Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

المطبوعة جليكان الصفيف: تقنية حساسة لتحليل مرجع تعميم الأجسام المضادة الكربوهيدرات في الحيوانات الصغيرة

Published: February 14, 2019 doi: 10.3791/57662
Automatic Translation
*1, *2,3, 3, 2, 2, 2, 2, 2, 2,4, 1, 1,5
1Infectious Pathology and Transplantation Division, Bellvitge Biomedical Research Institute (IDIBELL), 2Shemyakin-Ovchinnikov Institute of Bioorganic Chemistry (IBCh), Russian Academy of Sciences, 3Semiotik LLC, 4Auckland University of Technology, 5Intensive Care Department, Bellvitge University Hospital
* These authors contributed equally

Summary

ويبين هذا العمل إمكانات تكنولوجيا صفيف (PGA) جليكان المطبوعة لتحليل تعميم الأجسام المضادة الكربوهيدرات في الحيوانات الصغيرة.

Abstract

وكثيراً ما يرتبط مرجع تعميم الأجسام المضادة الكربوهيدرات فرد معين مع حالتها المناعية. لا يحدد الشرط محصنة ضد كل النجاح في مكافحة إشارات التهديد المحتملة الداخلية والخارجية فحسب، بل أيضا يمكن أن يكون وجود نمط معين لتعميم الأجسام المضادة-جليكان (وعلى اختلاف مستوى المصلية) علامة هامة لظهور وتطور بعض الحالات المرضية. وهنا، يمكننا وصف منهجية المستندة إلى الشبكة الصفيف جليكان طبعت التي تتيح الفرصة لقياس مئات أهداف جليكان مع حساسية عالية جداً؛ استخدام الحد أدنى من عينة، وحيوانات موجودة عند صغيرة مشتركة تقييد (الجرذان، الفئران، الهامستر، إلخ) وتستخدم كنماذج لتناول الجوانب المتعلقة بالأمراض التي تصيب الإنسان. وكمثال ممثل لهذا النهج، نعرض النتائج المستخلصة من تحليل مرجع الأجسام المضادة الطبيعية-جليكان في الفئران بالب/ج. علينا أن نظهر أن الماوس بالب/ج كل المشاركين في الدراسة، وعلى الرغم من كونها متطابقة وراثيا وصيانتها تحت نفس الظروف، تطور نمط معين من الطبيعي الكربوهيدرات المضادة الأجسام المضادة. ويدعي هذا العمل لتوسيع نطاق استخدام تكنولوجيا الشبكة للتحقيق مرجع (الخصائص) ومستويات تداول الكربوهيدرات المضادة الأجسام المضادة، سواء في الصحة أو أثناء أي حالة مرضية.

Introduction

الأجسام المضادة تلعب دوراً مركزياً في دفاعنا ضد غزو العوامل الممرضة بتحييد الفيروسات1،2 والبكتيريا2،3، مباشرة قبل تفعيل4،نظام مكمل5 وتعزيز البلعمه6. بالإضافة إلى ذلك، عناصر أساسية في استهداف السرطان والقضاء على الخلايا الخبيثة7، وصيانة التوازن8،9.

يمكن أن تؤدي أمراض المناعة الذاتية والالتهابات10 والسرطان11اضطرابات في الجهاز المناعي. ومن الناحية المثالية الطلب جميع هذه الحالات المرضية تشخيص سريع لإجراء معالجة فعالة. في حالة اضطرابات المناعة الذاتية، والمصلية وجود الأجسام المضادة في معظم الحالات يكون مؤشرا للتشخيص للمناعة الذاتية10،12. هذه الأجسام المضادة التي تتفاعل مع سطح الخلية وخارج الخلية أوتوانتيجينس، وأنها غالباً ما تكون موجودة لسنوات عديدة قبل العرض التقديمي من أمراض المناعة الذاتية10،12. القصور المناعي والسرطان ويتم أيضا تشخيص مع اختبارات الدم أما قياس مستوى العناصر المناعية مثل الأجسام المضادة، أو نشاط وظيفي11.

تحديد المرجع لتعميم الأجسام المضادة والمستويات المصلية لها أهمية قصوى لتعيين تشخيص وتقييم التقدم لجميع الحالات المرضية المذكورة. وقد أثبتنا سابقا إمكانات تقنية الشبكة لتحليل تعميم أجسام مضادة في مختلف الأنواع الحيوانية13–16، تقليل استخدام كميات كبيرة من العينات المصلية، وتجنب المشكلة المرتبطة بالأجسام المضادة ه17 والتنميط الفائق مما يسمح مرجع واسعة من الأجسام المضادة15.

