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Cancer Research

应用 Fraumeni 综合征诱导多潜能干细胞建模骨肉瘤

Published: June 13, 2018 doi: 10.3791/57664

Summary

在这里, 我们提出了一个由李-Fraumeni 综合征 (LFS) 患者衍生成纤维细胞生成诱导多能干细胞 (iPSCs) 的协议, 通过间充质干细胞 (MSCs) 分化成成骨细胞, 并在体内建模利用 LFS 患者源性成骨细胞进行肿瘤发生。

Abstract

Fraumeni 综合征 (LFS) 是一种常染色体显性遗传性癌症疾病。LFS 患者易患多种类型的肿瘤, 包括骨肉瘤, 这是儿童和青春期最常见的原发性非血液病性恶性肿瘤之一。因此, LFS 为研究这一恶性肿瘤提供了一个理想的模型。利用 iPSC 方法, LFS 相关的骨肉瘤可以通过区分 LFS 患者 iPSCs 间充质干细胞 (MSCs), 再到成骨细胞--骨肉瘤的起源细胞--成功地模拟。这些 LFS 成骨细胞概括了骨肉瘤的致癌性质, 为骨肉瘤的发病机制提供了一个有吸引力的模型体系。这篇手稿展示了一个 iPSCs 从 LFS 患者成纤维细胞生成的协议, iPSCs 分化为 mscs, 骨髓间充质干细胞分化成成骨细胞, 并在体内发生肿瘤的 LFS 成骨细胞。这种 iPSC 疾病模型可以扩展, 以确定潜在的生物标志物或治疗目标 LFS 相关的骨肉瘤。

Introduction

在2006和2007之间, 想法 Yamanaka 和詹姆斯. 汤姆森实验室的几个突破性发现导致了诱导多潜能干细胞 (iPSCs)123的发展。通过对具有明确转录因子的体细胞进行重新编程, 形成 iPSCs, 研究人员能够生成具有关键特征的细胞, 即干细胞和自我更新, 而先前认为仅存在于人类胚胎干细胞中。(干细胞)。iPSCs 可以由任何个人或病人产生, 也不必来自胚胎, 极大地扩大了研究的现有疾病和背景。从那时起, 病人衍生的 iPSCs 被用来重述各种人类疾病的表型, 从阿尔茨海默病4和肌萎缩侧索硬化5到长 QT 综合征6,7,8

这些 iPSC 研究的进展也为癌症研究开辟了新的途径。最近有几个小组利用病人 iPSCs 在易受感染的遗传背景下91011对癌症的发展进行了模型分析, 成功的应用表明, 在骨肉瘤9,白血病10,11,12, 结肠直肠癌13。尽管 iPSC 的癌症模型仍处于起步阶段, 但它们在 phenocopying 疾病相关的恶性肿瘤中表现出巨大的潜力, 阐明了病理机制, 并确定了治疗化合物14

Fraumeni 综合征 (LFS) 是由TP53生殖突变15引起的常染色体显性遗传性癌症障碍。LFS 患者易患多种类型的恶性肿瘤, 包括骨肉瘤, 使 LFS iPSCs 及其衍生细胞特别适合研究这一恶性肿瘤16。iPSC 骨肉瘤模型最初建立于 2015年, 使用 LFS 患者衍生的 iPSCs9随后分化为间充质干细胞 (MSCs), 然后向成骨细胞, 形成骨肉瘤。这些 LFS 成骨细胞重述骨肉瘤相关的成骨分化缺陷和致癌的性质, 表明模型电位作为 "一碟骨肿瘤" 平台。有趣的是, 全基因组转录分析揭示了 LFS 成骨细胞中骨肉瘤基因的特征, 该 LFS 基因表达谱的特征与骨肉瘤9的预后不良相关, 表明LFS iPSCs 疾病模型的潜力揭示临床相关性的特点。

这篇手稿详细描述了如何使用 LFS 病人衍生的 iPSCs 模型骨肉瘤。详细介绍了 LFS iPSCs 的产生、iPSCs 与骨髓间充质干细胞的分化以及成骨细胞在体外移植模型的应用。LFS 疾病模型包括几个优点, 最显著的是在骨肉瘤发育的各个阶段产生无限细胞的能力, 用于机械研究, 生物标志物鉴定和药物筛选9,14, 16

总之, LFS iPSC 骨肉瘤模型为促进骨肉瘤的研究提供了一个有吸引力的补充系统。这个平台还提供了一个概念证明的癌症建模使用患者衍生的 iPSCs。下面描述的这个策略可以很容易地扩展到与癌症倾向相关的其他遗传疾病的恶性肿瘤模型。

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Protocol

这项工作是通过德克萨斯大学卫生科学中心在休斯顿 (UTHealth) 动物福利委员会。这些实验严格按照 UTHealth 实验室动物医学 & 护理中心 (CLAMC) 制定的标准进行, 由美国实验动物护理协会 (AAALAC 国际) 认证。这项研究中的人类主题属于 NIH SF424 文件所定义的 "没有人的学科研究" 的设想。因此, 它不需要 UTHealth 人类研究伦理委员会的批准。

