Summary
Her præsenterer vi en protokol for generation af induceret pluripotente stamceller (iPSCs) fra Li-Fraumeni syndrom (LFS) patient afledte fibroblaster, differentiering af iPSCs via mesenchymale stamceller (msc) til osteoblaster og modellering in vivo tumordannelse med LFS patient-afledte osteoblaster.
Abstract
Li-Fraumeni syndrom (LFS) er en autosomal dominerende arvelig kræft sygdom. Patienter med LFS er disponerede for en forskellige type af tumorer, herunder osteosarkom - en af de hyppigste primære ikke-hæmatologiske maligniteter i barndommen og ungdomsårene. Derfor giver LFS en ideel model for at studere denne malignitet. At drage fordel af iPSC metoder, LFS-associerede osteosarkom kan modelleres med held ved at differentiere LFS patient iPSCs til mesenchymale stamceller (msc), og derefter til osteoblaster--celler af oprindelsen for osteosarkomer. Disse LFS osteoblaster sammenfatte muterede egenskaber af osteosarkom, giver en attraktiv modelsystem for skildrer patogenesen af osteosarkom. Dette manuskript viser en protokol for generation af iPSCs fra LFS patient fibroblaster, differentiering af iPSCs at MSC'er, differentiering af MSC'er til osteoblaster og i vivo tumordannelse med LFS osteoblaster. Denne iPSC sygdom model kan udvides til at identificere potentielle biomarkører eller terapeutiske mål for LFS-associerede osteosarkom.
Introduction
Mellem 2006 og 2007 førte flere gennembrud fund fra laboratorier Drs. Shinya Yamanaka og James A. Thomson til udviklingen af induceret pluripotente stamceller (iPSCs)1,2,3. Af omprogrammering somatiske celler med definerede transcriptional faktorer til form iPSCs, forskere var i stand til at generere celler med nøglen egenskaber nemlig, pluripotency og selvfornyelse, som man tidligere troede kun findes i humane embryonale stamceller (hESCs). iPSCs kan oprettes fra enhver enkeltperson eller patienten og behøvede ikke at være afledt af embryoner, voldsomt ekspanderende repertoire af tilgængelige sygdomme og baggrunde til undersøgelsen. Siden da, har patienten-afledte iPSCs blevet brugt til at sammenfatte Fænotypen af forskellige sygdomme hos mennesker, fra Alzheimers sygdom4 og Amyotrofisk lateral sklerose5 til langt QT syndrom6,7, 8.
Disse fremskridt inden for iPSC forskning har også åbnet nye muligheder for kræftforskningen. Flere grupper har for nylig brugt patient iPSCs model kræft udvikling under en modtagelige genetiske baggrund9,10,11, med vellykket anvendelse demonstreret til dato i osteosarcoma9, leukæmi10,11,12, og kolorektal cancer13. Selv om iPSC-afledte kræftmodeller er stadig i sin vorden, har de vist stort potentiale i phenocopying sygdom-associerede maligniteter, belyse patologiske mekanismer, og at identificere terapeutiske forbindelser14.
Li-Fraumeni syndrom (LFS) er en autosomal dominerende arvelig kræft sygdom forårsaget af TP53 kønscelleoverførsel mutation15. Patienter med LFS er disponerede for en forskellige type af maligne sygdomme herunder osteosarkom, at gøre LFS iPSCs og deres afledte celler særlig velegnet til at studere denne malignitet16. En iPSC-baserede osteosarkom model blev først etableret i 2015 ved hjælp af LFS patient-afledte iPSCs9 efterfølgende opdeles i mesenchymale stamceller (msc) og derefter til osteoblaster, den oprindelse celler af osteosarkom. Disse LFS osteoblaster sammenfatte osteosarkom-associerede osteogenic differentiering defekter og muterede egenskaber, demonstrerer model potentiale som en "knogletumor i et fad" platform. Interessant, genome-wide transkriptom analyse afsløre aspekter af en osteosarkom gen signatur i LFS osteoblaster, og at funktionerne i denne LFS gen expression profil er korreleret med dårlig prognose i osteosarcoma9, der angiver den potentialet i LFS iPSCs sygdomsmodeller til at afsløre funktioner af klinisk relevans.
Håndskriftet indeholder en detaljeret beskrivelse af hvordan man bruger LFS patient-afledte iPSCs til model osteosarkom. Det beskriver generation af LFS iPSCs, differentiering af iPSCs at MSC'er og derefter til osteoblaster, og brugen af en i vivo xenograft model ved hjælp af LFS osteoblaster. LFS sygdom model består af flere fordele, især evnen til at generere ubegrænset celler i alle faser af osteosarkom udvikling for Mekanistiske undersøgelser, biomarkør identifikation og stof screening9,14, 16.
I Resumé tilbyder LFS iPSC-baserede osteosarkom model en attraktiv komplementære system for at fremme osteosarkom forskning. Denne platform giver også en proof of concept for kræft modellering ved hjælp af patient-afledte iPSCs. Denne strategi er beskrevet nedenfor kan udvides let til model maligne sygdomme forbundet med andre genetiske sygdomme med kræft prædisposition.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Dette arbejde blev godkendt af The University of Texas Health Science Center i Houston (UTHealth) dyr Velfærdsudvalget. Forsøgene udføres i nøje overensstemmelse med de standarder fastsat af UTHealth Center for Laboratory Animal medicin & Care (CLAMC) som er akkrediteret af American Association for Laboratory Animal Care (AAALAC International). Forsøgspersoner i denne undersøgelse falder ind under Scenario en ("No menneskelige emner forskning") som defineret af NIH SF424 dokumentation. Det behøver derfor ikke nogen godkendelse af UTHealth menneskelige videnskabsetisk Komité.
1. generation af LFS iPSCs (figur 1A)
- På dag -2, plade 2 x 104 LFS patient fibroblaster i en brønd på en 6-godt plade, og kultur celler med fibroblast medium (tabel 1) ved 37 ° C i en fugtig 5% CO2 inkubator. Sikre at fibroblaster nå 50-60% sammenløbet på dagen for transduktion (dag 0).
