Summary
هنا، نقدم بروتوكولا لتوليد المستحثة pluripotent الخلايا الجذعية (إيبسكس) من متلازمة لي-Fraumeni (الدراسة الاستقصائية) الليفية المشتقة المريض، التفريق بين إيبسكس عبر الخلايا الجذعية الوسيطة (MSCs) إلى خلايا الاوستيوبلاستس، والنمذجة في فيفو توموريجينيسيس باستخدام خلايا الاوستيوبلاستس المستمدة من المريض في الدراسة الاستقصائية.
Abstract
متلازمة لي-Fraumeni (الدراسة الاستقصائية) اضطراب جسمي سرطان وراثية مهيمنة. المرضى الذين يعانون من الدراسة الاستقصائية مهيئون لنوع مختلف من الأورام، بما في ذلك أوستيوساركوما-واحدة من الأورام الخبيثة غير الدموية الأولية الأكثر شيوعاً في مرحلة الطفولة والمراهقة. ولذلك، تقدم الدراسة الاستقصائية نموذجا مثاليا لدراسة هذا الورم الخبيث. الاستفادة من المنهجيات اللجنة التوجيهية، يمكن أن تكون على غرار osteosarcoma المرتبطة بالدراسة الاستقصائية بنجاح بالتفريق بين الدراسة الاستقصائية إيبسكس المريض للخلايا الجذعية الوسيطة (MSCs)، ومن ثم إلى خلايا الاوستيوبلاستس-خلايا المنشأ ل osteosarcomas. هذه الدراسة الاستقصائية خلايا الاوستيوبلاستس الخص النمطان خصائص osteosarcoma، توفير نظام نموذج جذاب لتحديد الآلية المرضية أوستيوساركوما. يوضح هذه المخطوطة على بروتوكول لتوليد إيبسكس من الدراسة الاستقصائية المريض الليفية، التفريق بين إيبسكس إلى MSCs، التفريق بين MSCs إلى خلايا الاوستيوبلاستس، و في فيفو tumorigenesis باستخدام خلايا الاوستيوبلاستس الدراسة الاستقصائية. ويمكن تمديد هذا النموذج المرض اللجنة التوجيهية لتحديد المؤشرات الحيوية المحتملة أو الأهداف العلاجية ل osteosarcoma المرتبطة بالدراسة الاستقصائية.
Introduction
بين عامي 2006 و 2007، أدت نتائج اختراق عدة من مختبرات الدكتور شينيا ياماناكا وألف جيمس تومسون إلى تطوير المستحثة pluripotent الخلايا الجذعية (إيبسكس)1،،من23. بإعادة برمجة خلايا جسدية مع تعريف العوامل النسخي للنموذج إيبسكس، الباحثين وكانت قادرة على توليد خلايا ذات الخصائص الرئيسية هي، بلوريبوتينسي، والتجديد الذاتي، الذي كان يعتقد في السابق فقط موجودة في الخلايا الجذعية الجنينية البشرية (هيسكس). إيبسكس يمكن أن تتولد من أي فرد أو المريض، ولم يكن يمكن أن تستمد من الأجنة، إلى حد كبير توسيع مرجع الأمراض المتاحة والخلفيات للدراسة. ومنذ ذلك الحين، استخدمت إيبسكس المستمدة من المريض أن الخص النمط الظاهري لمختلف الأمراض البشرية، من مرض الزهايمر4 والتصلب العضلي الجانبي5 إلى طويلة كيو تي متلازمة6،7، 8.
أوجه التقدم هذه في اللجنة التوجيهية للبحث أيضا قد فتحت آفاقاً جديدة لبحوث السرطان. عدة مجموعات مؤخرا استخدمت إيبسكس المريض لنموذج التنمية سرطان تحت خلفية وراثية عرضه9،،من1011، مع التطبيق الناجح أثبتت حتى الآن في أوستيوساركوما9، سرطان الدم10،11،12، و13من سرطان القولون والمستقيم. على الرغم من أن نماذج السرطان المستمدة من اللجنة التوجيهية لا تزال في بداياتها، قد أظهروا إمكانات كبيرة في فينوكوبيينج المرتبطة بأمراض الأورام الخبيثة، توضيح الآليات المرضية، وتحديد المركبات العلاجية14.
متلازمة لي-Fraumeni (الدراسة الاستقصائية) اضطراب جسمية سرطان وراثي السائد الناجم عن الطفرة germline TP53 15. المرضى الذين يعانون من الدراسة الاستقصائية مهيئون لنوع مختلف من الأورام الخبيثة، بما في ذلك أوستيوساركوما، مما يجعل إيبسكس الدراسة الاستقصائية والخلايا المشتقة الخاصة لا سيما مناسبة تماما لدراسة هذا الورم الخبيث16. نموذج osteosarcoma المستندة إلى اللجنة التوجيهية أنشئت أول مرة في عام 2015 في وقت لاحق باستخدام الدراسة الاستقصائية إيبسكس المستمدة من المريض9 متباينة في الخلايا الجذعية الوسيطة (MSCs) وثم إلى خلايا الاوستيوبلاستس، التي تنشأ الخلايا من أوستيوساركوما. تلخيص هذه الدراسة الاستقصائية خلايا الاوستيوبلاستس العيوب المرتبطة osteosarcoma osteogenic التمايز وخصائص النمطان، مما يدل على نموذج المحتملة كمنصة "ورم العظام في طبق". التحليلات على نطاق الجينوم الترنسكربيتوم تكشف عن جوانب توقيع osteosarcoma الجينات في خلايا الاوستيوبلاستس الدراسة الاستقصائية من المثير للاهتمام، وأن ملامح هذه الشخصية التعبير الجيني في الدراسة الاستقصائية ترتبط بسوء التشخيص في osteosarcoma9، مشيراً إلى إمكانات الدراسة الاستقصائية إيبسكس المرض نماذج لتكشف عن ملامح أهميتها السريرية.
هذه المخطوطة يوفر وصفاً مفصلاً لكيفية استخدام الدراسة الاستقصائية إيبسكس المستمدة من المريض إلى نموذج أوستيوساركوما. أنها تفاصيل توليد إيبسكس الدراسة الاستقصائية، التفريق بين إيبسكس إلى MSCs ومن ثم إلى خلايا الاوستيوبلاستس، واستخدامها في فيفو إكسينوجرافت نموذج لاستخدام خلايا الاوستيوبلاستس الدراسة الاستقصائية. نموذج المرض الدراسة الاستقصائية وتضم العديد من المزايا، وأبرزها القدرة على توليد خلايا غير محدود في جميع مراحل التنمية osteosarcoma الدراسات الميكانيكية وتحديد العلامات البيولوجية، والمخدرات فرز149،، 16.
وباختصار، يوفر الطراز osteosarcoma المستندة إلى اللجنة التوجيهية الدراسة الاستقصائية نظام تكميلي جذابة للنهوض بالبحوث أوستيوساركوما. كما ينص هذا النظام الأساسي من بين مفهوم إثبات السرطان النمذجة باستخدام إيبسكس المستمدة من المريض. ويمكن تمديد هذه الاستراتيجية الوارد وصفها أدناه سهولة إلى نموذج الأورام الخبيثة المرتبطة مع غيرها من الاضطرابات الوراثية مع الميول السرطان.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
واعتمد هذا العمل بمركز العلوم الصحية في "جامعة تكساس" في هيوستن (أوثيالث) "للجنة رعاية الحيوان". وتجري التجارب يتفق بشكل صارم مع المعايير التي وضعتها في مركز أوثيالث "الطب الحيوانات المختبرية" والرعاية (كلامك) التي معتمدة من قبل "الرابطة الأمريكية" "مختبر رعاية الحيوان" (آآلاك International). البشر في هذه الدراسة تندرج في إطار السيناريو ("لا البشرية مواضيع بحث") كما حددتها الوثائق SF424 المعاهد الوطنية للصحة. ولذلك، فإنه لا حاجة أي موافقة لجنة أخلاقيات البحوث البشرية أوثيالث.