1. LFS iPSCs 的产生 (图 1A)

  1. 在天-2, 板材 2 x 104 LFS 患者成纤维细胞入一个6井板的一个井, 并且培养细胞与成纤维化的媒介 (桌 1) 在37°c 在加湿 5% CO2个孵化器。确保成纤维细胞在转导日达到 50-60% 汇合 (0 天)。
  2. 在0天执行仙台病毒传导。要做到这一点, 用预预热成纤维细胞的培养基取代所用培养基。解冻商业仙台病毒重新编程套件 (见材料表) 在冰上。根据制造商的指示, 感染 LFS 成纤维细胞与仙台病毒混合。
  3. 转基因细胞的维持 (天 1-6):
    1. 在转导后的1天, 24 小时, 去除含有仙台病毒的成纤维细胞培养基, 并用2毫升的新鲜成纤维细胞取代。培养转基因成纤维细胞在37°c 在湿 5% CO2孵化器。
    2. 每隔一天从 2-6 改变培养基与成纤维细胞培养基。
  4. 饲养者培养条件下转基因细胞的维护 (7-28 天):
    1. 在6天准备辐照 CF1 小鼠胚胎成纤维细胞 (MEF) 培养皿。要做到这件大衣六100毫米组织培养皿添加5毫升0.1% 明胶到每板室温为30分钟. 吸入0.1% 明胶后涂层。
    2. 从液氮容器中取出 MEFs。根据制造商的说明, 解冻 MEFs 使用商业上可用的解冻系统。用 MEF/MSC 培养基 (表 1) 在明胶涂层板上板上的细胞, 每100毫米组织培养皿的播种密度约为 6.7 x 105细胞。
    3. 将转基因细胞接种到 MEF 板上 (7 天): 胰蛋白酶处理在室温下使用1毫升0.25% 胰蛋白酶-EDTA 每100毫米盘子的转基因细胞, 达到 2-4 分钟。中和胰蛋白酶与9毫升成纤维细胞培养基。将细胞转移到圆锥管和离心细胞, 在 230 x g 在37°c 为4分钟. 在6天准备的六 MEF 菜肴上的转基因成纤维细胞, 并培养他们在8毫升的成纤维细胞培养基每道菜。
      注: MEFs 的融合在转基因细胞在 MEF 板上播种前约为20%。
    4. 在8天, 丢弃成纤维细胞培养基, 替换为人类胚胎干细胞培养基 (表 1)。
    5. 等待 iPS 克隆的出现从 9-28 天 (图 1C)。每隔一天更换花人类胚胎干细胞培养基, 并监测显微镜下 iPS 克隆的出现。等待 iPSCs 克隆大到足以被肉眼观察, 然后继续扩展 iPS 克隆在无馈线的文化条件。
  5. 在无馈线养殖条件下出现的 iPS 克隆的扩展 (天 29-79 ~ 99):
    1. 为制备基体涂覆板, 在48井板上涂上120µL 基底膜基质涂层溶液 (表 1)。确保基底膜基质涂层溶液覆盖好, 并涂上培养皿表面。在室温下保持1小时, 在使用前立即吸出涂层溶液, 并在2µM 岩石抑制剂 Thiazovivin 中加入250µL 人类胚胎干细胞介质。
    2. 在28天, 吸入用过的人类胚胎干细胞培养基和洗涤 iPS 克隆与 1x DPBS。拿起一个1毫升吸管尖端可见的 iPS 克隆和转移到一个处理好的48井板 (步骤 1.4.1)。种子一殖民地每井48井板材。
    3. 离心板在 230 x g 4 分钟, 以方便细胞附着。文化 iPS 克隆在37°c 在一个湿润的 5% CO2孵化器。
    4. 第二天 (29 天), 删除所用的人类胚胎干细胞介质, 并在每个井中添加250µL 的商业可用 iPSC 介质。
    5. 在加湿 5% CO2孵化器中保持37摄氏度的 iPS 克隆, 每隔一天更换 iPSC 介质。
    6. 当 iPS 克隆达到85% 汇合, 亚文化细胞在1:10 的比例被培养区域。添加60µL 的商业传代解决方案, 以分离细胞和孵化在37摄氏度3分钟。
    7. 在1毫升的人类胚胎干细胞介质中, 用2µM 岩石抑制剂 Thiazovivin, 在基底膜基质涂层12井板上分离 iPSCs 的种子一半。文化 iPS 克隆在一个12井板与1毫升的商业上可用的 iPSC 培养基每井和亚文化 iPSCs 在1:10 的比例, 直到他们达到10。
      注: iPSCs 每 5-7 天以1:10 的比例进行亚培养。iPS 克隆需要长达10周的时间才能到达通道10。iPSC 特征包括细胞形态学, 碱性磷酸酶 (AP) 活性, 以及干细胞因子和人类胚胎干细胞标记的表达, 可以检查后确认清除仙台病毒在 iPSCs (通常显示后约10通道) (图 1B-E)。iPSC 特征的抗体和底漆信息包括在表 24中。