- Udføre Sendai virus transduktion på dag 0. For at gøre dette, skal du erstatte brugt mediet med pre varmede fibroblast medium. Optø den kommercielle Sendai virus omprogrammering kit (Se Tabel af materialer) på is. Inficere LFS fibroblaster med blandet Sendai virus ifølge producentens anvisninger.
- Vedligeholdelse af de transduced celler i fibroblast medium (dag 1-6):
- På dag 1, 24 h efter transduktion, fjerne den fibroblast medium indeholdende resterende Sendai virus og erstatte det med 2 mL frisk fibroblast medium. Kultur transduced fibroblaster ved 37 ° C i en fugtig 5% CO2 inkubator.
- Ændre medium med fibroblast medium hver anden dag fra dag 2-6.
- Vedligeholdelse af de transduced celler i feeder kultur tilstand (dag 7-28):
- Forberede bestrålede CF1 mus embryonale fibroblast (MEF) kultur retter på dag 6. For at gøre denne frakke Aspirér seks 100 mm vævskultur retter ved at tilføje 5 mL af 0,1% gelatine til hver plade ved stuetemperatur i 30 min. 0,1% gelatine efter belægning.
- Fjern MEFs fra flydende kvælstof container. Optø MEFs ved hjælp af kommercielt tilgængelige optøningen system efter fabrikantens anvisninger. Plade celler på gelatine-belagte plader med MEF/MSC næringssubstratet (tabel 1) med en seeding tæthed på omkring 6.7 x 105 celler pr. 100 mm vævskultur parabol.
- Podes transduced cellerne på MEF plader (dag 7): Trypsinize transduced celler ved hjælp af 1 mL 0,25% Trypsin-EDTA pr. 100 mm parabol for 2-4 min ved stuetemperatur. Neutralisere trypsin med 9 mL fibroblast medium. Overførsel celler til koniske rør og centrifugeres celler på 230 x g ved 37 ° C i 4 min. plade de transduced fibroblaster på seks MEF retter tilberedt på dag 6 og kultur dem i 8 mL af fibroblast medium pr. fad.
Bemærk: Confluency af MEFs er omkring 20% før såning transduced celle på MEF plader. - På dag 8, kassere fibroblast medium og erstatte med menneskelige stamceller medium (tabel 1).
- Vente på fremkomsten af iPS kloner fra dage 9-28 (figur 1C). Ændre brugt menneskelige stamceller medium hver anden dag og overvåge fremkomsten af iPS kloner under mikroskop. Afvente iPSCs kloner stor nok til at ses med det blotte øje og derefter gå videre til at udvide undersøgelsesperioderne kloner i feeder-fri kultur tilstand.
- Udvidelse af den opstået iPS kloner i feeder-fri kultur tilstand (dag 29-79 ~ 99):
- For at forberede den matrix-belagt plade, pels en 48-godt plade med 120 µL af basalmembranen matrix belægning løsning (tabel 1) pr. brønd. Kontroller basalmembranen matrix belægning løsning dækker godt og frakker kultur parabol overflade. Lade det blive ved stuetemperatur for 1 h. aspirat belægning løsning umiddelbart før brug og tilføje 250 µL af menneskelige stamceller medium pr. brønd med 2 µM ROCK hæmmer Thiazovivin.
- På den dag 28, Aspirér brugt menneskelige stamceller medium og vaske iPS kloner med 1 x DPBS. Afhente synlige iPS kloner med 1 mL pipette tip og overførsel i en brønd på en behandlet 48-godt plade (trin 1.4.1). Frø en koloni pr. brønd af 48-godt plade.
- Der centrifugeres plade på 230 x g i 4 min. at lette celle vedhæftet fil. Kultur iPS kloner ved 37 ° C i en fugtig 5% CO2 inkubator.
- Den følgende dag (dag 29), fjerne brugte menneskelige stamceller medium og tilføje 250 µL af kommercielt tilgængelige iPSC medium i hver brønd.
- Vedligeholde iPS kloner ved 37 ° C i en fugtig 5% CO2 inkubator, og ændre iPSC medium hver anden dag.
- Når iPS kloner nå 85% sammenløb, subkultur celler på en 1:10 ratio af kultur område. Tilsættes 60 µL af den kommercielle passaging løsning at afmontere cellerne og inkuberes ved 37 ° C i 3 min.
- Seed halvdelen af de aftagne iPSCs på en basalmembran matrix-belagt 12-godt plade i 1 mL af menneskelige stamceller medium med 2 µM ROCK hæmmer Thiazovivin. Kultur iPS kloner i en 12-godt plade med 1 mL af kommercielt tilgængelige iPSC medium pr. brønd og subkultur iPSCs på en 1:10 forholdet indtil de når passage 10.
Bemærk: iPSCs er sub kulturperler hver 5-7 dage på en 1:10 ratio. Det tager op til 10 uger for iPS kloner at nå passage 10. iPSC beskrivelser herunder celle morfologi, alkalisk fosfatase (AP) aktivitet og udtryk pluripotency faktorer og menneskelige stamceller markører, kan undersøges efter bekræftelse af fjernelse af Sendai virus i iPSCs (vist normalt efter omkring 10 passager) (figur 1B-E). Antistof og primer information til iPSC karakterisering er inkluderet i tabel 2 og 4.
2. differentiering af LFS iPSCs til mesenchymale stamceller (msc) (figur 2A)
- Kultur iPSC kloner på MEF plader i mindst 2 uger (dag ~ -14-0): forberede MEF retter (100 mm vævskultur retter) som tidligere beskrevet (1.3.1 - 1.3.2). Opretholde iPSCs i menneskelige stamceller medium og ændre medium hver anden dag. Når iPSCs nå 90% sammenløb, subkultur iPSCs ved 1:10 fortynding.