1-جيل من الدراسة الاستقصائية إيبسكس (الشكل 1A)
- في يوم-2، لوحة 2 × 104 الدراسة الاستقصائية الليفية المريض في بئر واحدة للوحة 6-جيدا، وثقافة الخلايا مع تنتجها الخلايا الليفية المتوسطة (الجدول 1) عند 37 درجة مئوية في هوميديفيد 5% CO2 حاضنة. ضمان أن الليفية التوصل إلى التقاء 50-60% في اليوم لتوصيل (يوم 0).
- إجراء توصيل الفيروسات سينداي اليوم 0. للقيام بذلك، استبدال المستهلك المتوسط مع متوسط حرارة قبل تنتجها الخلايا الليفية. ذوبان الجليد سينداي التجارية إعادة برمجة فيروس كيت (انظر الجدول للمواد) على الجليد. تصيب الخلايا الليفية الدراسة الاستقصائية مع فيروسات سينداي المختلطة وفقا لإرشادات الشركة المصنعة.
- صيانة الخلايا ترانسدوسيد في المتوسط تنتجها الخلايا الليفية (اليوم 1-6):
- في اليوم 1، 24 ساعة بعد توصيل، إزالة المتوسطة تنتجها الخلايا الليفية التي تحتوي على الفيروسات سينداي المتبقية واستبدله مع 2 مل الطازجة تنتجها الخلايا الليفية المتوسطة. ثقافة الليفية ترانسدوسيد عند 37 درجة مئوية في نسبة % 5 هوميديفيد CO2 حاضنة.
- تغيير المتوسطة مع المتوسط تنتجها الخلايا الليفية كل يوم من يوم 2-6.
- صيانة الخلايا ترانسدوسيد في حالة تغذية الثقافة (يوم 7-28):
- إعداد المشع CF1 الماوس جنينية تنتجها الخلايا الليفية (MEF) ثقافة الأطباق على 6 يوم. للقيام بهذا المعطف نضح ستة أطباق زراعة الأنسجة 100 ملم بإضافة 5 مل جيلاتين 0.1% لكل لوحة في درجة حرارة الغرفة عن 30 دقيقة الجيلاتين 0.1% بعد الطلاء.
- إزالة ميفس من حاوية نيتروجين سائل. ذوبان الجليد MEFs تستخدم نظام متاح تجارياً ذوبان اتباع إرشادات الشركة المصنعة. لوحة الخلايا على لوحات المغلفة بالجيلاتين مع MEF/ماجستير الثقافة المتوسطة (الجدول 1) في كثافة بذر حوالي 6.7 × 105 خلايا كل طبق استنبات الأنسجة 100 مم.
- تلقيح خلايا ترانسدوسيد على لوحات MEF (يوم 7): تريبسينيزي الخلايا ترانسدوسيد باستخدام 1 مل من 0.25% يدتا التربسين كل طبق 100 مم لمدة 2-4 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. تحييد التربسين مع 9 مل متوسطة تنتجها الخلايا الليفية. نقل الخلايا إلى أنابيب مخروطية وخلايا أجهزة الطرد المركزي في 230 س ز في 37 درجة مئوية للحد الأدنى 4 لوحة الليفية ترانسدوسيد على الأطباق MEF ستة إعداد في يوم 6 والثقافة لهم في 8 مل متوسطة تنتجها الخلايا الليفية للطبق الواحد.
ملاحظة: كونفلوينسي ميفس هو حوالي 20% قبل البذر خلية ترانسدوسيد على ألواح MEF. - اليوم 8، تجاهل المتوسطة تنتجها الخلايا الليفية واستبدل بمتوسط هيس (الجدول 1).
- انتظر حتى ظهور استنساخ البرامج المتكاملة من أيام 9-28 (الشكل 1ج). تغيير المتوسطة هيس المستهلك كل يوم ورصد ظهور استنساخ البرامج المتكاملة تحت المجهر. الانتظار لاستنساخ إيبسكس كبيرة بما يكفي ملاحظة بالعين المجردة وثم الشروع في توسيع استنساخ البرامج المتكاملة في حالة ثقافة خالية من علبة التغذية بالورق.
- التوسع في البرامج المتكاملة ظهرت استنساخ في حالة خالية من تغذية الثقافة (يوم 29-79 ~ 99):
- إعداد لوحة المغلفة بالمصفوفة، معطف صفيحة 48-جيدا مع 120 ميليلتر من الغشاء مصفوفة الطلاء الحل (الجدول 1) كل بئر. تأكد من أن الحل طلاء مصفوفة الغشاء يغطي البئر ويكسو سطح الطبق الثقافة. تترك في درجة حرارة الغرفة ل 1 h. أسبيراتي الحل الطلاء مباشرة قبل الاستخدام وإضافة 250 ميليلتر من هيس المتوسطة الواحدة وكذلك مع 2 ميكرومتر روك مثبط ثيازوفيفين.
- في 28 يوما، نضح المتوسطة هيس المستهلك وتغسل استنساخ البرامج المتكاملة مع 1 x DPBS. التقاط استنساخ iPS مرئية مع تلميح ماصة 1 مل ونقل في بئر لوحة 48-كذلك المعالجة (الخطوة 1.4.1). بذور مستعمرة واحدة كل من لوحة 48-جيدا جيدا.
- الطرد المركزي اللوحة في 230 س ز لمدة دقيقة 4 تيسير المرفق الخلية. ثقافة استنساخ البرامج المتكاملة في 37 درجة مئوية في نسبة % 5 هوميديفيد CO2 حاضنة.
- وفي اليوم التالي (يوم 29)، إزالة المتوسطة هيس المستهلك وإضافة 250 ميليلتر من المتوسطة اللجنة التوجيهية المتاحة تجارياً في كل بئر.
- الحفاظ على استنساخ البرامج المتكاملة في 37 درجة مئوية في نسبة % 5 هوميديفيد CO2 حاضنة، وتغيير المتوسطة اللجنة التوجيهية كل يوم.
- عند استنساخ iPS التوصل إلى التقاء 85%، ثقافة فرعية الخلايا في 01:10 نسبة حسب مجال الثقافة. إضافة 60 ميليلتر من الحل باساجينج التجارية لفصل الخلايا واحتضان في 37 درجة مئوية لمدة 3 دقائق.
- البذور نصف إيبسكس منفصلة على غشاء المغلفة بمصفوفة لوحة 12-جيدا في 1 مل هيس متوسطة مع 2 ميكرومتر روك مثبط ثيازوفيفين. ثقافة استنساخ البرامج المتكاملة في صفيحة 12-جيدا مع 1 مل المتوسطة اللجنة التوجيهية المتاحة تجارياً كل ثقافة فرعية وكذلك إيبسكس في 01:10 نسبة حتى بلوغهم سن 10.