2. LFS iPSCs 对间充质干细胞 (MSCs) 的分化 (图 2A)

  1. 在 mef 板上的文化 iPSC 克隆至少2周 (天 ~-14-0): 准备 mef 菜肴 (100 毫米组织培养皿) 如前所述 (1.3.1-1.3.2)。在人类胚胎干细胞介质中保持 iPSCs, 并在每隔一天更换培养基。每当 iPSCs 到达90% 汇合, 亚文化 iPSCs 由1:10 稀释。
  2. 从 iPSCs 中去除 MEFs (0 天):
    1. 在 MEFs 维持 iPSCs 2 周后, 培养 iPSCs 100 毫米的组织培养皿, 直到细胞达到 80-90% 汇合。取出所用的人类胚胎干细胞介质, 用5毫升 1x DPBS 清洗 iPSCs。加入1毫升的细胞脱离溶液, 分离细胞, 在室温下孵育3分钟。
    2. 添加9毫升的 MEF/MSC 培养基, 以中和细胞脱离溶液活动, 并转移分离细胞到一个新的100毫米组织培养皿没有任何涂层。
    3. 在室温下孵化细胞30分钟, 使 MEFs 附着在盘子上。
    4. 仔细收集含有未连接 iPSCs 的上清液, 离心机在 230 x g 4 摄氏度, 4 分钟。
      注: 不小心冲洗板底导致 MEFs 脱离。
  3. iPSCs 向 MSCs 的分化 (天 0-28):
    1. 三井6井板与1毫升0.1% 明胶每井在室温下为30分钟。
    2. 从2.2.4 中取出所收集 iPSCs 的上清。
    3. 并用重悬 iPSCs 在6毫升的 MSC 分化培养基 (表 1) 和种子细胞在三涂层井与2毫升每井 (天 0)。
    4. 每两天更改 MSC 分型培养基以去除未连接和/或死细胞 (1-28 天)。
  4. iPSC 干细胞的成熟 (天 28-45):
    1. 去除所花的 MSC 分化培养基和洗涤细胞与1毫升的 1x DPBS。
    2. 胰蛋白酶处理 MSCs, 0.5 毫升0.25% 胰蛋白酶-EDTA 每井在室温下3分钟。
    3. 用1.5 毫升的 MEF/MSC 培养基中和胰蛋白酶, 从三口井中提取 MSCs, 成15毫升锥形管。离心机在 230 x g 在4°c 为4分钟。
    4. 去除3毫升的 MEF/MSC 培养基中的上清和并用重悬 MSCs, 并在60毫米0.1% 明胶涂层板上涂上 (28 天)。
    5. 在 MEF/MSC 培养基中培养 MSCs, 每两天改变培养基。当细胞达到100% 汇合, 亚文化间充质干细胞在1:3 的比例使用0.25% 胰蛋白酶-EDTA。
      注: MSCs 显示成纤维细胞样形态 (图 2B)。当 mscs 在高密度的情况下生长时, 细长的 mscs 可以形成类似涡流的模式 (图 2B)。
    6. 通过检查 MSC 表面标记 CD44、CD73、CD105 和 CD166 (图 2C), 执行免疫荧光染色以评估 iPSC 派生的 MSCs。
      注: 抗体的稀释情况见表 2。根据制造商的指示, 对活细胞进行免疫荧光染色。
    7. 确认后, 在 100 mm 的组织培养皿中以1:3 的比例展开 MSCs。用含有10% 亚砜和90% 血清的冷冻培养基冷冻小瓶 (每100毫米组织培养皿3瓶)。
      注意: 为了丰富 msc 的数量, MSCs 可以使用 CD105+CD24 标准进行分类, 流式细胞术9,17。iPSC 的骨髓间充质干细胞, 通常可以维持 2-3 月的文化, 而不丧失 MSC 的身份9。在确认 msc 特征后, 从早期通道编号中冻结 MSCs。