- Fjernelse af MEFs fra iPSCs (dag 0):
- Efter fastholdelse af iPSCs på MEFs i 2 uger, nå kultur iPSCs i 100 mm vævskultur retter indtil celler 80-90% sammenløb. Fjern den brugte menneskelige stamceller medium og vaske iPSCs med 5 mL af 1 x DPBS. Der tilsættes 1 mL af celle detachement løsning at afmontere cellerne og inkuberes ved stuetemperatur i 3 min.
- Tilføje 9 mL MEF/MSC næringssubstratet på pladen til at neutralisere celle detachement løsning aktivitet og overføre de fritliggende celler til en ny 100 mm vævskultur parabol uden nogen belægning.
- Inkuber cellerne ved stuetemperatur i 30 min. at tillade MEFs at knytte til pladen.
- Omhyggeligt indsamle supernatanten, som indeholder løstliggende iPSCs og centrifugeres ved 230 x g ved 4 ° C i 4 min.
Bemærk: Skødesløst rødmen plade bunden fører til udstationering af MEFs.
- Differentiering af iPSCs mod MSCs (dag 0 - 28):
- Coat tre brønde i en 6-godt plade med 1 mL 0,1% gelatine pr. brønd ved stuetemperatur i 30 min.
- Fjern supernatanten af det indsamlede iPSCs fra 2.2.4.
- Resuspend iPSCs i 6 mL af MSC differentiering medium (tabel 1) og frø celler i de tre coatede brønde med 2 mL pr. brønd (dag 0).
- Ændre MSC differentiering mellem hver to dage for at fjerne løstliggende og/eller døde celler (dag 1 - 28).
- Modning af iPSC-afledte MSCs (dag 28-45):
- Fjern den brugte MSC differentiering medium og vaske cellerne med 1 mL af 1 x DPBS.
- Trypsinize MSCs med 0,5 mL 0,25% Trypsin-EDTA pr. brønd ved stuetemperatur i 3 min.
- Neutralisere trypsin af 1,5 mL af næringssubstratet MEF/MSC og indsamle MSCs fra tre brønde i en 15 mL konisk tube. Der centrifugeres ved 230 x g ved 4 ° C i 4 min.
- Fjern supernatanten og resuspend MSCs i 3 mL MEF/MSC næringssubstratet og plade på en 60 mm 0,1% gelatine-belagt plade (dag 28).
- Kultur MSCs MEF/MSC dyrkningsmedium og ændre medium hver to dage. Når cellerne kommer 100% sammenløb, subkultur MSCs i forholdet 1:3 med 0,25% Trypsin-EDTA.
Bemærk: MSCs vise en fibroblast-lignende morfologi (figur 2B). Når MSCs vokser med en høj massefylde, kan aflange MSCs danne en hvirvel-lignende mønster (figur 2B). - Udføre immunfluorescent farvning for at evaluere iPSC-afledte MSCs ved at undersøge MSC celleoverflademarkører CD44, CD73, CD105 og CD166 (figur 2 c).
Bemærk: Fortyndingen af antistoffer er vist i tabel 2. Immunfluorescent farvning af levende celler er udført efter fabrikantens anvisninger. - Efter bekræftelse, skal du udvide MSCs i forholdet 1:3 i 100 mm vævskultur retter. Fryse ned hætteglas (3 hætteglas pr. 100 mm vævskultur parabol) ved hjælp af indefrysning medium indeholdende 10% DMSO og 90% FBS.
Bemærk: For at berige befolkningens MSC, MSCs kan sorteres ved hjælp af CD105+, CD24-kriterier ved flow flowcytometri9,17. iPSC-afledte MSCs differentieret ved hjælp af metoden PDGF-AB-baserede almindeligvis kan opretholdes i 2-3 måneder i kultur uden tab af MSC identitet9. Fryse MSCs fra en tidlig passage nummer efter bekræfter MSC karakteristika.
3. differentieringen af LFS MSC'er til osteoblaster (figur 3A)
- Forberedelse af MSCs for osteogenic differentiering (dag -1)
- For at sikre en tilstrækkelig mængde af celler til at fuldføre osteogenic differentiering protokol, Begynd med MSCs kulturperler i 100 mm vævskultur retter til 95% sammenløb. Fjern det brugte næringssubstratet og vaske MSCs med 5 mL af 1 x DPBS.
- Trypsinize MSCs med 1 mL 0,25% trypsin-EDTA pr. 100 mm parabol ved stuetemperatur i 3 min. For at sikre, at cellerne ikke er over trypsinized, stoppe trypsinization når 50% af celle udstationering er observeret under mikroskop.
- Neutralisere trypsin af 9 mL MEF/MSC næringssubstratet og indsamle MSCs fra 3 brønde i en 15 mL konisk tube. Der centrifugeres ved 230 x g ved 4 ° C i 4 min.
- Opsug supernatanten, resuspend MSCs i 5 mL af MSC medium, og tæller antallet af celler af en hemocytometer.
- Plade ordentlig antallet af MSCs på en kultur plade.
Bemærk: Detalje i celle antal 12-godt plade, 6 godt-plade, og 100 mm vævskultur retter er sammenfattet i tabel 3.
- Induktion af osteogenic differentiering af osteoblastdannelse differentiering medium (ODM) (tabel 1) (dag 0 - 24):
- Opsug MEF/MSC næringssubstratet og erstatte med den korrekte mængde af ODM (1 mL, 2 mL og 8 mL for hver brønd af 12-godt plade, hver brønd 6-godt plade, og 100 mm vævskultur parabol, henholdsvis) at differentiere MSC'er til osteoblaster (dag 0).
- Opsug den brugte ODM og erstatte med den korrekte mængde af ODM hver to dage i løbet af osteogenic differentiering processen.
- Udføre den basisk fosfatase (AP) og Alizarin rød S (ARS) farvning til påvisning af knogle-associerede alkalisk fosfatase produceret af preosteoblasts og mineralske deposition produceret af modne osteoblaster, henholdsvis på dag 3, 6, 9, 12, 15, 18, 21 og 24 ( Figur 3B).
