Summary
Ici, nous présentons un protocole pour la génération de pluripotentes induites des cellules souches (CISP) de Syndrome de Li-Fraumeni (LFS) patient dérivée fibroblastes, différenciation de CISP par l’intermédiaire de cellules souches mésenchymateuses (CSM) d’ostéoblastes et modélisation in vivo tumorigenèse utilisant des ostéoblastes patient dérivé de LFS.
Abstract
Syndrome de Li-Fraumeni (EPA) est une affection autosomique dominante cancer héréditaire. Les patients avec l’EFT sont prédisposés à un divers types de tumeurs, notamment ostéosarcome--un des plus souvent malignes non hématologique primaires dans l’enfance et l’adolescence. LFS offre donc un modèle idéal pour étudier cette malignité. Profitant des méthodologies de l’iPSC, ostéosarcome LFS-associés peut être modélisé avec succès en différenciant EFT patient CISP de cellules souches mésenchymateuses (CSM), puis aux ostéoblastes--les cellules d’origine des ostéosarcomes. Ces ostéoblastes LFS récapitulent des propriétés oncogènes de l’ostéosarcome, fourniture d’un système de modèle attrayant pour délimiter la pathogenèse de l’ostéosarcome. Ce manuscrit montre un protocole pour la génération de CISP de fibroblastes de patients LFS, différenciation du CISP de MSCs, différenciation des MSCs aux ostéoblastes et in vivo tumorigenèse utilisant des ostéoblastes LFS. Ce modèle de maladie iPSC peut être étendu pour identifier des biomarqueurs potentiels ou cibles thérapeutiques pour l’ostéosarcome associés à LFS.
Introduction
Entre 2006 et 2007, plusieurs conclusions de la percée des laboratoires des Drs Shinya Yamanaka et James A. Thomson conduit à l’élaboration de pluripotentes induites des cellules souches (CISP)1,2,3. En reprogrammant des cellules somatiques avec des facteurs transcriptionnels définis à forme CISP, les chercheurs ont pu générer des cellules ayant des caractéristiques clés à savoir, pluripotence et auto-renouvellement, que l'on croyait seulement existent dans les cellules souches embryonnaires humaines (CSEh). CISP pourrait provenir de n’importe quel individu ou patient et ne devait pas être provenant d’embryons, élargissant considérablement le répertoire des maladies disponibles et des horizons pour l’étude. Depuis lors, CISP patient dérivés ont été utilisés pour récapituler le phénotype de diverses maladies humaines, de la maladie d’Alzheimer4 et sclérose latérale amyotrophique5 QT long syndrome6,7, 8.
Ces avancées dans la recherche de l’iPSC ont également ouvert de nouvelles avenues pour la recherche sur le cancer. Plusieurs groupes ont récemment utilisé CISP patient au développement du cancer de modèle sous un fond génétique sensibles9,10,11, avec une application réussie démontrée à ce jour l’ostéosarcome9, la leucémie10,11,12et du cancer colorectal13. Bien que les modèles de cancer iPSC dérivés sont encore à leurs débuts, ils ont démontré grand potentiel en cancers associés à la maladie phenocopying, élucider les mécanismes pathologiques et d’identifier des composés thérapeutiques14.
Syndrome de Li-Fraumeni (EPA) est une maladie de cancer héréditaire dominante autosomale causée par de mutation germinale TP53 15. Les patients avec l’EFT sont prédisposés à un divers types de tumeurs malignes dont l’ostéosarcome, faire EFT CISP et leurs dérivées de cellules particulièrement bien adaptée à l’étude de cette tumeur maligne16. Un modèle basé sur iPSC ostéosarcome fut institué en 2015 à l’aide de LFS CISP patient dérivé9 par la suite se différenciée en cellules souches mésenchymateuses (CSM) et puis d’ostéoblastes, la provenance des cellules de l’ostéosarcome. Ces ostéoblastes LFS récapitulent les défauts associés à ostéosarcome ostéogénique différenciation et des propriétés oncogènes, démontrant le potentiel comme une plate-forme de « tumeur osseuse dans un plat » du modèle. Fait intéressant, génome transcriptome analyses révèlent des aspects d’une signature de gène d’ostéosarcome en ostéoblastes LFS et caractéristiques de ce profil d’expression génique LFS corrélées avec un pronostic sombre dans l’ostéosarcome9, indiquant la potentiel des modèles de maladies CISP LFS pour révéler les caractéristiques de pertinence clinique.
Ce manuscrit fournit une description détaillée de comment utiliser EFT dérivé de patient CISP d’ostéosarcome de modèle. Il détaille la génération de LFS CISP, différenciation du CISP pour MSCs et puis aux ostéoblastes et utilisation d’un modèle xénogreffe in vivo à l’aide des ostéoblastes LFS. Le modèle de maladie EFT comporte plusieurs avantages, notamment la capacité de générer des cellules illimités à tous les stades du développement de l’ostéosarcome pour études mécanistes, l’identification de biomarqueurs et drogues dépistage9,14, 16.
En résumé, le modèle de base iPSC ostéosarcome LFS offre un système complémentaire attrayant pour faire avancer la recherche de l’ostéosarcome. Cette plate-forme offre également une preuve de concept pour la modélisation du cancer à l’aide de CISP dérivé de patient. Cette stratégie décrite ci-dessous peut être facilement étendue à malignités modèle associées aux autres maladies génétiques avec les prédispositions du cancer.
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Protocol
Ce travail a été approuvé par l’Université du Texas Health Science Center à Houston (UTHealth) Comité sur le bien-être Animal. Les expériences réalisées en stricte conformité avec les normes établies par le centre UTHealth pour la médecine des animaux de laboratoire & soins (CLAMC) qui est accrédité par l’American Association for Laboratory Animal Care (AAALAC International). Les sujets humains dans cette étude relèvent de scénario A (No sujets la recherche humaine ») tel que défini par la documentation SF424 NIH. Par conséquent, il n’a pas l’approbation par le Comité de déontologie de la recherche humaine UTHealth.