3. LFS MSCs 与成骨细胞的分化 (图 3A)

  1. 成骨分化的骨髓间充质干细胞的制备 (1 天)
    1. 为了保证足够数量的细胞完成成骨分化的协议, 从培养的100毫米组织培养皿到95% 汇合的 MSCs 开始。去除所用培养基, 用5毫升的 1x DPBS 洗涤 MSCs。
    2. 胰蛋白酶处理 MSCs, 1 毫升0.25% 胰蛋白酶-EDTA 每100毫米菜在室温下为3分钟。为了确保细胞不超过 trypsinized, 在显微镜下观察到50% 的细胞脱离时停止 trypsinization。
    3. 用9毫升的 MEF/MSC 培养基中和胰蛋白酶, 从3口井中提取 MSCs 为15毫升圆锥管。离心机在 230 x g 在4°c 为4分钟。
    4. 在5毫升的 msc 培养基中吸入上清, 并用重悬 MSCs, 用 hemocytometer 计数细胞数。
    5. 在培养板上适当数量的 MSCs。
      注:表 3概述了12井板、6井板、100 mm 组织培养皿细胞数的详细情况。
  2. 成骨细胞分化培养基 (ODM) 诱导成骨分化 (表 1) (天 0-24):
    1. 吸入 MEF/MSC 培养基, 并取代适当体积的 ODM (1 毫升, 2 毫升, 8 毫升为每井12井板, 每井6井板, 和100毫米组织培养皿, 分别) 区分 MSCs 与成骨细胞 (天 0)。
    2. 在成骨分化过程中, 每两天吸入一次花的 odm 并替换为适当的 odm 量。
    3. 执行碱性磷酸酶 (AP) 和茜素红 S (ARS) 染色, 以检测由成熟成骨细胞产生的 preosteoblasts 和矿物沉积所产生的骨相关碱性磷酸酶, 分别在3、6、9、12、15、18、21和 24 (图 3B)。
      注意: AP 染色和 ARS 染色是使用商业可用的套件后, 制造商协议。
    4. 观察 preosteoblast 和成熟成骨细胞标记物的表达水平 (ALPL 和 COL1A1 preosteoblasts;PTH1R 和 BGLAP 为成熟成骨细胞) qRT PCR (图 3C)。
      注: 阳性的 AP 染色预计在9天后, 成骨分化和阳性的 ARS 染色有望在21天后成骨分化。在 MEF/MSC 培养基中生长的 MSCs 可作为 AP 染色和 ARS 染色的阴性对照。

4. LFS 型成骨细胞体外肿瘤移植模型的研究 (图 4A)

  1. LFS 干细胞向成骨细胞分化的研究:
    1. 种子 3-4.5 x 105 MSCs 在100毫米组织培养皿。为一皮下注射准备五碟。
    2. 在 ODM 中培养 mscs, 将 mscs 与成骨细胞区分为3.2 至14天。
  2. 皮下注射分化成骨细胞的制备:
    1. 为制备成骨细胞脱离液 (表 1), 在1000毫升的αMEM 培养基中溶解1克 ii. 型胶原酶, 使胶原酶 ii 溶液 (1 毫克/毫升)。将胶原酶 II 溶液保持在摄氏-20 摄氏度。将0.25% 胰蛋白酶-EDTA 和胶原酶 II. 的溶液混合在1:1 的比值上, 使成骨细胞脱离溶液。
    2. 去除花的 ODM 和洗涤分化成骨细胞与5毫升 1x DPBS 每100毫米菜。
    3. 增加1.5 毫升成骨细胞脱离溶液每100毫米菜和孵化菜在37°c 30 分钟. 通过显微镜检查并确保成骨细胞脱离。
    4. 用 ODM 中和成骨细胞脱离溶液, 在50毫升锥形管中采集分离成骨细胞。离心机在 230 x g 在4°c 为5分钟。
    5. 去除25毫升的 ODM 培养基中的上清和并用重悬细胞。通过70µm 细胞过滤器传递细胞, 以去除聚集的细胞。使用 hemocytometer 计算单元格数。
    6. 每皮下注射准备 1 x 107成骨细胞, 并在4摄氏度的 230 x g 处离心细胞为4分钟。
    7. 并用重悬 1 x 107成骨细胞在50µL 冰冷 1x DPBS。混合分化成骨细胞与50µL 酚-红游离基底膜基质 (成骨细胞悬浮和基底膜基质混合在1:1 的比例), 并保持成骨细胞在冰前注射。
  3. LFS 型成骨细胞体移植瘤模型的建立:
    1. 麻醉8周大的女性免疫受损的女/女鼠在提供 5% (v/v) 吸入异氟醚的1升/分氧 (由 CLAMC 提供)。在动物成为卧后, 将麻醉传递系统切换到鼻锥, 提供 2% (v/v) 吸入异氟醚在200毫升/分钟的氧气 (由 CLAMC 提供)。通过检查角膜和踏板反射来监测麻醉深度, 使小鼠充分麻醉, 并在手术过程中不感到不适。
    2. 对被洗必泰和70% 异丙醇交替拭子注射的区域进行消毒。使用26克针进行皮下注射基底膜基质-混合 LFS 成骨细胞的一侧的后腿8周的免疫缺陷的女/女鼠 (图 4A)。
    3. 通过每周在注射部位进行触诊来监测小鼠皮下结节密度的增长。注射后6-10 周左右可以观察到肿瘤的形成 (图 4B)。
    4. 采用二氧化碳窒息法对小鼠弄死颈椎脱位。解剖发达的肿瘤。用各种染色方法 (苏木精和 preosteoblasts (H & e) 染色, Picro 天狼星红染色, 科萨染色) 测定肿瘤分级和分化指数、和成熟成骨细胞。