Bemærk: AP farvning og ARS farvning er udført ved hjælp af kommercielt tilgængelige kit efter fabrikanten protokol. - Undersøge udtrykket niveauer af preosteoblast og modne osteoblastdannelse markører (ALPL og COL1A1 for preosteoblasts; PTH1R og BGLAP for modne osteoblaster) af qRT-PCR (figur 3 c).
Bemærk: Positiv AP farvning forventes efter dag 9 af osteogenic differentiering og positive ARS farvning kan forventes efter dag 21 af osteogenic differentiering. MSC'er voksende MEF/MSC dyrkningsmedium kan serveres som en negativ kontrol af AP farvning og ARS farvning.
4. Xenograft Model til at studere In Vivo tumordannelse af LFS MSC-afledte osteoblaster (figur 4A)
- Differentiering af LFS MSC'er til osteoblaster:
- Frø 3-4,5 x 105 MSCs i 100 mm vævskultur parabol. Forberede en subkutan injektion fem retter.
- Kultur MSCs i ODM at differentiere MSC'er til osteoblaster, som beskrevet i punkt 3.2 indtil dag 14.
- Forberedelse af differentierede osteoblaster til subkutan injektion:
- For at forberede osteoblastdannelse detachement løsning (tabel 1), opløse 1 g type II collagenase i 1000 mL af αMEM medium at gøre collagenase II løsning (1 mg/mL). Holde collagenase II løsning på-20 ° C. Bland 0,25% Trypsin-EDTA og collagenase II løsning på forholdet 1:1 at gøre osteoblaster detachement løsning.
- Fjern den brugte ODM og vaske differentieret osteoblaster med 5 mL af 1 x DPBS pr. 100 mm parabol.
- Der tilsættes 1,5 mL osteoblastdannelse detachement løsning pr. 100 mm parabol og inkuberes retter ved 37 ° C i 30 min. undersøge og sikre osteoblastdannelse detachement ved mikroskopi.
- Neutralisere osteoblaster detachement løsning af ODM og indsamle de fritliggende osteoblaster i en 50 mL konisk slange. Der centrifugeres ved 230 x g ved 4 ° C i 5 min.
- Fjern supernatanten og resuspend celler i 25 mL af ODM medium. Passere en 70 µm celle si at fjerne aggregerede celler celler. Tælle celle tal ved hjælp af en hemocytometer.
- Forberede 1 x 107 osteoblaster pr. subkutan injektion og centrifugeres celler på 230 x g ved 4 ° C i 4 min.
- Resuspend 1 x 107 osteoblaster i 50 µL iskold 1 x DPBS. Mix opdelte osteoblaster med 50 µL af phenol-rød gratis basalmembranen matrix (osteoblaster suspension og basalmembranen matrix blev mixet i forholdet 1:1) og vedligeholde osteoblaster på is før injektion.
-
In vivo xenograft tumor model af LFS MSC-afledte osteoblaster:
- Bedøver 8-uge-forhenværende kvindelig immunkompromitterede NU/NU mus i et kammer levere 5% (v/v) inhaleret isofluran i 1 L/min ilt (fra CLAMC). Når dyret bliver liggende, skifte den bedøvende levering system til næsen kegle, levere 2% (v/v) inhaleret isofluran i 200mL/min ilt (fra CLAMC). Overvåge dybde af anæstesi ved at kontrollere den hornhinde og pedal reflekser at musene er tilstrækkeligt bedøvede og ikke lider af ubehag under proceduren.
- Desinficere området sprøjtes med vekslende svaberprøver af klorhexidin og 70% isopropanol. Bruge 26 G kanyle til subkutan injektion af basalmembranen matrix-blandet LFS osteoblaster i den ene side af bagbenene af 8-uge-forhenværende immunkompromitterede NU/NU mus (figur 4A).
- Overvåge mus ved at udføre ugentlige palpering på injektionssteder for vækst af subkutane nodulær tætheder. Tumordannelse kan iagttages omkring 6-10 uger efter injektion (figur 4B).
- Aflive mus af kuldioxid kvælning metode efterfulgt af cervikal dislokation. Dissekere de udviklede tumorer. Bestemme tumor lønklasse og differentiering indeks, preosteoblasts og modne osteoblaster af forskellige farvning metoder (fx hæmatoxylin og Eosin (H & E) farvning, Picro Sirius rød farvning, og von Kossa farvning henholdsvis).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Denne protokol præsenterer de procedurer, herunder LFS-iPSC generation, MSC-differentiering, osteoblastdannelse differentiering og i vivo tumordannelse assay med LFS MSC-afledte osteoblaster.
Ordningen for generation af LFS iPSCs fra fibroblaster ved hjælp af en kommercielt tilgængelig Sendai virus omprogrammering kit er vist i figur 1A. Sendai virus-baserede levering af Yamanaka fire faktorer er en ikke-integrere omprogrammering metode. Stabil LFS iPSC kloner bør derfor gratis Sendai virusgenom og tab af eksogene OCT4, SOX2, KLF4 og c-MYC transgener, som kan blive undersøgt af RT-PCR ved hjælp af specifikke primere (figur 1B). Som det er foreslået i fabrikantens anvisninger, generation af Sendai virus-fri iPSCs, afhænger af både kultur og passage betingelser. Under de beskrevne kultur betingelser i denne protokol, kan fjernelse af Sendai virus i iPSCs normalt påvises efter 10 passager (figur 1B). De etablerede LFS iPSC kloner skal udviser typiske menneskelige stamceller morfologi og vise den positive AP aktivitet (figur 1 c). LFS iPSCs stærkt udtryk pluripotency faktor mRNAs (NANOG, OCT4, SOX2, DPPA4og REX1), sammenlignes med menneskelige stamceller H1 linje og meget højere end forældrenes fibroblaster (fig. 1 d). Udtryk pluripotency faktorer (NANOG, OCT4) og menneskelige stamceller markører (SSEA4 og TRA-1-81) kan også undersøges af immunfluorescent farvning (figur 1E).
iPSCs vedligeholdes på MEFs i mindst 14 dage før indlede MSC differentiering (figur 2A). Selv om en masse celledød sker under MSC differentiering, masser af differentierede celler er synlige på celle kultur plade og fibroblast-lignende MSCs på kanten af de celle masserne kan observeres i dag 28. (Figur 2B). Efter sub dyrkning differentierede celler MEF/MSC dyrkningsmedium, differentieret MSCs formere sig hurtigt og Vis fibroblast-lignende morfologi omkring dag 35, og derefter gradvist repræsenterer en aflang form og danne en hvirvel mønster på dag 40 (figur 2B ). Differentierede LFS MSCs express MSC markører, herunder CD44, CD73, CD105 og CD166 ved immunfluorescens farvning (figur 2 c).