1. génération de LFS CISP (Figure 1 a)
- Jour -2, plaque de 2 x 104 fibroblastes de patients EFT dans un puits d’une plaque 6 puits et les cellules avec moyen de fibroblastes (tableau 1) de la culture à 37 ° C dans un humidifié 5 % CO2 incubateur. S’assurer que les fibroblastes confluence de 50 à 60 % le jour de la transduction (jour 0).
- La transduction virus Sendai au jour 0. Pour ce faire, remplacez le milieu usé avec milieu de fibroblaste pré chauffé. Décongeler le Sendai commercial virus reprogrammation nécessaire (voir la Table des matières) sur la glace. Infecter les fibroblastes EPA avec des virus Sendai mixtes selon les instructions du fabricant.
- Entretien des cellules transduits dans le milieu des fibroblastes (jour 1-6) :
- Le jour 1, 24h après transduction, retirez le support de fibroblastes contenant des autres virus Sendai et remplacez-le par 2 mL de milieu de fibroblastes fraîches. La culture de fibroblastes transduits à 37 ° C dans un humidifié 5 % CO2 incubateur.
- Changer le support avec le médium de fibroblastes tous les deux jours depuis le jour 2-6.
- Entretien des cellules transduits de la condition de la culture de mangeoire (jour 7-28) :
- Préparer des fibroblastes embryonnaires souris CF1 irradiés Pétri (MEF) sur 6 jours. Pour faire ce manteau six plats de vitroplants de 100 mm en ajoutant 5 mL de la gélatine de 0,1 % à chaque plaque à température ambiante pendant 30 min. aspirer la gélatine de 0,1 % après enduit.
- Retirer MEFs du contenant de l’azote liquide. Décongelez les MEFs en utilisant le système de dégivrage commercialement disponible suivant les instructions du fabricant. Plaque des cellules sur les plaques de gélatine-enduit avec milieu de culture MEF/MSC (tableau 1) à une densité de semis d’autour de 6,7 x 105 cellules par plat de vitroplants de 100 mm.
- Ensemencer les cellules transduits sur plaques MEF (jour 7) : Trypsinize les cellules transduits en utilisant 1 mL de 0,25 % trypsine-EDTA par plat de 100 mm pour 2-4 minutes à température ambiante. Neutraliser la trypsine avec 9 mL de milieu de fibroblastes. Cellules de transfert pour tubes coniques et centrifuger à 230 x g à 37 ° C pendant 4 min. plaque les fibroblastes transduits sur les MEF six plats préparés le jour 6 et leur culture dans 8 mL de milieu de fibroblastes par plat.
Remarque : La confluence de MEFs est d’environ 20 % avant d’ensemencer la cellule transduite de la force expéditionnaire des marines. - Le jour 8, jetez le milieu des fibroblastes et remplacez-les par les CSEh moyen (tableau 1).
- Attendez que l’émergence de clones iPS de jours 9-28 (Figure 1C). Changer le milieu CSEh a passé tous les deux jours et de surveiller l’émergence de clones iPS sous le microscope. Attendez de CISP clones assez grands pour être observé à l’oeil nu et passer ensuite à étendre iPS clones en condition de culture sans chargeur.
- Expansion de l’EPI a émergé des clones en condition de culture sans chargeur (jour 29-79 ~ 99) :
- Pour préparer la plaque matrice-enduit, recouvrir une plaque de 48 puits avec 120 µL de la solution de revêtement de matrice (tableau 1) membrane basale par puits. Assurez-vous que la solution de revêtement membrane basale matrice couvre le puits et recouvre la surface de plat de la culture. Laissez-le à température ambiante pendant 1 h. aspirer la solution de revêtement immédiatement avant utilisation et ajouter 250 µL de milieu de CSEh / puits avec inhibiteur de ROCK 2 µM Thiazovivin.
- Le jour 28, aspirer le milieu CSEh usé et laver les clones iPS avec 1 x DPBS. Ramasser les clones iPS visible avec une pointe de pipette de 1 mL et le transfert dans un puits d’une plaque de 48 puits traitée (étape 1.4.1). Graines d’une colonie par puits de la plaque de 48 puits.
- Centrifuger la plaque à 230 g pendant 4 min faciliter la fixation des cellules. Culture des clones d’iPS à 37 ° C dans un humidifié 5 % CO2 incubateur.
- Le lendemain (jour 29), retirer le support de CSEh usé et ajouter 250 µL du milieu iPSC commercialement disponibles dans chaque puits.
- Maintenir les clones d’iPS à 37 ° C dans un 5 % humidifié incubateur à CO2 et le changement du milieu de l’iPSC tous les deux jours.
- Quand les iPS clones atteignent 85 % confluence, sous-culture cellules à un 01:10 ratio par zone de culture. Ajouter 60 µL de la solution commerciale passaging pour détacher les cellules et incuber à 37 ° C pendant 3 min.
- La moitié de la CISP détaché sur une plaque de 12 puits matrice-revêtement membrane basale dans 1 mL de milieu de CSEh avec inhibiteur de ROCK 2 µM Thiazovivin graines. Culture des clones iPS dans une plaque de 12 puits avec 1 mL de milieu iPSC commercialisé par puits et sous-culture CISP à un 01:10 rapport jusqu'à ce qu’ils atteignent le passage 10.
NOTE : CISP est sub cultivé tous les 5-7 jours à une 01:10 ratio. Il faut jusqu'à 10 semaines pour les clones d’iPS atteindre le passage 10. CPSI qualifications dont la morphologie cellulaire, l’activité phosphatase alcaline (PA) et l’expression des facteurs de pluripotence et marqueurs de CSEh, peuvent être examinées après la confirmation de la suppression du virus Sendai au CISP (généralement démontré après environ 10 passages) (Figure 1 b-E). Anticorps et apprêt des informations pour la caractérisation de l’iPSC figurent au tableau 2 et 4.