ملاحظة: يتم إيبسكس الفرعي مثقف كل 5-7 أيام في 01:10 نسبة. ويستغرق مدة تصل إلى 10 أسابيع لاستنساخ البرامج المتكاملة للوصول إلى مرور 10. يمكن فحص الأوصاف اللجنة التوجيهية بما في ذلك مورفولوجيا الخلايا والنشاط الفوسفاتيز القلوي (AP)، والتعبير عن العوامل بلوريبوتينسي وعلامات هيسك، بعد التأكد من إزالة الفيروس سينداي في إيبسكس (تبين عادة بعد حوالي 10 مقاطع) (الشكل 1B-E). معلومات جسم والتمهيدي لتوصيف اللجنة التوجيهية مدرجة في الجدول 2 و 4.
2-التفريق في الدراسة الاستقصائية إيبسكس "الخلايا الجذعية الوسيطة" (MSCs) (الشكل 2A)
- استنساخ الثقافة اللجنة التوجيهية على ألواح MEF لمدة أسبوعين على الأقل (اليوم ~-14-0): إعداد أطباق MEF (أطباق زراعة الأنسجة 100 ملم)، كما تم وصفه سابقا (1.3.1-1-3-2). الحفاظ على إيبسكس في المتوسط هيس وتغيير المتوسط كل يوم. كلما إيبسكس التوصل إلى التقاء 90 ٪، إيبسكس ثقافة فرعية من 01:10 إضعاف.
- إزالة ميفس من إيبسكس (يوم 0):
- بعد الحفاظ على إيبسكس في ميفس لمدة أسبوعين، إيبسكس الثقافة في 100 ملم زراعة الأنسجة الأطباق حتى الخلايا التوصل إلى التقاء 80-90%. إزالة المتوسطة هيس المستهلك وتغسل إيبسكس مع 5 مل 1 x DPBS. أضف 1 مل الحل خلية مفرزة لفصل الخلايا واحتضان في درجة حرارة الغرفة لمدة 3 دقائق.
- إضافة 9 مل من MEF/ماجستير الثقافة المتوسطة إلى لوحة لتحييد نشاط حل مفرزة الخلية ونقل الخلايا المنفصلة إلى طبق استنبات الأنسجة 100 ملم جديدة دون أي طلاء.
- احتضان الخلايا في درجة حرارة الغرفة لمدة 30 دقيقة للسماح ميفس تعلق على اللوحة.
- بعناية بجمع المادة طافية الذي يحتوي على إيبسكس فاتحة، وأجهزة الطرد المركزي في 230 س ز عند 4 درجة مئوية لمدة 4 دقائق.
ملاحظة: بلا مبالاة التنظيف أسفل لوحة يؤدي إلى مفرزة من ميفس.
- التفريق بين إيبسكس نحو MSCs (اليوم 0-28):
- معطف ثلاث آبار للوحة 6-جيدا مع 1 مل جيلاتين 0.1% كل بئر في درجة حرارة الغرفة لمدة 30 دقيقة.
- إزالة المادة طافية إيبسكس التي تم جمعها من 2.2.4.
- ريسوسبيند إيبسكس في 6 مل MSC التمايز المتوسطة (الجدول 1) وخلايا البذور في الآبار المغلفة ثلاثة مع 2 مل في البئر (يوم 0).
- تغيير وسيلة تمايز ماجستير كل يومين لإزالة الخلايا فاتحة و/أو ميتا (اليوم 1-28).
- نضوج MSCs المستمدة من اللجنة التوجيهية (يوم 28-45):
- إزالة المتوسطة ماجستير المستهلك على التمايز وغسل الخلايا مع 1 مل 1 x DPBS.
- تريبسينيزي MSCs مع 0.5 مل من 0.25% يدتا التربسين الواحدة وكذلك في درجة حرارة الغرفة لمدة 3 دقائق.
- تحييد التربسين من 1.5 مل المتوسط الثقافة MEF/ماجستير وجمع MSCs من ثلاث آبار في أنبوب مخروطي 15 مل واحد. أجهزة الطرد المركزي في 230 س ز عند 4 درجة مئوية لمدة 4 دقائق.
- إزالة المادة طافية وريسوسبيند MSCs في 3 مل MEF/ماجستير الثقافة المتوسطة وطبق على 60 مم 0.1% المغلفة بالجيلاتين لوح واحد (28 يوما).
- الثقافة MSCs في MEF/ماجستير الثقافة المتوسطة وتغيير المتوسطة كل يومين. عندما تصل الخلايا إلى التقاء 100 ٪، MSCs ثقافة فرعية بنسبة 1:3 باستخدام 0.25% يدتا التربسين.
ملاحظة: عرض MSCs مورفولوجيا تشبه تنتجها الخلايا الليفية (الشكل 2). MSCs ممدود عندما تنمو MSCs في كثافة عالية، يمكن أن تشكل نمطاً شبيهة بالدوامة (الشكل 2). - أداء تلطيخ إيمونوفلوريسسينت لتقييم MSCs المستمدة من اللجنة التوجيهية بدراسة ماجستير السطح علامات CD44، CD73، CD105، و CD166 (الشكل 2).
ملاحظة: التخفيف من الأجسام المضادة معروضة في الجدول 2. يتم تلوين إيمونوفلوريسسينت للخلايا الحية وفقا لإرشادات الشركة المصنعة. - بعد تأكيد، قم بتوسيع MSCs بنسبة 1:3 في أطباق زراعة الأنسجة 100 مم. تجميد أسفل قارورة (قنينة 3 كل طبق استنبات الأنسجة 100 مم) باستخدام المتوسط التجميد التي تحتوي على [دمس] 10% و 90% FBS.
ملاحظة: لإثراء السكان لجنة السلامة البحرية، MSCs يمكن فرزها باستخدام CD105+، CD24-معايير التدفق الخلوي9،17. يمكن الحفاظ على MSCs المستمدة من اللجنة التوجيهية متباينة عادة باستخدام الأسلوب القائم على أساسها PDGF لمدة 2-3 أشهر في الثقافة دون فقدان الهوية MSC9. تجميد MSCs من رقم مرور مبكر بعد تأكيد الخصائص MSC.
3-التفريق بين الدراسة الاستقصائية MSCs إلى خلايا الاوستيوبلاستس (الشكل 3A)
- إعداد MSCs للتفريق بين أوستيوجينيك (اليوم-1)
- لضمان كمية كافية من الخلايا لإكمال البروتوكول osteogenic التمايز، تبدأ مع MSCs مثقف في أطباق زراعة الأنسجة 100 مم إلى التقاء 95%. إزالة المتوسطة ثقافة المستهلك وتغسل MSCs مع 5 مل 1 x DPBS.
- تريبسينيزي MSCs مع 1 مل من 0.25% التربسين-يدتا كل طبق 100 مم في درجة حرارة الغرفة لمدة 3 دقائق. للتأكد من الخلايا التي لا تريبسينيزيد أكثر، وقف تريبسينيزيشن عند 50% مفرزة خلية يلاحظ تحت المجهر.
- تحييد التربسين من 9 مل من MEF/ماجستير الثقافة المتوسطة وجمع MSCs من 3 آبار في أنبوب مخروطي 15 مل واحد. أجهزة الطرد المركزي في 230 س ز عند 4 درجة مئوية لمدة 4 دقائق.
- نضح المادة طافية، ريسوسبيند MSCs في 5 مل متوسطة لجنة السلامة البحرية، وحساب عدد الخلايا التي هيموسيتوميتير.
- لوحة عدد مناسب من MSCs على لوحة ثقافة.
ملاحظة: تفاصيل أرقام الخلية لوحة 12-جيدا وجيدا--لوحة 6، وأطباق زراعة الأنسجة 100 ملم ملخصة في الجدول 3.