تحديدكم المستندة إلى جليكان أساسا تخضع، من بين عوامل أخرى، بالأصل والإنتاج من الكربوهيدرات، والتي تحدد بتقارب وملزم من يغاندس15،،من1819،20 ،21. يمكن وضع على أساس جليكان تحديدكم في التعليق الجزئي (المجالات الخرز الصغير)15،،من2122 أو الأسطح المسطحة المنشط15،،من2122، ،من 2324. وتشمل الأخيرة أليسا (الأكثر تقليدية من هذه الأساليب) والشبكة. ليس هناك الكثير من البيانات التي تقارن هذه المنهجيات في نفس الإعداد التجريبية15،25،،من2627. أننا قد سبق مقارنة فعالية والانتقائية لهذه تحديدكم للأجسام المضادة-جليكان الشخصية في عينات البلازما البشرية الفردية15. لبعض الأجسام المضادة مثل تلك المجموعة الدم المضادة-A/B الاستهداف، جميع تحديدكم يمكن الكشف عنها بدلالة إحصائية وأنهم ارتباطاً إيجابيا مع بعضها البعض15،،من1821. وفي الوقت نفسه، أساسا تم الكشف عن الأجسام المضادة-P1 بالشبكة مع أعلى سلطة التمييزية، وكان هناك أي ارتباط في القرارات المقدمة من مختلف تحديدكم المستندة إلى جليكان15،18، 21-هذه الاختلافات بين أساليب كانت تتعلق أساسا بجسم/مستضد جليكان ونسبة التوجه15. أليسا وتعليق الصفائف أكثر عرضه للربط غير محدد من الشبكة نظراً لوجود فائض مستضد عن الأجسام المضادة في هذه الأساليب15. بالإضافة إلى ذلك، توجه جليكانس في الشبكة أكثر تقييداً من صفائف أليسا وتعليق15. أليسا مناسب عند الدراسة ويشمل فريق محدود من جليكانس. جنبا إلى جنب مع صفائف تعليق، يقدم أليسا أوسع من المرونة فيما يتعلق بإعادة الفحص. الشبكة مناسبة استثنائية لاكتشاف نهج15،،من1821،28. وعلى الرغم من هذه المزايا الواضحة وعيوب، يمكن استخدامها تحديدكم المذكورة ثلاثة لدراسة الجوانب المختلفة لتفاعلات جسم جليكان. والهدف النهائي من هذه الدراسة واحد سيتم توجيه اختيار منهجية أكثر ملاءمة.

هذا العمل يهدف إلى توسيع نطاق استخدام تكنولوجيا الشبكة لتحليل مرجع تعميم الأجسام المضادة-جليكان في الحيوانات الصغيرة. ونتيجة لممثل، نقدم هنا بروتوكولا مفصلة لتقييم مرجع الأجسام المضادة الكربوهيدرات الطبيعية في الكبار بالب/ج الفئران بالشبكة.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1-جليكوتشيبس الإنتاج

  1. إعداد ميكرواري
    1. طباعة جليكانس (50 مم) والسكريات (10 ميكروغرام/مل) في الفوسفات 300 مم مخزنة المالحة (PBS، الأس الهيدروجيني 8.5) الساعة 6 وإنشاء نسخ متماثلة على الشرائح الزجاجية N-هيدروكسيسوكسينيميدي-ديريفاتيزيد، باستخدام غير-اتصل أرايير الروبوتية (انخفاض حجم ~ 900 رر). تحتوي كل شريحة على 4 كتل مختلفة من الصفيف الفرعي (الشكل 1A، ألوان) كرر 6 مرات. كل مجموعة فرعية واحدة تتكون من 112 جليكان مختلف المواقع، بما في ذلك عناصر التحكم (8 صفوف أعمدة × 14) (الشكل 1B).
      ملاحظة: يتم توفير المعلومات المتصلة جليكان في التكميلية الجدول 1. مكتبة جليكان المستخدمة للرقائق الطباعة هو نتيجة لجهد طويل الأجل الاصطناعية فريق ايبش؛ وترد أمثلة للتوليف في المنشورات ذات الصلة29،30،،من3132،،من3334،35،36 ،،من3738. مكتبة جليكان شمل المستضدات فصيلة الدم وبعض من أكثر تكراراً oligosaccharides الطرفية، فضلا عن زخارف الأساسية من الثدييات مرتبطة N و O glycoproteins و glycolipids، المستضدات الكربوهيدرات المرتبطة بالورم، و السكريات من البكتيريا المسببة للأمراض.
    2. احتضان الشرائح في مربع الرطوبة (الرطوبة النسبية ~ 70%) في درجة حرارة الغرفة (25 درجة مئوية) ح 1.
    3. حظر [ميكروارس]: احتضان الشرائح ل 1.5 ح مع المخزن المؤقت حظر في درجة حرارة الغرفة (حمض البوريك 100 مم، 25 مم ايثانولامين، 0.2% (v/v) توين-20 في الماء عالي النقاوة).
    4. أغسل جليكوتشيب بالماء عالي النقاوة والجافة عن طريق الجو.
  2. مراقبة الجودة جليكوتشيب
    1. تحليل [ميكروارس] اثنان من كل دفعة باستخدام الحل 1 ملغ/مل من إعداد معقدة الغلوبولين المناعي (CIP، التي تحتوي على IgG، IgM و IgA)، 10 ميكروغرام/مل الحل من بيوتينيلاتيد الماعز المناعية المضادة الإنسان كجسم ثانوي (IgM + IgG + إيغا)، تليها 1 ميكروغرام/مل حل المتقارن streptavidin نيون المقابلة (عن طريق بروتوكول الموصوفة أدناه، راجع الخطوة 2).
    2. فحص وتحليل جليكوتشيبس (راجع الخطوة 3، تحليل لمجموعة جليكان).
    3. استخدام ميكرواري دفعات مع رقاقة داخلها وبينها ترابط أعلى من 0.9.