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Representative Results

该协议包括 LFS iPSC 生成、MSC 分化、成骨细胞分化和 LFS MSC 成骨细胞在体内肿瘤发生的过程。

采用商用仙台病毒重新编程套件生成成纤维细胞 LFS iPSCs 的方案如图 1A所示。仙台病毒 Yamanaka 四因素的传递是一种非集成化的重编程方法。因此, 稳定的 LFS iPSC 克隆应该没有仙台病毒基因组和失去外源性 OCT4, SOX2, KLF4 和 c-myc 转基因, 这可以通过 rt-pcr 检查使用特定的引物 (图 1B)。正如制造商的指示中所建议的, 仙台无病毒 iPSCs 的产生取决于文化和通道条件。在本协议所描述的文化条件下, 在 iPSCs 中清除仙台病毒通常可以在10通道后检测到 (图 1B)。建立的 LFS iPSC 克隆应表现出典型的人类胚胎干细胞形态, 并显示阳性 AP 活动 (图 1C)。LFS iPSCs 高度表达干细胞因子基因 (北美OCT4SOX2DPPA4REX1), 可媲美人类胚胎干细胞 H1 线, 远高于父母成纤维细胞 (图 1D)。干细胞因子 (北美、OCT4) 和人类胚胎干细胞标记 (SSEA4 和 TRA-1-81) 的表达也可以通过免疫荧光染色 (图 1E) 来检验。

iPSCs 保持在 MEFs 至少14天前, 开始 MSC 分化 (图 2A)。虽然许多细胞死亡发生在 MSC 分化, 细胞培养板上可见的大量分化细胞和成纤维细胞样 MSCs 在细胞的边缘可以观察28天。(图 2B)。在对 MEF/MSC 培养基中分化细胞进行亚培养后, 分化的 MSCs 迅速增殖, 在35天左右呈现成纤维细胞状形态, 然后逐渐代表拉长的形状, 在40天形成涡流状图案 (图2B).差异化 LFS MSCs 表达的 msc 标记, 包括 CD44, CD73, CD105 和 CD166 的免疫荧光染色 (图 2C)。

图 3A勾勒成骨细胞分化。当 MSCs 受到成骨分化信号时, 分化细胞开始显示阳性碱性磷酸酶活性在9天 (图 3B)。该染色可用于检测成熟成骨细胞所产生的矿物质沉积。鲜艳的红色染色代替棕色染色, 表明了该染色的阳性结果, 可在21天后观察到 (图 3B)。分化成骨细胞显示, preosteoblast 基因 (ALPLCOL1A1) 和成熟成骨细胞基因 (BGLAPPTH1R) 在成骨过程中的表达水平呈上升趋势。

在体外移植模型可以建立的皮下注射 LFS MSC 成骨细胞在女/女鼠 (图 4A)。肿瘤可观察 6-10 周后皮下注射 (图 4B)。LFS 成骨细胞衍生肿瘤表现为未成熟成骨细胞特征, 阳性 ap 活性 (ap 染色), 阳性胶原基质沉积 (picrosirius 红染色), 但负矿化 (冯科萨染色) (图 4C).

Figure 1
图 1: iPSC 世代从 LFS 患者成纤维细胞.(A) iPSC 生成示意图。(B) 在10通道 (左) 和成纤维细胞后感染日 11 (转基因) 后重新编程的 KLF4 克隆中对仙台病毒基因组和 (科斯 (KLF4、OCT4SOX2)、iPSCc-myc) 进行 rt-pcr PCR 检测 (右,积极控制)。LFS iPSC 克隆是仙台病毒后10通道免费。GAPDH显示为内部控制。(C) LFS iPSCs 和 AP 染色的细胞形态学。比例条, 50 µm (D) qRT PCR北美, SOX2, OCT4, DPPA4 和 REX1 mRNA 表达 LFS iPSCs。人类胚胎干细胞 H1 线和父母 LFS 成纤维细胞分别用作阳性和阴性对照。mRNA 表达式被规范化为GAPDH表达式。相对 mRNA 表达调整为人类胚胎干细胞 H1 线为1。(E) 在人类胚胎干细胞 SSEA4 染色人类胚胎干细胞多能转录因子 (北美和 OCT4) 和 TRA-1-81 表面标记 (LFS 和 iPSCs)。刻度条, 50 µm。本研究所用抗体的稀释情况见表 2。引物序列如表 4所示。请单击此处查看此图的较大版本.

Figure 2
图 2: LFS iPSCs 分化为 MSCs.(A) 血小板生长因子 AB 诱导的 MSC 分化的示意图。(B) LFS iPSC 干细胞在分化日28、36天和40天的细胞形态。缩放条 , 100 µm. (C) 免疫荧光染色表明, 分化的 LFS MSCs 显示 CD44+, CD73+, CD105+, CD166+和 CD24 签名。刻度条, 30 µm。本研究所用抗体的稀释情况见表 2请单击此处查看此图的较大版本.