- تحريض تمايز osteogenic حسب osteoblast التمايز المتوسطة (ODM) (الجدول 1) (يوم 0-24):
- نضح MEF/ماجستير الثقافة المتوسطة، واستبدال وحدة التخزين السليم لتصنيع التصميم الشخصي (1 مل، 2 مل، ومل 8 لكل بئر من لوحة 12-جيدا، وأيضا كل لوحة 6-جيدا، وزراعة الأنسجة 100 مم طبق، على التوالي) التفريق بين MSCs إلى خلايا الاوستيوبلاستس (يوم 0).
- نضح ODM المستهلك واستبدل بحجم مناسب لتصنيع كل يومين أثناء عملية التمايز أوستيوجينيك.
- أداء الفوسفاتيز القلوي (AP) وتنضج S أحمر الأليزارين (ARS) تلطيخ للكشف عن الفوسفاتيز القلوية المرتبطة بالعظام التي تنتجها بريوستيوبلاستس والترسيبات المعدنية التي تنتجها خلايا الاوستيوبلاستس، على التوالي، في يوم 3، 6، 9، 12، 15، 18، 21 و 24 ( الشكل 3B).
ملاحظة: تلطيخ AP وتلطيخ ARS تتم باستخدام مجموعة متاحة تجارياً بعد بروتوكول الشركة المصنعة. - فحص مستويات التعبير من علامات أوستيوبلاست بريوستيوبلاست وناضجة (البل و COL1A1 على بريوستيوبلاستس؛ PTH1R وبجلاب لتنضج خلايا الاوستيوبلاستس) التي قرت-بكر (الشكل 3).
ملاحظة: تلطيخ AP الإيجابي المتوقع بعد يوم 9 من التمايز osteogenic وتلطيخ ARS إيجابية يمكن توقع بعد 21 يوما من التمايز أوستيوجينيك. ويمكن تقديم MSCs المتنامية في مستنبت MEF/ماجستير كعنصر تحكم سلبية لتلطيخ AP وتلطيخ أرس.
4-نموذج إكسينوجرافت للدراسة في فيفو توموريجينيسيس من خلايا الاوستيوبلاستس المستمدة من الدراسة الاستقصائية لجنة السلامة البحرية (الشكل 4 أ)
- التفريق بين الدراسة الاستقصائية MSCs إلى خلايا الاوستيوبلاستس:
- البذور 3-4.5 × 105 MSCs في طبق استنبات الأنسجة 100 مم. إعداد أطباق خمسة لواحد من الحقن تحت الجلد.
- الثقافة MSCs في تصنيع التصميم الشخصي التفريق بين MSCs إلى خلايا الاوستيوبلاستس كما هو موضح في 3.2 حتى 14 يوم.
- إعداد خلايا الاوستيوبلاستس المتباينة للحقن تحت الجلد:
- إعداد osteoblast مفرزة الحل (الجدول 1)، حل ز 1 النوع الثاني كولاجيناز في مل 1,000 المتوسطة αMEM لجعل الحل الثاني كولاجيناز (1 ملغ/مل). يبقى الحل الثاني كولاجيناز في-20 درجة مئوية. مزيج 0.25% يدتا التربسين والحل الثاني كولاجيناز بنسبة 1:1 لجعل خلايا الاوستيوبلاستس مفرزة الحل.
- إزالة ODM المستهلك ويغسل خلايا الاوستيوبلاستس المتباينة مع 5 مل 1 x DPBS كل طبق 100 مم.
- إضافة 1.5 مل osteoblast مفرزة حل كل طبق 100 مم واحتضان الأطباق في 37 درجة مئوية للحد الأدنى 30 دراسة وضمان مفرزة osteoblast بالفحص المجهري.
- تحييد الحل مفرزة خلايا الاوستيوبلاستس بتصنيع التصميم الشخصي وجمع خلايا الاوستيوبلاستس منفصلة في أنبوب 50 مل مخروطية الشكل. أجهزة الطرد المركزي في 230 س ز عند 4 درجة مئوية لمدة 5 دقائق.
- إزالة المادة طافية وريسوسبيند الخلايا في 25 مل متوسطة ODM. تمر الخلايا 70 ميكرومتر خلية مصفاة لإزالة الخلايا المجمعة. عد الأرقام الخلية باستخدام هيموسيتوميتير.
- إعداد 1 × 107 خلايا الاوستيوبلاستس في الحقن تحت الجلد، وخلايا أجهزة الطرد المركزي في 230 س ز عند 4 درجة مئوية لمدة 4 دقائق.
- ريسوسبيند خلايا الاوستيوبلاستس7 1 × 10 في 50 ميليلتر 1 المثلج x DPBS. ميكس متمايزة خلايا الاوستيوبلاستس مع 50 ميليلتر من الغشاء الفينول الأحمر مجاناً المصفوفة (خلايا الاوستيوبلاستس التعليق والغشاء مصفوفة مختلطة بنسبة 1:1)، والحفاظ على خلايا الاوستيوبلاستس على الجليد قبل الحقن.
-
في فيفو إكسينوجرافت الورم النموذجي لخلايا الاوستيوبلاستس المستمدة من الدراسة الاستقصائية لجنة السلامة البحرية:
- تخدير الفئران نو نو/المناعة أنثى عمرها 8 الأسبوع في دائرة إمداد isoflurane 5% (v/v) استنشاقه في 1 لتر في الدقيقة للأوكسجين (المقدمة من كلامك). بعد أن يصبح الحيوان راقد، تبديل نظام التسليم مخدر لمخروط الآنف، تزويد isoflurane 2% (v/v) استنشاقه في 200 مل/دقيقة أكسجين (المقدمة من كلامك). رصد عمق التخدير عن طريق فحص القرنية ودواسة ردود الفعل جعل الفئران يتم تخديره بما فيه الكفاية ولا يعانون من عدم الراحة أثناء الإجراء.
- تطهير المنطقة بالحقن مع مسحات متناوبة من الايزوبروبانول الكلورهيكسيدين و 70%. استخدام إبرة ز 26 لإجراء الحقن تحت الجلد من الغشاء مختلطة مصفوفة خلايا الاوستيوبلاستس الدراسة الاستقصائية في جانب واحد من الخلفيتين عمرها 8 الأسبوع المناعة نو/نو الفئران (الشكل 4 أ).
- مراقبة الفئران عن طريق إجراء الجس أسبوعية في مواقع الحقن للنمو كثافات عقيدية تحت الجلد. ويمكن ملاحظة تشكيل الورم حوالي 6-10 أسابيع بعد الحقن (الشكل 4 باء).
- Euthanize الفئران بطريقة الخنق بغاز ثاني أكسيد الكربون متبوعاً بخلع عنق الرحم. تشريح الأورام المتقدمة. تحديد درجة الورم ومؤشر التمايز، بريوستيوبلاستس، وخلايا الاوستيوبلاستس ناضجة بمختلف أساليب المصبوغة (مثلاً الهيماتوكسيلين وويوزين (H & E) تلطيخ وتلطيخ "بيكرو سيريوس الأحمر" وكوسى فون تلطيخ على التوالي).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
ويقدم هذا البروتوكول الإجراءات بما في ذلك الدراسة الاستقصائية جيل اللجنة التوجيهية ولجنة السلامة البحرية التمايز والتمايز osteoblast و في فيفو مقايسة tumorigenesis باستخدام خلايا الاوستيوبلاستس المستمدة من الدراسة الاستقصائية لجنة السلامة البحرية.