2. différenciation des EPA CISP de cellules souches mésenchymateuses (CSM) (Figure 2 a)
- La culture iPSC clones sur Force expéditionnaire des marines pendant au moins 2 semaines (journée ~ -14-0) : préparer les plats MEF (boîtes de vitroplants de 100 mm) comme décrits précédemment (1.3.1 - 1.3.2). Maintenir la CISP dans un milieu CSEh et changement moyen tous les deux jours. Chaque fois que le CISP atteindre 90 % confluence, sous-culture CISP par 01:10 dilution.
- Suppression de MEFs de CISP (jour 0) :
- Après maintien CISP sur MEFs pendant 2 semaines, culture CISP dans les plats de vitroplants de 100 mm jusqu’au cellules atteindre confluence de 80 à 90 %. Enlever le support de CSEh usé et laver CISP avec 5 mL de 1 x DPBS. Ajouter 1 mL de la solution de détachement cellulaire pour détacher les cellules et incuber à température ambiante pendant 3 min.
- Ajouter 9 mL de milieu de culture MEF/MSC à la plaque pour neutraliser l’activité de solution de détachement cellulaire et les cellules individuelles de transfert à une autre boite de culture de tissu de 100 mm sans revêtement.
- Incuber les cellules à température ambiante pendant 30 min permettre les MEFs à fixer sur la plaque.
- Soigneusement recueillir le surnageant qui contient les seules CISP et centrifuger à 230 x g à 4 ° C pendant 4 min.
NOTE : Rinçage négligemment le fond de plaque conduit au détachement de MEFs.
- Différenciation du CISP vers MSCs (jour 0 - 28) :
- Manteau trois puits d’une plaque de 6 puits avec 1 mL de 0,1 % de gélatine / puits à température ambiante pendant 30 min.
- Retirez le surnageant de la CISP recueillies 2.2.4.
- Resuspendre CISP dans 6 mL de moyen de différenciation MSC (tableau 1) et des cellules de semences en trois de la microplaque avec 2 mL par puits (jour 0).
- Changer le moyen de différenciation MSC tous les deux jours pour déloger les cellules libres ou morts (jour 1 - 28).
- Maturation des dérivés iPSC MSCs (jour 28-45) :
- Enlever le support de différenciation MSC usé et laver les cellules avec 1 mL de 1 x DPBS.
- Trypsinize MSCs avec 0,5 mL de 0,25 % trypsine-EDTA / puits à température ambiante pendant 3 min.
- Neutraliser la trypsine par 1,5 mL de milieu de culture MEF/MSC et recueillir les MSCs de trois puits dans un tube conique de 15 mL. Centrifuger à 230 x g à 4 ° C pendant 4 min.
- Retirez le surnageant et remettre en suspension les MSCs dans 3 mL de milieu de culture MEF/MSC et plaque sur un 60 mm 0,1 % enduit de gélatine plat (jour 28).
- Culture de MSCs dans le milieu de culture MEF/MSC et changement moyen tous les deux jours. Quand les cellules atteignent 100 % confluence, sous-culture MSCs à un ratio de 1:3, à l’aide de 0,25 % trypsine-EDTA.
Remarque : Les MSCs affichent une morphologie fibroblastique (Figure 2 b). Lorsque MSCs poussent dans une forte densité, allongées MSCs peuvent se former un motif tourbillon (Figure 2 b). - Effectuer l’immunofluorescence pour évaluer MSCs dérivés iPSC en examinant les marqueurs de surface MSC CD44, CD73, CD105 et CD166 (Figure 2).
Remarque : La dilution des anticorps apparaissent dans le tableau 2. Immunofluorescence de cellules vivantes est effectué conformément aux instructions du fabricant. - Après confirmation, développez MSCs à un ratio de 1:3 dans les plats de vitroplants de 100 mm. Geler les flacons (3 flacons par plat de vitroplants de 100 mm) en utilisant le support de gel contenant 10 % DMSO et 90 % FBS.
NOTE : Afin d’enrichir la population MSC, MSCs peuvent être triées à l’aide de CD105+, CD24-critères par écoulement cytometry9,17. iPSC-dérivé MSCs différenciées selon la méthode de base de PDGF-AB couramment peuvent être maintenues pendant 2-3 mois de culture sans perte d' identité MSC9. Geler MSCs d’un numéro de passage au début après avoir vérifié les caractéristiques MSC.
3. différenciation des EPA MSCs aux ostéoblastes (Figure 3 a)
- Préparation de MSCs pour la différenciation ostéogénique (jour -1)
- Afin d’assurer une quantité suffisante de cellules pour compléter le protocole de différenciation ostéogénique, commencer avec MSCs cultivées dans les plats de vitroplants de 100 mm au confluent de 95 %. Enlever le milieu de culture usé et laver MSCs avec 5 mL de 1 x DPBS.
- Trypsinize MSCs avec 1 mL de 0,25 % de trypsine-EDTA par plat de 100 mm à température ambiante pendant 3 min. Pour s’assurer que les cellules ne sont pas plus trypsinisées, arrêter la trypsinisation lorsque 50 % du détachement cellulaire est observée au microscope.
- Neutraliser la trypsine par 9 mL de milieu de culture MEF/MSC et recueillir les MSCs de 3 puits dans un tube conique de 15 mL. Centrifuger à 230 x g à 4 ° C pendant 4 min.
- Aspirer le surnageant, resuspendre MSCs dans 5 mL de milieu MSC et compter le nombre de cellules par un hémocytomètre.
- Plaque bon nombre de MSCs sur une plaque de culture.