Figur 3A skitserer osteoblastic differentiering. Når MSCs udsættes for osteogenic differentiering signaler, begynder de differentierede celler at vise positive alkalisk fosfataseaktivitet på dag 9 (figur 3B). ARS farvning kan bruges til at registrere mineral deposition produceret af modne osteoblaster. Den lyse røde farve pletter i stedet for brun farve farvning angiver det positive resultat af ARS farvning, som kan observeres efter dag 21 (figur 3B). De differentiering osteoblaster viser stigende udtryk niveau af preosteoblast gener (ALPL og COL1A1) og modne osteoblastdannelse gener (BGLAP og PTH1R) under osteogenic differentiering.
In vivo xenograft model kan etableres ved at indsprøjte subkutant LFS MSC-afledte osteoblaster i NU/NU mus (figur 4A). Tumorer kan observeres 6-10 uger efter subkutan injektion (figur 4B). LFS osteoblastdannelse-afledte tumorer viste umodne osteoblastdannelse karakteristika, positiv AP aktivitet (AP farvning), positive kollagen matrix deposition (picrosirius røde pletter) men negative mineralisering (von Kossa farvning) på (figur 4 c) .
Figur 1 : iPSC generation fra LFS patient fibroblaster. (A) skematisk diagram over iPSC generation. ()B) RT-PCR påvisning af Sendai virusgenom og transgener (KOS (KLF4, OCT4, og SOX2), KLF4, og c-MYC) i omprogrammeret iPSC klon efter 10 passager (venstre) og fibroblast efter infektionen dag 11 (til højre, positiv kontrol). LFS iPSC klon er Sendai virus fri efter 10 passager. GAPDH er vist som intern kontrol. (C) celle morfologi af LFS iPSCs og AP farvning. Skalalinjen, 50 µm (D) qRT-PCR NANOG, SOX2, OCT4, DPPA4og REX1 mRNA udtryk i LFS iPSCs. menneskelige stamceller H1 linje og forældrenes LFS fibroblaster er brugt som en positiv og en negativ kontrol, henholdsvis. MRNA udtryk er normaliseret til GAPDH udtryk. Den relative mRNA udtryk er justeret til menneskelige stamceller H1 linje som 1. (E) immunfarvning af menneskelige stamceller pluripotente transkriptionsfaktorer (NANOG og OCT4) og menneskelige stamceller overflade markører (SSEA4 og TRA-1-81) i LFS iPSCs. Skalalinjen, 50 µm. Fortynding af antistoffer, der anvendes i denne undersøgelse er vist i tabel 2. Primer sekvenser er vist i tabel 4. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2 : Differentiering af LFS iPSCs til MSCs. (A) skematisk diagram af PDGF-AB-induceret MSC differentiering. (B) celle morfologi af LFS iPSC-afledte MSCs på differentiering dag 28, dag 36 og dag 40 +. Skalalinjen, 100 µm. (C) immunofluorescens farvning viser, at differentierede LFS MSCs udviser CD44+, CD73+, CD105+, CD166+, og CD24- underskrift. Skalalinjen, 30 µm. Fortynding af antistoffer, der anvendes i denne undersøgelse er vist i tabel 2. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3 : Differentiering af LFS MSC'er til osteoblaster. (A) skematisk diagram over osteogenic differentiering. (B) AP og ARS farvning er udført på forskellige tidspunkter (dag 3, 6, 9, 12, 15, 18, 21 og 24). Osteoblastic differentiering af LFS MSC-afledte osteoblaster forventes at føre til positive AP farvning omkring dag 9 og positive ARS farvning i dag 21. (C) qRT-PCR analyse viser øget udtryk for pre osteoblastdannelse (ALPL og COL1A1) og modne osteoblastdannelse (PTH1R og BGLAP) gener under osteogenic differentiering. MRNA udtryk er normaliseret til GAPDH udtryk. Udtrykket niveau var i forhold til celler på differentiering dag 0. Primer sekvenser er vist i tabel 4. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 4 : In vivo tumordannelse af LFS MSC-afledte osteoblaster. (A) skematisk diagram af tumor xenograft af LFS osteoblaster. (B) NU/NU mus bære LFS osteoblastdannelse-afledte tumorer efter 10 uger efter subkutan injektion. (C) LFS osteoblastdannelse-afledte tumorer blev undersøgt af H & E, AP, picrosirius røde og von Kossa farvning for morfologi, knogle-associerede AP, kollagen og mineralforekomster, henholdsvis. LFS-afledte tumorer udgør umodne osteoblastdannelse egenskaber viser positiv AP aktivitet, positive kollagen og negative mineral mineralisering. Skalalinjen, 1 mm. venligst klik her for at se en større version af dette tal.