2. تقنية المصفوفة جليكان

  1. إعداد المحاليل التالية (في الماء عالي النقاوة) وتخزينها في درجة حرارة الغرفة (25 درجة مئوية):
    • المخزن المؤقت-1:1 % (w/v) البقري ألبومين المصل (BSA) في برنامج تلفزيوني، 1% (v/v) توين-20 و 0.01% (w/v) نان3
    • المخزن المؤقت-2:1 % (w/v) جيش صرب البوسنة في برنامج تلفزيوني، 0.1% (v/v) توين-20 و 0.01% (w/v) نان3.
    • المخزن المؤقت-3: 0.1% (v/v) توين-20 في برنامج تلفزيوني.
    • المخزن المؤقت-4: 0.001% (v/v) توين-20 في برنامج تلفزيوني.
  2. إعداد جليكوتشيب والعينة
    1. وضع مربع التخزين مع الشرائح على الطاولة حتى تصل إلى درجة حرارة الغرفة (25 درجة مئوية).
      ملاحظة: استخدام قفازات مطاط خالية من مسحوق. يجب معالجته في جليكوتشيب في الجزء السفلي من الشريحة الزجاجية، حيث يقع الرمز الشريطي. الرمز الشريطي سوف تساعدك على التعرف على الجانب الأيمن، تجنب الاتصال مع السطح حيث تطبع جليكانس.
    2. فتح المربع وتأخذ في جليكوتشيب ووضعه في غرفة الحضانة (25 درجة مئوية)، الفعل مكيفة مع ورق الترشيح الرطب للحفاظ على رطوبة ثابتة داخل الدائرة.
    3. ومن ناحية أخرى، يؤدي إلى تمييع المصل الفئران مع المخزن المؤقت-1 (01:20) في أنابيب 1.5 مل. مجانسة الحل المصل (5 ق) مع خلاط دوامة.
      ملاحظة: وحدة التخزين اللازمة لتغطية تماما على سطح جليكوتشيب واحد حوالي 1 مل.
    4. بعد التجانس، احتضان المصل المخفف في 37 درجة مئوية لمدة 10 دقيقة في حمام مائي لتفادي تجميع الغلوبولين المناعي. الطرد المركزي هذه الأنابيب لمدة 3 دقائق 10 آلاف س ز و 25 درجة مئوية، وجمع المادة طافية وتجاهل أي مادة سرع.
    5. مكان جليكوتشيب بعناية في غرفة الحضانة. تبني عليه لمدة 15 دقيقة عند 25 درجة مئوية مع 1 مل من المخزن المؤقت-3 للقضاء على أي مواد متبقية على السطح جليكوتشيب.
    6. اضغط جليكوتشيب في وضع عمودي ورواش أنه مع بعض قطرات من المخزن المؤقت-3 استخدام ماصة باستور بلاستيك. بعناية إزالة المخزن المؤقت من السطح جليكوتشيب باستخدام ورق الترشيح.
  3. رد: الأجسام المضادة ملزمة
    1. مكان جليكوتشيب في غرفة الحضانة. نشر العينة المصل المخفف على سطح جليكوتشيب باستخدام ميكروبيبيتي. احتضان بالانفعالات المداري (30 لفة في الدقيقة) عند 37 درجة مئوية ل h. 1.5 ضمان أن كل منطقة جافة السطح جليكوتشيب تغطيها العينة المصل المخفف باستخدام تلميح الماصة.
    2. قم بإزالة أي عينة الزائدة وتزج في جليكوتشيب لمدة 5 دقائق في المخزن المؤقت-3 عند 25 درجة مئوية. ثم نقل جليكوتشيب إلى حاوية مع المخزن المؤقت-4 (5 دقائق) وأخيراً يغسل (5 دقيقة) جليكوتشيب مع الماء عالي النقاوة. الطرد المركزي جليكوتشيب لمدة 1 دقيقة على 175 × ز و 25 درجة مئوية لإزالة السائل.
  4. الكشف: جسم الثانوي
    1. مكان جليكوتشيب في غرفة الحضانة. تنتشر على سطح جليكوتشيب حلاً (5 ميكروغرام/مل) من الماعز المضادة الماوس (IgG + IgM) يضاف إلى البيوتين في المخزن المؤقت-2. احتضان بالانفعالات المداري (30 لفة في الدقيقة) عند 37 درجة مئوية ح 1.
    2. إزالة الجزء غير منضم وكرر الخطوات الغسيل.
    3. بعد الطرد المركزي، احتضان جليكوتشيب في الظلام عند 25 درجة مئوية لمدة 45 دقيقة (30 لفة في الدقيقة) مع 2 ميكروغرام/مل الحل المسمى fluorochrome streptavidin المقابلة (في المخزن المؤقت-2).
    4. في الظلام، إزالة الجزء غير منضم وكرر الخطوات الغسيل.
    5. جاف جليكوتشيب عن طريق الجو.
      ملاحظة: ينبغي أن تفحص جليكوتشيب وقت ممكن. ولكن إذا كان من المستحيل أن تفحص مباشرة بعد تلطيخ، جليكوتشيبس يمكن تخزينها في مكان بارد وجاف في الظلام.