NOTE : Le détail du nombre de cellules de la plaque de 12 puits, 6 puits-plaque et récipients de culture de tissu de 100 mm sont résumées dans le tableau 3.
- Induction de la différenciation ostéogénique par moyen de différenciation ostéoblastique (ODM) (tableau 1) (jour 0 - 24) :
- Aspirer le milieu de culture MEF/MSC et le remplacer par le bon volume des ODM (1 mL, 2 mL et 8 mL pour chaque puits de la plaque de 12 puits, chaque puits de la plaque 6 puits et des cultures tissulaires 100 mm plat, respectivement) pour différencier les MSCs aux ostéoblastes (jour 0).
- Aspirer l’ODM usé et remplacer par le bon volume d’ODM tous les deux jours au cours du processus de différenciation ostéogénique.
- Effectuer la phosphatase alcaline (PA) et le S rouge de l’alizarine (ARS) a souillure pour détecter la phosphatase alcaline osseuse associée, produit par preosteoblasts et les dépôts minéraux produites par échéance ostéoblastes, respectivement, le jour 3, 6, 9, 12, 15, 18, 21 et 24 ( Figure 3 b).
NOTE : AP souillant et la souillure de ARS sont effectuées avec kit commercialement disponible suivant le protocole du fabricant. - Examiner les niveaux d’expression des marqueurs d’ostéoblastes matures et preosteoblast (ALPL et COL1A1 pour preosteoblasts ; PTH1R et BGLAP pour mûrissent les ostéoblastes) par qRT-PCR (Figure 3).
NOTE : La coloration Positive AP devrait après 9 jours de différenciation ostéogénique et ARS une coloration positive peut s’attendre après 21 jours de différenciation ostéogénique. Les MSCs croissant dans le milieu de culture MEF/CSM peuvent être servis comme témoin négatif d’AP de coloration et de coloration d’ARS.
4. le modèle de xénogreffe pour étudier In Vivo la tumorigenèse des ostéoblastes dérivés LFS MSC (Figure 4 a)
- Différenciation de LFS MSCs aux ostéoblastes :
- Graines de 3 à 4,5 x 105 MSCs dans plat de vitroplants de 100 mm. Préparer cinq plats pour une injection sous-cutanée.
- La culture MSCs dans ODM pour différencier les MSCs aux ostéoblastes comme décrit au point 3.2, jusqu’au jour 14.
- Préparation des ostéoblastes différenciés pour injection sous-cutanée :
- Pour préparer la solution de détachement des ostéoblastes (tableau 1), dissoudre 1 g type II collagénase dans 1 000 mL de milieu αMEM de faire la solution II de collagénase (1 mg/mL). Conserver la solution II de collagénase à-20 ° C. Mélanger 0,25 % trypsine-EDTA et la solution de collagènase II à un ratio de 1:1 pour faire les ostéoblastes solution de détachement.
- Enlevez l’ODM usé et lavez les ostéoblastes différenciés avec 5 mL de 1 x DPBS par plat de 100 mm.
- Ajouter 1,5 mL de solution de détachement des ostéoblastes par plat de 100 mm et incuber plats à 37 ° C pendant 30 min. examiner et s’assurer que le détachement d’ostéoblastes par microscopie.
- Neutraliser la solution de détachement des ostéoblastes par ODM et recueillir les ostéoblastes détachés dans un tube conique de 50 mL. Centrifuger à 230 x g à 4 ° C pendant 5 min.
- Retirez le surnageant et remettre en suspension des cellules dans 25 mL de milieu de l’ODM. Passer les cellules à travers un tamis de cellule 70 µm pour éliminer les cellules agrégées. Compter le nombre de cellules à l’aide d’un hémocytomètre.
- Préparer 1 x 107 ostéoblastes par injection sous-cutanée et les cellules de la centrifugeuse à 230 x g à 4 ° C pendant 4 min.
- Remettre en suspension les ostéoblastes de7 1 x 10 dans 50 µL glacée 1 x DPBS. Mix différenciés des ostéoblastes avec 50 µL de matrice de la membrane de sous-sol libre-rouge de phénol (ostéoblastes suspension et membrane basale de la matrice ont été mélangés à un ratio de 1:1) et de maintenir des ostéoblastes sur la glace avant l’injection.
-
In vivo tumeur modèle de xénogreffe des ostéoblastes dérivés MSC LFS :
- Anesthésier 8 semaines femelle NU/NU souris immunodéprimées dans une chambre fournissant 5 % (v/v) par inhalation isoflurane dans 1 L/min d’oxygène (fourni par CLAMC). Après que l’animal est couché, placez-vous le système de livraison anesthésique dans le cône de nez, fournissant 2 % (v/v) par inhalation isoflurane dans 200mL/min d’oxygène (fourni par CLAMC). Contrôler la profondeur de l’anesthésie en vérifiant les réflexes cornéaux et pédales pour rendre les souris sont suffisamment anesthésiés et ne souffrez pas de malaise au cours de la procédure.
- Désinfecter la zone à injecter avec alternance de tampons d’isopropanol chlorhexidine et 70 %. Aiguille de 26 G permet d’effectuer une injection sous-cutanée de la membrane basale matrice mixte des ostéoblastes EFT en un seul côté des pattes de souris NU/NU immunodéprimés âgés de 8 semaines (Figure 4 a).
- Surveiller les souris en effectuant une palpation hebdomadaire aux sites d’injection pour la croissance des densités nodulaires sous-cutanée. La formation de tumeurs peut être observée autour de 6 à 10 semaines après l’injection (Figure 4 b).
- Euthanasier les souris par méthode d’asphyxie carbonique suivie par dislocation cervicale. Disséquer les tumeurs développées. Déterminer le grade tumoral et l’index de la différenciation, preosteoblasts et ostéoblastes matures par diverses méthodes de coloration (p. ex. l’hématoxyline et éosine (H & E) coloration, coloration rouge Sirius Picro et von Kossa coloration respectivement).