Figure 3
图 3: LFS 干细胞分化成成骨细胞.(A) 成骨分化的示意图。(B) AP 和 ARS 染色在不同的时间点 (3 天、6、9、12、15、18、21和 24) 进行。LFS 的成骨细胞的成骨分化有望导致9天左右的阳性 AP 染色和21天的阳性染色。(C) qRT PCR 分析表明, 在成骨分化过程中, 成骨细胞 (ALPLCOL1A1) 和成熟成骨细胞 (PTH1RBGLAP) 基因的表达增加。mRNA 表达式被规范化为GAPDH表达式。表达水平是相对于细胞在分化日0。引物序列如表 4所示。请单击此处查看此图的较大版本.

Figure 4
图 4:体内LFS 成骨细胞的肿瘤发生.(A) LFS 成骨细胞异种瘤的原理图。(B) LFS 小鼠在皮下注射10周后承受了成骨细胞衍生的肿瘤。(C) LFS 成骨细胞衍生肿瘤由 H & E、AP、picrosirius 红和科萨染色的形态学、骨相关 AP、胶原蛋白和矿床分别进行检查。LFS 肿瘤代表未成熟的成骨细胞特征, 表现为阳性 AP 活性、阳性胶原和负矿化。缩放栏, 1 毫米.请单击此处查看此图的较大版本.

成纤维细胞培养基 (500 毫升)
DMEM 440毫升
热灭活血清 50毫升
抗生素 (笔/链球菌) (100x) 5毫升
不必要氨基酸 (100x) 5毫升
2-巯基乙醇 3.5 µL
MEF/培养基 (500 毫升)
DMEM 440毫升
热灭活血清 50毫升
抗生素 (笔/链球菌) (100x) 5毫升
l-谷氨酰胺 (100x) 5毫升
人类胚胎干细胞介质 (500 毫升)
DMEM/F-12 384.5 毫升
剔除血清置换术 100毫升 (总共: 20%)
不必要氨基酸 (100x) 5毫升
抗生素 (笔/链球菌) (100x) 5毫升
l-谷氨酰胺 (100x) 5毫升
bFGF (10 µg/毫升) 500µL
2-巯基乙醇 3.5 µL
分化培养基 (500 毫升)
挖空 DMEM/F-12 或 DMEM/F-12 445毫升
剔除血清置换术 50毫升
bFGF (10 µg/毫升) 500µL (10 ng/毫升)
血小板-AB (25 µg/毫升) 200µL (10 ng/毫升)
不必要氨基酸 (100x) 5毫升
2-巯基乙醇 3.5 µL
成骨细胞分化培养基 (ODM) (500 毫升)
αMEM 395毫升
热灭活血清 50毫升
10毫米β甘油 50毫升 (1.08 克在50毫升αMEM)
0.1 µM 地塞米松 (光敏) 10µL 5 毫米地塞米松
200µM 抗坏血酸 (光敏) 100µL 1 毫米抗坏血酸
抗生素 (笔/链球菌) (100x) 5毫升
胶涂层溶液 (50 毫升)
基底膜基质 2毫升
DMEM/F-12 (前冷4°c) 48毫升
成骨细胞脱离溶液 (50 毫升)
0.25% 胰蛋白酶-EDTA 25毫升
胶原酶 II 溶液 (1 毫克/毫升) 25毫升
注: 在使用前先准备好成骨细胞脱离液。胶原酶 II 溶液保存在-20 摄氏度, 长达6月。

表 1: 成纤维细胞培养基、MEF/msc 培养基、人类胚胎干细胞培养基、分化培养基、ODM 和成骨细胞脱离液组成。

抗体名称 稀释
北美 1:500
OCT4 1:300
SSEA-4 聚乙烯共轭 1:600
TRI-1-81 1:600
驴抗山羊 IgG 1:500
山羊抗兔 IgG 1:500
CD105 1:500
CD44 1:500
CD73 1:500
CD166 1:500
CD24 1:500

表 2:抗体稀释.

培养板 播种密度 测定
12井板 0.67x104细胞每井 碱性磷酸酶染色 (AP 染色)
茜素红 S 染色 (ARS 染色)
6井板 2x104细胞每井 rt-pcr 检测
Preosteoblast 标记: ALPL, COL1A1
成熟成骨细胞标记物: PTH1R, BGLAP
100 mm 菜 3-4.5x105细胞每板 体内肿瘤发生

表 3:骨髓基质干细胞在成骨细胞分化中的播种密度.

