09 | Dissolve 8 g NaCl, 0.2 g KCl, 1.42 g Na2HPO3 , 0.27 g KH2PO4 in 1 L of purified water. Autoclave at 121° for 15 min. Use KOH to adjust pH to 7.4. |
| KOH | Xilong Scientific Co., Ltd | 9009014-01-09 | Dissolve 8 g NaCl, 0.2 g KCl, 1.42 g Na2HPO3 , 0.27 g KH2PO4 in 1 L of purified water. Autoclave at 121° for 15 min. Use KOH to adjust pH to 7.4. |
| Glycerol | Sionpharm Chemical Reagent Co., Ltd | 10010618 | Diluted with equal volumu of purified water, autoclave at 121° for 15 min |
| 4% paraformaldehyde | Sionpharm Chemical Reagent Co., Ltd | 80096675 | |
| 25% Glutaraldehyde | Sionpharm Chemical Reagent Co., Ltd | 30092436 | 10-fold diluted with purified water for fixation. |
| Ethanol | Sionpharm Chemical Reagent Co., Ltd | 10009218 | |
| Chloroform | Sionpharm Chemical Reagent Co., Ltd | 10006818 | |
| Spctrophotometre | DeNovix Inc. | DS-11+ | |
| Ultrasound cell crusher | NingBo Scientz Biotechnology Co.,Ltd | JY96-IIN | |
| Centrifuge | Hitachi Koki Co., Ltd | CT15RE | |
| Refrigerator | Aucma Co., Ltd | DW-86L500 | |
| Scanning electron microscope | Zeiss | EVO-LS10 | |
| FastRNA Pro Green Kit | MP Biomedicals | #6045-050 | |
| FastPrep-24 Instrument | MP Biomedicals | 116005500 | |
| Instrument for PCR | SensoQuest GmbH | 1124310110 | |
| QuantStudio 6 Flex | Thermo Fisher Scientific | 4485689 | |
| SYBR Premix Ex Taq II | Takara Biomedical Technology (Beijing) Co., Ltd | RR820A | |
| PrimeScript RT reagent kit with gDNA Eraser | Takara Biomedical Technology (Beijing) Co., Ltd | RR047A | |
| Fully Enclosed Tissue Processor | Leica Biosystems Nussloch GmbH | ASP200S | |
| Heated Paraffin Embedding Module | Leica Biosystems Nussloch GmbH | EG1150H | |
| Semi-Automated Rotary Microtome | Leica Biosystems Nussloch GmbH | RM2245 | |
| Water bath for paraffin sections | Leica Biosystems Nussloch GmbH | HI1210 | |
| Autostainer XL | Leica Biosystems Nussloch GmbH | ST5010 | |
| Agilent 2100 | Agilent Technologies | G2939A | |
| Optical microscope | Olympus | BX51 |
References
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