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Representative Results
Ce protocole présente les procédures dont EFT iPSC génération MSC différenciation, la différenciation ostéoblastique et essai in vivo tumorigenèse avec utilisant des dérivés de LFS MSC ostéoblastes.
Régime pour la génération de LFS CISP de fibroblastes en utilisant un virus Sendai commercialement disponible kit de reprogrammation est montré dans la Figure 1 a. Base de virus Sendai livraison des Yamanaka quatre facteurs est une méthode de reprogrammation sans intégration. Par conséquent, stable LFS iPSC clones devraient être libres du génome du virus Sendai et perte d’exogène OCT4, SOX2, KLF4 et c-MYC transgènes, qui peuvent être examinés par RT-PCR avec des amorces spécifiques (Figure 1 b). Comme il est suggéré dans les instructions du fabricant, génération de CISP sans virus Sendai dépend des conditions de culture et de passage. Dans les conditions de culture décrites dans le présent protocole, suppression de virus Sendai au CISP habituellement peut être détectée après 10 passages (Figure 1 b). Les clones d’iPSC EFT établies devraient pièce la morphologie typique CSEh et montrent l’activité positive de l’AP (Figure 1). LFS CISP exprimer hautement pluripotence facteur ARNm (NANOG, OCT4, SOX2, DPPA4et REX1), comparable à la ligne de CSEh H1 et beaucoup plus élevé que les fibroblastes parentales (Figure 1). L’expression des facteurs de pluripotence (NANOG, OCT4) et marqueurs de CSEh (SSEA4 et TRA-1-81) peut également être consultée par immunofluorescence (Figure 1E).
CISP est maintenus sur MEFs pendant au moins 14 jours avant d’amorcer la différenciation MSC (Figure 2 a). Bien que beaucoup de la mort cellulaire se produire durant la différenciation MSC, des masses de cellules différenciées sont visibles sur la plaque de culture cellulaire et MSCs fibroblaste ressemblant au bord des masses cellulaires peuvent être observés à 28 jours. (Figure 2 b). Après que void mise en culture des cellules en milieu de culture MEF/MSC différenciées, différenciées MSCs prolifèrent rapidement et voir la morphologie des fibroblastes environ 35 jours et puis progressivement représentent une forme allongée et forment un motif tourbillon à jour 40 (Figure 2 b ). Différenciée LFS MSCs expriment des marqueurs MSC, y compris CD44, CD73, CD105 et CD166 par immunofluorescence souillant (Figure 2).
Figure 3 a décrit la différenciation ostéoblastique. Lorsque MSCs sont soumis à des signaux de différenciation ostéogénique, les cellules différenciées commencent à apparaître l’activité phosphatase alcaline positif au jour 9 (Figure 3 b). Coloration des ARS peut être utilisée pour détecter des dépôts minéraux, produites par les ostéoblastes matures. La couleur rouge vif, coloration au lieu de taches de couleur brune indique le résultat positif de coloration d’ARS, qui peut être observé après 21 jours (Figure 3 b). Les ostéoblastes différenciation montrent augmenter l’expression de gènes preosteoblast (ALPL et COL1A1) et les gènes des ostéoblastes matures (BGLAP et PTH1R) durant la différenciation ostéogénique.
Modèle de xénogreffe de in vivo peut être établi en injectant par voie sous-cutanée dérivé de LFS MSC ostéoblastes chez les souris NU/NU (Figure 4 a). Les tumeurs peuvent être observés de 6 à 10 semaines après l’injection sous-cutanée (Figure 4 b). Les tumeurs d’ostéoblastes dérivés EFT a démontré, caractéristiques ostéoblastes immatures, une activité positive AP (AP coloration), dépôt de matrice de collagène positive (coloration de picrosirius rouge) mais négative minéralisation (von Kossa coloration) (Figure 4) .
Figure 1 : génération iPSC de fibroblastes de patients LFS. (A) schéma de principe de génération de l’iPSC. ()B) RT-PCR detection du génome du virus de Sendai et de transgènes (KOS (KLF4, OCT4, et SOX2), KLF4, et c-MYC) dans le clone de l’iPSC reprogrammé après 10 passages (à gauche) et après l’infection des fibroblastes jour 11 (à droite, contrôle positif). LFS iPSC clone est exempt de virus Sendai après 10 passages. GAPDH est affiché dans le contrôle interne. (C) morphologie des EPA CISP et AP coloration de cellules. Echelle, 50 µm (D) qRT-PCR de NANOG, SOX2, OCT4, DPPA4et l’expression de l’ARNm REX1 dans LFS CISP. ligne de CSEh H1 et parental LFS fibroblastes sont utilisés comme un positif et un témoin négatif, respectivement. L’expression de l’ARNm est normalisée à l’expression de GAPDH . L’expression relative de l’ARNm est ajustée à CSEh H1 ligne 1. (E) Immunostaining des facteurs de transcription CSEh pluripotentes (NANOG et OCT4) et marqueurs de surface CSEh (SSEA4 et TRA-1-81) en EPA CISP. Echelle, 50 µm. La dilution des anticorps utilisés dans cette étude sont présentées au tableau 2. Les séquences d’amorces sont indiquées dans le tableau 4. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 2 : Différenciation du CISP EFT pour MSCs. (A) schéma de principe de la différenciation induite par la PDGF-AB MSC. (B) morphologie des EFT dérivé iPSC MSCs à différenciation jour 28 et 36 jour jour 40 + de la cellule. Echelle, 100 µm. (C) Immunofluorescence souillant montre que différenciée LFS MSCs pièce CD44+, CD73+, CD105+, CD166+et CD24 signature– . Echelle, 30 µm. La dilution des anticorps utilisés dans cette étude sont présentées au tableau 2. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 3 : Différenciation des EPA MSCs aux ostéoblastes. (A) schéma de principe de différenciation ostéogénique. (B) AP et ARS coloration sont effectuées à des moments différents (jour 3, 6, 9, 12, 15, 18, 21 et 24). Différenciation ostéoblastique des ostéoblastes dérivés LFS MSC devrait conduire à positive AP coloration autour de 9 jours et positive ARS coloration au jour 21. (C) le qRT-PCR analyse montre l’expression accrue des ostéoblastes pre (ALPL et COL1A1) et ostéoblastes matures (PTH1R et BGLAP) gènes durant la différenciation ostéogénique. L’expression de l’ARNm est normalisée à l’expression de GAPDH . Niveaux d’expression étaient comparativement aux cellules à différenciation jour 0. Les séquences d’amorces sont indiquées dans le tableau 4. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 4 : In vivo tumorigenèse des ostéoblastes dérivés LFS MSC. (A) schéma de xénogreffes tumorales des ostéoblastes LFS. (B) souris NU/NU portent des tumeurs dérivées ostéoblastes LFS après 10 semaines d’injection sous-cutanée. (C) EFT dérivé ostéoblastes tumeurs ont été examinés par H & E, AP, picrosirius rouge et von Kossa coloration pour la morphologie, osseuse associée à AP, le collagène et les dépôts minéraux, respectivement. Les tumeurs dérivées de LFS représentent les caractéristiques d’ostéoblastes immature montrant une activité positive AP, le collagène positif et négative minéralisation minérale. Barre d’échelle, 1 mm. s’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
| Fibroblaste moyen (500 mL) | |
| DMEM | 440 mL |
| FBS inactivés par la chaleur | 50 mL |
| Antibiotics(Pen/STREP) (x 100) | 5 mL |
| Des acides aminés non essentiels (x 100) | 5 mL |
| 2-mercaptoéthanol | 3,5 ΜL |
| Milieu de Culture MEF/MSC (500 mL) | |
| DMEM | 440 mL |
| FBS inactivés par la chaleur | 50 mL |
| Antibiotics(Pen/STREP) (x 100) | 5 mL |
| L-Glutamine (x 100) | 5 mL |
| CSEh moyen (500 mL) | |
| DMEM/F-12 | 384,5 mL |
| Remplacement de sérum knockOut | 100 mL (total : 20 %) |
| Des acides aminés non essentiels (x 100) | 5 mL |
| Antibiotiques (Pen/Strep) (100 x) | 5 mL |
| L-Glutamine (x 100) | 5 mL |
| bFGF (10 µg/mL) | 500 ΜL |
| 2-mercaptoéthanol | 3,5 ΜL |
| Moyen de différenciation de MSC (500 mL) | |
| KnockOut DMEM/F-12 ou DMEM/F-12 | 445 mL |
| Remplacement de sérum knockOut | 50 mL |
| bFGF (10 µg/mL) | 500 µL (10 ng/mL) |
| PDGF-AB (25 µg/mL) | 200 µL (10 ng/mL) |
| Des acides aminés non essentiels (x 100) | 5 mL |
| 2-mercaptoéthanol | 3,5 ΜL |
| Moyen de différenciation ostéoblastique (ODM) (500 mL) | |
| ΑMEM | 395 mL |
| FBS inactivés par la chaleur | 50 mL |
| β-glycérophosphate de 10 mM | 50 mL (1,08 g dans 50 mL αMEM) |
| Dexaméthasone 0,1 µM (sensible à la lumière) | 10 µL de dexaméthasone 5 mM |
| Acide ascorbique 200 µM (sensible à la lumière) | 100 µL de l’acide ascorbique 1 mM |
| Antibiotiques (Pen/Strep) (100 x) | 5 mL |
| Solution d’enrobage de matrigel (50 mL) | |
| Matrice de la Membrane basale | 2 mL |
| DMEM/F-12 (froide à 4 ° C) | 48 mL |
| Solution de détachement des ostéoblastes (50 mL) | |
| 0,25 % de trypsine-EDTA | 25 mL |
| Solution de collagènase II (1 mg/mL) | 25 mL |
| Remarque : Préparer les ostéoblastes détachement solution fraîche juste avant utilisation. Solution de collagènase II est stockée à-20 ° C jusqu'à 6 mois. | |
Tableau 1 : Compositions de moyen de fibroblastes, milieu de culture MEF/MSC, CSEh moyen, moyen de différenciation de MSC, ODM et solution de détachement des ostéoblastes.
| Nom de l’anticorps | Dilution |
| NANOG | 1/500 |
| OCT4 | 1 : 300 |
| AESS-4 PE-conjugués | 1:600 |
| TRI-1-81 | 1:600 |
| Âne de anti-chèvre IgG | 1/500 |
| IgG anti-lapin de chèvre | 1/500 |
| CD105 | 1/500 |
| CD44 | 1/500 |
| CD73 | 1/500 |
| CD166 | 1/500 |
| CD24 | 1/500 |
Tableau 2 : Dilution anticorps.
| Plaque de culture | Densité de semis | Test |
| Plaque de 12 puits | 0.67x104 cellules / puits | Phosphatase alcaline (AP coloration) de la coloration |
| Solution d’alizarine S coloration (ARS coloration) | ||
| Plaque 6 puits | 2 x 104 cellules / puits | Détection par RT-PCR |
| Preosteoblast marqueurs : ALPL, COL1A1 | ||
| Mature des marqueurs de l’ostéoblaste : PTH1R, BGLAP | ||
| 100 mm plat | 3 - 4.5x105 cellules / plaque | In vivo la tumorigenèse |
Tableau 3 : Ensemencement densité de MSCs de différenciation ostéoblastique.