仙台病毒引物
目标 底漆套
严重性 前进: GGATCACTAGGTGATATCGAGC
反向: ACCAGACAAGAGTTTAAGAGATATGTATC
科斯 (KLF4/OCT4/SOX2) 前进: ATGCACCGCTACGACGTGAGCGC
反向: ACCTTGACAATCCTGATGTGG
KLF4 前进: TTCCTGCATGCCAGAGGAGCCC
反向: AATGTATCGAAGGTGCTCAA
c-myc 前进: TAACTGACTAGCAGGCTTGTCG
反向: TCCACATACAGTCCTGGATGATGATG
rt-pcr 底漆
目标 底漆套
北美 前进: TTTGTGGGCCTGAAGAAAACT
反向: AGGGCTGTCCTGAATAAGCAG
SOX2 前进: AGAAGAGGAGAGAGAAAGAAAGGGAGAGA
反向: GAGAGAGGCAAACTGGAATCAGGATCAAA
OCT4 前进: AACCTGGAGTTTGTGCCAGGGTTT
反向: TGAACTTCACCTTCCCTCCAACCA
DPPA4 前进: GACCTCCACAGAGAAGTCGAG
反向: TGCCTTTTTCTTAGGGCAGAG
REX1 前进: GCCTTATGTGATGGCTATGTGT
反向: ACCCCTTATGACGCATTCTATGT
ALPL 前进: GGGACTGGTACTCAGACAACG
反向: GTAGGCGATGTCCTTACAGCC
COL1A1 前进: GTGCGATGACGTGATCTGTGA
反向: CGGTGGTTTCTTGGTCGGT
PTH1R 前进: AGTGCGAAAAACGGCTCAAG
反向: GATGCCTTATCTTTCCTGGGC
BGLAP 前进: GGCGCTACCTGTATCAATGG
反向: GGCGCTACCTGTATCAATGG

表 4: 底漆信息。

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Discussion

为了达到更高的 MSC 分化效率, 有几个方面是至关重要的。一是 iPSCs 的文化条件, 然后才开始进行 MSC 分化。手稿中提出的协议是基于以前的研究9,17。iPSCs 需要在 MEFs 上培养至少2周。维持 iPSCs 在良好的条件下 MEFs 是至关重要的细胞附着在明胶涂层板的 MSC 分化。另一个重要的方面是 iPSCs 在 MEFs 分化前的密度。80-90% 融合 iPSCs 的首选, 以启动 MSC 分化。iPSCs 的过度生长会损害细胞在分化过程中的存活。最后一个关键点是在开始 MSC 分化时的播种密度。在我们的手中, 高细胞密度促进 iPSC 附着在明胶涂层板。一个100毫米的盘子 iPSCs 可以播种到三井6井板。通过直接 resuspending 和电镀 iPSCs 在 msc 分化培养基中的诱导分化, 对 iPSCs 产生很大的压力, 因此在播种后偶尔会导致严重的细胞死亡。高密度的 iPSCs 提高了 MSC 分化的成功率。

与 MSC 分化不同, 成骨细胞分化过程更直接。为了实现可重现的分化结果, 确保起始 MSC 数字是一致的。同一细胞株的成骨分化结果可能随批次而变化, 因此, 不同品系的分型差异将在各组间产生比较结果。MSC 数量的增加缩短了阳性 AP 和 ARS 染色在较早时间点所显示的分化过程。同时, 在培养过程中, 由于聚集成骨细胞的潜在分离, 在较晚分化阶段 (18-24 天) 不推荐采用强力真空吸尘系统, 保证了 ODM 介质的变化。

异种成骨细胞用于体外移植实验是成骨细胞在14天的分化时间点。成骨细胞晚于 5月14日, 由于成骨细胞产生的胶原蛋白和其他骨基质材料的巨大堆积而难以离解。为防止成骨细胞离解的困难, LFS MSCs 可在成骨细胞分化的起始步骤中, 在 2-3 倍高的密度下播种, 以促进成骨分化。LFS 的成骨细胞可以在 6-10 天的分化时间点分离和收集在 6-7 天的外肿瘤发生检测的时候。LFS 移植瘤模型表明 LFS 的成骨细胞在体内癌变能力的概述, 为研究 LFS 相关骨肉瘤提供了一个替代平台。

总之, LFS iPSC 骨肉瘤模型为骨肉瘤的研究提供了宝贵的依据。除了骨肉瘤外, LFS 患者还患有各种其他类型的癌症, 如软组织肉瘤、乳腺癌和脑瘤。因此, LFS iPSC 的疾病模型可以推广到其他 LFS 相关的恶性肿瘤。干细胞疾病模型结合 LFS 患者衍生的 iPSCs 和工程突变 p53 (mutp53) LFS18, 对 mutp53 相关恶性肿瘤的发病机制和发展新的治疗策略具有重要的意义致癌p5316

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Disclosures

作者没有什么可透露的。

Acknowledgments

r.z. 是支持 UTHealth 创新的癌症预防研究培训项目前博士奖学金 (得克萨斯州癌症预防和研究所 RP160015)。j.t. 是中山大学第一附属医院科林项目的支持。F.L. 是癌症研究的 CPRIT 学者, 并获得 NIH 独立奖 R00 CA181496 和 CPRIT 奖 RR160019 的支持。