| Fibroblast Medium (500 mL) | |
| DMEM | 440 mL |
| Varme-inaktiverede FBS | 50 mL |
| Antibiotics(pen/STREP) (100 x) | 5 mL |
| Uvæsentlige aminosyre (100 x) | 5 mL |
| 2-Mercaptoethanol | 3,5 ΜL |
| MEF/MSC næringssubstratet (500 mL) | |
| DMEM | 440 mL |
| Varme-inaktiverede FBS | 50 mL |
| Antibiotics(pen/STREP) (100 x) | 5 mL |
| L-glutamin (100 x) | 5 mL |
| menneskelige stamceller medium (500 mL) | |
| DMEM/F-12 | 384.5 mL |
| KnockOut Serum udskiftning | 100 mL (total: 20%) |
| Uvæsentlige aminosyre (100 x) | 5 mL |
| Antibiotika (Pen/Strep) (100 x) | 5 mL |
| L-glutamin (100 x) | 5 mL |
| bFGF (10 µg/mL) | 500 ΜL |
| 2-Mercaptoethanol | 3,5 ΜL |
| MSC differentiering Medium (500 mL) | |
| KnockOut DMEM/F-12 eller DMEM/F-12 | 445 mL |
| KnockOut Serum udskiftning | 50 mL |
| bFGF (10 µg/mL) | 500 µL (10 ng/mL) |
| PDGF-AB (25 µg/mL) | 200 µL (10 ng/mL) |
| Uvæsentlige aminosyre (100 x) | 5 mL |
| 2-Mercaptoethanol | 3,5 ΜL |
| Osteoblastdannelse differentiering Medium (ODM) (500 mL) | |
| ΑMEM | 395 mL |
| Varme-inaktiverede FBS | 50 mL |
| 10 mM β-Glycerophosphate | 50 mL (1.08 g i 50 mL αMEM) |
| 0,1 µM dexamethason (lysfølsomt) | 10 µL af 5 mM dexamethason |
| 200 µM ascorbinsyre (lysfølsomt) | 100 µL af 1 mM ascorbinsyre |
| Antibiotika (Pen/Strep) (100 x) | 5 mL |
| Matrigel belægning løsning (50 mL) | |
| Basalmembranen Matrix | 2 mL |
| DMEM/F-12 (pre kold 4 ° C) | 48 mL |
| Osteoblastdannelse detachement løsning (50 mL) | |
| 0,25% trypsin-EDTA | 25 mL |
| Collagenase II løsning (1 mg/mL) | 25 mL |
| Bemærk: Forberede osteoblastdannelse detachement løsning frisk lige før brug. Collagenase II løsningen gemmes ved-20 ° C i op til 6 måneder. | |
Tabel 1: Sammensætningen af fibroblast medium, MEF/MSC næringssubstrat, menneskelige stamceller medium, MSC differentiering medium, ODM og osteoblastdannelse detachement løsning.
| Antistof navn | Fortynding |
| NANOG | 1: 500 |
| OCT4 | 1: 300 |
| SSEA-4 PE-konjugeret | 1:600 |
| TRI-1-81 | 1:600 |
| Æsel anti-ged IgG | 1: 500 |
| Ged anti-kanin IgG | 1: 500 |
| CD105 | 1: 500 |
| CD44 | 1: 500 |
| CD73 | 1: 500 |
| CD166 | 1: 500 |
| CD24 | 1: 500 |
Tabel 2: Antistof fortynding.
| Kultur plade | Såning tæthed | Analysen |
| 12-godt plade | 0.67x104 celler pr. brønd | Alkalisk fosfatase farvning (AP farvning) |
| Alizarin rød S farvning (ARS farvning) | ||
| 6-godt plade | 2 x 104 celler pr. brønd | RT-PCR påvisning |
| Preosteoblast markører: ALPL, COL1A1 | ||
| Modne osteoblastdannelse markører: PTH1R, BGLAP | ||
| 100 mm parabol | 3 - 4.5x105 celler pr. plade | In vivo tumordannelse |
Tabel 3: Såning tæthed af MSCs for osteoblastic differentiering.
| Sendai Virus primere | |
| Target | Primer sæt |
| SeV | Frem: GGATCACTAGGTGATATCGAGC |
| Omvendt: ACCAGACAAGAGTTTAAGAGATATGTATC | |
| KOS (KLF4/OCT4/SOX2) | Frem: ATGCACCGCTACGACGTGAGCGC |
| Omvendt: ACCTTGACAATCCTGATGTGG | |
| KLF4 | Frem: TTCCTGCATGCCAGAGGAGCCC |
| Omvendt: AATGTATCGAAGGTGCTCAA | |
| c-MYC | Frem: TAACTGACTAGCAGGCTTGTCG |
| Omvendt: TCCACATACAGTCCTGGATGATGATG | |
| RT-PCR-primere | |
| Target | Primer sæt |
| NANOG | Frem: TTTGTGGGCCTGAAGAAAACT |
| Omvendt: AGGGCTGTCCTGAATAAGCAG | |
| SOX2 | Frem: AGAAGAGGAGAGAGAAAGAAAGGGAGAGA |
| Omvendt: GAGAGAGGCAAACTGGAATCAGGATCAAA | |
| OCT4 | Frem: AACCTGGAGTTTGTGCCAGGGTTT |
| Omvendt: TGAACTTCACCTTCCCTCCAACCA | |
| DPPA4 | Frem: GACCTCCACAGAGAAGTCGAG |
| Omvendt: TGCCTTTTTCTTAGGGCAGAG | |
| REX1 | Frem: GCCTTATGTGATGGCTATGTGT |
| Omvendt: ACCCCTTATGACGCATTCTATGT | |
| ALPL | Frem: GGGACTGGTACTCAGACAACG |
| Omvendt: GTAGGCGATGTCCTTACAGCC | |
| COL1A1 | Frem: GTGCGATGACGTGATCTGTGA |
| Omvendt: CGGTGGTTTCTTGGTCGGT | |
| PTH1R | Frem: AGTGCGAAAAACGGCTCAAG |
| Omvendt: GATGCCTTATCTTTCCTGGGC | |
| BGLAP | Frem: GGCGCTACCTGTATCAATGG |
| Omvendt: GGCGCTACCTGTATCAATGG |
Tabel 4: Primer oplysninger.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
For at opnå højere MSC differentiering effektivitet, er flere aspekter kritisk. En er betingelsen kultur af iPSCs før indlede MSC differentiering. Protokollen præsenteret i håndskriftet er baseret på tidligere undersøgelser 9,17. iPSCs skal være kulturperler på MEFs i mindst 2 uger. Opretholde iPSCs i gode er betingelser på MEFs afgørende for celler til at fastgøre på gelatine-belagt pladen for MSC differentiering. Et andet vigtigt aspekt er massefylden af iPSCs på MEFs før differentiering. 80 - 90% confluency af iPSCs er foretrukket at indlede MSC differentiering. Overvækst af iPSCs vil forringe celle overlevelse under differentiering proces. Den sidste kritiske punkt er seeding massefylden ved start MSC differentiering. I vores hænder fremmer høj celle tæthed iPSC vedhæftet fil på gelatine-belagt pladen. En 100 mm parabol iPSCs kan være seedet til tre brønde af 6-godt plade. Indledning af MSC differentiering af direkte resuspending og plating iPSCs i MSC differentiering medium producerer store belastninger på iPSCs, derfor undertiden resulterer i alvorlige celledød efter såning. Høj tæthed af iPSCs øger succesraten for MSC differentiering.