3-تحليل صفيف جليكان

  1. مسح الصفيف
    1. إجازة في جليكوتشيب على الطاولة حتى تصل إلى درجة حرارة الغرفة في الظلام. في نفس الوقت، قم بتشغيل الماسح الضوئي الشريحة والليزر (الطول الموجي الإثارة من 633 نانومتر).
    2. عقد في ميكرواري، الشريحة جليكوتشيب في الفتحة حتى أنه يمس ظهره.
    3. مسح جليكوتشيب ("مسح سهلة التشغيل")، وحفظ المسح الضوئي ". ملف TIFF ".
  2. تحديد حجم الصفيف
    1. تحديد حجم الصفيف باستخدام "نظام التحليل سكاناراي". فتح سابقا الصور الممسوحة ضوئياً، بواسطة النقر فوق "ملف" في "مجموعة تكوين & ملف" في "النافذة الرئيسية" (الشكل 1B-D)
    2. تحميل قالب ملف الصفيف المقابلة في شكل غال (التصرف جليكانس المطبوعة على الشريحة الزجاجية) (الشكل 1).
    3. ضبط قالب غال بمحاذاة الصفيف (الشبكات) مع البقع في الصورة بعناية وبدء القياس الكمي (الشكل 1).
    4. حدد معلمات القياس الكمي:
      • نوع القياس الكمي: تشغيل "سهل ضليع في الرياضيات".
      • الأسلوب الكمي: ثابت الدائرة
      • البحث التلقائي عن البقع: unclick جميع الخيارات
      • أسلوب التطبيع: لويس (محلياً المرجح مبعثر مؤامرة تجانس).
    5. حفظ البيانات الكمية ". ملف CSV "(الشكل 1). نقل هذه البيانات إلى ملف جدول بيانات مشتركة باستخدام Microsoft Excel أو تطبيق آخر مناسب.
    6. استخدام نطاق المجال (IQR) كالطريقة الإحصائية الرئيسية: حساب المتوسط (الربع 2) جميع الإشارات لكل يجند والانحراف المجال (مقاييس النسبة المئوية 75 و 25، أو quartiles العلوي والسفلي Q3 و Q1، على التوالي).
    7. إجراء استكشاف تفاعلي للبيانات باستخدام تطبيق Explorer تجميع التسلسل الهرمي.
    8. استخدام تجميع المعلمات: متوسط الربط (أوبجما) ومسافة إقليدية كتشابه قياس المسافة. القيام بتجميع تسلسل هرمي حسب الصفوف دون تطبيع.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

نقدم هنا، موجزاً للممثل النتائج التي تم الحصول عليها من التحديد الكمي لمرجع الأجسام المضادة الطبيعية-جليكان في عدد سكان من 20 بالب/ج الفئران. جليكوتشيبس المستخدمة في هذه الدراسة الواردة 419 جليكان مختلف الهياكل. معظم جليكانس تم تصنيعه ك-CH2CH2CH2NH2 فاصل المسلحة س-جليكوسيدات، في العديد من الحالات ك-CH2CH2NH2 أو-نهكوتش2NH2 جليكوسيدات. جميع جليكان هياكل تتسم بدقة عالية (700-أو 800 ميجاهرتز) مطيافية الرنين المغناطيسي النووي، تنقية واختبارها من قبل [هبلك]، مما يدل على > النقاوة 95%. ونحن في نفس الوقت تحديد IgM + مفتش الأضداد المضادة جليكان بسبب تقييد مبلغ المصل الماوس. في الشبكة، ونحن نظر القيم أعلاه رفو 4,000 كإشارة إيجابية لربط جسم (هذه القيمة هو ~ 10% جليكانس الأعلى رفو). النتائج المعروضة في هذا العمل اتبع معظم المبادئ التوجيهية للإبلاغ عن البيانات على أساس ميكرواري جليكان39. 17% فقط من الكربوهيدرات هياكل أظهر إيه فور، رفو 000 في الشبكة (الشكل 2، باللون الأحمر). معظم جليكان هياكل مكشوف في جليكوتشيبس لم تكن تعترف بالمرجع لتعميم الأجسام المضادة-جليكان فئران BALB/c (الشكل 2، في الأزرق والأبيض)28. نمط مصانة من الأجسام المضادة الكربوهيدرات الطبيعية بالب/ج شملت 12 جليكان مختلف الخصوصيات، مع كثافة إشارة متوسط مرتفع جداً من الأجسام المضادة ملزمة (إيه وان زيرو، رفو 000 1 الجدول)28.

Figure 1
الشكل 1 : التمثيل التخطيطي (وليس في نطاق) تكوين الصفيف جليكان والطباعة، والتحليل- (أ) توضع الرقائق المطبوعة مع مكتبة من 419 جليكان مختلف الهياكل، تليها الكشف مع جسم ثانوي مسمى فلوريسسينتلي مناسبة. تحتوي كل شريحة على 4 كتل مختلفة من صفائف الفرعية (بالألوان)، وكرر 6 مرات. كل مجموعة فرعية واحدة تتكون من 112 جليكان مختلف البقع (الصفوف 8 × الأعمدة 14)، بما في ذلك عناصر التحكم. (ب) مثال على الصور التي تم الحصول عليها من الرقائق الدقيقة المسح باستخدام ماسح ضوئي الأسفار (الجزء الثالث من الصورة). (ج) عملية مواءمة "الشبكة" للبقع في الصفيف الفرعي كل واحد (تعديل قالب أثناء القياس الكمي). تم الكشف عن (د) الأسفار لكل نقطة، ويتم تحويل النتائج إلى ملف جدول بيانات مشتركة. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Figure 2
الشكل 2 : مرجع الطبيعية المتداولة الكربوهيدرات المضادة الأجسام المضادة الفئران بالب/ج. عينات المصل الماوس (01:20) كان المحتضنة مع جليكوتشيبس والممسوحة ضوئياً باستخدام قارئ سكاناراي. تم تحليل البيانات باستخدام نظام تحليل ميكرواري وأعرب عن النتائج في وحدات fluorescence النسبي (رفو) كالانحراف المطلق المتوسط ± متوسط (جنون). تمثل الألوان الأزرق والأبيض إشارات الربط أقل من رفو 4,000 (الخلفية)؛ اللون الأحمر يمثل إشارات إيه فور، رفو 000 (الربط الإيجابي). واو: أنثى؛ م: الذكور (n = 20). هذا الرقم قد استنسخ من بيلو-جيل، دال- وآخرون. 28- الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