ويبين الشكل 1Aمخطط لتوليد إيبسكس الدراسة الاستقصائية من الخلايا الليفية باستخدام فيروس سينداي متاحة تجارياً إعادة برمجة مجموعة. الولادة المرتكزة إلى الفيروس سينداي العوامل ياماناكا أربعة أسلوب إعادة برمجة غير دمج. ولذلك ينبغي استنساخ اللجنة التوجيهية الدراسة الاستقصائية مستقر خال من جينوم الفيروس سنداي والخسارة OCT4 الخارجية، SOX2، KLF4، والمتسلسلات ج-حركة، التي يمكن أن تدرسها RT-PCR باستخدام محدد الإشعال (الشكل 1B). كما اقترح في إرشادات الشركة المصنعة، جيل إيبسكس خالية من الفيروسات سينداي يعتمد على ظروف الثقافة والمرور. في ظل الظروف الثقافة الموصوفة في هذا البروتوكول، يمكن الكشف عن إزالة الفيروسات سينداي في إيبسكس عادة بعد 10 فقرات (الشكل 1B). الدراسة الاستقصائية أنشئت اللجنة التوجيهية المستنسخين ينبغي أن يحمل مورفولوجية هيس نموذجية وإظهار النشاط AP الإيجابية (الشكل 1). إيبسكس الدراسة الاستقصائية شديدة التعبير عن بلوريبوتينسي عامل مرناس (نانج، OCT4، SOX2، DPPA4و REX1)، مماثلة لخط هيس H1 وأعلى بكثير من الوالدين الليفية (الشكل 1). ويمكن أيضا فحص التعبير عن علامات هيسك (SSEA4 وهيئة تنظيم الاتصالات-1-81) والعوامل بلوريبوتينسي (نانوج، OCT4) إيممونوفلوريسسينت تلطيخ (الشكل 1E).
تمسك إيبسكس ميفس لمدة 14 يوما على الأقل قبل بدء المفاضلة لجنة السلامة البحرية (الشكل 2A). على الرغم من أن الكثير من موت الخلايا يحدث أثناء تمايز MSC، الجماهير من الخلايا المتمايزة مرئية في لوحة الثقافة الخلية وتنتجها الخلايا الليفية مثل MSCs في الحافة من الجماهير خلية يمكن ملاحظتها في 28 يوم. (الشكل 2). بعد استزراع الفرعية متمايزة خلايا في MEF/ماجستير الثقافة المتوسطة، MSCs المتباينة تتكاثر بسرعة وإظهار مورفولوجيا تنتجها الخلايا الليفية مثل حوالي 35 يوما، ثم تدريجيا تمثل شكل ممدود وتشكل نمطاً دوامة تشبه في 40 يوما (الشكل 2B ). المتمايزة الدراسة الاستقصائية MSCs التعبير عن علامات لجنة السلامة البحرية، بما في ذلك CD44، CD73، CD105، و CD166 الفلورة تلطيخ (الشكل 2).
يبين الشكل 3 ألف التفريق أوستيوبلاستيك. عندما يتعرض MSCs لإشارات التمايز osteogenic، تبدأ الخلايا المتمايزة لإظهار النشاط الفوسفاتيز القلوية الإيجابية في يوم 9 (الشكل 3B). أرس تلطيخ يمكن استخدامها للكشف عن ترسب المعادن التي تنتجها خلايا الاوستيوبلاستس ناضجة. لون أحمر تلطيخ بدلاً من تلطيخ اللون البنى يشير إلى نتيجة إيجابية لتلطيخ جمعية الإغاثة اﻷرمنية، التي يمكن ملاحظتها بعد 21 يوما (الشكل 3B). خلايا الاوستيوبلاستس التفريق إظهار التعبير زيادة مستوى الجينات بريوستيوبلاست (البل و COL1A1) والجينات osteoblast ناضجة (بجلاب و PTH1R) خلال التمايز أوستيوجينيك.
يمكن إنشاء نموذج في فيفو إكسينوجرافت بالحقن تحت الجلد خلايا الاوستيوبلاستس المستمدة من الدراسة الاستقصائية MSC في الفئران نو/نو (الشكل 4 أ). ويمكن ملاحظة الأورام 6-10 أسابيع بعد الحقن تحت الجلد (الشكل 4 باء). الأورام المشتقة من أوستيوبلاست الدراسة الاستقصائية أظهرت خصائص osteoblast غير ناضجة، إيجابية نشاط وكالة اسوشييتد برس (AP تلطيخ)، ترسب مصفوفة الكولاجين الإيجابية (تلطيخ بيكروسيريوس الأحمر) لكن التمعدن السلبية (فون كوسي تلطيخ) (الشكل 4) .
الشكل 1 : إنشاء اللجنة التوجيهية من الدراسة الاستقصائية المريض الليفية. (أ) رسم تخطيطي لتوليد اللجنة التوجيهية. (ب) RT-PCR الكشف عن جينوم الفيروس سينداي والمتسلسلات (كوس (KLF4، OCT4، و SOX2)، KLF4، وج-حركة) في استنساخ اللجنة التوجيهية أعيدت برمجتها بعد 10 فقرات (على اليسار) وتنتجها الخلايا الليفية العدوى بعد 11 يوما (يمين، مراقبة إيجابية). الدراسة الاستقصائية اللجنة التوجيهية استنساخ هو سينداي الفيروس مجاناً بعد 10 مقاطع. يتم إظهار جابده كالمراقبة الداخلية. (ج) خلية مورفولوجيا إيبسكس الدراسة الاستقصائية وتلطيخ AP. مقياس بار، 50 ميكرومتر (د) قرة-PCR نانج، SOX2، OCT4، DPPA4، والتعبير مرناً REX1 في إيبسكس الدراسة الاستقصائية. خط هيسك H1 والأبوية الدراسة الاستقصائية الليفية تستخدم إيجابية وعنصر سلبي، على التوالي. هو تطبيع التعبير مرناً للتعبير جابده . يتم ضبط التعبير مرناً النسبي إلى هيس خط H1 كما 1. (ﻫ) إيمونوستينينج عوامل النسخ pluripotent هيس (نانج و OCT4) وعلامات سطح هيس (SSEA4 وهيئة تنظيم الاتصالات-1-81) في إيبسكس الدراسة الاستقصائية. مقياس بار، 50 ميكرومتر. وترد في الجدول 2التخفيف من الأجسام المضادة المستخدمة في هذه الدراسة. وترد في الجدول 4متواليات التمهيدي. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 2 : التفريق بين إيبسكس الدراسة الاستقصائية على MSCs- (أ) رسم تخطيطي للتفريق MSC AB المستحثة PDGF. (ب) خلية مورفولوجية الدراسة الاستقصائية MSCs المستمدة من اللجنة التوجيهية في تمايز يوم 28، 36 يوما واليوم 40 +. 