I modsætning til MSC differentiering er osteoblastic differentiering proces mere ligetil. For at opnå reproducerbare differentiering resultater, sikre de igangsættende MSC tal er konsistent. Resultater for osteoblastic differentiering fra de samme cellelinje kan variere fra batch til batch, derfor, opsætning af differentiering for forskellige linjer på samme tid vil give flere sammenlignende resultater blandt grupper. Forhøjelsen af MSC numre forkorte differentiering processen angivet af positive AP og ARS farvning på et tidligere tidspunkt. Ligeledes, sikre ændringen af ODM medium håndteres på en blid måde og kraftfulde vakuum suge system anbefales ikke i de sene differentiering fase (dag 18 - 24) på grund af den potentielle udstationering af aggregerede osteoblaster under kultur proces.
De differentierede osteoblaster bruges til i vivo xenograft eksperiment er osteoblaster for dag 14 differentiering tidspunkt. Osteoblaster senere end dagen 14 kan aggregere og være vanskeligt at adskille på grund af de store ophobninger af collagens og andre knogle matrix materialer produceret af osteoblaster. For at undgå problemer med osteoblastdannelse dissociation, LFS MSCs kan være seedet i 2 - 3-fold højere tæthed i indledningen trin for osteoblastic differentiering til at lette osteoblastdannelse differentiering. LFS MSC-afledte osteoblaster kan adskilles og indsamlet på dag 6-10 differentiering tidspunkt for i vivo tumordannelse assay på dag 6 - 7 differentiering tidspunkt. LFS xenograft tumor model viser LFS MSC-afledte osteoblaster sammenfatte i vivo tumorfremkaldende evne, som giver en alternativ platform for at studere LFS-associerede osteosarkom.
I Resumé giver en LFS iPSC-baserede osteosarkom model en værdifuld berette for osteosarkom forskning. Ud over osteosarkom lider LFS patienter af forskellige andre typer af kræft såsom bløddelssarkom, brystkræft og hjernetumor. Derfor, LFS iPSC-baseret sygdomsmodeller kan udvides til at modellere andre LFS relaterede maligniteter. Kombinere LFS patient-afledte iPSCs og manipuleret muterede p53 (mutp53) hESCs18, LFS sygdom model har også stor værdi i skildrer patogenesen af mutp53 forbundet maligniteter og udvikle nye terapeutiske strategier rettet mod mutationer P5316.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ikke noget at oplyse.
Acknowledgments
R. Z. er støttet af UTHealth Innovation for kræft forebyggelse Research Training Program Pre-Doctoral Fellowship (forebyggelse af kræft og Research Institute of Texas give RP160015). J.T. understøttes af Ke Lin Program for det første tilknyttede Hospital af Sun Yat-sen Universitet. D.-F.L. CPRIT scholar i kræftforskning og understøttes af NIH vej til uafhængighed Award R00 CA181496 og CPRIT Award RR160019.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Plastic ware | |||
| 100 mm Dish | Corning | 430107 | |
| 60 mm Dish | Corning | 430166 | |
| 6-well Plate | Falcon | 353046 | |
| 12-well Plate | Falcon | 353043 | |
| 48-well Plate | Falcon | 353078 | |
| 1 mL Pipet Tip | USA Scientific | 1111-2721 | |
| 200 µL Pipet Tip | USA Scientific | 1111-0706 | |
| 10 µL Pipet Tip | USA Scientific | 1111-3700 | |
| 5 mL Serological Pipette | SARSTEDT | 86.1253.001 | |
| 10 mL Serological Pipette | SARSTEDT | 86.1254.001 | |
| 25 mL Serological Pipette | SARSTEDT | 86.1685.001 | |
| 50 mL Tube, PP | SARSTEDT | 62.547.100 | |
| 15 mL Tube, PP | SARSTEDT | 62.554.100 | |
| Culture materials and Reagents | |||
| CytoTune- iPS 2.0 Sendai Reprogramming Kit | Invitrogen | A16517 | Commercial Sendai virus reprogramming kit |
| Corning hESC-Qualified Matrix | Corning | 354277 | Basement membrane matrix |
| CF1 MEFs, irradiated | ThermoFisher | A34180 | |
| DMEM | Sigma-Aldrich | D5671 | |
| DMEM/F12 | Corning | 10-090-CV | |
| αMEM | Corning | 10-022-CV | |
| StemMACS iPS-Brew XF | Miltenyi Biotec | 130-104-368 | Commercial iPSC medium |
| KnockOut DMEM/F-12 | ThermoFisher | 12660012 | |
| FBS Opti-Gold | GenDEPOT | F0900-050 | |
| KnockOut Serum Replacement | ThermoFisher | A3181502 | |
| Penicillin-Streptomycin | Sigma-Aldrich | P4333 | |
| MEM Nonessential Amino Acids | Corning | 25-025-CI | |
| L-Glutamine Solution | Sigma-Aldrich | G7513 | |
| 2-Mercaptoethanol | Sigma-Aldrich | M3148 | |
| Human FGF-basic (bFGF) | PEPROTECH | 100-18B | |
| Recombinant Human PDGF-AB | PEPROTECH | 100-00AB | |
| β-Glycerophosphate | Sigma-Aldrich | G9422 | |
| Dexamethasone | Sigma-Aldrich | A4902 | |
| Ascorbic Acid | Sigma-Aldrich | A5960 | |
| Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline, 1x (DPBS) | Corning | 21-031-CV | |