جليكان
معرف (#)		 هيكل الاسم الشائع الوسيط وجنون رفو عدد الفئران عرض ≥4000 رفو (%)
60 6-س-سو-Galβ-سب 61113 1156 100
271 Galβ1-6Galβ1-4Glcβ-sp 53622 1934 100
802 Galβ1-3GalNAc(furc) β-sp 51348 2324 100
176 3-س-سو-Galβ1-4(6-O-Su) Glcβ-sp 43008 9342 100
166 GlcAβ1-6Galβ-sp 39105 2993 85
150 3-O-Su-Galβ1-3GalNAcα-sp 37943 3232 100
437 GalNAcα1-3(Fucα1-2) Galβ1-3GalNAcβ-sp A(type 4) 33886 3193 90
125 6-Bn-Galβ1-4GlcNAcβ-sp 32674 5389 95
154 3-O-Su-Galβ1-3GlcNAcβ-sp 32651 3954 100
177 3-س-سو-Galβ1-4(6-O-Su) GlcNAcβ-sp 32496 7215 100
287 3-س-سو-Galβ1-3(Fucα1-4) GlcNAcβ-sp سولي 20063 4962 95
234 Galβ1-4(Fucα1-3) GlcNAcβ-sp لوس 13573 2635 80

الجدول 1: الهياكل الأعلى رتبة جليكان المعترف بها الأجسام المضادة الطبيعية للفئران بالب/ج. إشارات جليكانس مع الربط أعلاه رفو 4,000 في 80 في المائة على الأقل من دراسة الفئران (n = 20). ويعني بس مباعدة أمينو إيثايل أو أمينوبروبيل أو جليسيل. فرانس ج؛ جميع السكريات الأحادية الأخرى شكل بيرنز؛ وقد بقايا الجبهة L-التكوين، جميع الآخرين السكريات الأحادية-د-التكوين. وقد تم تعديل هذا الجدول من بيلو-جيل، دال- وآخرون. 28.

التكميلية الجدول 1: قائمة جليكانس، تجليدها للأجسام المضادة المتداولة الطبيعية (IgM + IgG) من الفئران بالب/c (n = 20)، معبراً عنها بوحدات fluorescence النسبي (رفو) كجنون ± متوسط، وعدد الحيوانات التي تتجاوز قطع (≥رفو 4000)- هذا الجدول وقد استنسخ من بيلو-جيل، دال- وآخرون. 28- الرجاء اضغط هنا لتحميل هذا الجدول

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

وقد أصبحت جليكان [ميكروارس] أدوات لا غنى عنها لدراسة تفاعلات البروتين-جليكان40. ويصف العمل الحالي بروتوكول يستند إلى تكنولوجيا الشبكة لدراسة مرجع المتداولة من الكربوهيدرات المضادة الأجسام المضادة في الفئران بالب/ج. منذ الشبكة يتيح إمكانية لشاشة إعداد كبيرة من جليكانس بيولوجيا غير معروف، هو اكتشاف استثنائي ملائمة أداة13،،من1528. الطريقة المقترحة توفر إمكانية قياس، في نفس الإعداد التجريبية، مئات هياكل جليكان باستخدام كمية أقل من العينة المصلية (50 ميليلتر). هذا أمر بالغ الأهمية خصوصا في حالة الحيوانات الصغيرة (ليتل يتناقل حجم الدم)، أو عندما يكون ذلك ضروريا لاستخراج الدم عدة مرات من نفس الحيوانات التجريبية.

أظهرنا، كنتائج الممثل، أن الفئران متطابقة وراثيا ينبغي أن لا تعتبر المناعية مكافئات؛ نظراً لأن تتطور أنماط مختلفة الطبيعية الأجسام المضادة الكربوهيدرات (فقط 12 جليكان خصوصيات قد حفظت). المستويات المصلية لبقية مرجع الأجسام المضادة الكربوهيدرات الطبيعية تختلف اختلافاً كبيرا بين الحيوانات فحصها. تحليل الحجمية القناة الهضمية للحيوانات الفطرية41 يمكن أن يفسر هذا التباين43،42،44،،من4546. إذا هو إنتاج الأجسام المضادة الطبيعية-جليكان بتحفيز مستضدي الحجمية وساطة، وهذا يختلف بين الفئران فطري41، لن تكون متطابقة غرامة خصوصية هذه الأجسام المضادة.

ويعتبر العيب الرئيسي لتطوير الشبكة هو الحصول على جليكان المعالم هياكل40،47. جليكانس المنتجة في النظم البيولوجية غير متجانسة40،،من4748، ويعتمد على تخليق الحيوي على التعبير التفاضلية من إنزيمات الكربوهيدرات، نتج عنه خليط غير متجانس من جليكوفورمس، كل منها نشاط فسيولوجية متميزة47. تركيبة معقدة، وتكوين جليكانس موجودة في النظم البيولوجية جعل آثارهم تحدي40،،من4748. جنبا إلى جنب مع توليف الكيماوي الانزيمية، سوف تستمر جليكانس المعزولة من المصادر الطبيعية لتكون المصدر الرئيسي جليكانس ل تنمية صفائف40. غلة منخفضة الاصطناعية وجعل عملية تنقية معقدة من جليكوبروتينس وجليكوسفينجوليبيدس كفاءة إنتاج جليكانس طليقا مقياس الصعب40،،من4748. ومن ثم مواصلة التوافر وأسعار جليكانس كونها شرطا مقيداً جداً التوسع في استخدام الشبكة كأداة لاكتشاف.