100 ميكرومتر. (ج) الفلورة تلطيخ يوضح مقياس بار، أن يحمل متمايزة الدراسة الاستقصائية MSCs CD44+، CD73+، CD105+، CD166+، و CD24 التوقيع– . مقياس بار، 30 ميكرون. وترد في الجدول 2التخفيف من الأجسام المضادة المستخدمة في هذه الدراسة. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 3 : التفريق في الدراسة الاستقصائية MSCs إلى خلايا الاوستيوبلاستس. (أ) رسم تخطيطي للتفريق أوستيوجينيك. AP (ب) وجمعية الإغاثة اﻷرمنية تلطيخ تتم في نقاط زمنية مختلفة (اليوم 3، 6، 9، 12، 15، 18، 21 و 24). أوستيوبلاستيك التفريق بين خلايا الاوستيوبلاستس المستمدة من الدراسة الاستقصائية MSC يتوقع أن تؤدي إلى إيجابية AP تلطيخ حول يوم 9 وأرس إيجابية تلطيخ في يوم 21. تحليل (ج) قرة-PCR يوضح التعبير زيادة osteoblast قبل (البل و COL1A1) والجينات (PTH1R وبجلاب) osteoblast ناضجة خلال التمايز أوستيوجينيك. هو تطبيع التعبير مرناً للتعبير جابده . وكانت مستويات التعبير بالنسبة إلى الخلايا في التمايز اليوم 0. وترد في الجدول 4متواليات التمهيدي. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 4 : في فيفو توموريجينيسيس من خلايا الاوستيوبلاستس المستمدة من الدراسة الاستقصائية MSC. (أ) رسم تخطيطي للورم إكسينوجرافت من خلايا الاوستيوبلاستس الدراسة الاستقصائية. (ب) تتحمل نو/نو الفئران أورام المستمدة من أوستيوبلاست الدراسة الاستقصائية بعد 10 أسابيع حقن تحت الجلد. تم فحص الأورام المستمدة من أوستيوبلاست (ج) الدراسة الاستقصائية التي ح & ه ووكالة اسوشييتد برس، بيكروسيريوس الأحمر وكوسى فون تلطيخ مورفولوجية، العظام المرتبطة بوكالة اسوشييتد برس، الكولاجين، والرواسب المعدنية، على التوالي. الأورام المستمدة من الدراسة الاستقصائية تمثل الخصائص osteoblast غير ناضجة تظهر إيجابية AP النشاط والكولاجين الإيجابية والسلبية تعدين المعادن. مقياس بار، 1 مم. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
| تنتجها الخلايا الليفية المتوسطة (500 مل) | |
| دميم | 440 مل |
| إبطال الحرارة FBS | 50 مل |
| Antibiotics(Pen/Strep) (100 x) | 5 مل |
| الأحماض الأمينية غير الأساسية (100 x) | 5 مل |
| 2-ميركابتوثانول | ميليلتر 3.5 |
| MEF/ماجستير الثقافة المتوسطة (500 مل) | |
| دميم | 440 مل |
| إبطال الحرارة FBS | 50 مل |
| Antibiotics(Pen/Strep) (100 x) | 5 مل |
| لام-الجلوتامين (100 x) | 5 مل |
| هيس المتوسطة (500 مل) | |
| دميم/و-12 | مل 384.5 |
| استبدال المصل خروج المغلوب | 100 مل (المجموع: 20%) |
| الأحماض الأمينية غير الأساسية (100 x) | 5 مل |
| المضادات الحيوية (القلم/بكتيريا) (100 x) | 5 مل |
| لام-الجلوتامين (100 x) | 5 مل |
| بفجف (10 ميكروغرام/مل) | 500 ميليلتر |
| 2-ميركابتوثانول | ميليلتر 3.5 |
| ماجستير التمايز المتوسطة (500 مل) | |
| خروج المغلوب دميم/و-12 أو دميم/و-12 | مل 445 |
| استبدال المصل خروج المغلوب | 50 مل |
| بفجف (10 ميكروغرام/مل) | 500 ميليلتر (10 نانوغرام/مل) |
| بدجف-آب (25 ميكروغرام/مل) | 200 ميليلتر (10 نانوغرام/مل) |
| الأحماض الأمينية غير الأساسية (100 x) | 5 مل |
| 2-ميركابتوثانول | ميليلتر 3.5 |
| Osteoblast التمايز المتوسطة (ODM) (500 مل) | |
| ΑMEM | مل 395 |
| إبطال الحرارة FBS | 50 مل |
| 10 مم β-جليسيروفوسفاتي | 50 مل (1.08 ز في αMEM 50 مل) |
| دكساميثازون 0.1 ميكرومتر (حساسة للضوء) | 10 ميليلتر من الديكساميتازون 5 مم |
| حمض الأسكوربيك 200 ميكرومتر (حساسة للضوء) | 100 ميليلتر من حمض الأسكوربيك 1 مم |
| المضادات الحيوية (القلم/بكتيريا) (100 x) | 5 مل |
| ماتريجيل طلاء الحل (50 مل) | |
| مصفوفة الغشاء | 2 مل |
| دميم/و-12 (الباردة قبل 4 درجة مئوية) | مل 48 |
| أوستيوبلاست مفرزة الحل (50 مل) | |
| 0.25% التربسين-يدتا | 25 مل |
| الحل الثاني كولاجيناز (1 ملغ/مل) | 25 مل |
| ملاحظة: إعداد osteoblast مفرزة الحل حق الطازج قبل الاستخدام. الحل الثاني كولاجيناز مخزنة في-20 درجة مئوية لمدة تصل إلى 6 أشهر. | |
الجدول 1: التراكيب المتوسطة تنتجها الخلايا الليفية و MEF/ماجستير الثقافة المتوسطة، والمتوسطة هيس، متوسطة التمايز MSC، ODM والحل مفرزة osteoblast.
| اسم الجسم المضاد | تمييع |
| نانج | 1: 500 |
| OCT4 | رافعة |
| سا-4 مترافق PE | مقاومة |
| ثلاثي-1-81 | مقاومة |
| مفتش حمار المضادة الماعز | 1: 500 |
| مفتش أرنب المضادة الماعز | 1: 500 |
| CD105 | 1: 500 |
| CD44 | 1: 500 |
| CD73 | 1: 500 |
| CD166 | 1: 500 |
| CD24 | 1: 500 |
الجدول 2: إضعاف جسم.
| لوحة الثقافة | بذر الكثافة | الفحص |
| 12-كذلك لوحة | 0.67x104 خلايا كل بئر | الفوسفاتيز القلوي تلطيخ (تلطيخ AP) |
| S الأليزارين الأحمر تلطيخ (جمعية الإغاثة اﻷرمنية تلطيخ) | ||
| 6-كذلك لوحة | 2 × 104 خلايا كل بئر | كشف RT-PCR |
| علامات بريوستيوبلاست: البل، COL1A1 | ||
| الناضجة علامات أوستيوبلاست: PTH1R، بجلاب | ||
| 100 مم صحن | 3-4.5x105 خلايا للوحة الواحدة | في فيفو توموريجينيسيس |
الجدول 3: بذر كثافة MSCs للتمايز أوستيوبلاستيك.