| Amorces de Virus Sendai | |
| Objectif | Paires d’amorces |
| SeV | Avant : GGATCACTAGGTGATATCGAGC |
| Inverse : ACCAGACAAGAGTTTAAGAGATATGTATC | |
| KOS (KLF4/OCT4/SOX2) | Avant : ATGCACCGCTACGACGTGAGCGC |
| Inverse : ACCTTGACAATCCTGATGTGG | |
| KLF4 | Avant : TTCCTGCATGCCAGAGGAGCCC |
| Inverse : AATGTATCGAAGGTGCTCAA | |
| c-MYC | Avant : TAACTGACTAGCAGGCTTGTCG |
| Inverse : TCCACATACAGTCCTGGATGATGATG | |
| RT-PCR amorces | |
| Objectif | Paires d’amorces |
| NANOG | Avant : TTTGTGGGCCTGAAGAAAACT |
| Inverse : AGGGCTGTCCTGAATAAGCAG | |
| SOX2 | Avant : AGAAGAGGAGAGAGAAAGAAAGGGAGAGA |
| Inverse : GAGAGAGGCAAACTGGAATCAGGATCAAA | |
| OCT4 | Avant : AACCTGGAGTTTGTGCCAGGGTTT |
| Inverse : TGAACTTCACCTTCCCTCCAACCA | |
| DPPA4 | Avant : GACCTCCACAGAGAAGTCGAG |
| Inverse : TGCCTTTTTCTTAGGGCAGAG | |
| REX1 | Avant : GCCTTATGTGATGGCTATGTGT |
| Inverse : ACCCCTTATGACGCATTCTATGT | |
| ALPL | Avant : GGGACTGGTACTCAGACAACG |
| Inverse : GTAGGCGATGTCCTTACAGCC | |
| COL1A1 | Avant : GTGCGATGACGTGATCTGTGA |
| Inverse : CGGTGGTTTCTTGGTCGGT | |
| PTH1R | Avant : AGTGCGAAAAACGGCTCAAG |
| Inverse : GATGCCTTATCTTTCCTGGGC | |
| BGLAP | Avant : GGCGCTACCTGTATCAATGG |
| Inverse : GGCGCTACCTGTATCAATGG |
Tableau 4 : Les infos de Primer.
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Discussion
Pour parvenir à une plus grande efficacité de différenciation de MSC, plusieurs aspects sont essentiels. L’un est la condition de culture de CISP avant d’initier la différenciation MSC. Le protocole présenté dans le manuscrit est issu des précédentes études 9,17. CISP doivent être cultivés sur MEFs pendant au moins 2 semaines. Maintenir le CISP en bonne conditions sur MEFs sont critiques pour les cellules à fixer sur la plaque de gélatine-enduit pour la différentiation de MSC. Un autre aspect important est la densité du CISP sur MEFs avant la différenciation. 80 - confluence de 90 % de CISP est préférable pour initier la différenciation MSC. La prolifération de CISP nuira à la survie des cellules au cours du processus de différenciation. Le dernier point critique est la densité de semis lors du démarrage de la différenciation de MSC. Dans nos mains, haute densité cellulaire favorise l’iPSC fixation sur la plaque de gélatine-enduit. Un CISP plat de 100 mm peut être semé dans trois puits de la plaque 6 puits. Initiation de différenciation de la SMC directement resuspendant et placage CISP dans un milieu de différenciation MSC produit grands stress sur la CISP, donc parfois entraînant la mort cellulaire sévère après l’ensemencement. Haute densité de CISP augmente le taux de réussite de la différenciation de MSC.
Contrairement à la différenciation du CSM, le processus de différenciation ostéoblastique est plus simple. Pour obtenir des résultats reproductibles de différenciation, s’assurer que les numéros initiatrice de MSC sont compatibles. Résultats de la différenciation ostéoblastique de la même lignée cellulaire peuvent varier d’un lot à l’autre, c’est pourquoi, mise en place d’une différenciation pour différentes lignes en même temps donnera davantage de résultats comparatifs entre les groupes. L’augmentation du nombre MSC raccourcir le processus de différenciation, indiqué par une coloration AP et ARS positive à un stade antérieur de temps. Vérifiez également le changement du milieu de l’ODM est traité d’une manière douce et puissant système d’aspiration sous vide n’est pas recommandé dans le dernier stade de différenciation (jour 18 - 24) en raison du détachement potentiel des ostéoblastes agrégées au cours du processus de culture.
Les ostéoblastes différenciés utilisés pour in vivo l’expérience de xénogreffes sont ostéoblastes au point temps de différenciation J14. Les ostéoblastes au plus tard 14 jours peut agréger et être difficile de dissocier en raison de l’énorme accumulation de collagènes et autres matériaux de matrice osseuse produites par les ostéoblastes. Pour éviter la difficulté de la dissociation de l’ostéoblaste, LFS MSCs peut être semé en 2 - 3 fois plus grande densité dans l’étape d’initiation de la différenciation ostéoblastique pour faciliter la différenciation ostéoblastique. Ostéoblastes dérivés LFS MSC peuvent être dissociées et recueillies lors de la journée 6-10 point de temps de différenciation pour in vivo tumorigenèse dosage au jour 6 - point 7 de la différenciation dans le temps. Le modèle de tumeur de xénogreffe de LFS montre ostéoblastes dérivés LFS MSC récapitulent dans capacité tumorigènes vivo , qui fournit une plateforme alternative pour étudier l’ostéosarcome associés à LFS.
En résumé, un modèle de base iPSC ostéosarcome LFS fournit un précieux recours pour la recherche de l’ostéosarcome. En plus de l’ostéosarcome, LFS les patients souffrent de divers autres types de cancers tels que le sarcome des tissus mous, le cancer et tumeur au cerveau. Par conséquent, les modèles de maladies iPSC-basé de LFS peuvent être étendus pour modéliser les autre EPA liés malignes. Combinant EFT dérivé de patient CISP et conçu des mutants de p53 (mutp53) CSEh18, modèle de maladie EFT a également une grande valeur en délimitant la pathogénie des affections malignes mutp53 associés et le développement de nouvelles stratégies thérapeutiques ciblant les oncogènes 16de p53.