بالإضافة إلى ذلك، يجب تنفيذ الخطوات الحاسمة المتعلقة بمعظمها للتوزيع الصحيح لحلول (مصل الدم، والأجسام المضادة الثانوية) على سطح جليكوتشيب ضمن البروتوكول، مع توخي الحذر. ويتطلب المنهجية، على الأقل، 1 مل من هذه الحلول، لامتصاص جميع المناطق الجافة من سطح جليكوتشيب المتجانس. هذا أمر بالغ الأهمية للحصول على الحد الأدنى من الخلافات بين replicates جليكان وأيضا لتجنب الخلفية المفرط أثناء القياس الكمي.

وعلى الرغم من القيود المذكورة، الشبكة أداة حساسة جداً للنهج المتعلقة بدراسة تفاعلات البروتين-جليكان40، أو دراسة مرجع الأجسام المضادة-جليكان في إعداد تجريبي معين أو حالة13، 15،28. ويمكن استقراء هذه الدراسة إلى أنواع مختلفة (بما في ذلك العينات البشرية) 13،15،23،28، تقديم منهجية متعددة لتحديد المرجع لتعميم الأجسام المضادة الكربوهيدرات.

ونحن نتوقع أيضا إمكانية أن هذا النهج قد يؤدي في التشخيص المبكر والعلاج المشتقة في بعض الظروف المرضية حيث الأجسام المضادة الموجهة إلى هياكل جليكان ويبدو أن تلعب دوراً هاما.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

خاسبيولينا نايلياونكيل أليكسي هم موظفون في سيميوتيك LLC، الذي هو مورد جليكوتشيبس المستخدمة في هذه الدراسة.

Acknowledgments

هذا العمل كان يدعمها "فوندو دي البحوث Sanitarias" منح (الجبهة الإسلامية للإنقاذ) PI13/01098 من معهد كارلوس الثالث الصحي، وزارة الصحة الإسبانية. وكان استفاد DB-ز من مركز أبحاث ما بعد دكتوراه ممولة من "الاتحاد الأوروبي البرنامج الإطاري السابع" (FP7-2007-2013) تحت 603049 اتفاق المنحة (ترانس). وأيد أعمال ناغورني-كاراباخ، NS، وملاحظة: منحة #14-50-00131 "المؤسسة الروسية للعلوم". ز-DB يريد أن يعرب عن امتنانه لمارتا Broto، "ج." بابلو السلفادور وأنا سانشيز للمساعدة التقنية الممتازة، وألكسندر راكيتكو للمساعدة في التحليل الإحصائي. بالدعم من "الصناعيين جيش التحرير الشعبي الصيني de دوكتوراتس de la أمانة d'Universitats أنا d'Empresa ريسيركا ديل خلية أنا كونيكسيمينت de la محافظة كاتالونيا (منح رقم 2018 دي 021). ونشكر "برنامج سيركا"/محافظة كاتالونيا للدعم المؤسسي.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Antibodies
biotinylated goat anti-human Igs Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA Ref. #: 31782
biotinylated goat anti-mouse IgM + IgG Thermo Fisher Scientific Ref. #: 31807
Equipment
Robotic Arrayer sciFLEXARRAYER S5  Scienion AG, Berlin, Germany http://www.scienion.com/products/sciflexarrayer/
Stain Tray (slide incubation chamber) Simport, Beloeil, QC, Canada Ref. #: M920-2
Centrifuge Eppendorf, Hamburg, Germany  Ref. #: 5810 R
Pipettes Gilson, Middleton, WI, USA http://www.gilson.com/en/Pipette/
Slide Scanner  PerkinElmer, Waltham, MA, USA ScanArray GX Plus 
Shaking incubator Cole-Parmer, Staffordshire, UK Ref. #: SI50
Biological samples
BALB/c mice sera This paper N/ A
Complex Immunoglobulin Preparation (CIP) Immuno-Gem, Moscow, Russia http://www.biomedservice.ru/price/goods/1/17531
Chemicals, Reagents and Glycans 
Glycan library Institute of Bioorganic Chemistry (IBCh), Moscow, Russia N/ A
Bovine serum albumin (BSA) Sigma-Aldrich, St. Louis, MO,  Ref. #: A9418
Ethanolamine Sigma-Aldrich Ref. #: 411000
Tween-20 Merck Chemicals & Life Science S.A., Madrid, Spain Ref. #: 655204
Phospahte buffered saline (PBS) VWR International Eurolab S.L, Barcelona, Spain Ref. #: E404
Sodium azide Sigma-Aldrich Ref. #: S2002
Streptavidin Alexa Fluor 555 conjugate  Thermo Fisher Scientific Ref. #: S21381
Streptavidin Cy5 conjugate GE Healthcare, Little Chalfont, Buckinghamshire, UK Ref. #: PA45001
Materials
N-hydroxysuccinimide-derivatized glass slides H  Schott-Nexterion, Jena, Germany Ref. #: 1070936
Whatman filter paper  Sigma-Aldrich Ref. #: WHA10347509
1.5 mL tubes Eppendorf  Ref. #: 0030120086
Software and algorithms
ScanArray Express Microarray Analysis System PerkinElmer http://www.per
kinelmer.com/microarray
Hierarchical Clustering Explorer application University of Maryland, MD, USA http://www.cs.umd.edu/hcil/hce/