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Plastic ware
100 mm Dish Corning 430107
60 mm Dish Corning 430166
6-well Plate Falcon 353046
12-well Plate Falcon 353043
48-well Plate Falcon 353078
1 mL Pipet Tip USA Scientific 1111-2721
200 µL Pipet Tip USA Scientific 1111-0706
10 µL Pipet Tip USA Scientific 1111-3700
5 mL Serological Pipette SARSTEDT 86.1253.001
10 mL Serological Pipette SARSTEDT 86.1254.001
25 mL Serological Pipette SARSTEDT 86.1685.001
50 mL Tube, PP SARSTEDT 62.547.100
15 mL Tube, PP SARSTEDT 62.554.100
Culture materials and Reagents
CytoTune- iPS 2.0 Sendai Reprogramming Kit Invitrogen A16517 Commercial Sendai virus reprogramming kit
Corning hESC-Qualified Matrix Corning 354277 Basement membrane matrix
CF1 MEFs, irradiated ThermoFisher A34180
DMEM Sigma-Aldrich D5671
DMEM/F12 Corning 10-090-CV
αMEM Corning 10-022-CV
StemMACS iPS-Brew XF Miltenyi Biotec 130-104-368 Commercial iPSC medium
KnockOut DMEM/F-12 ThermoFisher 12660012
FBS Opti-Gold GenDEPOT F0900-050
KnockOut Serum Replacement ThermoFisher A3181502
Penicillin-Streptomycin Sigma-Aldrich P4333
MEM Nonessential Amino Acids Corning 25-025-CI
L-Glutamine Solution Sigma-Aldrich G7513
2-Mercaptoethanol Sigma-Aldrich M3148
Human FGF-basic (bFGF) PEPROTECH 100-18B
Recombinant Human PDGF-AB PEPROTECH 100-00AB
β-Glycerophosphate Sigma-Aldrich G9422
Dexamethasone Sigma-Aldrich A4902
Ascorbic Acid Sigma-Aldrich A5960
Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline, 1x (DPBS) Corning 21-031-CV
StemMACS Passaging Solution XF Miltenyi Biotec 130-104-688 Commercial passaging solution
Accutatse Cell Detachment Solution Corning 25-058-CI Cell detachment solution
Thiazovivin (ROCK Inhibitor) Calbiochem 420220
0.25% Trypsin-EDTA Solution Sigma-Aldrich T4049
Collagenase, Type II   ThermoFisher 17101015
Human NANOG Antibody R&D System AF1997
OCT4 Antibody (H-134) Santa Cruz sc-9081
Human/Mouse SSEA-4 PE-conjugated Antibody R&D System FAB1435P
Alexa Fluor 555 Mouse Anti-Human TRA-1-81 Antigen DB Biosciences 560123
Alexa Fluor 488 Donkey Anti-Goat IgG (H+L) Jackson ImmunoResearch 705-545-003
Alexa Fluor 488 Goat Anti-Rabbit IgG (H+L) Jackson ImmunoResearch 111-545-144
PE Mouse Anti-Human CD105 eBioscience 12-1057-42
FITC Mouse Anti-Human CD44 DB Biosciences 555478
PE Mouse Anti-Human CD73 DB Biosciences 550257
PE Mouse Anti-Human CD166 DB Biosciences 560903
FITC Mouse Anti-Human CD24 DB Biosciences 555427
Donkey Serum Jackson ImmunoResearch 017-000-121
Goat Serum Jackson ImmunoResearch 005-000-121
Alkaline Phosphatase Staining Kit II Stemgent 00-0055
Alizarin Red S Sigma-Aldrich A5533
TRIzol Reagent ThermoFisher 15596018
Chloroform ThermoFisher C298-500
2-Propanol ThermoFisher A416-4
Ethanol, Absolute, Molecular Biology Grade ThermoFisher BP28184
DNase I, RNase-free (1 U/µL) ThermoFisher EN0521
iScript cDNA Synthesis Kit BioRad 1708891BUN
iQ SYBR Green Supermix BioRad 1708884
Matrigel Matrix High Concentration (HC), Phenol-Red Free Corning 354262
1 mL Slip Tip Syringe, 26 Gauge x 5/8 Inch DB Biosciences 309597

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References

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癌症研究 问题 136 iPSCs Fraumeni 综合征 重编程 分化 间充质干细胞 成骨细胞 骨肉瘤 异种异体
应用 Fraumeni 综合征诱导多潜能干细胞建模骨肉瘤
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Zhou, R., Xu, A., Tu, J., Liu, M.,More

Zhou, R., Xu, A., Tu, J., Liu, M., Gingold, J. A., Zhao, R., Lee, D. F. Modeling Osteosarcoma Using Li-Fraumeni Syndrome Patient-derived Induced Pluripotent Stem Cells. J. Vis. Exp. (136), e57664, doi:10.3791/57664 (2018).

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