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Disclosures
Les auteurs n’ont rien à divulguer.
Acknowledgments
R. Z. est soutenue par l’Innovation UTHealth Cancer Prevention Training programme Pre-Doctoral bourse de recherche (prévention du Cancer et Research Institute of Texas accorder RP160015). J.T. est pris en charge par le programme de Lin Ke de l’Université de premier affilié hôpital de Sun Yat-sen. D.-F.L. est le savant CPRIT en cancérologie et soutenu par les NIH voie vers l’indépendance prix R00 CA181496 et CPRIT prix RR160019.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Plastic ware | |||
| 100 mm Dish | Corning | 430107 | |
| 60 mm Dish | Corning | 430166 | |
| 6-well Plate | Falcon | 353046 | |
| 12-well Plate | Falcon | 353043 | |
| 48-well Plate | Falcon | 353078 | |
| 1 mL Pipet Tip | USA Scientific | 1111-2721 | |
| 200 µL Pipet Tip | USA Scientific | 1111-0706 | |
| 10 µL Pipet Tip | USA Scientific | 1111-3700 | |
| 5 mL Serological Pipette | SARSTEDT | 86.1253.001 | |
| 10 mL Serological Pipette | SARSTEDT | 86.1254.001 | |
| 25 mL Serological Pipette | SARSTEDT | 86.1685.001 | |
| 50 mL Tube, PP | SARSTEDT | 62.547.100 | |
| 15 mL Tube, PP | SARSTEDT | 62.554.100 | |
| Culture materials and Reagents | |||
| CytoTune- iPS 2.0 Sendai Reprogramming Kit | Invitrogen | A16517 | Commercial Sendai virus reprogramming kit |
| Corning hESC-Qualified Matrix | Corning | 354277 | Basement membrane matrix |
| CF1 MEFs, irradiated | ThermoFisher | A34180 | |
| DMEM | Sigma-Aldrich | D5671 | |
| DMEM/F12 | Corning | 10-090-CV | |
| αMEM | Corning | 10-022-CV | |
| StemMACS iPS-Brew XF | Miltenyi Biotec | 130-104-368 | Commercial iPSC medium |
| KnockOut DMEM/F-12 | ThermoFisher | 12660012 | |
| FBS Opti-Gold | GenDEPOT | F0900-050 | |
| KnockOut Serum Replacement | ThermoFisher | A3181502 | |
| Penicillin-Streptomycin | Sigma-Aldrich | P4333 | |
| MEM Nonessential Amino Acids | Corning | 25-025-CI | |
| L-Glutamine Solution | Sigma-Aldrich | G7513 | |
| 2-Mercaptoethanol | Sigma-Aldrich | M3148 | |
| Human FGF-basic (bFGF) | PEPROTECH | 100-18B | |
| Recombinant Human PDGF-AB | PEPROTECH | 100-00AB | |
| β-Glycerophosphate | Sigma-Aldrich | G9422 | |
| Dexamethasone | Sigma-Aldrich | A4902 | |
| Ascorbic Acid | Sigma-Aldrich | A5960 | |
| Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline, 1x (DPBS) | Corning | 21-031-CV | |
| StemMACS Passaging Solution XF | Miltenyi Biotec | 130-104-688 | Commercial passaging solution |
| Accutatse Cell Detachment Solution | Corning | 25-058-CI | Cell detachment solution |
| Thiazovivin (ROCK Inhibitor) | Calbiochem | 420220 | |
| 0.25% Trypsin-EDTA Solution | Sigma-Aldrich | T4049 | |
| Collagenase, Type II | ThermoFisher | 17101015 | |
| Human NANOG Antibody | R&D System | AF1997 | |
| OCT4 Antibody (H-134) | Santa Cruz | sc-9081 | |
| Human/Mouse SSEA-4 PE-conjugated Antibody | R&D System | FAB1435P | |
| Alexa Fluor 555 Mouse Anti-Human TRA-1-81 Antigen | DB Biosciences | 560123 | |
| Alexa Fluor 488 Donkey Anti-Goat IgG (H+L) | Jackson ImmunoResearch | 705-545-003 | |
| Alexa Fluor 488 Goat Anti-Rabbit IgG (H+L) | Jackson ImmunoResearch | 111-545-144 | |
| PE Mouse Anti-Human CD105 | eBioscience | 12-1057-42 | |
| FITC Mouse Anti-Human CD44 | DB Biosciences | 555478 | |
| PE Mouse Anti-Human CD73 | DB Biosciences | 550257 | |
| PE Mouse Anti-Human CD166 | DB Biosciences | 560903 | |
| FITC Mouse Anti-Human CD24 | DB Biosciences | 555427 | |
| Donkey Serum | Jackson ImmunoResearch | 017-000-121 | |
| Goat Serum | Jackson ImmunoResearch | 005-000-121 | |
| Alkaline Phosphatase Staining Kit II | Stemgent | 00-0055 | |
| Alizarin Red S | Sigma-Aldrich | A5533 | |
| TRIzol Reagent | ThermoFisher | 15596018 | |
| Chloroform | ThermoFisher | C298-500 | |
| 2-Propanol | ThermoFisher | A416-4 | |
| Ethanol, Absolute, Molecular Biology Grade | ThermoFisher | BP28184 | |
| DNase I, RNase-free (1 U/µL) | ThermoFisher | EN0521 | |
| iScript cDNA Synthesis Kit | BioRad | 1708891BUN | |
| iQ SYBR Green Supermix | BioRad | 1708884 | |
| Matrigel Matrix High Concentration (HC), Phenol-Red Free | Corning | 354262 | |
| 1 mL Slip Tip Syringe, 26 Gauge x 5/8 Inch | DB Biosciences | 309597 |
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