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Karlsson, G. B., Fouchier, R. A., Phogat, S., Burton, D. R., Sodroski, J., Wyatt, R. T. The challenges of eliciting neutralizing antibodies to HIV-1 and to influenza virus. Nat Rev Microbiol. 6 (2), 143-155 (2008).
  2. Lu, L. L., Suscovich, T. J., Fortune, S. M., Alter, G. Beyond binding: antibody effector functions in infectious diseases. Nat Rev Immunol. 18 (1), 46-61 (2017).
  3. Bebbington, C., Yarranton, G. Antibodies for the treatment of bacterial infections: current experience and future prospects. Curr Opin Biotech. 19 (6), 613-619 (2008).
  4. Murphy, K., Travers, P., Walport, M. The complement system and innate immunity. Janeway's Immunobiology. , 7th, Garland Science. New York. 61-80 (2008).
  5. Botto, M., Kirschfink, M., Macor, P., Pickering, M. C., Wurzner, R., Tedesco, F. Complement in human diseases: lessons from complement deficiencies. Mol Immunol. 46 (14), 2774-2783 (2009).
  6. Borrok, M. J., et al. Enhancement of antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity by endowing IgG with FcαRI (CD89) binding. MAbs. 7 (4), 743-751 (2015).
  7. Weiner, L. M., Murray, J. C., Shuptrine, C. W. Antibody-based immunotherapy of cancer. Cell. 148 (6), 1081-1084 (2012).
  8. Ricklin, D., Hajishengallis, G., Yang, K., Lambris, J. D. Complement: a key system for immune surveillance and homeostasis. Nat Immunol. 11 (9), 785-797 (2010).
  9. Prechl, J. A generalized quantitative antibody homeostasis model: antigen saturation, natural antibodies and a quantitative antibody network. Clin Transl Immunology. 6 (2), e131 (2017).
  10. Vojdani, A. Antibodies as predictors of complex autoimmune diseases. Int J Immunopath Ph. 21 (2), 267-278 (2008).
  11. Liu, W., Peng, B., Lu, Y., Xu, W., Qian, W., Zhang, J. Y. Autoantibodies to tumor-associated antigens as biomarkers in cancer immunodiagnosis. Autoimmun Rev. 10 (6), 331-335 (2011).
  12. Suurmond, J., Diamond, B. Autoantibodies in systemic autoimmune diseases: specificity and pathogenicity. J Clin Invest. 125 (6), 2194-2202 (2015).
  13. Bovin, N., et al. Repertoire of human natural anti-glycan immunoglobulins. Do we have auto-antibodies? Biochim Biophys Acta. 1820 (9), 1373-1382 (2012).
  14. de los Rios, M., Criscitiello, M. F., Smider, V. V. Structural and genetic diversity in antibody repertoires from diverse species. Curr Opin Struc Biol. 33, 27-41 (2015).
  15. Pochechueva, T., et al. Comparison of printed glycan array, suspension array and ELISA in the detection of human anti-glycan antibodies. Glycoconjugate J. 28 (8-9), 507-517 (2011).
  16. Shilova, N., Navakouski, M., Khasbiullina, N., Blixt, O., Bovin, N. Printed glycan array: antibodies as probed in undiluted serum and effects of dilution. Glycoconjugate J. 29 (2-3), 87-91 (2012).
  17. Manimala, J. C., Roach, T. A., Li, Z., Gildersleeve, J. C. High-throughput carbohydrate microarray profiling of 27 antibodies demonstrates widespread specificity problems. Glycobiology. 17 (8), 17C-23C (2007).
  18. Jacob, F., et al. Serum anti-glycan antibody detection of non-mucinous ovarian cancers by using a printed glycan array. Int. J. Cancer. 130 (1), 138-146 (2012).
  19. Lewallen, D. M., Siler, D., Iyer, S. S. Factors affecting protein-glycan specificity: effect of spacers and incubation time. ChemBioChem. 10 (9), 1486-1489 (2009).
  20. Oyelaran, O., Li, Q., Farnsworth, D., Gildersleeve, J. C. Microarrays with varying carbohydrate density reveal distinct subpopulations of serum antibodies. J. Proteome Res. 8 (7), 3529-3538 (2009).
  21. Pochechueva, T. Multiplex suspension array for human anti-carbohydrate antibody profiling. Analyst. 136 (3), 560-569 (2011).
  22. Chinarev, A. A., Galanina, O. E., Bovin, N. V. Biotinylated multivalent glycoconjugates for surface coating. Methods Mol Biol. 600, 67-78 (2010).
  23. Huflejt, M. E. Anti-carbohydrate antibodies of normal sera: findings, surprises and challenges. Mol Immunol. 46 (15), 3037-3049 (2009).
  24. Buchs, J. P., Nydegger, U. E. Development of an ABO-ELISA for the quantitation of human blood group anti-A and anti-B IgM and IgG antibodies. J Immunol Methods. 118 (1), 37-46 (1989).
  25. de Jager, W., Rijkers, G. T. Solid-phase and bead-based cytokine immunoassay: a comparison. Methods. 38 (4), 294-303 (2006).
  26. Galanina, O. E., Mecklenburg, M., Nifantiev, N. E., Pazynina, G. V., Bovin, N. V. GlycoChip: multiarray for the study of carbohydrate binding proteins. Lab Chip. 3 (4), 260-265 (2003).
  27. Willats, W. G., Rasmussen, S. E., Kristensen, T., Mikkelsen, J. D., Knox, J. P. Sugar-coated microarrays: a novel slide surface for the high-throughput analysis of glycans. Proteomics. 2 (12), 1666-1671 (2002).
