Summary
Qui, presentiamo un protocollo per la generazione di induced pluripotent Stem Cells (iPSCs) da fibroblasti derivata pazienti di sindrome di Li-Fraumeni (LFS), differenziazione delle iPSCs tramite cellule staminali mesenchimali (MSCs) di osteoblasti e modellazione in vivo tumorigenesi utilizzando osteoblasti derivati paziente LFS.
Abstract
Sindrome di Li-Fraumeni (LFS) è un disordine ereditario dominante autosomal del cancro. I pazienti con LFS sono predisposti a un tipo di vari tumori, compreso osteosarcoma..--una delle malignità primaria non ematologica più frequente nell'infanzia e nell'adolescenza. Di conseguenza, LFS fornisce un modello ideale per studiare questa malignità. Approfittando delle metodologie iPSC, osteosarcoma LFS-collegato può essere modellato con successo differenziando LFS iPSCs paziente alle cellule staminali mesenchimali (MSCs) e quindi di osteoblasti, le cellule di origine per gli osteosarcomi. Questi osteoblasti LFS ricapitolano proprietà oncogeniche di osteosarcoma, fornendo un sistema di modello attraente per delineare la patogenesi di osteosarcoma. Questo manoscritto viene illustrato un protocollo per la generazione di iPSCs da fibroblasti pazienti di LFS, differenziazione delle iPSCs per MSCs, differenziazione di cellule staminali mesenchimali di osteoblasti e tumorigenesi in vivo utilizzando osteoblasti LFS. Questo modello di malattia di iPSC può essere esteso per identificare potenziali biomarcatori o bersagli terapeutici per LFS-collegati di osteosarcoma.
Introduction
Tra il 2006 e 2007, parecchi risultati di svolta dai laboratori di DRS. Shinya Yamanaka e James A. Thomson ha condotto allo sviluppo di pluripotenti indotte (iPSCs) le cellule staminali1,2,3. Di riprogrammare le cellule somatiche con definiti fattori trascrizionali a forma iPSCs, i ricercatori sono stati in grado di generare cellule con caratteristiche chiave, vale a dire, pluripotenza e auto-rinnovamento, che era precedentemente pensato solo esistono in cellule staminali embrionali umane (hESC). iPSCs potrebbe essere generato da qualsiasi individuo o il paziente e non ha dovuto essere derivate da embrioni, ampliando enormemente il repertorio delle malattie disponibili e sfondi gratis per lo studio. Da allora, iPSCs derivate dal paziente sono stati usati per ricapitolare il fenotipo di varie malattie umane, da morbo di Alzheimer4 e sclerosi laterale amiotrofica5 a lungo QT sindrome6,7, 8.
Questi avanzamenti nella ricerca di iPSC hanno anche aperto nuove strade per la ricerca sul cancro. Diversi gruppi hanno recentemente utilizzato iPSCs paziente allo sviluppo del cancro modello sotto un background genetico suscettibile9,10,11, con applicazione di successo ha dimostrata fino ad oggi in osteosarcoma9, leucemia10,11,12e13di cancro colorettale. Anche se modelli iPSC-derivato del cancro sono ancora nella loro infanzia, hanno dimostrato grande potenziale nella malignità phenocopying malattia-collegate, delucidare i meccanismi patologici e identificando i composti terapeutici14.
Sindrome di Li-Fraumeni (LFS) è un disordine ereditario dominante autosomal del cancro causato dalla mutazione di TP53 germline15. Pazienti con LFS sono predisposti a un vario tipo di malignità compreso osteosarcoma, rendendo particolarmente adatto allo studio di questa malignità16LFS iPSCs e le loro cellule derivate. Un modello basato su iPSC osteosarcoma è stato fondato nel 2015 utilizzando LFS iPSCs derivate paziente9 successivamente differenziate in cellule staminali mesenchimali (MSCs) e quindi di osteoblasti, l'originario cellule di osteosarcoma. Questi osteoblasti LFS ricapitolano osteosarcoma-collegata la differenziazione osteogenica difetti e proprietà oncogene, che dimostra il potenziale come una piattaforma di "tumore dell'osso in un piatto" modello. È interessante notare che, genoma transcriptome analisi rivelano aspetti di una firma del gene di osteosarcoma in osteoblasti LFS e che caratteristiche di questo profilo di espressione genica LFS sono correlate con la prognosi difficile in osteosarcoma9, che indica la potenziale di modelli di malattia iPSCs LFS a rivelare le caratteristiche di rilevanza clinica.
Questo manoscritto fornisce una descrizione dettagliata di come utilizzare LFS iPSCs derivate dal paziente all'osteosarcoma di modello. Vi si descrive la generazione di LFS iPSCs, differenziazione delle iPSCs a MSCs e poi di osteoblasti e l'uso di un modello in vivo dello xenotrapianto utilizzando osteoblasti LFS. Il modello di malattia LFS presenta diversi vantaggi, in particolare la capacità di generare cellule illimitate in tutte le fasi di sviluppo di osteosarcoma per studi meccanicistici, identificazione di biomarker e9,14, di screening di stupefacenti 16.
In sintesi, il modello di base di iPSC osteosarcoma LFS offre un attraente sistema complementare per far progredire la ricerca di osteosarcoma. Questa piattaforma fornisce anche un proof-of-concept per la modellazione di cancro usando iPSCs derivate dal paziente. Questa strategia descritta di seguito può essere facilmente esteso alle malignità di modello associata con altri disordini genetici con predisposizioni di cancro.
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Protocol
Questo lavoro è stato approvato da The University of Texas Health Science Center a Houston (UTHealth) Animal Welfare Committee. Gli esperimenti vengono eseguiti in stretta conformità con le norme stabilite dal centro UTHealth per la medicina del laboratorio animale & cura (CLAMC) che è accreditato dall'associazione americana per laboratorio Animal Care (AAALAC International). I soggetti umani in questo studio rientrano Scenario un ("No Human Subjects Research"), come definito nella documentazione di NIH SF424. Pertanto, non ha bisogno di alcuna approvazione comitato etico di UTHealth ricerca umana.