| كبسولة تفجير الفيروس سنداي | |
| الهدف | مجموعات التمهيدي |
| SeV | إلى الأمام: جاتكاكتاجتجاتاتكجاجك |
| عكس: أككاجاكاجاجتتاجاجاتاتجتاتك | |
| كوس (KLF4/OCT4/SOX2) | إلى الأمام: أتجكاككجكتاكجاكجتجاجكجك |
| عكس: أككتجاكاتككتجاتجتج | |
| KLF4 | إلى الأمام: تككتجكاتجككاجاجاجككك |
| عكس: آتجتاتكجاجتجكتكا | |
| ج-حركة | إلى الأمام: تاكتجاكتاجكاجكتجتكج |
| عكس: تككاكاتاكاجتككتجاتجاتجاتج | |
| كبسولة تفجير RT-PCR | |
| الهدف | مجموعات التمهيدي |
| نانج | إلى الأمام: تتجتججككتجاجاااكت |
| عكس: أججكتجتككتجاتاجكاج | |
| SOX2 | إلى الأمام: أجاجاجاجاجاجااجااججاجاجا |
| عكس: جاجاجاجكااكتجاتكاجاتكاا | |
| OCT4 | إلى الأمام: آككتجاجتتجتجككاججتت |
| عكس: تجاكتكاككتكككتككاككا | |
| DPPA4 | إلى الأمام: جاككتككاكاجاجاجتكجاج |
| عكس: تجككتتتتكتاججكاجاج | |
| REX1 | إلى الأمام: جككتاتجتجاتجكتاتجتجت |
| عكس: أككككتاتجاكجكاتكتاتجت | |
| البل | إلى الأمام: ججاكتجتاكتكاجاكاكج |
| عكس: جتاجكجاتجتككتاكاجكك | |
| COL1A1 | إلى الأمام: جتجكجاتجاكجتجاتكتجتجا |
| عكس: كجتجتتتكتجتكغت | |
| PTH1R | إلى الأمام: أجتجكجااااكجكتكاج |
| عكس: جاتجككتاتكتتككتججك | |
| بجلاب | إلى الأمام: جكجكتاككتجتاتكاتج |
| عكس: جكجكتاككتجتاتكاتج |
الجدول 4: معلومات التمهيدي.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
لتحقيق مستوى أعلى من الكفاءة التمايز ماجستير، عدة جوانب الحاسمة. واحد هو شرط الثقافة إيبسكس قبل بدء المفاضلة لجنة السلامة البحرية. البروتوكول الواردة في المخطوطة يستند إلى دراسات سابقة 9،17. إيبسكس بحاجة إلى أن يكون مثقف في ميفس لمدة أسبوعين على الأقل. الحفاظ على إيبسكس في حسن الأحوال في ميفس هما أمران حاسمان للخلايا لنعلق على لوحة المغلفة بالجيلاتين للتمايز ماجستير. ثمة جانب مهم آخر هو كثافة إيبسكس في ميفس قبل التمايز. 80-ويفضل كونفلوينسي 90% من إيبسكس الشروع في تمايز MSC. سوف تنال من فرط إيبسكس بقاء الخلية أثناء عملية التمايز. والنقطة الحرجة الأخيرة هو كثافة البذر عندما يبدأ التمايز ماجستير. في أيدينا، يعزز خلية عالية الكثافة مرفق اللجنة التوجيهية للوحة المغلفة بالجيلاتين. يمكن المصنف إيبسكس طبق 100 ملليمتر واحد إلى ثلاثة آبار للوحة 6-جيدا. الشروع في تمايز ماجستير مباشرة ريسوسبيندينج وتصفيح إيبسكس في متوسطة التمايز MSC تنتج كبيرة تؤكد على إيبسكس، ولذلك أحياناً مما يؤدي إلى موت الخلايا شديدة بعد البذر. كثافة عالية من إيبسكس تزيد من معدل النجاح للتمايز MSC.
خلافا للتفريق بين لجنة السلامة البحرية، وعملية التمايز أوستيوبلاستيك أكثر وضوحاً. لتحقيق نتائج المفاضلة استنساخه، ضمان إعداد ماجستير المبادر وتتسق. نتائج المفاضلة أوستيوبلاستيك من نفس خط الخلية قد تختلف من دفعة إلى دفعة، ولذلك إقامة تمييز لخطوط مختلفة في نفس الوقت سيعطي المزيد من نتائج المقارنة فيما بين المجموعات. الزيادة في إعداد ماجستير تقصير عملية التمايز أشارت إلى جانب إيجابي أ فب وأرس تلطيخ في نقطة سابقة من الزمن. أيضا، تأكد من تغيير المتوسطة ODM تتم بطريقة رقيقة وقوية نظام شفط فراغ غير مستحسن في مرحلة التمايز متأخرة (يوم 18-24) بسبب مفرزة المحتملة من خلايا الاوستيوبلاستس المجمعة خلال عملية الثقافة.
خلايا الاوستيوبلاستس المتباينة التي استخدمت في التجربة في فيفو إكسينوجرافت هي خلايا الاوستيوبلاستس عند نقطة وقت تمايز 14 يوم. خلايا الاوستيوبلاستس أقصاه 14 يوما قد تكون صعبة أن تنأى بسبب تراكمات ضخمة من كولاجينس وغيرها من المواد مصفوفة العظام التي تنتجها خلايا الاوستيوبلاستس وتجميع. للحيلولة دون صعوبة الانفصال osteoblast، يمكن أن تبذر MSCs الدراسة الاستقصائية في 2-3-fold أعلى كثافة في الخطوة بدء من التمايز أوستيوبلاستيك لتسهيل التفريق osteoblast. يمكن فصل خلايا الاوستيوبلاستس المستمدة من الدراسة الاستقصائية لجنة السلامة البحرية والتي جمعت في يوم 6-10 نقطة الوقت التمايز في فيفو tumorigenesis الاعتداء في يوم 6-التمايز 7 الوقت نقطة. يوضح نموذج الدراسة الاستقصائية xenograft الورم خلايا الاوستيوبلاستس المستمدة من الدراسة الاستقصائية MSC الخص في قدرة الورمية فيفو ، الذي يوفر منصة بديلة لدراسة osteosarcoma المرتبطة بالدراسة الاستقصائية.
وباختصار، يوفر نموذج osteosarcoma المستندة إلى اللجنة التوجيهية للدراسة الاستقصائية لجوء قيماً للأبحاث أوستيوساركوما. وبالإضافة إلى osteosarcoma، الدراسة الاستقصائية المرضى الذين يعانون من مختلف أنواع أخرى من السرطانات مثل الأنسجة اللينة كابوزي وسرطان الثدي وورم الدماغ. ولذلك، يمكن أن تمتد الدراسة الاستقصائية نماذج المرض المستندة إلى اللجنة التوجيهية نموذج الدراسة الاستقصائية الأخرى ذات الصلة بالأورام الخبيثة. الجمع بين الدراسة الاستقصائية إيبسكس المستمدة من المريض وهندستها p53 متحولة (mutp53) هيسكس18، نموذج المرض الدراسة الاستقصائية أيضا له قيمة كبيرة في تحديد الآلية المرضية للأورام الخبيثة المرتبطة mutp53 وتطوير استراتيجيات علاجية جديدة تستهدف النمطان p5316.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
الكتاب ليس لها علاقة بالكشف عن.
Acknowledgments
ر. ز. معتمد من قبل "أوثيالث الابتكار" "السرطان منع التدريب برنامج بريدوكتورال زمالة بحثية" (الوقاية من السرطان ومعهد أبحاث من تكساس منح RP160015). ج. ت. معتمد من قبل البرنامج لين كه الجامعة الأولى التابعة للمستشفى من صن يأت-صن. دال-الباحث كبريت في "أبحاث السرطان" ودعم من المعاهد الوطنية للصحة في الطريق إلى الاستقلال جائزة R00 CA181496 وكبريت جائزة RR160019.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Plastic ware | |||
| 100 mm Dish | Corning | 430107 | |
| 60 mm Dish | Corning | 430166 | |
| 6-well Plate | Falcon | 353046 | |
| 12-well Plate | Falcon | 353043 | |
| 48-well Plate | Falcon | 353078 | |
| 1 mL Pipet Tip | USA Scientific | 1111-2721 | |
| 200 µL Pipet Tip | USA Scientific | 1111-0706 | |
| 10 µL Pipet Tip | USA Scientific | 1111-3700 | |
| 5 mL Serological Pipette | SARSTEDT | 86.1253.001 | |
| 10 mL Serological Pipette | SARSTEDT | 86.1254.001 | |
| 25 mL Serological Pipette | SARSTEDT | 86.1685.001 | |
| 50 mL Tube, PP | SARSTEDT | 62.547.100 | |
| 15 mL Tube, PP | SARSTEDT | 62.554.100 | |
| Culture materials and Reagents | |||
| CytoTune- iPS 2.0 Sendai Reprogramming Kit | Invitrogen | A16517 | Commercial Sendai virus reprogramming kit |
| Corning hESC-Qualified Matrix | Corning | 354277 | Basement membrane matrix |
| CF1 MEFs, irradiated | ThermoFisher | A34180 | |
| DMEM | Sigma-Aldrich | D5671 | |
| DMEM/F12 | Corning | 10-090-CV | |
| αMEM | Corning | 10-022-CV | |
| StemMACS iPS-Brew XF | Miltenyi Biotec | 130-104-368 | Commercial iPSC medium |
| KnockOut DMEM/F-12 | ThermoFisher | 12660012 | |
| FBS Opti-Gold | GenDEPOT | F0900-050 | |
| KnockOut Serum Replacement | ThermoFisher | A3181502 | |
| Penicillin-Streptomycin | Sigma-Aldrich | P4333 | |
| MEM Nonessential Amino Acids | Corning | 25-025-CI | |
| L-Glutamine Solution | Sigma-Aldrich | G7513 | |
| 2-Mercaptoethanol | Sigma-Aldrich | M3148 | |
| Human FGF-basic (bFGF) | PEPROTECH | 100-18B | |
| Recombinant Human PDGF-AB | PEPROTECH | 100-00AB | |
| β-Glycerophosphate | Sigma-Aldrich | G9422 | |
| Dexamethasone | Sigma-Aldrich | A4902 | |
| Ascorbic Acid | Sigma-Aldrich | A5960 | |
| Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline, 1x (DPBS) | Corning | 21-031-CV | |
| StemMACS Passaging Solution XF | Miltenyi Biotec | 130-104-688 | Commercial passaging solution |
| Accutatse Cell Detachment Solution | Corning | 25-058-CI | Cell detachment solution |
| Thiazovivin (ROCK Inhibitor) | Calbiochem | 420220 | |
| 0.25% Trypsin-EDTA Solution | Sigma-Aldrich | T4049 | |
| Collagenase, Type II | ThermoFisher | 17101015 | |
| Human NANOG Antibody | R&D System | AF1997 | |
| OCT4 Antibody (H-134) | Santa Cruz | sc-9081 | |
| Human/Mouse SSEA-4 PE-conjugated Antibody | R&D System | FAB1435P | |
| Alexa Fluor 555 Mouse Anti-Human TRA-1-81 Antigen | DB Biosciences | 560123 | |
| Alexa Fluor 488 Donkey Anti-Goat IgG (H+L) | Jackson ImmunoResearch | 705-545-003 | |
| Alexa Fluor 488 Goat Anti-Rabbit IgG (H+L) | Jackson ImmunoResearch | 111-545-144 | |
| PE Mouse Anti-Human CD105 | eBioscience | 12-1057-42 | |
| FITC Mouse Anti-Human CD44 | DB Biosciences | 555478 | |
| PE Mouse Anti-Human CD73 | DB Biosciences | 550257 | |
| PE Mouse Anti-Human CD166 | DB Biosciences | 560903 | |
| FITC Mouse Anti-Human CD24 | DB Biosciences | 555427 | |
| Donkey Serum | Jackson ImmunoResearch | 017-000-121 | |
| Goat Serum | Jackson ImmunoResearch | 005-000-121 | |
| Alkaline Phosphatase Staining Kit II | Stemgent | 00-0055 | |
| Alizarin Red S | Sigma-Aldrich | A5533 | |
| TRIzol Reagent | ThermoFisher | 15596018 | |
| Chloroform | ThermoFisher | C298-500 | |
| 2-Propanol | ThermoFisher | A416-4 | |
| Ethanol, Absolute, Molecular Biology Grade | ThermoFisher | BP28184 | |
| DNase I, RNase-free (1 U/µL) | ThermoFisher | EN0521 | |
| iScript cDNA Synthesis Kit | BioRad | 1708891BUN | |
| iQ SYBR Green Supermix | BioRad | 1708884 | |
| Matrigel Matrix High Concentration (HC), Phenol-Red Free | Corning | 354262 | |
| 1 mL Slip Tip Syringe, 26 Gauge x 5/8 Inch | DB Biosciences | 309597 |
References
- Takahashi, K., Yamanaka, S. Induction of pluripotent stem cells from mouse embryonic and adult fibroblast cultures by defined factors. Cell. 126 (4), 663-676 (2006).
- Takahashi, K., et al. Induction of pluripotent stem cells from adult human fibroblasts by defined factors. Cell. 131 (5), 861-872 (2007).
- Yu, J., et al. Induced pluripotent stem cell lines derived from human somatic cells. Science. 318 (5858), 1917-1920 (2007).
- Yagi, T., et al. Modeling familial Alzheimer's disease with induced pluripotent stem cells. Hum Mol Genet. 20 (23), 4530-4539 (2011).
- Dimos, J. T., et al. Induced pluripotent stem cells generated from patients with ALS can be differentiated into motor neurons. Science. 321 (5893), 1218-1221 (2008).
- Moretti, A., et al. Patient-specific induced pluripotent stem-cell models for long-QT syndrome. N Engl J Med. 363 (15), 1397-1409 (2010).
- Itzhaki, I., et al. Modelling the long QT syndrome with induced pluripotent stem cells. Nature. 471 (7337), 225-229 (2011).
- Carvajal-Vergara, X., et al. Patient-specific induced pluripotent stem-cell-derived models of LEOPARD syndrome. Nature. 465 (7299), 808-812 (2010).
- Lee, D. F., et al. Modeling familial cancer with induced pluripotent stem cells. Cell. 161 (2), 240-254 (2015).
- Mulero-Navarro, S., et al. Myeloid Dysregulation in a Human Induced Pluripotent Stem Cell Model of PTPN11-Associated Juvenile Myelomonocytic Leukemia. Cell Rep. 13 (3), 504-515 (2015).
- Kotini, A. G., et al. Functional analysis of a chromosomal deletion associated with myelodysplastic syndromes using isogenic human induced pluripotent stem cells. Nat Biotechnol. 33 (6), 646-655 (2015).
- Kotini, A. G., et al. Stage-Specific Human Induced Pluripotent Stem Cells Map the Progression of Myeloid Transformation to Transplantable Leukemia. Cell Stem Cell. 20 (3), 315-328 (2017).
- Crespo, M., et al. Colonic organoids derived from human induced pluripotent stem cells for modeling colorectal cancer and drug testing. Nat Med. 23 (7), 878-884 (2017).
- Gingold, J., Zhou, R., Lemischka, I. R., Lee, D. F. Modeling Cancer with Pluripotent Stem Cells. Trends Cancer. 2 (9), 485-494 (2016).
- Lin, Y. H., et al. Osteosarcoma: Molecular Pathogenesis and iPSC Modeling. Trends Mol Med. 23 (8), 737-755 (2017).
- Zhou, R., et al. Li-Fraumeni Syndrome Disease Model: A Platform to Develop Precision Cancer Therapy Targeting Oncogenic p53. Trends Pharmacol Sci. 38 (10), 908-927 (2017).
- Lian, Q., et al. Derivation of clinically compliant MSCs from CD105+, CD24- differentiated human ESCs. Stem Cells. 25 (2), 425-436 (2007).
- Zhou, R., et al. A homozygous p53 R282W mutant human embryonic stem cell line generated using TALEN-mediated precise gene editing. Stem Cell Res. 27, 131-135 (2018).