| StemMACS Passaging Solution XF | Miltenyi Biotec | 130-104-688 | Commercial passaging solution |
| Accutatse Cell Detachment Solution | Corning | 25-058-CI | Cell detachment solution |
| Thiazovivin (ROCK Inhibitor) | Calbiochem | 420220 | |
| 0.25% Trypsin-EDTA Solution | Sigma-Aldrich | T4049 | |
| Collagenase, Type II | ThermoFisher | 17101015 | |
| Human NANOG Antibody | R&D System | AF1997 | |
| OCT4 Antibody (H-134) | Santa Cruz | sc-9081 | |
| Human/Mouse SSEA-4 PE-conjugated Antibody | R&D System | FAB1435P | |
| Alexa Fluor 555 Mouse Anti-Human TRA-1-81 Antigen | DB Biosciences | 560123 | |
| Alexa Fluor 488 Donkey Anti-Goat IgG (H+L) | Jackson ImmunoResearch | 705-545-003 | |
| Alexa Fluor 488 Goat Anti-Rabbit IgG (H+L) | Jackson ImmunoResearch | 111-545-144 | |
| PE Mouse Anti-Human CD105 | eBioscience | 12-1057-42 | |
| FITC Mouse Anti-Human CD44 | DB Biosciences | 555478 | |
| PE Mouse Anti-Human CD73 | DB Biosciences | 550257 | |
| PE Mouse Anti-Human CD166 | DB Biosciences | 560903 | |
| FITC Mouse Anti-Human CD24 | DB Biosciences | 555427 | |
| Donkey Serum | Jackson ImmunoResearch | 017-000-121 | |
| Goat Serum | Jackson ImmunoResearch | 005-000-121 | |
| Alkaline Phosphatase Staining Kit II | Stemgent | 00-0055 | |
| Alizarin Red S | Sigma-Aldrich | A5533 | |
| TRIzol Reagent | ThermoFisher | 15596018 | |
| Chloroform | ThermoFisher | C298-500 | |
| 2-Propanol | ThermoFisher | A416-4 | |
| Ethanol, Absolute, Molecular Biology Grade | ThermoFisher | BP28184 | |
| DNase I, RNase-free (1 U/µL) | ThermoFisher | EN0521 | |
| iScript cDNA Synthesis Kit | BioRad | 1708891BUN | |
| iQ SYBR Green Supermix | BioRad | 1708884 | |
| Matrigel Matrix High Concentration (HC), Phenol-Red Free | Corning | 354262 | |
| 1 mL Slip Tip Syringe, 26 Gauge x 5/8 Inch | DB Biosciences | 309597 |
References
- Takahashi, K., Yamanaka, S. Induction of pluripotent stem cells from mouse embryonic and adult fibroblast cultures by defined factors. Cell. 126 (4), 663-676 (2006).
- Takahashi, K., et al. Induction of pluripotent stem cells from adult human fibroblasts by defined factors. Cell. 131 (5), 861-872 (2007).
- Yu, J., et al. Induced pluripotent stem cell lines derived from human somatic cells. Science. 318 (5858), 1917-1920 (2007).
- Yagi, T., et al. Modeling familial Alzheimer's disease with induced pluripotent stem cells. Hum Mol Genet. 20 (23), 4530-4539 (2011).
- Dimos, J. T., et al. Induced pluripotent stem cells generated from patients with ALS can be differentiated into motor neurons. Science. 321 (5893), 1218-1221 (2008).
- Moretti, A., et al. Patient-specific induced pluripotent stem-cell models for long-QT syndrome. N Engl J Med. 363 (15), 1397-1409 (2010).
- Itzhaki, I., et al. Modelling the long QT syndrome with induced pluripotent stem cells. Nature. 471 (7337), 225-229 (2011).
- Carvajal-Vergara, X., et al. Patient-specific induced pluripotent stem-cell-derived models of LEOPARD syndrome. Nature. 465 (7299), 808-812 (2010).
- Lee, D. F., et al. Modeling familial cancer with induced pluripotent stem cells. Cell. 161 (2), 240-254 (2015).
- Mulero-Navarro, S., et al. Myeloid Dysregulation in a Human Induced Pluripotent Stem Cell Model of PTPN11-Associated Juvenile Myelomonocytic Leukemia. Cell Rep. 13 (3), 504-515 (2015).
- Kotini, A. G., et al. Functional analysis of a chromosomal deletion associated with myelodysplastic syndromes using isogenic human induced pluripotent stem cells. Nat Biotechnol. 33 (6), 646-655 (2015).
- Kotini, A. G., et al. Stage-Specific Human Induced Pluripotent Stem Cells Map the Progression of Myeloid Transformation to Transplantable Leukemia. Cell Stem Cell. 20 (3), 315-328 (2017).
- Crespo, M., et al. Colonic organoids derived from human induced pluripotent stem cells for modeling colorectal cancer and drug testing. Nat Med. 23 (7), 878-884 (2017).
- Gingold, J., Zhou, R., Lemischka, I. R., Lee, D. F. Modeling Cancer with Pluripotent Stem Cells. Trends Cancer. 2 (9), 485-494 (2016).
- Lin, Y. H., et al. Osteosarcoma: Molecular Pathogenesis and iPSC Modeling. Trends Mol Med. 23 (8), 737-755 (2017).
- Zhou, R., et al. Li-Fraumeni Syndrome Disease Model: A Platform to Develop Precision Cancer Therapy Targeting Oncogenic p53. Trends Pharmacol Sci. 38 (10), 908-927 (2017).
- Lian, Q., et al. Derivation of clinically compliant MSCs from CD105+, CD24- differentiated human ESCs. Stem Cells. 25 (2), 425-436 (2007).
- Zhou, R., et al. A homozygous p53 R282W mutant human embryonic stem cell line generated using TALEN-mediated precise gene editing. Stem Cell Res. 27, 131-135 (2018).