1. generazione di LFS iPSCs (Figura 1A)
- Il giorno -2, piastra 2 x 104 nei fibroblasti del paziente LFS in un pozzetto di una piastra a 6 pozzetti e cultura le cellule con il mezzo del fibroblasto (tabella 1) a 37 ° C in un 5% umidificata incubatore a CO2 . Garantire che i fibroblasti raggiungano 50-60% confluenza il giorno di trasduzione (giorno 0).
- Eseguire trasduzione del virus Sendai il giorno 0. Per effettuare questa operazione, sostituire il mezzo esaurito con il mezzo del fibroblasto pre-riscaldato. Scongelare il commerciale Sendai virus riprogrammazione kit (Vedi Tabella materiali) sul ghiaccio. Infettare fibroblasti LFS con misto virus Sendai secondo le istruzioni del produttore.
- Manutenzione delle cellule trasdotte in mezzo del fibroblasto (giorno 1-6):
- Il giorno 1, 24h dopo la trasduzione, rimuovere il supporto di fibroblasto contenente rimanenti Sendai virus e sostituirlo con 2 mL di terreno di fresco del fibroblasto. Cultura dei fibroblasti trasdotte a 37 ° C in un 5% umidificata incubatore a CO2 .
- Modificare il mezzo con il mezzo del fibroblasto ogni altro giorno dal giorno 2-6.
- Manutenzione delle cellule trasdotte nella condizione di cultura di alimentatore (giorno 7-28):
- Preparare dei fibroblasti embrionali di mouse irradiati di CF1 piastre di coltura (MEF) il giorno 6. Per fare questo cappotto sei piatti di coltura del tessuto di 100mm aggiungendo 5 mL di 0,1% gelatina ogni piastra a temperatura ambiente per 30 min. di aspirare la gelatina di 0,1% dopo il rivestimento.
- Rimuovere MEFs dal contenitore di azoto liquido. Scongelare MEFs utilizzando il sistema di scongelamento disponibile in commercio seguendo le istruzioni del produttore. Piastra le cellule sulle piastre rivestite con gelatina con terreno di coltura MEF/MSC (tabella 1) con una densità di semina di intorno 6.7 x 105 celle per ogni piatto di coltura del tessuto di 100 mm.
- Inoculare le cellule trasdotte sulle piastre di MEF (giorno 7): tripsinizzano le cellule trasdotte con 1 mL di 0,25% tripsina-EDTA per ogni piatto di 100 mm per 2-4 min a temperatura ambiente. Neutralizzare la tripsina con 9 mL di medium del fibroblasto. Cellule di trasferimento per provette coniche e centrifuga cellule a 230 x g a 37 ° C per un minimo di 4 loro cultura in 8 mL di terreno del fibroblasto per ogni piatto e piatto i fibroblasti trasdotte su sei MEF piatti preparati il giorno 6.
Nota: La confluenza di MEFs è intorno 20% prima della semina delle cellule trasdotte sulle piastre di MEF. - Il giorno 8, eliminare il terreno del fibroblasto e sostituire con hESC medio (tabella 1).
- Attendere la comparsa di cloni di iPS da giorni 9-28 (Figura 1C). Modificare il mezzo hESC speso ogni altro giorno e monitorare la comparsa di cloni di iPS sotto il microscopio. Attendere iPSCs cloni abbastanza grandi per essere osservata ad occhio nudo e poi procedere per espandere iPS cloni in condizioni di coltura privo di alimentatore.
- Espansione dell'iPS emerse cloni in condizioni di coltura privo di alimentatore (giorno 29-79 ~ 99):
- Per preparare la piastra matrix-rivestito, ricoprire una piastra a 48 pozzetti con 120 µ l di soluzione di rivestimento di matrix (tabella 1) della membrana dello scantinato per pozzetto. Assicurarsi che la soluzione di rivestimento matrice della membrana dello scantinato copre il pozzo e riveste la superficie del piatto di cultura. Lasciarlo a temperatura ambiente per 1 h. aspirare la soluzione di rivestimento immediatamente prima dell'uso e aggiungere 250 µ l di terreno di hESC per pozzetto con inibitore di 2 µM ROCK Thiazovivin.
- Il giorno 28, aspirare il medio speso hESC e lavare iPS cloni con 1 x DPBS. Prelevamento di cloni di iPS visibile con una punta di pipetta da 1 mL e trasferimento in un pozzetto di una piastra a 48 pozzetti trattata (punto 1.4.1). Una colonia per pozzetto della piastra 48 pozzetti del seme.
- Centrifugare la piastra a 230 x g per 4 min facilitare il collegamento delle cellule. Cultura di cloni di iPS a 37 ° C in un 5% umidificata incubatore a CO2 .
- Il giorno seguente (giorno 29), rimuovere il mezzo esaurito hESC e aggiungere 250 µ l del mezzo iPSC commercialmente disponibili in ciascun pozzetto.
- Mantenere iPS cloni a 37 ° C in un 5% umidificata incubatore a CO2 e cambiare il mezzo di iPSC ogni altro giorno.
- Quando iPS cloni raggiungono 85% confluenza, sottocultura cellule presso un 01:10 rapporto di zona della coltura. Aggiungere 60 µ l della soluzione passaging commerciale per staccare le cellule e incubare a 37 ° C per 3 min.
- Semi di metà del iPSCs indipendente su una piastra a 12 pozzetti rivestite con matrice della membrana dello scantinato in 1 mL di medium hESC con inibitore di 2 µM ROCK Thiazovivin. Cultura di cloni di iPS in un piatto di 12-pozzetti con 1 mL di terreno iPSC commercialmente disponibili per bene e sottocultura iPSCs presso un 01:10 rapporto fino a raggiungere il passaggio 10.
Nota: iPSCs sono coltivate ogni 5-7 giorni presso un 01:10 di sub rapporto. Ci vogliono fino a 10 settimane per i cloni di iPS raggiungere passaggio 10. iPSC caratterizzazioni compreso la morfologia delle cellule, attività della fosfatasi alcalina (AP) e l'espressione di fattori di pluripotenza e hESC marcatori, possono essere esaminati dopo aver confermato la rimozione del virus di Sendai in iPSCs (solitamente hanno dimostrato dopo circa 10 passaggi) (Figura 1B-E). Informazioni dell'anticorpo e primer per iPSC caratterizzazione sono inclusi in tabella 2 e 4.
2. differenziazione di LFS iPSCs a cellule staminali mesenchimali (MSCs) (Figura 2A)
- Cultura iPSC cloni su piastre di MEF per almeno 2 settimane (giorno ~ -14-0): preparare i piatti MEF (piastre di coltura del tessuto di 100 mm) come descritti in precedenza (1.3.1 - 1.3.2). Mantenere iPSCs in mezzo hESC e sostituire il terreno ogni altro giorno. Se il iPSCs raggiunge 90% confluenza, sottocultura iPSCs di 01:10 diluizione.
- Rimozione di MEFs da iPSCs (giorno 0):
- Dopo il mantenimento iPSCs su MEFs per 2 settimane, cultura iPSCs in piastre di coltura del tessuto 100 mm fino alle cellule raggiungere confluenza di 80-90%. Rimuovere il mezzo esaurito hESC e lavare iPSCs con 5 mL di 1 x DPBS. Aggiungere 1 mL della soluzione di distacco delle cellule per staccare le cellule e incubare a temperatura ambiente per 3 min.
- Aggiungere 9 mL di terreno di coltura MEF/MSC alla piastra per neutralizzare l'attività di soluzione di distacco delle cellule e trasferire le cellule indipendente a un piatto di coltura del tessuto nuovo 100 mm senza alcun rivestimento.
- Incubare le cellule a temperatura ambiente per 30 minuti consentire il MEFs di allegare alla piastra.
- Con attenzione e raccogliere il surnatante contenente unattached iPSCs e centrifugare a 230 x g a 4 ° C per 4 min.
Nota: Vampate di calore con noncuranza il fondo piatto conduce al distacco di MEFs.
- Differenziazione delle iPSCs verso MSCs (giorno 0 - 28):
- Cappotto tre pozzetti di una piastra a 6 pozzetti con 1 mL di 0,1% gelatina per pozzetto a temperatura ambiente per 30 min.
- Rimuovere il surnatante delle iPSCs raccolti da 2.2.4.
- Risospendere iPSCs in 6 mL di mezzo di differenziazione di MSC (tabella 1) e cellule di seme nei tre pozzetti rivestiti con 2 mL per pozzetto (giorno 0).
- Cambiare il mezzo di differenziazione di MSC ogni due giorni per rimuovere cellule non collegate e/o morte (giorno 1 - 28).
- Maturazione delle MSCs iPSC-derivato (giorno 28-45):
- Rimuovere il mezzo di differenziazione MSC esausto e lavare le cellule con 1 mL di 1 x DPBS.
- Tripsinizzano MSCs con 0,5 mL di 0,25% tripsina-EDTA per pozzetto a temperatura ambiente per 3 min.
- Neutralizzare la tripsina da 1,5 mL di terreno di coltura MEF/MSC e raccogliere MSCs da tre pozzi in una provetta conica da 15 mL. Centrifuga a 230 x g a 4 ° C per 4 min.
- Rimuovere il supernatante e risospendere MSCs in 3 mL di terreno di coltura MEF/MSC e piatto su una piastra 60 mm rivestite con gelatina 0,1% (giorno 28).
- MSCs della coltura in terreno di coltura MEF/MSC e sostituire il terreno ogni due giorni. Quando le cellule raggiungono 100% confluenza, MSCs sottocultura ad un rapporto di 1:3 con 0,25% tripsina-EDTA.
Nota: Il MSCs visualizzare una fibroblasto-come la morfologia (Figura 2B). Quando MSCs crescere in un'alta densità, allungata MSCs possono formare un modello di vortice (Figura 2B). - Eseguire la macchiatura immunofluorescente per valutare MSCs iPSC-derivato esaminando gli indicatori di superficie MSC CD44, CD73, CD105 e CD166 (Figura 2).
Nota: La diluizione degli anticorpi sono riportati nella tabella 2. Macchiatura immunofluorescente delle celle in tensione viene eseguita secondo le istruzioni del produttore. - Dopo la conferma, è possibile espandere MSCs ad un rapporto di 1:3 in piastre di coltura del tessuto 100 mm. Congelare giù fiale (3 fiale per ogni piatto di coltura del tessuto di 100 mm) utilizzando il supporto di congelamento contenente 10% DMSO e 90% FBS.
Nota: Per arricchire la popolazione di MSC, MSCs possono essere ordinati utilizzando CD105+, CD24-criteri di flusso cytometry9,17. iPSC-derivato MSCs differenziati utilizzando il metodo di PDGF-AB-based comunemente può essere mantenuta per 2-3 mesi in cultura senza perdita di MSC identità9. Congelare MSCs da un numero di passaggio precoce dopo aver confermato le caratteristiche MSC.
3. la differenziazione di cellule staminali mesenchimali LFS di osteoblasti (Figura 3A)
- Preparazione di cellule staminali mesenchimali per la differenziazione osteogenica (giorno -1)
- Per garantire un'adeguata quantità di cellule per completare il protocollo di differenziazione osteogenica, iniziano con MSCs coltivate in piatti di coltura del tessuto di 100 mm alla confluenza del 95%. Rimuovere il terreno di coltura speso e lavare MSCs con 5 mL di 1 x DPBS.
- Tripsinizzano MSCs con 1 mL di tripsina-EDTA 0,25% per ogni piatto 100 mm a temperatura ambiente per 3 min. Per garantire che le cellule non sono più tripsinizzate, interrompere trypsinization quando il 50% del distaccamento delle cellule è osservato al microscopio.
- Neutralizzare la tripsina da 9 mL di terreno di coltura MEF/MSC e raccogliere MSCs da 3 pozzi in una provetta conica da 15 mL. Centrifuga a 230 x g a 4 ° C per 4 min.
- Aspirare il supernatante e risospendere MSCs in 5 mL di mezzo MSC contare il numero di cellule di un emocitometro.
- Adeguato numero di targa di MSCs su una piastra di coltura.
Nota: Il dettaglio dei numeri delle cellule di piastra 12-pozzetti, 6-pozzetti e piatti di coltura del tessuto 100mm sono riassunti nella tabella 3.
- Induzione del differenziamento osteogenico di mezzo di differenziazione degli osteoblasti (ODM) (tabella 1) (giorno 0 - 24):
- Aspirare il terreno di coltura MEF/MSC e sostituire con un volume adeguato di ODM (1 mL, 2 mL e 8 mL per ciascun pozzetto della piastra 12-pozzetti, ciascun pozzetto della piastra a 6 pozzetti e coltura tissutale 100 mm piatto, rispettivamente) per differenziare MSCs di osteoblasti (giorno 0).
- Aspirare l'ODM esaurito e sostituire con un volume adeguato di ODM ogni due giorni durante il processo di differenziamento osteogenico.
- Eseguire la fosfatasi alcalina (AP) e la S di rosso alizarina (ARS) che macchia per rilevare fosfatasi alcalina osso-collegata, prodotto da preosteoblasts e deposizione minerale prodotto da maturare osteoblasti, rispettivamente, il giorno 3, 6, 9, 12, 15, 18, 21 e 24 ( Figura 3B).
Nota: AP macchiatura e ARS colorazione vengono eseguite utilizzando kit disponibile in commercio seguendo il protocollo del produttore. - Esaminare i livelli di espressione di marcatori preosteoblast e maturo degli osteoblasti (ALPL e COL1A1 per preosteoblasts; PTH1R e BGLAP per maturo osteoblasti) mediante qRT-PCR (Figura 3).
Nota: La macchiatura positiva AP è previsto dopo 9 giorni di differenziamento osteogenico e macchiatura positiva ARS può essere preveduta dopo 21 giorno di differenziamento osteogenico. MSCs cresce in terreno di coltura MEF/MSC può essere servito come un controllo negativo di AP colorazione e colorazione di ARS.
4. il modello di xenotrapianto di studiare In Vivo Tumorigenesis di osteoblasti derivati LFS MSC (Figura 4A)
- Differenziazione di cellule staminali mesenchimali LFS di osteoblasti:
- Seme 3-4.5 x 105 MSCs nella piastra di coltura del tessuto di 100 mm. Preparare cinque piatti per una sola iniezione sottocutanea.
- Cultura MSCs nel ODM per differenziare MSCs a osteoblasti, come descritto al punto 3.2 fino al giorno 14.
- Preparazione degli osteoblasti differenziati per iniezione sottocutanea:
- Per preparare la soluzione di distacco degli osteoblasti (tabella 1), sciogliere collagenasi II tipo 1g in 1.000 mL di terreno αMEM per rendere la soluzione II di collagenasi (1 mg/mL). Tenere la soluzione di collagenasi II a-20 ° C. Mescolare 0,25% tripsina-EDTA e la soluzione di collagenasi II con un rapporto 1:1 per rendere l'osteoblasto soluzione di distacco.
- Rimuovere l'ODM esaurito e lavare osteoblasti differenziati con 5 mL di 1 x DPBS per ogni piatto di 100 mm.
- Aggiungere 1,5 mL di soluzione di distacco degli osteoblasti per ogni piatto di 100 mm e incubare piatti a 37 ° C per 30 min. esaminare e garantire il distacco degli osteoblasti da microscopia.
- Neutralizzare la soluzione di distacco di osteoblasti di ODM e raccogliere l'osteoblasto distaccato in una provetta conica da 50 mL. Centrifuga a 230 x g a 4 ° C per 5 min.
- Rimuovere il supernatante e risospendere le cellule in 25 mL di terreno ODM. Passare le cellule attraverso un colino di cella 70 µm per rimuovere cellule aggregate. Contare i numeri di cellulare utilizzando un emocitometro.
- Preparare 1 x 107 osteoblasti per iniezione sottocutanea e centrifuga cellule a 230 x g a 4 ° C per 4 min.
- Risospendere l'osteoblasto7 1 x 10 in 50 µ l ghiacciata 1 x DPBS. Mix differenziato osteoblasti con 50 µ l di matrice della membrana basale gratuito di rosso fenolo (osteoblasti matrice sospensione e della membrana dello scantinato sono stati mescolati con un rapporto 1:1) e mantenere osteoblasti sul ghiaccio prima dell'iniezione.
-
In vivo modello tumore dello xenotrapianto di osteoblasti derivati LFS MSC:
- Anestetizzare 8-settimana-vecchi topi femminili NU/NU immunocompromessi in una camera di fornitura isoflurano 5% (v/v) per via inalata a 1 L/min di ossigeno (fornito da CLAMC). Dopo che l'animale diventa recumbent, passare il sistema di consegna anestetico per il cono di naso, fornitura di 2% (v/v) inalato isoflurano in 200mL/min di ossigeno (fornito da CLAMC). Monitorare la profondità dell'anestesia controllando i riflessi corneali e pedali per rendere i topi sono sufficientemente anestetizzati e non soffre di disagio durante la procedura.
- Disinfettare la zona deve essere iniettato con tamponi alternati di clorexidina e 70% di isopropanolo. Utilizzare ago da 26 G per eseguire l'iniezione sottocutanea di osteoblasti LFS matrix-misto della membrana dello scantinato in un lato delle zampe posteriori di topi di 8-settimana-vecchio immunocompromessi NU/NU (Figura 4A).
- Monitor mouse effettuando download palpazione in siti di iniezione per la crescita della densità nodulari sottocutanee. Formazione del tumore può essere osservato circa 6-10 settimane dopo l'iniezione (Figura 4B).
- Eutanasia i topi dal biossido di carbonio metodo di asfissia seguita da dislocazione cervicale. Sezionare i tumori sviluppati. Determinare il grado del tumore e l'indice di differenziazione, preosteoblasts e osteoblasto maturo di vari metodi di colorazione (ad es. ematossilina ed eosina (H & E) colorazione, colorazione Picro Sirius Red e von Kossa colorazione rispettivamente).
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Representative Results
Questo protocollo presenta le procedure incluse LFS iPSC generazione MSC differenziazione, differenziazione degli osteoblasti e in vivo nella tumorigenesi analisi usando osteoblasti LFS MSC-derivato.
Schema per la generazione di LFS iPSCs dai fibroblasti utilizzando un virus Sendai disponibile in commercio kit di riprogrammazione è mostrato in Figura 1A. Sendai virus-ha basato la consegna dei fattori Yamanaka quattro è un metodo di riprogrammazione non-integrazione. Pertanto, cloni stabili di iPSC LFS dovrebbero essere liberi di genoma del virus Sendai e perdita di esogeno OCT4, SOX2, KLF4 e c-MYC transgeni, che possono essere esaminato mediante RT-PCR utilizzando primers specifici (Figura 1B). Come è suggerito nelle istruzioni del produttore, generazione di iPSCs privo di Sendai virus dipende da condizioni di cultura e di passaggio. Sotto le condizioni della coltura descritti nel presente protocollo, rimozione di virus di Sendai in iPSCs solitamente può essere rilevata dopo 10 passaggi (Figura 1B). I cloni di iPSC LFS stabiliti dovrebbero esibire la morfologia tipica hESC e mostrano l'attività AP positivo (Figura 1). LFS iPSCs altamente express pluripotenza fattore mRNA (NANOG, OCT4, SOX2, DPPA4e REX1), paragonabile alla linea hESC H1 e molto superiore di fibroblasti parentale (Figura 1). L'espressione di fattori di pluripotenza (NANOG, OCT4) e marcatori hESC (SSEA4 e TRA-1-81) può anche essere esaminato dalla macchiatura immunofluorescente (Figura 1E).
iPSCs sono mantenuti su MEFs per almeno 14 giorni prima dell'inizio della differenziazione MSC (Figura 2A). Anche se un sacco di morte delle cellule accadere durante la differenziazione di MSC, masse di cellule differenziate sono visibili sulla piastra di coltura delle cellule e fibroblasto-come MSCs al bordo delle masse delle cellule può essere osservato al giorno 28. (Figura 2B). Dopo sub coltura di cellule in terreno di coltura MEF/MSC differenziate, MSCs differenziato proliferare rapidamente e mostrano morfologia fibroblasto-come circa 35 giorni e poi gradualmente rappresentano una forma allungata e formano un motivo a ricciolo al giorno 40 (Figura 2B ). MSCs LFS differenziate esprimono marcatori MSC, tra cui CD44, CD73, CD105 e CD166 dall'immunofluorescenza che macchia (Figura 2).
Figura 3A delinea differenziamento osteoblastico. Quando MSCs sono sottoposti ai segnali di differenziazione osteogenica, le cellule differenziate iniziano a mostrare l'attività della fosfatasi alcalina positivo al giorno 9 (Figura 3B). ARS di colorazione può essere utilizzato per rilevare la deposizione minerale prodotto dall'osteoblasto maturo. Il colore rosso brillante colorazione invece di macchiatura colore marrone indica il risultato positivo di macchiatura di ARS, che può essere osservato dopo 21 giorno (Figura 3B). L'osteoblasto differenziazione Mostra espressione crescente livello dei geni preosteoblast (ALPL e COL1A1) e geni osteoblast maturo (BGLAP e PTH1R) durante il differenziamento osteogenico.
Può essere stabilito in vivo modello dello xenotrapianto iniettando sottocute osteoblasti derivati LFS MSC nei topi NU/NU (Figura 4A). I tumori possono essere osservati 6-10 settimane dopo l'iniezione sottocutanea (Figura 4B). I tumori di osteoblast-derivati di LFS ha dimostrato caratteristiche degli osteoblasti immaturi, positiva attività di AP (AP colorazione), deposizione di matrice collagene positivo (percentuale rosso colorazione) ma negativo mineralizzazione (von Kossa macchiatura) (Figura 4) .
Figura 1 : iPSC generazione da fibroblasti di pazienti di LFS. (A) diagramma schematico della generazione iPSC. (B) rilevazione di RT-PCR del genoma del virus Sendai e transgeni (KOS (KLF4, OCT4, e SOX2), KLF4, e c-MYC) nel clone iPSC riprogrammato dopo 10 passaggi (a sinistra) e dopo l'infezione del fibroblasto giorno 11 (a destra, controllo positivo). LFS iPSC clone è privo di virus Sendai dopo 10 passaggi. GAPDH è indicato come controllo interno. (C) morfologia del LFS iPSCs e AP macchiatura di cella. Barra della scala, 50 µm (D) qRT-PCR di NANOG, SOX2, OCT4, DPPA4e l'espressione di mRNA REX1 in iPSCs LFS. hESC H1 linea e parentale LFS fibroblasti vengono utilizzati come un positivo e un controllo negativo, rispettivamente. L'espressione del mRNA è normalizzato all'espressione di GAPDH . L'espressione di mRNA relativa è regolata a hESC H1 linea come 1. (E) Immunostaining di fattori di trascrizione di hESC pluripotenti (NANOG e OCT4) e marcatori di superficie hESC (SSEA4 e TRA-1-81) in iPSCs LFS. Barra della scala, 50 µm. La diluizione degli anticorpi utilizzati in questo studio sono riportati nella tabella 2. Le sequenze dell'iniettore sono mostrate nella tabella 4. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2 : Differenziazione di LFS iPSCs a MSCs. (A) diagramma schematico della differenziazione indotta da PDGF-AB MSC. (B) cella morfologia di LFS iPSC-derivati di cellule staminali mesenchimali a differenziazione giorno 28, 36 giorno e giorno 40 +. Barra della scala, 100 µm. (C) colorazione di immunofluorescenza dimostra che differenziato LFS MSCs esibiscono CD44+, CD73+, CD105+, CD166+e CD24 firma– . Barra della scala, 30 µm. La diluizione degli anticorpi utilizzati in questo studio sono riportati nella tabella 2. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 3 : Differenziazione delle MSC di LFS a osteoblasti. (A) diagramma schematico di differenziamento osteogenico. (B) AP e ARS colorazione vengono eseguite a intervalli di tempo diversi (giorno 3, 6, 9, 12, 15, 18, 21 e 24). Differenziamento osteoblastico degli osteoblasti derivati LFS MSC dovrebbe portare a positivo AP macchiatura intorno giorno 9 e positivo ARS colorazione al giorno 21. (C) la qRT-PCR analisi dimostra l'espressione aumentata di pre-degli osteoblasti (ALPL e COL1A1) e geni (PTH1R e BGLAP) maturo degli osteoblasti durante il differenziamento osteogenico. L'espressione del mRNA è normalizzato all'espressione di GAPDH . Livelli di espressione erano rispetto a cellule a differenziazione giorno 0. Le sequenze dell'iniettore sono mostrate nella tabella 4. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 4 : In vivo tumorigenesis di osteoblasti derivati LFS MSC. (A) diagramma schematico di xenotrapianto di tumore degli osteoblasti LFS. (B) topi NU/NU bear tumori osteoblast-derivati di LFS dopo 10 settimane di iniezione sottocutanea. (C), LFS osteoblast-derivati i tumori sono stati esaminati da H & E, AP, percentuale di rosso e von Kossa macchiatura per morfologia, osso-associati AP, collagene e depositi di minerali, rispettivamente. I tumori di derivazione LFS rappresentano le caratteristiche degli osteoblasti immaturi risultati positiva attività di AP, collagene positivo e negativo minerale mineralizzazione. Barra della scala, 1 mm. per favore clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
| Mezzo del fibroblasto (500 mL) | |
| DMEM | da 440 mL |
| Inattivati FBS | 50 mL |
| Antibiotics(Pen/STREP) (100x) | 5 mL |
| Aminoacido non essenziale (100x) | 5 mL |
| 2-mercaptoetanolo | 3,5 Μ l |
| Terreno di coltura MEF/MSC (500 mL) | |
| DMEM | da 440 mL |
| Inattivati FBS | 50 mL |
| Antibiotics(Pen/STREP) (100x) | 5 mL |
| L-Glutammina (100x) | 5 mL |
| hESC medio (500 mL) | |
| DMEM/F-12 | 384,5 mL |
| Sostituzione del siero ad eliminazione diretta | 100 mL (Totale: 20%) |
| Aminoacido non essenziale (100x) | 5 mL |
| Antibiotici (Pen/Strep) (100x) | 5 mL |
| L-Glutammina (100x) | 5 mL |
| bFGF (10 µ g/mL) | 500 Μ l |
| 2-mercaptoetanolo | 3,5 Μ l |
| Mezzo di differenziazione di MSC (500 mL) | |
| KnockOut DMEM/F-12 o DMEM/F-12 | 445 mL |
| Sostituzione del siero ad eliminazione diretta | 50 mL |
| bFGF (10 µ g/mL) | 500 µ l (10 ng/mL) |
| PDGF-AB (25 µ g/mL) | 200 µ l (10 ng/mL) |
| Aminoacido non essenziale (100x) | 5 mL |
| 2-mercaptoetanolo | 3,5 Μ l |
| Mezzo di differenziazione degli osteoblasti (ODM) (500 mL) | |
| ΑMEM | 395 mL |
| Inattivati FBS | 50 mL |
| β-glicerofosfato di 10 mM | 50 mL (1,08 g in 50 mL αMEM) |
| Desametasone 0,1 µM (sensibile alla luce) | 10 µ l di desametasone 5 mM |
| Acido ascorbico 200 µM (sensibile alla luce) | 100 µ l di acido ascorbico 1 mM |
| Antibiotici (Pen/Strep) (100x) | 5 mL |
| Soluzione di rivestimento di Matrigel (50 mL) | |
| Matrice della membrana basale | 2 mL |
| DMEM/F-12 (pre-freddo 4 ° C) | da 48 mL |
| Soluzione di distacco degli osteoblasti (50 mL) | |
| 0,25% tripsina-EDTA | 25 mL |
| Soluzione di collagenasi II (1 mg/mL) | 25 mL |
| Nota: Preparare degli osteoblasti distacco soluzione fresca proprio prima dell'uso. Collagenasi II soluzione è conservata a-20 ° C fino a 6 mesi. | |
Tabella 1: Composizioni di medie del fibroblasto, terreno di coltura MEF/MSC, hESC medie, mezzo di differenziazione di MSC, ODM e soluzione di distacco degli osteoblasti.
| Nome dell'anticorpo | Diluizione |
| NANOG | 1: 500 |
| OCT4 | 1: 300 |
| SSEA-4 PE-coniugato | 1:600 |
| TRI-1-81 | 1:600 |
| Asino di anti-capra IgG | 1: 500 |
| IgG di capra anti-coniglio | 1: 500 |
| CD105 | 1: 500 |
| CD44 | 1: 500 |
| CD73 | 1: 500 |
| CD166 | 1: 500 |
| CD24 | 1: 500 |
Tabella 2: Diluizione anticorpo.
| Piastra di coltura | Densità di semina | Analisi |
| 12-pozzetti | 0.67x104 cellule per pozzetto | Fosfatasi alcalina (AP colorazione) di colorazione |
| Colore rosso di alizarina S colorazione (ARS colorazione) | ||
| Piastra a 6 pozzetti | 2 x 104 cellule per pozzetto | Rilevazione di RT-PCR |
| Preosteoblast marcatori: ALPL, COL1A1 | ||
| Maturo marcatori degli osteoblasti: PTH1R, BGLAP | ||
| 100 mm piatto | 3 - 4.5x105 cellule per piastra | Tumorigenesi in vivo |
Tabella 3: Semina densità di MSCs per differenziazione osteoblastica.
| Sendai Virus primer | |
| Destinazione | Insiemi dell'iniettore |
| SeV | Avanti: GGATCACTAGGTGATATCGAGC |
| Inversa: ACCAGACAAGAGTTTAAGAGATATGTATC | |
| KOS (KLF4/OCT4/SOX2) | Avanti: ATGCACCGCTACGACGTGAGCGC |
| Inversa: ACCTTGACAATCCTGATGTGG | |
| KLF4 | Avanti: TTCCTGCATGCCAGAGGAGCCC |
| Inversa: AATGTATCGAAGGTGCTCAA | |
| c-MYC | Avanti: TAACTGACTAGCAGGCTTGTCG |
| Inversa: TCCACATACAGTCCTGGATGATGATG | |
| RT-PCR Primers | |
| Destinazione | Insiemi dell'iniettore |
| NANOG | Avanti: TTTGTGGGCCTGAAGAAAACT |
| Inversa: AGGGCTGTCCTGAATAAGCAG | |
| SOX2 | Avanti: AGAAGAGGAGAGAGAAAGAAAGGGAGAGA |
| Inversa: GAGAGAGGCAAACTGGAATCAGGATCAAA | |
| OCT4 | Avanti: AACCTGGAGTTTGTGCCAGGGTTT |
| Inversa: TGAACTTCACCTTCCCTCCAACCA | |
| DPPA4 | Avanti: GACCTCCACAGAGAAGTCGAG |
| Inversa: TGCCTTTTTCTTAGGGCAGAG | |
| REX1 | Avanti: GCCTTATGTGATGGCTATGTGT |
| Inversa: ACCCCTTATGACGCATTCTATGT | |
| ALPL | Avanti: GGGACTGGTACTCAGACAACG |
| Inversa: GTAGGCGATGTCCTTACAGCC | |
| COL1A1 | Avanti: GTGCGATGACGTGATCTGTGA |
| Inversa: CGGTGGTTTCTTGGTCGGT | |
| PTH1R | Avanti: AGTGCGAAAAACGGCTCAAG |
| Inversa: GATGCCTTATCTTTCCTGGGC | |
| BGLAP | Avanti: GGCGCTACCTGTATCAATGG |
| Inversa: GGCGCTACCTGTATCAATGG |
Tabella 4: Informazioni sul Primer.
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Discussion
Per raggiungere una maggiore efficienza di differenziazione di MSC, alcuni aspetti sono fondamentali. Uno è la condizione di cultura di iPSCs prima dell'inizio della differenziazione di MSC. Il protocollo presentato nel manoscritto si basa su precedenti studi 9,17. iPSCs devono essere coltivate su MEFs per almeno 2 settimane. Mantenere iPSCs in buone condizioni su MEFs sono critiche per celle fissare la piastra rivestite con gelatina per il differenziamento di MSC. Un altro aspetto importante è la densità di iPSCs su MEFs prima differenziazione. 80 - confluency di 90% di iPSCs è preferito per avviare la differenziazione di MSC. La crescita eccessiva di iPSCs potrebbe compromettere la sopravvivenza delle cellule durante il processo di differenziazione. L'ultimo punto di critica è la densità di semina all'avvio di differenziazione di MSC. Nelle nostre mani, cellula di elevata densità favorisce iPSC allegato alla piastra rivestite con gelatina. Un 100 mm piatto iPSCs può essere seminato in tre pozzetti di piastre da 6. L'inizio della differenziazione di MSC direttamente ematico e placcatura iPSCs in mezzo di differenziazione di MSC produce grandi sollecitazioni su iPSCs, quindi occasionalmente con conseguente morte delle cellule severa dopo la semina. Ad alta densità di iPSCs aumenta il tasso di successo di differenziazione di MSC.
A differenza di differenziazione di MSC, è più semplice il processo di differenziamento osteoblastico. Per ottenere risultati riproducibili differenziazione, verificare che i numeri MSC d'inizio siano consistenti. Risultati di differenziazione osteoblastic dalla stessa linea cellulare possono variare da lotto a lotto, perciò, creazione di differenziazione per le differenti linee allo stesso tempo vi darà più risultati comparativi tra gruppi. L'aumento dei numeri MSC abbreviare il processo di differenziazione indicato dalla macchiatura positiva AP e ARS presso un punto di tempo precedente. Verificare inoltre il cambiamento di mezzo ODM viene gestito in modo delicato e potente sistema di aspirazione sotto vuoto non è raccomandato in fase avanzata di differenziazione (giorno 18 - 24) dovuto il potenziale distacco degli aggregati osteoblasti durante processo di cultura.
L'osteoblasto differenziato utilizzato per in vivo dello xenotrapianto esperimento è osteoblasti presso il punto di tempo di differenziazione di giorno 14. L'osteoblasto più tardi del giorno 14 può aggregare ed essere difficile dissociare dovuto gli accumuli enormi di collageni e altri materiali di matrice ossea prodotte dagli osteoblasti. Per evitare la difficoltà di dissociazione degli osteoblasti, LFS MSCs può essere seminato in 2 - 3 volte maggiore densità nella fase di inizio della differenziazione osteoblastic per facilitare la differenziazione degli osteoblasti. Osteoblasti derivati LFS MSC possono essere dissociati e raccolti al giorno 6-10 punto di tempo di differenziazione per il tumorigenesis in vivo analisi al giorno 6 - punto di differenziazione 7 tempo. Il modello di tumore dello xenotrapianto LFS dimostra osteoblasti derivati LFS MSC ricapitolano in vivo capacità tumorigeniche, che fornisce una piattaforma alternativa per studiare LFS-collegati di osteosarcoma.
In sintesi, un modello basato su iPSC osteosarcoma LFS fornisce un prezioso ricorso per la ricerca di osteosarcoma. Oltre a osteosarcoma, LFS pazienti soffrono di vari altri tipi di tumori come il sarcoma dei tessuti molli, cancro al seno e tumore al cervello. Pertanto, modelli basati su iPSC malattia LFS possono essere esteso per altri LFS di modello correlati a tumori maligni. Combinando il LFS paziente-derivato iPSCs e ingegnerizzato mutante p53 (mutp53) hESCs18, modello di malattia LFS inoltre ha un grande valore nel delineare la patogenesi delle malignità mutp53 associato e lo sviluppo di nuove strategie terapeutiche oncogeno di targeting p5316.
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Disclosures
Gli autori non hanno nulla a rivelare.
Acknowledgments
R. Z. è supportato da UTHealth innovazione per cancro Prevenzione ricerca formazione programma corso Fellowship (prevenzione del cancro e Istituto di ricerca del Texas concedere RP160015). J.T. è supportato dal programma Ke Lin dell'Università ospedale affiliato prima di Sun Yat-sen. D.-F.L. è lo studioso CPRIT nella ricerca sul cancro e supportato da NIH via indipendenza Premio R00 CA181496 e CPRIT premio RR160019.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Plastic ware | |||
| 100 mm Dish | Corning | 430107 | |
| 60 mm Dish | Corning | 430166 | |
| 6-well Plate | Falcon | 353046 | |
| 12-well Plate | Falcon | 353043 | |
| 48-well Plate | Falcon | 353078 | |
| 1 mL Pipet Tip | USA Scientific | 1111-2721 | |
| 200 µL Pipet Tip | USA Scientific | 1111-0706 | |
| 10 µL Pipet Tip | USA Scientific | 1111-3700 | |
| 5 mL Serological Pipette | SARSTEDT | 86.1253.001 | |
| 10 mL Serological Pipette | SARSTEDT | 86.1254.001 | |
| 25 mL Serological Pipette | SARSTEDT | 86.1685.001 | |
| 50 mL Tube, PP | SARSTEDT | 62.547.100 | |
| 15 mL Tube, PP | SARSTEDT | 62.554.100 | |
| Culture materials and Reagents | |||
| CytoTune- iPS 2.0 Sendai Reprogramming Kit | Invitrogen | A16517 | Commercial Sendai virus reprogramming kit |
| Corning hESC-Qualified Matrix | Corning | 354277 | Basement membrane matrix |
| CF1 MEFs, irradiated | ThermoFisher | A34180 | |
| DMEM | Sigma-Aldrich | D5671 | |
| DMEM/F12 | Corning | 10-090-CV | |
| αMEM | Corning | 10-022-CV | |
| StemMACS iPS-Brew XF | Miltenyi Biotec | 130-104-368 | Commercial iPSC medium |
| KnockOut DMEM/F-12 | ThermoFisher | 12660012 | |
| FBS Opti-Gold | GenDEPOT | F0900-050 | |
| KnockOut Serum Replacement | ThermoFisher | A3181502 | |
| Penicillin-Streptomycin | Sigma-Aldrich | P4333 | |
| MEM Nonessential Amino Acids | Corning | 25-025-CI | |
| L-Glutamine Solution | Sigma-Aldrich | G7513 | |
| 2-Mercaptoethanol | Sigma-Aldrich | M3148 | |
| Human FGF-basic (bFGF) | PEPROTECH | 100-18B | |
| Recombinant Human PDGF-AB | PEPROTECH | 100-00AB | |
| β-Glycerophosphate | Sigma-Aldrich | G9422 | |
| Dexamethasone | Sigma-Aldrich | A4902 | |
| Ascorbic Acid | Sigma-Aldrich | A5960 | |
| Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline, 1x (DPBS) | Corning | 21-031-CV | |
| StemMACS Passaging Solution XF | Miltenyi Biotec | 130-104-688 | Commercial passaging solution |
| Accutatse Cell Detachment Solution | Corning | 25-058-CI | Cell detachment solution |
| Thiazovivin (ROCK Inhibitor) | Calbiochem | 420220 | |
| 0.25% Trypsin-EDTA Solution | Sigma-Aldrich | T4049 | |
| Collagenase, Type II | ThermoFisher | 17101015 | |
| Human NANOG Antibody | R&D System | AF1997 | |
| OCT4 Antibody (H-134) | Santa Cruz | sc-9081 | |
| Human/Mouse SSEA-4 PE-conjugated Antibody | R&D System | FAB1435P | |
| Alexa Fluor 555 Mouse Anti-Human TRA-1-81 Antigen | DB Biosciences | 560123 | |
| Alexa Fluor 488 Donkey Anti-Goat IgG (H+L) | Jackson ImmunoResearch | 705-545-003 | |
| Alexa Fluor 488 Goat Anti-Rabbit IgG (H+L) | Jackson ImmunoResearch | 111-545-144 | |
| PE Mouse Anti-Human CD105 | eBioscience | 12-1057-42 | |
| FITC Mouse Anti-Human CD44 | DB Biosciences | 555478 | |
| PE Mouse Anti-Human CD73 | DB Biosciences | 550257 | |
| PE Mouse Anti-Human CD166 | DB Biosciences | 560903 | |
| FITC Mouse Anti-Human CD24 | DB Biosciences | 555427 | |
| Donkey Serum | Jackson ImmunoResearch | 017-000-121 | |
| Goat Serum | Jackson ImmunoResearch | 005-000-121 | |
| Alkaline Phosphatase Staining Kit II | Stemgent | 00-0055 | |
| Alizarin Red S | Sigma-Aldrich | A5533 | |
| TRIzol Reagent | ThermoFisher | 15596018 | |
| Chloroform | ThermoFisher | C298-500 | |
| 2-Propanol | ThermoFisher | A416-4 | |
| Ethanol, Absolute, Molecular Biology Grade | ThermoFisher | BP28184 | |
| DNase I, RNase-free (1 U/µL) | ThermoFisher | EN0521 | |
| iScript cDNA Synthesis Kit | BioRad | 1708891BUN | |
| iQ SYBR Green Supermix | BioRad | 1708884 | |
| Matrigel Matrix High Concentration (HC), Phenol-Red Free | Corning | 354262 | |
| 1 mL Slip Tip Syringe, 26 Gauge x 5/8 Inch | DB Biosciences | 309597 |
References
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