  28. Bello-Gil, D., Khasbiullina, N., Shilova, N., Bovin, N., Mañez, R. Repertoire of BALB/c mice natural anti-Carbohydrate antibodies: mice vs. humans difference, and otherness of individual animals. Front Immunol. 8, 1449 (2017).
  29. Pazynina, G., et al. Synthetic glyco-O-sulfatome for profiling of human natural antibodies. Carbohydr Res. 445, 23-31 (2017).
  30. Ryzhov, I. M., Korchagina, E. Y., Popova, I. S., Tyrtysh, T. V., Paramonov, A. S., Bovin, N. V. Block synthesis of A (type 2) and B (type 2) tetrasaccharides related to the human ABO blood group system. Carbohydr Res. 430, 59-71 (2016).
  31. Ryzhov, I. M., et al. Function-spacer-lipid constructs of Lewis and chimeric Lewis/ABH glycans. Synthesis and use in serological studies. Carbohyd Res. 435, 83-96 (2016).
  32. Pazynina, G. V., Tsygankova, S. V., Sablina, M. A., Paramonov, A. S., Tuzikov, A. B., Bovin, N. V. Stereo- and regio-selective synthesis of spacer armed α2-6 sialooligosaccharides. Mendeleev Commun. 26 (5), 380-382 (2016).
  33. Pazynina, G. V., Tsygankova, S. V., Sablina, M. A., Paramonov, A. S., Formanovsky, A. A., Bovin, N. V. Synthesis of blood group pentasaccharides ALey, BLey and related tri- and tetrasaccharides. Mendeleev Commun. 26 (2), 103-105 (2016).
  34. Severov, V. V., Pazynina, G. V., Ovchinnikova, T. V., Bovin, N. V. The synthesis of oligosaccharides containing internal and terminal Galβ1-3GlcNAcβ fragments. Russian J. Bioorgan. Chem. 41 (2), 147-160 (2015).
  35. Pazynina, G. V., Tsygankova, S. V., Bovin, N. V. Synthesis of glycoprotein N-chain core fragment GlcNAcβ1-4(Fucα1-6)GlcNAc. Mendeleev Commun. 25 (4), 250-251 (2015).
  36. Solís, D., et al. A guide into glycosciences: How chemistry, biochemistry and biology cooperate to crack the sugar code. Biochim Biophys Acta. 1850 (1), 186-235 (2015).
  37. Pazynina, G. V., et al. Divergent strategy for the synthesis of α2-3-Linked sialo-oligosaccharide libraries using a Neu5TFA-(α2-3)-Gal building block. Synlett. 24 (02), 226-230 (2013).
  38. Blixt, O., et al. Printed covalent glycan array for ligand profiling of diverse glycan binding proteins. P Natl Acad Sci USA. 101 (49), 17033-17038 (2004).
  39. Liu, Y., et al. The minimum information required for a glycomics experiment (MIRAGE) project: improving the standards for reporting glycan microarray-based data. Glycobiology. 27 (4), 280-284 (2017).
  40. Song, X., Heimburg-Molinaro, J., Cummings, R. D., Smith, D. F. Chemistry of natural glycan microarrays. Curr Opin Chem Biol. 18, 70-77 (2014).
  41. Hoy, Y. E., et al. Variation in taxonomic composition of the fecal microbiota in an inbred mouse strain across individuals and time. PLoS One. 10 (11), e0142825 (2015).
  42. D'Argenio, V., Salvatore, F. The role of the gut microbiome in the healthy adult status. Clin Chim Acta. 451 (Pt A), 97-102 (2015).
  43. Khasbiullina, N. R., Bovin, N. V. Hypotheses of the origin of natural antibodies: a glycobiologist's opinion. Biochemistry (Mosc). 80 (7), 820-835 (2015).
  44. Butler, J. E., Sun, J., Weber, P., Navarro, P., Francis, D. Antibody repertoire development in fetal and newborn piglets, III. Colonization of the gastrointestinal tract selectively diversifies the preimmune repertoire in mucosal lymphoid tissues. Immunology. 100 (1), 119-130 (2000).
  45. Bos, N. A., et al. Serum immunoglobulin levels and naturally occurring antibodies against carbohydrate antigens in germ-free BALB/c mice fed chemically defined ultrafiltered diet. Eur J Immunol. 19 (12), 2335-2339 (1980).
  46. van der Heijden, P. J., Bianchi, A. T., Heidt, P. J., Stok, W., Bokhout, B. A. Background (spontaneous) immunoglobulin production in the murine small intestine before and after weaning. J Reprod Immunol. 15 (3), 217-227 (1989).
  47. Krasnova, L., Wong, C. H. Understanding the chemistry and biology of glycosylation with glycan synthesis. Annu Rev Biochem. 85, 599-630 (2016).
  48. Overkleeft, H. S., Seeberger, P. H., et al. Chemoenzymatic synthesis of glycans and glycoconjugates. Essentials of Glycobiology [Internet]. Varki, A., et al. , 3rd, Cold Spring Harbor Laboratory Press. Cold Spring Harbor (NY). Chapter 54 2015-2017 (2017).

Tags

علم المناعة والعدوى، العدد 144، نمط من الأجسام الطبيعية، تعميم الأجسام المضادة-جليكان، وخصوصيات جليكان، جليكوتشيبس، طباعة جليكان صفيف، الشبكة، الفئران
المطبوعة جليكان الصفيف: تقنية حساسة لتحليل مرجع تعميم الأجسام المضادة الكربوهيدرات في الحيوانات الصغيرة
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Olivera-Ardid, S., Khasbiullina, N., … More

Olivera-Ardid, S., Khasbiullina, N., Nokel, A., Formanovsky, A., Popova, I., Tyrtysh, T., Kunetskiy, R., Shilova, N., Bovin, N., Bello-Gil, D., Mañez, R. Printed Glycan Array: A Sensitive Technique for the Analysis of the Repertoire of Circulating Anti-carbohydrate Antibodies in Small Animals. J. Vis. Exp. (144), e57662, doi:10.3791/57662 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter