Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

Gedrukte Glycan Array: Een gevoelige techniek voor de analyse van het Repertoire van circulerende anti-koolhydraten antilichamen in kleine dieren

Published: February 14, 2019 doi: 10.3791/57662
Automatic Translation
*1, *2,3, 3, 2, 2, 2, 2, 2, 2,4, 1, 1,5
1Infectious Pathology and Transplantation Division, Bellvitge Biomedical Research Institute (IDIBELL), 2Shemyakin-Ovchinnikov Institute of Bioorganic Chemistry (IBCh), Russian Academy of Sciences, 3Semiotik LLC, 4Auckland University of Technology, 5Intensive Care Department, Bellvitge University Hospital
* These authors contributed equally

Summary

Dit werk toont het potentieel van gedrukte glycan matrix (PGA) technologie voor de analyse van de circulerende anti-koolhydraten antistoffen bij kleine dieren.

Abstract

Het repertoire van circulerende anti-koolhydraten antilichamen van een bepaalde persoon wordt vaak geassocieerd met de immunologische status. Niet alleen de individuele immuun aandoening bepaalt het succes in de strijd tegen interne en externe potentiële bedreiging signalen, maar ook het bestaan van een bepaald patroon van de circulerende antilichamen anti-glycan (en hun serologische niveau variatie) kan een belangrijke markering van het ontstaan en de progressie van bepaalde pathologische condities. Hier beschrijven we een afgedrukt Glycan Array PGA gebaseerde methodiek die de mogelijkheid biedt voor het meten van honderden glycan doelen met zeer hoge gevoeligheid; met behulp van een minimale hoeveelheid monster, dat een gemeenschappelijke beperking aanwezig wanneer kleine dieren is (ratten, muizen, hamster, enz.) worden gebruikt als modellen aanpak van aspecten van ziekten bij de mens. Als een representatief voorbeeld van deze aanpak tonen wij de resultaten van de analyse van het repertoire van natuurlijke anti-glycan antilichamen in BALB/c muizen. We laten zien dat elke BALB/c muis betrokken in de studie, ondanks het feit dat genetisch identiek en onderhouden onder dezelfde voorwaarden, een bepaald patroon van natuurlijke anti-koolhydraten antilichamen ontwikkelt. Dit werk beweert dat het gebruik van PGA technologie te onderzoeken repertoire (kenmerken) en de niveaus van circulerende antilichamen anti-koolhydraten, zowel in gezondheid en tijdens een pathologische aandoening uit te breiden.

Introduction

Antilichamen spelen een centrale rol in onze verdediging tegen invasie ziekteverwekkers door virussen1,2 en bacteriën2,3, rechtstreeks te neutraliseren door het activeren van de aanvulling systeem4,5 en de versterking van fagocytose6. Bovendien, zijn ze essentiële elementen in kanker targeting en eliminatie van kwaadaardige cellen7en homeostase onderhoud8,9.

Aandoeningen van het immuunsysteem kunnen leiden tot auto-immune en inflammatoire ziekten10 en kanker11. Al deze pathologische voorwaarden ideaal eisen een snelle diagnose voor een efficiënte behandeling. In het geval van auto-immune aandoeningen is de serologische aanwezigheid van autoantilichamen in de meeste gevallen een voorspeller voor diagnose van autoimmuniteit10,12. Deze antistoffen met het celoppervlak reageren en extracellulaire autoantigens en ze zijn vaak aanwezig voor vele jaren voorafgaand aan de indiening van auto-immune ziekte10,12. Immuun tekortkomingen en kanker zijn ook gediagnosticeerd met bloedonderzoek dat ofwel meten van het niveau van immuun elementen zoals antilichamen, of hun functionele activiteit11.

De identificatie van het repertoire van de circulerende antilichamen en serologische kwalificatieniveaus staan om een prognose en evalueren van de voortgang van alle genoemde pathologische voorwaarden. Wij hebben eerder aangetoond dat het potentieel van PGA techniek voor de analyse van de circulerende antilichamen in verschillende diersoorten13-16, minimaliseren van het gebruik van grote hoeveelheden van serologische monsters, het vermijden van het probleem in verband met antilichamen Kruisallergie17 en waardoor high-throughput profilering van een uitgebreid repertoire van antilichamen15.

Glycan gebaseerde immunoassay zijn voornamelijk geconditioneerd, onder andere door de oorsprong en productie van koolhydraten, die de affiniteit en de binding van liganden15,18,19,20 bepalen ,21. Glycan gebaseerde immunoassay kunnen worden ontwikkeld in suspensie (microbolletjes)15,21,22 of flat-geactiveerde oppervlakken15,21,22, 23,24. De laatste omvatten ELISA (de meeste conventionele methoden) en PGA. Er is niet veel gegevens vergelijken deze methodologieën in de dezelfde experimentele instelling15,25,26,27. Wij hebben eerder de werkzaamheid en de selectiviteit van deze immunoassay aan profiel anti-glycan antilichamen in individuele menselijk plasma monsters15vergeleken. Voor sommige antilichamen zoals die gericht op anti-A/B-bloedgroep, alle de immunoassay kon ze detecteren met statistische significantie en ze positief gecorreleerd met elkaar15,18,21. Ondertussen, anti-P1 antilichamen zijn voornamelijk aangetroffen door PGA met het hoogste discriminerende vermogen, en er was geen correlatie in de vaststellingen gedaan door de verschillende glycan gebaseerde immunoassay15,18, 21. deze verschillen tussen methoden werden voornamelijk verband houden met het antilichaam/antigeen verhouding en de glycan geaardheid15. ELISA en schorsing arrays zijn meer vatbaar voor aspecifieke bindende dan PGA, want er een overschrijding van het antigeen van antilichamen in deze methoden15 is. Daarnaast is de richting van glycanen in de PGA beperkter dan in ELISA en schorsing matrices15. ELISA is handig wanneer de studie een beperkte panel van glycanen omvat. Samen met schorsing arrays biedt ELISA bredere flexibiliteit met betrekking tot assay herconfiguratie. PGA is buitengewoon handig voor ontdekking benaderingen15,18,21,28. Ondanks deze duidelijke voor- en nadelen, kunnen de drie genoemde immunoassay worden gebruikt om verschillende aspecten van glycan-antilichaam interactie te bestuderen. Het uiteindelijke doel van de studie is dat de ene begeleidt de selectie van de meer geschikte methode.

Het huidige werk is gericht op het uitbreiden van het gebruik van PGA technologie voor de analyse van het repertoire van circulerende antilichamen van de anti-glycan in kleine dieren. Als een representatief resultaat presenteren we hier een gedetailleerd protocol voor de beoordeling van het repertoire van natuurlijke anti-koolhydraten antilichamen in volwassen BALB/c muizen door PGA.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Glycochips productie

  1. Microarray voorbereiding
    1. Print de glycanen (50 mM) en polysacchariden (10 µg/mL) in 300 mM fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS, pH 8,5) op 6 op glas N-hydroxysuccinimide-derivatized-dia's repliceert, gebruik van contactloze robotachtige arrayer (drop volume ~ 900 pL). Elke dia bevat 4 verschillende blokken van sub arrays (figuur 1A, in kleuren) 6 keer herhaald. Elke één sub array wordt gevormd door 112 verschillende glycan vlekken, met inbegrip van controles (8 rijen × 14 kolommen breed) (figuur 1B).
      Opmerking: Glycan-gerelateerde informatie wordt verstrekt in de aanvullende tabel 1. De bibliotheek van de glycan die wordt gebruikt voor afdrukken microchips is het resultaat van een lange termijn synthetische inspanning van het team van IBCh; voorbeelden van synthese worden beschreven in Verwante publicaties29,30,31,32,33,34,35,36 3837, ,. De glycan bibliotheek opgenomen bloedgroep-antigenen en enkele van de meest vaak voorkomende terminal oligosacchariden, evenals kern motieven van zoogdieren N en O-alternerende glycoproteïnen en glycolipiden, koolhydraten tumor-geassocieerde antigenen, en polysacchariden van pathogene bacteriën.
    2. Incubeer de dia's in vocht vak (relatieve vochtigheid ~ 70%) bij kamertemperatuur (25 ° C) gedurende 1 uur.
    3. Blokkeren van microarrays: Incubeer de dia's gedurende 1,5 uur met een blokkeerbuffer bij kamertemperatuur (boorzuur van 100 mM, 25 mM ethanolamine, 0,2% (v/v) Tween-20 in ultrazuiver water).
    4. De glycochip met ultrazuiver water wassen en droog het door de lucht.
  2. De controle van de kwaliteit van de Glycochip
    1. Analyseren van twee microarrays van elke partij met 1mg/mL oplossing van complexe immunoglobulin voorbereiding (CIP, met IgA, IgG en IgM), 10 µg/mL oplossing van biotinyleerd geit anti-menselijke immunoglobulinen als een secundair antilichaam (IgM IgG + IgA), gevolgd door 1 µg/mL oplossing van de overeenkomstige fluorescerende streptavidine geconjugeerde (via het protocol die hieronder worden beschreven, zie stap 2).
    2. Scannen en analyseren van de glycochips (zie stap 3, analyse van glycan matrix).
    3. Gebruiken microarray batches met intra - en intersite - chip correlatie hoger dan 0.9.

2. Glycan Array techniek

  1. Voorbereiding van de volgende waterige oplossingen (in ultrazuiver water) en bewaar ze bij kamertemperatuur (25 ° C):
    • Buffer-1: 1% (m/v) bovien serumalbumine (BSA) in PBS, 1% (v/v) Tween-20 en 0,01% (g/v) NaN3
    • Buffer-2: 1% (m/v) BSA in PBS, 0,1% (v/v) Tween-20 en 0,01% (g/v) NaN3.
    • Buffer-3: 0,1% (v/v) Tween-20 in PBS.
    • Buffer-4: 0,001% (v/v) Tween-20 in PBS.
  2. Glycochip en sample voorbereiding
    1. De opbergdoos met de dia's op tafel gelegd, totdat ze bij kamertemperatuur (25 ° C).
      Opmerking: Gebruik poedervrije latex handschoenen. De glycochip moet worden gemanipuleerd door het onderste gedeelte van het glasplaatje, waar de streepjescode zich bevindt. De barcode zal u helpen te bepalen de rechterkant, het vermijden van het contact met het oppervlak waar de glycanen worden afgedrukt.
    2. Open het, neem de glycochip en plaats het in het incubatie-zaal (25 ° C), al geconditioneerd met natte filtreerpapier constant te houden vochtigheid in de kamer.
    3. Ondertussen, Verdun het serum van de muizen met Buffer-1 (1:20) in 1,5 mL tubes. Meng de serum-oplossing (5 s) met een vortex-mixer.
      Opmerking: Het volume moest volledig betrekking hebben op een enkele glycochip oppervlak is ongeveer 1 mL.
    4. Na de homogenisering, Incubeer het verdund serum bij 37 ° C gedurende 10 minuten in een waterbad te vermijden immunoglobulin aggregatie. Centrifugeer de buizen voor 3 min op 10.000 x g en 25 ° C, verzamelen het supernatant en gooi geprecipiteerde materiaal.
    5. Plaats de glycochip zorgvuldig in de zaal van de incubatie. Incubeer het 15 min bij 25 ° C met 1 mL van de Buffer-3 te heffen resterende materiaal op het oppervlak van de glycochip.
    6. Houd de glycochip in een verticale positie en het rewash met enkele druppels Buffer-3 met behulp van een plastic pipet van Pasteur. Verwijder voorzichtig de buffer van het oppervlak van de glycochip met filtreerpapier.
  3. Reactie: antilichamen bindende
    1. Plaats de glycochip in het incubatie-zaal. De verdunde serummonster verspreid over de oppervlakte van de glycochip met behulp van een micropipet. Incubeer met orbitale agitatie (30 rpm) bij 37 ° C voor 1,5 h. Zorg ervoor dat alle droge gebied van het glycochip oppervlak wordt bestreken door het serummonster van de verdunde met behulp van het uiteinde van de pipet.
    2. Verwijder alle overtollige monster en dompel de glycochip gedurende 5 min. in Buffer-3 bij 25 ° C. Vervolgens plaatst u de glycochip naar een container met Buffer-4 (5 min) en tot slot wassen (5 min) de glycochip met ultrazuiver water. Centrifugeer het glycochip voor 1 min op 175 x g en 25 ° C tot de vloeistof afzuigen.
  4. Detectie: secundair antilichaam
    1. Plaats de glycochip in het incubatie-zaal. Verspreid over het oppervlak van de glycochip een oplossing (5 µg/mL) van geit-antimuis (IgG + IgM) geconjugeerd met biotine in Buffer-2. Incubeer met orbitale agitatie (30 rpm) bij 37 ° C gedurende 1 uur.
    2. Verwijder de niet-afhankelijke breuk en herhaal de stappen wassen.
    3. Na het centrifugeren, Incubeer de glycochip in het donker bij 25 ° C gedurende 45 minuten (30 rpm) met 2 µg/mL van de overeenkomstige daar fluorescerende-label oplossing (in Buffer-2).
    4. In duisternis, verwijdert u de ongebonden Fractie en herhaal de stappen wassen.
    5. Droog de glycochip door de lucht.
      Opmerking: Glycochip moet zo spoedig mogelijk worden gescand. Maar als het onmogelijk is om onmiddellijk na kleuring kan scannen, glycochips kunnen worden opgeslagen in een koele en droge plaats in duisternis.

3. analyse van de Glycan matrix

  1. Scannen van de array
    1. Laat de glycochip op de tabel totdat het kamertemperatuur in donker bereikt. Op hetzelfde moment, zet de dia scanner en de laser (excitatie golflengte van 633 nm).
    2. Houd de microarray en schuif de glycochip in de sleuf tot het raakt de achterkant.
    3. Scannen van de glycochip ("uitvoeren gemakkelijk scan"), en sla de scan als een ". TIFF"bestand.
  2. Kwantificering van de matrix
    1. Kwantificeren van de array gebruikmakend van een systeem voor de analyse van ScanArray. Open eerder gescande afbeeldingen, door te klikken op "Bestand" in het "Configure & bestand groep" op het hoofdscherm (figuur 1B-D)
    2. Laden van de bijbehorende matrix bestand sjabloon in GAL formaat (vervreemding van gedrukte glycanen op het glasplaatje) (Figuur 1 c).
    3. GAL sjabloon aanpassen door het zorgvuldig het uitlijnen van de matrix (grids) met de plekken in de afbeelding en starten van kwantificering (Figuur 1 d).
    4. Selecteer de kwantificering parameters:
      • Kwantificering type: Run gemakkelijk Quant.
      • Kwantificering methode: vaste cirkel
      • Auto vinden plekken: klik alle opties
      • Normalisatie methode: LOWESS (lokaal gewogen Scatter Plot vloeiend maken).
    5. Sla de gekwantificeerde gegevens als ". CSV-"bestand (Figuur 1 d). Overdracht van deze gegevens in een gemeenschappelijke spreadsheet-bestand met behulp van Microsoft Excel of een andere geschikte toepassing.
    6. De interkwartielafstand (IQR) gebruiken als de belangrijkste statistische methode: berekening van de mediaan (kwartiel 2) van alle signalen voor elke ligand en de interquartile afwijking (75ste en 25e percentiel, of de bovenste en onderste kwartielen Q3 en Q1, respectievelijk).
    7. Interactieve verkenning van gegevens met behulp van een hiërarchische Clustering Explorer toepassing uitvoeren.
    8. Gebruik clustering parameters: gemiddelde koppeling (UPGMA) en Euclidische afstand als gelijkenis afstand maatregel. Hiërarchische clustering door rijen zonder normalisatie uitvoeren

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Hier presenteren we een samenvatting van de vertegenwoordiger van de resultaten van de kwantificering van het repertoire van natuurlijke anti-glycan antilichamen in een populatie van 20 BALB/c muizen. De glycochips gebruikt in deze studie bevatte 419 verschillende glycan structuren. Meeste glycanen werden gesynthetiseerd als -CH2CH2CH2NH2 spacer-gewapend O-glycosiden, in een aantal gevallen als -CH2CH2NH2 of -NHCOCH2NH2 glycosiden. Alle glycan-structuren werden gekenmerkt door een hoge resolutie (700 - of 800 MHz) NMR spectroscopie, gezuiverd en getest door HPLC, geven hun > 95% zuiverheid. We hebben tegelijkertijd bepaald IgM + IgG antilichamen van de anti-glycan als gevolg van een beperking van het bedrag van de muis serum. In de PGA beschouwd we waarden boven 4.000 RFU als een positief signaal van antilichaam binding (deze waarde is ~ 10% van de hoogste glycanen RFU). De resultaten gepresenteerd in dit werk volgen de meeste van de richtsnoeren voor het melden van glycan microarray gebaseerde gegevens39. Slechts 17% van koolhydraten structuren aangetoond ≥4, 000 RFU in de PGA (Figuur 2, in het rood). Allermeest naar de glycan structuren bloot in de glycochips niet werden erkend door het repertoire van circulerende antilichamen van de anti-glycan van de BALB/c muizen (Figuur 2, in blauw en wit)28. De geconserveerde patroon van natuurlijke anti-koolhydraten antilichamen van BALB/c opgenomen 12 specificiteit van de verschillende glycan, met zeer hoge gemiddelde signaal intensiteiten van antilichamen bindende (≥10, 000 RFU tabel 1)28.

Figure 1
Figuur 1 : Schematische weergave (niet op schaal) van de glycan Matrixconfiguratie, afdrukken en analyse. (A) gedrukte microchips worden ontwikkeld met een bibliotheek van 419 structuren van de verschillende glycan, gevolgd door de detectie met een passende fluorescently gelabeld secundair antilichaam. Elke dia bevat 4 verschillende blokken voor sub arrays (in kleuren), 6 keer herhaald. Elke één sub array wordt gevormd door 112 verschillende glycan plekken (8 rijen × 14 kolommen breed), met inbegrip van controles. (B) een representatief voorbeeld van de beelden verkregen microchip scannen met behulp van een scanner fluorescentie (derde deel van de afbeelding). (C) het proces van aanpassing van de "grid" te plaatsen in elke één sub array (sjabloon aanpassing tijdens kwantificering). (D) de fluorescentie wordt gedetecteerd voor elke vlek en resultaten worden overgebracht naar een gemeenschappelijk spreadsheet-bestand. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Figure 2
Figuur 2 : Repertoire van natuurlijke circulerende antilichamen van de anti-koolhydraten van BALB/c muizen. Muis serummonsters (1:20) werden geïncubeerd met de glycochips en gescand met behulp van een ScanArray reader. Gegevens zijn geanalyseerd met een systeem van microarray analyse en resultaten werden uitgedrukt in relatieve fluorescentie eenheden (RFU) als de mediaan ± mediaan absolute afwijking (MAD). Blauwe en witte kleuren vertegenwoordigen bindende signalen lager dan 4.000 RFU (achtergrond); rode kleur geeft signalen ≥4, 000 RFU (positieve bindende). F: de vrouw; M: mannelijke (n = 20). Dit cijfer is weergegeven vanaf Bello-Gil, D. et al.. 28. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Glycan
ID (#)		 Structuur Algemene naam Mediaan en MAD als RFU Aantal muizen tonen RFU ≥4000 (%)
60 6-O-Su-Galβ-spb 61113 1156 100
271 Galβ1-6Galβ1-4Glcβ-sp 53622 1934 100
802 Galβ1-3GalNAc(furc) β-sp 51348 2324 100
176 3-O-Su-Galβ1-4(6-O-Su) Glcβ-sp 43008 9342 100
166 GlcAβ1-6Galβ-sp 39105 2993 85
150 3-O-su-Galβ1-3GalNAcα-SP 37943 3232 100
437 GalNAcα1-3(Fucα1-2) Galβ1-3GalNAcβ-sp A(type 4) 33886 3193 90
125 6-Bn-Galβ1-4GlcNAcβ-sp 32674 5389 95
154 3-O-su-Galβ1-3GlcNAcβ-SP 32651 3954 100
177 3-O-Su-Galβ1-4(6-O-Su) GlcNAcβ-sp 32496 7215 100
287 3-O-Su-Galβ1-3(Fucα1-4) GlcNAcβ-sp SuLeeen 20063 4962 95
234 Galβ1-4(Fucα1-3) GlcNAcβ-sp Lex 13573 2635 80

Tabel 1: Top rank glycan structuren herkend door natuurlijke antilichamen van BALB/c muizen. Glycanen met bindende signalen boven 4.000 RFU in ten minste 80% van de muizen onderzocht (n = 20). bbetekent sp aminoethyl, aminopropyl of glycyl spacer. cfuranose; alle andere monosachariden zijn in de vorm van een pyranose; Fuc residu heeft L-configuratie, alle andere monosacchariden - D-configuratie. Deze tabel is gewijzigd vanaf Bello-Gil, D. et al.. 28.

Aanvullende tabel 1: lijst van glycanen, hun binding met natuurlijke circulerende antilichamen (IgM + IgG) van BALB/c muizen (n = 20), uitgedrukt in relatieve fluorescentie eenheden (RFU) als mediaan ± MAD, en het aantal dieren meer dan afgesneden (≥4000 RFU). Deze tabel is weergegeven vanaf Bello-Gil, D. et al.. 28. Please click here to download deze tabel

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Glycan microarrays zijn onmisbare tools voor de studie van eiwit-glycan interacties40geworden. Het huidige werk beschrijft een protocol op basis van PGA technologie te bestuderen van het repertoire van het circuleren van anti-koolhydraten antilichamen in BALB/c muizen. Aangezien PGA de mogelijkheid om de grote aantallen scherm van biologisch onbekende glycanen biedt, is een uitzonderlijk gunstige discovery tool13,15,28. De voorgestelde methode biedt de mogelijkheid om te meten, in dezelfde experimentele instelling, honderden glycan structuren met behulp van een verminderd bedrag van serologische monster (50 µL). Dit is vooral essentieel in het geval van kleine dieren (weinig Circulerend bloed volume), of wanneer het nodig is te uittreksel bloed meerdere malen uit de dezelfde proefdieren.

We toonden, als representatieve resultaten, dat genetisch identiek muizen niet moeten worden beschouwd als immunologische equivalenten; omdat ze ontwikkelen de verschillende patronen van natuurlijke anti-koolhydraten antilichamen (slechts 12 glycan specifieke kenmerken werden bewaard). Serologische niveaus voor de rest van het repertoire van natuurlijke anti-koolhydraten antilichamen gevarieerd aanzienlijk onder de onderzochte dieren. Analyse van de darmflora van ingeteelde dieren41 uitleggen deze heterogeniteit42,43,44,45,46. Als de productie van natuurlijke anti-glycan antilichamen is bemiddeld door de antigene stimulatie van microbiota en dit onder ingeteelde muizen41 verschilt, fijne specificiteit van deze antilichamen worden niet identiek.

Het belangrijkste nadeel voor PGA ontwikkeling is de toegang tot en met welomschreven glycan structuren40,47. Glycanen geproduceerd in biologische systemen zijn heterogene40,47,48, en hun biosynthese is gebaseerd op de differentiële expressie van koolhydraten enzymen, wat resulteert in heterogene mengsels van glycoforms, elk met een verschillende fysiologische activiteit47. De complexe samenstelling en de configuratie van de glycanen aanwezig in de biologische systemen maken hun producties uitdagende40,47,48. Samen met chemo-enzymatische synthese blijft glycanen geïsoleerd uit natuurlijke bronnen de belangrijkste bron van glycanen voor arrays ontwikkeling40. Lage synthetische opbrengsten en de complexe zuiveringsproces van glycoproteïnen en glycosphingolipids maken de efficiënte productie van glycanen op grote schaal moeilijk40,47,48. Vandaar, de beschikbaarheid en de prijzen van glycanen blijven een zeer beperkende voorwaarde om uit te breiden van het gebruik van PGA als een ontdekkingshulpmiddel.

Bovendien binnen het protocol, moeten kritische stappen meestal met betrekking tot de juiste verdeling van de oplossingen (serum, secundaire antilichamen) over het oppervlak van de glycochip worden uitgevoerd met de nodige voorzichtigheid. De methodologie heeft, tenminste, 1 mL van deze oplossingen, homogeen weken alle droge gebieden van het oppervlak glycochip. Dit is van cruciaal belang om te verkrijgen van minimale verschillen tussen glycan wordt gerepliceerd en ook om te voorkomen dat buitensporige achtergrond tijdens kwantificering.

Ondanks de genoemde beperkingen is PGA een zeer gevoelig instrument voor benaderingen gerelateerd aan studie eiwit-glycan interacties40, studie van het repertoire van anti-glycan antilichamen in een bepaalde experimentele instelling of voorwaarde13, 15,28. Deze studie kan worden geëxtrapoleerd naar verschillende soorten (met inbegrip van menselijke monsters) 13,15,23,28, bieden een veelzijdige methodologie voor het identificeren van het repertoire van circulerende anti-koolhydraten antilichamen.

Wij verwachten ook de potentie die deze aanpak kan brengen in de vroegtijdige diagnose en behandeling van de afgeleide in een aantal van de pathologische condities waar antilichamen aan glycan structuren gericht lijken een belangrijke rol spelen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Nailya Khasbiullinaen Alexey Nokel zijn onze medewerkers van Semiotik LLC, die de leverancier van de glycochips gebruikt in deze studie is.

Acknowledgments

Dit werk werd gesteund door de "Fondo de Investigaciones Sanitarias" (FIS) verlenen PI13/01098 van Carlos III Health Institute, Spaanse ministerie van volksgezondheid. DB-G werd geprofiteerd van een positie van de post-doctoraal onderzoek gefinancierd door de Europese Unie zevende kaderprogramma (KP7/2007-2013) onder de Grant overeenkomst 603049 (TRANSLINK). Werk van NK, NS, en NB werd gesteund door toekenning #14-50-00131 van Russische Science Foundation. DB-G wil zijn dank betuigen aan Marta Broto, J. Pablo Salvador en Ana Sanchis voor uitstekende technische bijstand en Alexander Rakitko voor hulp bij de statistische analyse. Met de steun van de "Pla de Doctorats Industrials de la Secretaria d'Universitats ik Recerca del Departament d'Empresa ik Coneixement de la Generalitat de Catalunya (verlenen van nummer 2018 DI 021). Wij danken CERCA programma / Generalitat de Catalunya voor institutionele ondersteuning.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Antibodies
biotinylated goat anti-human Igs Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA Ref. #: 31782
biotinylated goat anti-mouse IgM + IgG Thermo Fisher Scientific Ref. #: 31807
Equipment
Robotic Arrayer sciFLEXARRAYER S5  Scienion AG, Berlin, Germany http://www.scienion.com/products/sciflexarrayer/
Stain Tray (slide incubation chamber) Simport, Beloeil, QC, Canada Ref. #: M920-2
Centrifuge Eppendorf, Hamburg, Germany  Ref. #: 5810 R
Pipettes Gilson, Middleton, WI, USA http://www.gilson.com/en/Pipette/
Slide Scanner  PerkinElmer, Waltham, MA, USA ScanArray GX Plus 
Shaking incubator Cole-Parmer, Staffordshire, UK Ref. #: SI50
Biological samples
BALB/c mice sera This paper N/ A
Complex Immunoglobulin Preparation (CIP) Immuno-Gem, Moscow, Russia http://www.biomedservice.ru/price/goods/1/17531
Chemicals, Reagents and Glycans 
Glycan library Institute of Bioorganic Chemistry (IBCh), Moscow, Russia N/ A
Bovine serum albumin (BSA) Sigma-Aldrich, St. Louis, MO,  Ref. #: A9418
Ethanolamine Sigma-Aldrich Ref. #: 411000
Tween-20 Merck Chemicals & Life Science S.A., Madrid, Spain Ref. #: 655204
Phospahte buffered saline (PBS) VWR International Eurolab S.L, Barcelona, Spain Ref. #: E404
Sodium azide Sigma-Aldrich Ref. #: S2002
Streptavidin Alexa Fluor 555 conjugate  Thermo Fisher Scientific Ref. #: S21381
Streptavidin Cy5 conjugate GE Healthcare, Little Chalfont, Buckinghamshire, UK Ref. #: PA45001
Materials
N-hydroxysuccinimide-derivatized glass slides H  Schott-Nexterion, Jena, Germany Ref. #: 1070936
Whatman filter paper  Sigma-Aldrich Ref. #: WHA10347509
1.5 mL tubes Eppendorf  Ref. #: 0030120086
Software and algorithms
ScanArray Express Microarray Analysis System PerkinElmer http://www.per
kinelmer.com/microarray
Hierarchical Clustering Explorer application University of Maryland, MD, USA http://www.cs.umd.edu/hcil/hce/

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Karlsson, G. B., Fouchier, R. A., Phogat, S., Burton, D. R., Sodroski, J., Wyatt, R. T. The challenges of eliciting neutralizing antibodies to HIV-1 and to influenza virus. Nat Rev Microbiol. 6 (2), 143-155 (2008).
  2. Lu, L. L., Suscovich, T. J., Fortune, S. M., Alter, G. Beyond binding: antibody effector functions in infectious diseases. Nat Rev Immunol. 18 (1), 46-61 (2017).
  3. Bebbington, C., Yarranton, G. Antibodies for the treatment of bacterial infections: current experience and future prospects. Curr Opin Biotech. 19 (6), 613-619 (2008).
  4. Murphy, K., Travers, P., Walport, M. The complement system and innate immunity. Janeway's Immunobiology. , 7th, Garland Science. New York. 61-80 (2008).
  5. Botto, M., Kirschfink, M., Macor, P., Pickering, M. C., Wurzner, R., Tedesco, F. Complement in human diseases: lessons from complement deficiencies. Mol Immunol. 46 (14), 2774-2783 (2009).
  6. Borrok, M. J., et al. Enhancement of antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity by endowing IgG with FcαRI (CD89) binding. MAbs. 7 (4), 743-751 (2015).
  7. Weiner, L. M., Murray, J. C., Shuptrine, C. W. Antibody-based immunotherapy of cancer. Cell. 148 (6), 1081-1084 (2012).
  8. Ricklin, D., Hajishengallis, G., Yang, K., Lambris, J. D. Complement: a key system for immune surveillance and homeostasis. Nat Immunol. 11 (9), 785-797 (2010).
  9. Prechl, J. A generalized quantitative antibody homeostasis model: antigen saturation, natural antibodies and a quantitative antibody network. Clin Transl Immunology. 6 (2), e131 (2017).
  10. Vojdani, A. Antibodies as predictors of complex autoimmune diseases. Int J Immunopath Ph. 21 (2), 267-278 (2008).
  11. Liu, W., Peng, B., Lu, Y., Xu, W., Qian, W., Zhang, J. Y. Autoantibodies to tumor-associated antigens as biomarkers in cancer immunodiagnosis. Autoimmun Rev. 10 (6), 331-335 (2011).
  12. Suurmond, J., Diamond, B. Autoantibodies in systemic autoimmune diseases: specificity and pathogenicity. J Clin Invest. 125 (6), 2194-2202 (2015).
  13. Bovin, N., et al. Repertoire of human natural anti-glycan immunoglobulins. Do we have auto-antibodies? Biochim Biophys Acta. 1820 (9), 1373-1382 (2012).
  14. de los Rios, M., Criscitiello, M. F., Smider, V. V. Structural and genetic diversity in antibody repertoires from diverse species. Curr Opin Struc Biol. 33, 27-41 (2015).
  15. Pochechueva, T., et al. Comparison of printed glycan array, suspension array and ELISA in the detection of human anti-glycan antibodies. Glycoconjugate J. 28 (8-9), 507-517 (2011).
  16. Shilova, N., Navakouski, M., Khasbiullina, N., Blixt, O., Bovin, N. Printed glycan array: antibodies as probed in undiluted serum and effects of dilution. Glycoconjugate J. 29 (2-3), 87-91 (2012).
  17. Manimala, J. C., Roach, T. A., Li, Z., Gildersleeve, J. C. High-throughput carbohydrate microarray profiling of 27 antibodies demonstrates widespread specificity problems. Glycobiology. 17 (8), 17C-23C (2007).
  18. Jacob, F., et al. Serum anti-glycan antibody detection of non-mucinous ovarian cancers by using a printed glycan array. Int. J. Cancer. 130 (1), 138-146 (2012).
  19. Lewallen, D. M., Siler, D., Iyer, S. S. Factors affecting protein-glycan specificity: effect of spacers and incubation time. ChemBioChem. 10 (9), 1486-1489 (2009).
  20. Oyelaran, O., Li, Q., Farnsworth, D., Gildersleeve, J. C. Microarrays with varying carbohydrate density reveal distinct subpopulations of serum antibodies. J. Proteome Res. 8 (7), 3529-3538 (2009).
  21. Pochechueva, T. Multiplex suspension array for human anti-carbohydrate antibody profiling. Analyst. 136 (3), 560-569 (2011).
  22. Chinarev, A. A., Galanina, O. E., Bovin, N. V. Biotinylated multivalent glycoconjugates for surface coating. Methods Mol Biol. 600, 67-78 (2010).
  23. Huflejt, M. E. Anti-carbohydrate antibodies of normal sera: findings, surprises and challenges. Mol Immunol. 46 (15), 3037-3049 (2009).
  24. Buchs, J. P., Nydegger, U. E. Development of an ABO-ELISA for the quantitation of human blood group anti-A and anti-B IgM and IgG antibodies. J Immunol Methods. 118 (1), 37-46 (1989).
  25. de Jager, W., Rijkers, G. T. Solid-phase and bead-based cytokine immunoassay: a comparison. Methods. 38 (4), 294-303 (2006).
  26. Galanina, O. E., Mecklenburg, M., Nifantiev, N. E., Pazynina, G. V., Bovin, N. V. GlycoChip: multiarray for the study of carbohydrate binding proteins. Lab Chip. 3 (4), 260-265 (2003).
  27. Willats, W. G., Rasmussen, S. E., Kristensen, T., Mikkelsen, J. D., Knox, J. P. Sugar-coated microarrays: a novel slide surface for the high-throughput analysis of glycans. Proteomics. 2 (12), 1666-1671 (2002).
  28. Bello-Gil, D., Khasbiullina, N., Shilova, N., Bovin, N., Mañez, R. Repertoire of BALB/c mice natural anti-Carbohydrate antibodies: mice vs. humans difference, and otherness of individual animals. Front Immunol. 8, 1449 (2017).
  29. Pazynina, G., et al. Synthetic glyco-O-sulfatome for profiling of human natural antibodies. Carbohydr Res. 445, 23-31 (2017).
  30. Ryzhov, I. M., Korchagina, E. Y., Popova, I. S., Tyrtysh, T. V., Paramonov, A. S., Bovin, N. V. Block synthesis of A (type 2) and B (type 2) tetrasaccharides related to the human ABO blood group system. Carbohydr Res. 430, 59-71 (2016).
  31. Ryzhov, I. M., et al. Function-spacer-lipid constructs of Lewis and chimeric Lewis/ABH glycans. Synthesis and use in serological studies. Carbohyd Res. 435, 83-96 (2016).
  32. Pazynina, G. V., Tsygankova, S. V., Sablina, M. A., Paramonov, A. S., Tuzikov, A. B., Bovin, N. V. Stereo- and regio-selective synthesis of spacer armed α2-6 sialooligosaccharides. Mendeleev Commun. 26 (5), 380-382 (2016).
  33. Pazynina, G. V., Tsygankova, S. V., Sablina, M. A., Paramonov, A. S., Formanovsky, A. A., Bovin, N. V. Synthesis of blood group pentasaccharides ALey, BLey and related tri- and tetrasaccharides. Mendeleev Commun. 26 (2), 103-105 (2016).
  34. Severov, V. V., Pazynina, G. V., Ovchinnikova, T. V., Bovin, N. V. The synthesis of oligosaccharides containing internal and terminal Galβ1-3GlcNAcβ fragments. Russian J. Bioorgan. Chem. 41 (2), 147-160 (2015).
  35. Pazynina, G. V., Tsygankova, S. V., Bovin, N. V. Synthesis of glycoprotein N-chain core fragment GlcNAcβ1-4(Fucα1-6)GlcNAc. Mendeleev Commun. 25 (4), 250-251 (2015).
  36. Solís, D., et al. A guide into glycosciences: How chemistry, biochemistry and biology cooperate to crack the sugar code. Biochim Biophys Acta. 1850 (1), 186-235 (2015).
  37. Pazynina, G. V., et al. Divergent strategy for the synthesis of α2-3-Linked sialo-oligosaccharide libraries using a Neu5TFA-(α2-3)-Gal building block. Synlett. 24 (02), 226-230 (2013).
  38. Blixt, O., et al. Printed covalent glycan array for ligand profiling of diverse glycan binding proteins. P Natl Acad Sci USA. 101 (49), 17033-17038 (2004).
  39. Liu, Y., et al. The minimum information required for a glycomics experiment (MIRAGE) project: improving the standards for reporting glycan microarray-based data. Glycobiology. 27 (4), 280-284 (2017).
  40. Song, X., Heimburg-Molinaro, J., Cummings, R. D., Smith, D. F. Chemistry of natural glycan microarrays. Curr Opin Chem Biol. 18, 70-77 (2014).
  41. Hoy, Y. E., et al. Variation in taxonomic composition of the fecal microbiota in an inbred mouse strain across individuals and time. PLoS One. 10 (11), e0142825 (2015).
  42. D'Argenio, V., Salvatore, F. The role of the gut microbiome in the healthy adult status. Clin Chim Acta. 451 (Pt A), 97-102 (2015).
  43. Khasbiullina, N. R., Bovin, N. V. Hypotheses of the origin of natural antibodies: a glycobiologist's opinion. Biochemistry (Mosc). 80 (7), 820-835 (2015).
  44. Butler, J. E., Sun, J., Weber, P., Navarro, P., Francis, D. Antibody repertoire development in fetal and newborn piglets, III. Colonization of the gastrointestinal tract selectively diversifies the preimmune repertoire in mucosal lymphoid tissues. Immunology. 100 (1), 119-130 (2000).
  45. Bos, N. A., et al. Serum immunoglobulin levels and naturally occurring antibodies against carbohydrate antigens in germ-free BALB/c mice fed chemically defined ultrafiltered diet. Eur J Immunol. 19 (12), 2335-2339 (1980).
  46. van der Heijden, P. J., Bianchi, A. T., Heidt, P. J., Stok, W., Bokhout, B. A. Background (spontaneous) immunoglobulin production in the murine small intestine before and after weaning. J Reprod Immunol. 15 (3), 217-227 (1989).
  47. Krasnova, L., Wong, C. H. Understanding the chemistry and biology of glycosylation with glycan synthesis. Annu Rev Biochem. 85, 599-630 (2016).
  48. Overkleeft, H. S., Seeberger, P. H., et al. Chemoenzymatic synthesis of glycans and glycoconjugates. Essentials of Glycobiology [Internet]. Varki, A., et al. , 3rd, Cold Spring Harbor Laboratory Press. Cold Spring Harbor (NY). Chapter 54 2015-2017 (2017).

Tags

Immunologie en infecties probleem 144 patroon van natuurlijke antilichamen circulerende antilichamen anti-glycan glycan-specifieke kenmerken glycochips afgedrukt glycan matrix PGA muizen
Gedrukte Glycan Array: Een gevoelige techniek voor de analyse van het Repertoire van circulerende anti-koolhydraten antilichamen in kleine dieren
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Olivera-Ardid, S., Khasbiullina, N., … More

Olivera-Ardid, S., Khasbiullina, N., Nokel, A., Formanovsky, A., Popova, I., Tyrtysh, T., Kunetskiy, R., Shilova, N., Bovin, N., Bello-Gil, D., Mañez, R. Printed Glycan Array: A Sensitive Technique for the Analysis of the Repertoire of Circulating Anti-carbohydrate Antibodies in Small Animals. J. Vis. Exp. (144), e57662, doi:10.3791/57662 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter