Summary
Здесь мы представляем протокол для поколения индуцированных плюрипотентных стволовых клеток (iPSCs) от синдром ли-Фраумени (LFS) пациента производных фибробластов, дифференциация iPSCs через мезенхимальных стволовых клеток (МСК) остеобластов и моделирование в естественных условиях опухолей с помощью ОРС пациента производные остеобластов.
Abstract
Синдром ли-Фраумени (ОРС) является расстройством аутосомно-доминирующей Наследственный рак. У больных с ОРС предрасположены к различных типов опухолей, в том числе остеосаркома--один из наиболее частых первичной не гематологических злокачественных новообразований в детство и юность. Таким образом LFS обеспечивает идеальную модель для изучения этой злокачественности. Воспользовавшись iPSC методологий, LFS-связанные остеосаркомы может успешно моделируется дифференциации LFS пациента iPSCs мезенхимальных стволовых клеток (МСК), а затем остеобластов--клетки происхождения для osteosarcomas. Эти LFS остеобластов пилки Онкогенные свойства остеосаркома, предоставляя привлекательные модели системы для разграничения патогенеза остеосаркома. Эта рукопись демонстрирует протокол для генерации iPSCs от ОРС пациента фибробластов, дифференциация iPSCs до MSCs, дифференциация MSCs остеобластов, и в естественных условиях опухолей с помощью ОРС остеобластов. Эта модель iPSC болезни может быть продлен для выявления потенциальных биомаркеров или терапевтических целей ОРС связанные остеосаркома.
Introduction
Между 2006 и 2007 годах несколько прорыв результаты из лабораторий Drs. Синъя Яманака и Джеймс а. Томсон привели к развитию индуцированных плюрипотентных стволовых клеток (iPSCs)1,2,3. Перепрограммирование соматические клетки с определенными транскрипционный анализ факторов формы iPSCs, исследователи смогли генерировать клетки с ключевыми характеристиками, а именно, плюрипотентности и самообновления, которое ранее считалось только существуют в человеческих эмбриональных стволовых клеток (ЭСК). iPSCs могут быть получены из любого лица или пациента и не должны быть получены из эмбрионов, значительно расширяет репертуар имеющихся заболеваний и стола для изучения. С тех пор пациент производные iPSCs были использованы для пилки фенотип различных заболеваний человека, от болезни Альцгеймера4 и боковой амиотрофический склероз5 длинные QT синдром6,7, 8.
Эти достижения в iPSC исследованиях также открыли новые возможности для исследований рака. Несколько групп недавно использовали пациента iPSCs модель развития рака под восприимчивы генетический фон9,10,11, с успешным применением продемонстрировал на сегодняшний день в9остеосаркома, лейкемии10,11,12и13колоректального рака. Хотя рак iPSC производные модели все еще находятся в зачаточном, они продемонстрировали большой потенциал в phenocopying заболевание связанные злокачественных опухолей, изучение патологических механизмов и выявления терапевтических соединений14.
Синдром ли-Фраумени (ОРС) является расстройством аутосомно-доминирующей наследственного рака, вызванных TP53 герминальных мутаций15. У больных с ОРС предрасположены к различных типов злокачественных опухолей, включая остеосаркома, делая LFS iPSCs и их производные клетки особенно хорошо подходит для изучения этого злокачественного16. Модель на основе iPSC остеосаркома был впервые создан в 2015 году, впоследствии с помощью ОРС пациента производные iPSCs9 дифференцированных в мезенхимальных стволовых клеток (МСК) и затем для остеобластов, возникновение клетки из остеосаркома. Эти LFS остеобластов пилки связанные остеосаркома Остеогенные дифференциация дефектов и Онкогенные свойства, демонстрируя потенциал как «опухоль кости в блюдо» платформа модель. Интересно, что анализ генома общесистемной транскриптом выявить аспекты остеосаркома геном подписи в LFS остеобластов и что функции данного профиля выражение гена ОРС связаны с плохой прогноз в9остеосаркома, указывающее потенциал модели заболеванием iPSCs LFS раскрыть особенности клинической значимости.
Эта рукопись содержит подробное описание о том, как использовать LFS пациента производные iPSCs для модели остеосаркома. В нем подробно поколения LFS iPSCs, дифференциации iPSCs MSCs, а затем, чтобы остеобластов и использование в vivo ксенотрансплантата модели с помощью ОРС остеобластов. LFS болезни модель включает в себя ряд преимуществ, прежде всего способность генерировать неограниченные клетки на всех стадиях развития остеосаркома механистический исследований, биомаркер идентификации и наркотиков скрининг9,14, 16.
Таким образом модель на основе iPSC остеосаркома LFS предлагает привлекательные дополнительные системы для продвижения остеосаркома исследований. Эта платформа также обеспечивает доказательства в концепция для рака моделирования с помощью пациент производные iPSCs. Эта стратегия, описанные ниже может легко распространяться на модель злокачественных опухолей, связанных с другими генетических расстройств с раком предрасположенности.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Эта работа была утверждена центра науки здоровья университета Техаса в Комитете Благосостояние животных Хьюстон (UTHealth). Эксперименты проводятся в строгом соответствии с нормами, установленными в UTHealth центре для лабораторных животных медицина и уход (CLAMC) которая аккредитована американской ассоциации для лабораторных животных уход (АААЛЖ). Человеке в этом исследовании подпадают под сценарий («нет человека предметов исследования»), как определено в низ SF424 документации. Таким образом он не нуждается в каких-либо одобрения Комитета по этике исследований человеческого UTHealth.
1. поколение LFS iPSCs (рис. 1A)
- На день -2, плите 2 х 104 LFS пациента фибробластов в одну скважину 6-ну плиты и культура клетки фибробластов среднего (Таблица 1) при 37 ° C в увлажненные 5% CO2 инкубатора. Убедитесь, что фибробласты достичь слияния 50-60% в день трансдукции (день 0).
- Выполните трансдукции Сэндай вирус на день 0. Для этого замените подогретым фибробластов среднего отработанного среднего. Оттепель коммерческих Сэндай, вирус перепрограммирования комплекта (см. Таблицу материалы) на льду. Заразить LFS фибробластов с смешанной Сэндай вирусов согласно инструкциям производителя.
- Техническое обслуживание transduced клеток в среде фибробластов (день 1-6):
- В день 1, 24 ч после трансдукции фибробластов носитель, содержащий остальные Сэндай вирус удалить и заменить его с 2 мл свежего фибробластов среднего. Культура transduced фибробластов при 37 ° C в увлажненные 5% CO2 инкубатора.
- Измените в среду с фибробластов среднего каждый день от дня 2-6.
- Техническое обслуживание transduced клеток в условиях культуры фидер (день 7-28):
- Подготовьте облученного CF1 мыши эмбриональных фибробластов (MEF) культуры блюда на 6 день. Сделать это пальто шесть блюд культуры ткани 100 мм, добавив 5 мл 0,1% желатина для каждой пластины при комнатной температуре за 30 мин аспирационная 0,1% желатина после покрытия.
- Удаление MEFs из жидкого азота контейнера. Оттепель MEFs использование коммерчески доступных размораживания системы следуя инструкциям производителя. Пластина на желатин покрытием пластин ячейки с MEF/MSC питательной среды (Таблица 1) на посевной плотности около 6,7 x 105 клеток на 100 мм тканевой культуры блюдо.
- Прививать transduced клеток на MEF пластины (7 дней): Trypsinize transduced клетки, используя 1 мл 0,25% трипсина-ЭДТА за блюдо 100 мм для 2-4 мин при комнатной температуре. Нейтрализовать трипсина с 9 мл среды фибробластов. Передачи для конической трубки и центрифуги ячейки на 230 x g при 37 ° C мин 4 пластины transduced фибробластов на шести MEF блюда, приготовленные на день 6 и культуры их в 8 мл фибробластов среднего за блюдо.
Примечание: Confluency MEFs составляет около 20% перед посевом transduced клеток на тарелках MEF. - На 8 день отказаться от среднего фибробластов и заменить с Госкомсанэпиднадзором среднего (Таблица 1).
- Дождитесь появления клонов iPS от дней 9-28 (рис. 1C). Измените отработанного Госкомсанэпиднадзором среднего каждый день и следить за появлением iPS клонов под микроскопом. Ждать для iPSCs клоны достаточно большой, чтобы наблюдать невооружённым глазом, а затем приступить к расширить iPS клонов в состоянии фидер свободной культуры.
- Расширение возникли iPS клонов в состоянии фидер свободной культуры (день 29-79 ~ 99):
- Подготовить пластины с покрытием матрицу, пальто 48-ну плита с 120 мкл раствора покрытие матрицы базальной мембраны (Таблица 1) на хорошо. Убедитесь, что решение покрытие матрицы базальной мембраны охватывает также и пальто культуры блюдо поверхности. Оставить его при комнатной температуре в течение 1 ч. аспирационная раствор для нанесения покрытия непосредственно перед использованием и 250 мкл Госкомсанэпиднадзором среднего за хорошо с 2 мкм рок ингибитор Thiazovivin.
- На 28 день аспирационная отработанного Госкомсанэпиднадзором среднего и вымойте клонами iPS с 1 x DPBS. Подберите видимых iPS клоны с 1 мл наконечник пипетки и передачи в хорошо очищенных 48-ну плиты (шаг 1.4.1). Одна колония семян за хорошо 48-ну пластины.
- Центрифуга пластину на 230 g x 4 мин для облегчения ячейки вложение. Культура iPS клонов при 37 ° C в увлажненные 5% CO2 инкубатора.
- На следующий день (день 29), удаление отработанного Госкомсанэпиднадзором среднего и 250 мкл коммерчески доступных iPSC среды в каждой скважине.
- Поддерживать iPS клонов при 37 ° C в увлажненные 5% CO2 инкубатора и изменения среднего iPSC каждый день.
- Когда iPS клоны достигает 85% слияния, субкультура клеток в 1:10 соотношение по зоне культуры. 60 мкл коммерческих passaging решения для отсоединения клетки и инкубировать при 37 ° C на 3 мин.
- Заполнить половину отдельностоящий iPSCs на плите матрицы покрытием 12-ну базальной мембраны в 1 мл Госкомсанэпиднадзором среды с 2 мкм рок ингибитор Thiazovivin. Культура iPS клонов в 12-ну плита с 1 мл среды коммерчески доступных iPSC в колодец и субкультуры iPSCs в 1:10 соотношение до тех пор, пока они достигают проход 10.
Примечание: iPSCs, суб, культивированный каждые 5-7 дней на 1:10 соотношение. Она занимает до 10 недель iPS клоны достичь проход 10. iPSC характеристики, включая морфологии клеток, активность щелочной фосфатазы (AP) и выражение факторов плюрипотентности и Госкомсанэпиднадзором маркеры, может быть рассмотрен после подтверждения удаления вируса Сэндай в iPSCs (обычно продемонстрировал после около 10 проходы) (рис. 1B-E). Антитела и грунтовка информация для iPSC характеристики включены в таблице 2 и 4.
2. дифференциация LFS iPSCs к мезенхимальных стволовых клеток (МСК) (рисунок 2A)
- IPSC культуры клонов на тарелках MEF для по крайней мере 2 недели (день ~ -14-0): подготовить MEF блюда (100 мм культуры тканей) как описано выше (1.3.1 - 1.3.2). Поддерживать iPSCs в среде Госкомсанэпиднадзором и изменения среднего каждый день. Когда iPSCs достигают 90% слияния, субкультура iPSCs 1:10 разрежения.
- Удаление MEFs от iPSCs (день 0):
- После сохранения iPSCs на MEFs для 2 недели, iPSCs культуры в 100 мм культуры ткани блюд до клеток достичь слияния 80-90%. Удаление отработанного Госкомсанэпиднадзором среднего и мыть iPSCs с 5 mL 1 x DPBS. Добавьте 1 мл раствора отряд ячейки для отсоединения клетки и инкубации при комнатной температуре в течение 3 мин.
- Добавьте 9 мл MEF/MSC питательной среды к пластине нейтрализовать клеточной активности отряд решения и передавать отдельные клетки новое блюдо культуры ткани 100 мм без каких-либо покрытия.
- Инкубируйте клетки при комнатной температуре за 30 минут, чтобы позволить MEFs для присоединения к пластине.
- Тщательно Соберите супернатанта, который содержит неприсоединенной iPSCs и центрифуги на 230 x g при 4 ° C на 4 мин.
Примечание: Небрежно промывка нижней пластины приводит к отряда MEFs.
- Дифференциация iPSCs сторону MSCs (день 0 - 28):
- Герб три скважины 6-ну плиты с 1 мл 0,1% желатина в скважину при комнатной температуре в течение 30 мин.
- Удалите супернатант собранных iPSCs от 2.2.4.
- Ресуспензируйте iPSCs в 6 мл MSC дифференциации среднего (Таблица 1) и клеток семян в три скважины с покрытием с 2 мл в колодец (день 0).
- Измените MSC дифференциации среднего каждые два дня удалить неприсоединенной или мертвые клетки (день 1 - 28).
- Созревание iPSC производные MSCs (день 28-45):
- Удаление отработанного MSC дифференциации среднего и вымыть клетки с 1 мл раствора 1 x DPBS.
- Trypsinize MSCs с 0,5 мл 0,25% трипсина-ЭДТА в скважину при комнатной температуре 3 мин.
- Нейтрализовать трипсина по 1,5 мл MEF/MSC питательной среды и собирать MSCs с трех скважин в одной 15 мл конические трубы. Центрифуга на 230 x g при 4 ° C на 4 мин.
- Удалить супернатант и Ресуспензируйте MSCs в 3 мл MEF/MSC питательной среды и пластины на одном 60 мм 0.1% желатина покрытием плита (28 дней).
- Культура MSCs в MEF/MSC питательной среды и изменить среднего каждые два дня. Когда клетки достичь 100% слияния, субкультура MSCs в соотношении 1:3, с использованием 0,25% трипсина-ЭДТА.
Примечание: MSCs отображения фибробластоподобных морфологии (рис. 2B). Когда MSCs растут в высокой плотности, удлиненные MSCs могут образовывать вихрь как шаблон (рис. 2B). - Выполнить immunofluorescent окрашивания для оценки iPSC производные MSCs путем изучения поверхностных маркеров MSC CD44, CD73, CD105 и CD166 (рис. 2 c).
Примечание: В таблице 2показаны разбавления антитела. Immunofluorescent окрашивание живых клеток осуществляется в соответствии с инструкциями производителя. - После подтверждения разверните MSCs в соотношении 1:3 в 100 мм культуры ткани блюда. Заморозить вниз флаконов (3 флаконов в 100 мм тканевой культуры блюдо) с использованием замораживания средств, содержащие 10% ДМСО и 90% FBS.
Примечание: Чтобы обогатить MSC населения, MSCs могут быть отсортированы с помощью CD105+, CD24-критерии потока цитометрии9,17. iPSC производные MSCs продифференцировано с помощью метода на основе PDGF-AB часто может поддерживаться на 2-3 месяца в культуре без потери MSC личности9. Заморозить MSCs от ранних номер прохода после подтверждения MSC характеристики.
3. дифференциация LFS MSCs, остеобласты (рис. 3A)
- Подготовка MSCs для Остеогенные дифференциации (день -1)
- Чтобы обеспечить достаточное количество клеток для завершения протокола Остеогенные дифференциации, начинаются с MSCs, культивируемых в 100 мм культуры ткани блюд до 95% слияния. Удаление отработанного питательной среды и промойте MSCs 5 mL 1 x DPBS.
- Trypsinize MSCs с 1 мл 0,25% трипсина-ЭДТА за блюдо 100 мм при комнатной температуре в течение 3 мин. Чтобы убедиться, что клетки не более trypsinized, остановка trypsinization, когда 50% отряда клеток наблюдается под микроскопом.
- Нейтрализовать трипсина, 9 мл MEF/MSC питательной среды и собирать MSCs от 3 скважины в одной 15 мл конические трубы. Центрифуга на 230 x g при 4 ° C на 4 мин.
- Аспирационная супернатанта, Ресуспензируйте MSCs в 5 мл среды MSC и подсчитать количество ячеек с Горяева.
- Пластина надлежащее количество MSCs на табличке культуры.
Примечание: В таблице 3кратко излагаются подробно число клеток 12-ну пластины, 6 хорошо плита, и 100 мм культуры ткани блюда.
- Индукции дифференцировки остеогенные, остеобластов дифференциации среднего (ODM) (Таблица 1) (день 0 - 24):
- Аспирационная MEF/MSC питательной среды и заменить с надлежащим объемом ODM (1 мл, 2 мл и 8 мл для каждой скважины 12-ну пластины, каждой скважины 6-ну пластины, и 100 мм тканевой культуры блюдо, соответственно) для различения MSCs остеобластов (день 0).
- Аспирационная отработанного ODM и замените надлежащего объема ODM каждые два дня во время процесса Остеогенные дифференциации.
- Выполните щелочная фосфатаза (АР) и ализарин красный S (ARS), окрашивание обнаружить кости связанные щелочной фосфатазы, производимые preosteoblasts и минеральных осаждения производимых Зрелые остеобластов, соответственно, на день, 3, 6, 9, 12, 15, 18, 21 и 24 ( Рисунок 3B).
Примечание: AP окрашивание и ARS окрашивание, выполняются с использованием коммерчески доступных комплект Производитель протоколом. - Изучить уровни выражения preosteoblast и зрелые остеобластов маркеров (ALPL и COL1A1 для preosteoblasts; PTH1R и BGLAP для зрелой остеобласты) qRT-ПЦР (рис. 3 c).
Примечание: Позитивные AP пятнать ожидается после день 9 Остеогенные дифференциации и положительный пятнать ARS можно ожидать после 21 день Остеогенные дифференциации. MSCs, растущих в MEF/MSC питательной среды могут быть поданы как отрицательный контроль AP окрашивание и ARS окрашивания.
4 ксенотрансплантата модель для изучения в Vivo Tumorigenesis LFS MSC-производные остеобластов (рис. 4A)
- Дифференциация LFS MSCs для остеобластов:
- Семя 3-4.5 x 105 MSCs в 100 мм тканевой культуры блюдо. Подготовьте пять блюд для одной подкожной инъекции.
- Культура MSCs в ODM различать MSCs остеобластов, как описано в 3.2 до 14 дней.
- Подготовка дифференцированных остеобластов для подкожных инъекций:
- Для приготовления раствора остеобластов отряд (Таблица 1), растворяют 1 g типа II коллагеназы в 1000 мл αMEM среды для решения II коллагеназы (1 мг/мл). Держите коллагеназы II решения при-20 ° C. Смешайте 0,25% трипсина-ЭДТА и коллагеназы II решения в соотношении 1:1 чтобы остеобластов отряд решение.
- Удаление отработанного ODM и мыть дифференцированной остеобласты с 5 мл 1 x DPBS за 100 мм блюдо.
- Добавить 1,5 мл раствора отряд остеобластов на 100 мм блюдо и инкубировать блюд при 37 ° C на 30 мин исследовать и обеспечить остеобластов отряд по микроскопии.
- Нейтрализовать остеобластов отряд решение по ODM и собирать отдельные остеобластов в 50 мл Конические трубки. Центрифуга на 230 x g при 4 ° C за 5 мин.
- Удалить супернатант и Ресуспензируйте клетки в 25 мл ODM среды. Клетки проходят через 70 мкм клеток сито для удаления агрегированных клеток. Подсчет числа клеток с помощью Горяева.
- Подготовка 1 x 107 остеобластов на подкожно и клетки центрифуги на 230 x g при 4 ° C на 4 мин.
- Ресуспензируйте остеобластов7 1 x 10 в 50 мкл ледяной 1 x DPBS. Mix продифференцировано остеобласты с 50 мкл фенол красный бесплатно базальной мембраны матрицы (остеобластов, подвеска и базальной мембраны матрицы были смешаны в соотношении 1:1) и поддерживать остеобластов на льду перед инъекцией.
-
В естественных условиях ксенотрансплантата опухоли модель остеобластов LFS MSC-производные:
- Анестезировать женского ослабленным 8-week-old мышей NU/NU в камере поставки изофлюрановая 5% (v/v) вдыхается в 1 Л/мин кислорода (при условии CLAMC). После того, как животное становится лежачие, переключитесь носовой конус, поставки изофлюрановая 2% (v/v) вдыхается в 200 мл/мин кислорода (при условии CLAMC) обезболивающий системы доставки. Монитор глубины анестезии, проверяя роговицы и педали рефлексы, чтобы сделать мышей достаточно наркозом и не страдает от дискомфорт во время процедуры.
- Лечить области, чтобы быть введен с чередуя тампоны хлоргексидином и 70% изопропиловый спирт. Используйте 26 G иглы для выполнения подкожно базальной мембраны матрица смешанные LFS остеобластов в одну сторону задних ног 8-week-old мышей с ослабленным иммунитетом NU/NU (рис. 4A).
- Монитор мыши, выполняя загрузок пальпации в местах инъекций для роста подкожный узловой плотности. Образования опухоли можно наблюдать около 6-10 недель после инъекции (рис. 4В).
- Усыпить мышей методом удушение двуокиси углерода, следуют шейки матки дислокации. Вскрыть развитых опухолей. Определите опухоли и индекс дифференциации, preosteoblasts и зрелые остеобластов различными методами окрашивания (например гематоксилином и эозином (H & E) пятнать, Picro Сириус красного окрашивания и фон Kossa, окрашивание соответственно).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Этот протокол представляет процедур, включая iPSC поколение LFS, дифференциация MSC, остеобластов дифференциации и в естественных условиях tumorigenesis Пробирная использованием LFS MSC-производные остеобластов.
Схема для поколения LFS iPSCs от фибробластов, используя коммерчески доступных Сэндай вирус перепрограммирования комплект показана на рисунке 1A. Доставки на основе Сэндай вирус Яманака четырех факторов является методом перепрограммирования-интеграция. Таким образом стабильной LFS iPSC клоны должно быть свободной от генома вируса Сэндай и потеря экзогенных OCT4, SOX2, KLF4 и c-MYC трансгенов, который может быть проверен RT-PCR с использованием конкретных грунтовки (рис. 1B). Как предлагается в инструкции производителя, поколение Сэндай вирусов iPSCs зависит от культуры и принятие условий. На условиях, описанных культуры в настоящем Протоколе удаление вируса Сэндай в iPSCs обычно могут быть обнаружены после 10 ходов (рис. 1B). Установленным клоны iPSC ОРС следует демонстрируют типичные Госкомсанэпиднадзором морфологии и показать позитивные действия AP (рис. 1 c). LFS iPSCs высоко Экспресс плюрипотентности фактор mRNAs (NANOG, OCT4, SOX2, DPPA4и REX1), сопоставимые с Госкомсанэпиднадзором H1 линии и намного выше, чем родительский фибробластов (рис. 1 d). Выражение плюрипотентности факторов (NANOG, OCT4) и Госкомсанэпиднадзором маркеры (SSEA4 и тра-1-81) также может быть проверен immunofluorescent окрашивание (Рисунок 1E).
iPSCs ведутся на MEFs для по крайней мере за 14 дней до начала MSC дифференциации (рис. 2A). Хотя много смерти клетки случиться во время MSC дифференциации, массы дифференцированных клеток видны на пластину культуры клеток и фибробластоподобных MSCs на краю ячейки масс можно наблюдать на 28 день. (Рис. 2B). После того, как sub культивирования дифференцированных клеток в MEF/MSC питательной среды, дифференцированной MSCs размножаться быстро и показать фибробластоподобных морфология вокруг дней 35 и затем постепенно представляют собой продолговатую форму и формируют вихрем узор на 40 день (Рисунок 2B ). Дифференцированные LFS MSCs Экспресс MSC маркеров, в том числе CD44, CD73, CD105 и CD166, иммунофлюоресценции, окрашивание (рис. 2 c).
На рисунке 3A излагаются osteoblastic дифференцировки. Когда MSCs подвергаются Остеогенные дифференциация сигналов, дифференцированной клетки начинают Показать позитивные щелочной фосфатазы в день 9 (рис. 3B). ARS пятнать может использоваться для обнаружения минеральных осаждения производимых Зрелые остеобластов. Ярко-красный цвет, окрашивания вместо коричневого цвета окрашивания указывает положительный результат окрашивания ARS, которая может наблюдаться после 21 день (рис. 3B). Дифференцируя остеобластов показывают увеличение выражение уровня зрелой остеобластов генов (BGLAP и PTH1R) и preosteoblast генов (ALPL и COL1A1) во время Остеогенные дифференциации.
В естественных условиях ксенотрансплантата модель может устанавливаться путем инъекции подкожно LFS MSC-производные остеобластов NU/NU мышей (рис. 4A). Опухоли могут наблюдаться 6-10 недель после подкожной инъекции (рис. 4В). LFS остеобластов производные опухоли продемонстрировал незрелых остеобластов характеристики, позитивной деятельности AP (AP окрашивание), положительные Коллагеновые матрицы осаждения (picrosirius красное окрашивание) но негативные минерализации (фон Kossa окрашивание) (рис. 4 c) .
Рисунок 1 : iPSC поколение от пациента фибробластов LFS. (A) принципиальная схема iPSC поколения. ()B)-ПЦР обнаружение генома вируса Сэндай и трансгенов (Кос (KLF4, OCT4, и SOX2), KLF4, и c-MYC) в клон перепрограммировать iPSC после 10 ходов (слева) и фибробластов послеоперационные инфекции день 11 (справа, положительный контроль). LFS iPSC клон является Сендай вирус бесплатно после 10 ходов. GAPDH отображается как внутреннего контроля. (C) клетки морфология LFS iPSCs и AP окрашивания. Линейки, 50 мкм (D) qRT ПЦР NANOG, SOX2, OCT4, DPPA4и REX1 мРНК выражение в LFS iPSCs. Госкомсанэпиднадзором H1 линии и родительских LFS фибробластов используются как положительный и отрицательный контроль, соответственно. Выражение mRNA нормируется GAPDH выражение. Относительное выражение mRNA корректируется Госкомсанэпиднадзором H1 линии как 1. (E) иммуноокрашивания Госкомсанэпиднадзором плюрипотентных транскрипционных факторов (NANOG и OCT4) и Госкомсанэпиднадзором поверхностных маркеров (SSEA4 и тра-1-81) в LFS iPSCs. Линейки, 50 мкм. Разбавления антитела, используемые в данном исследовании приводятся в таблице 2. Грунтовка последовательности приведены в таблице 4. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 2 : Дифференциация LFS iPSCs до MSCs. (A) принципиальная схема PDGF-AB-индуцированной MSC дифференциации. (B) клетки морфология LFS iPSC производные MSCs на дифференциации день 28, 36 день и день 40 +. Линейки, 100 мкм. (C) иммунофлюоресценции пятнать демонстрирует дифференцированной LFS MSCs экспонат CD44+, CD73+, CD105+, CD166+и CD24– подпись. Линейки, 30 мкм. Разбавления антитела, используемые в данном исследовании приводятся в таблице 2. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 3 : Дифференциация LFS MSCs, остеобласты. (A) принципиальная схема Остеогенные дифференциации. (B) ап и ARS пятнать выполняются в разное время точках (день 3, 6, 9, 12, 15, 18, 21 и 24). Osteoblastic дифференциация LFS MSC-производные остеобластов, как ожидается, приведет к позитивным AP, окрашивание вокруг дней 9 и позитивные ARS пятнать в 21 день. (C) qRT ПЦР анализ демонстрирует увеличение выражение предварительно остеобластов (ALPL и COL1A1) и зрелые остеобластов генов (PTH1R и BGLAP) во время Остеогенные дифференциации. Выражение mRNA нормируется GAPDH выражение. Уровни выражения были относительно ячеек на дифференциации день 0. Грунтовка последовательности приведены в таблице 4. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 4 : В естественных условиях tumorigenesis LFS MSC-производные остеобластов. (A) принципиальная схема опухоли ксенотрансплантата LFS остеобластов. (B) NU/NU мышей нести LFS остеобластов производные опухоли после 10 недель подкожной инъекции. (C) LFS остеобластов производные опухоли были рассмотрены H & E, AP, picrosirius красный и фон Kossa, пятнать для морфологии, кость связанные AP, коллаген и полезных ископаемых, соответственно. LFS-производные опухолей представляют незрелых остеобластов характеристики показаны положительные AP активности, положительных коллагена и отрицательные минеральных минерализации. Линейки, 1 мм. пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
| Средний фибробластов (500 мл) | |
| DMEM | 440 мл |
| Тепло инактивированная FBS | 50 мл |
| Antibiotics(Pen/strep) (100 x) | 5 мл |
| Заменимая аминокислота (100 x) | 5 мл |
| 2-меркаптоэтанол | 3.5 МКЛ |
| MEF/MSC питательной среды (500 мл) | |
| DMEM | 440 мл |
| Тепло инактивированная FBS | 50 мл |
| Antibiotics(Pen/strep) (100 x) | 5 мл |
| L-глютамин (100 x) | 5 мл |
| Госкомсанэпиднадзором среднего (500 мл) | |
| DMEM/F-12 | 384,5 мл |
| Замена сыворотки нокаут | 100 мл (всего: 20%) |
| Заменимая аминокислота (100 x) | 5 мл |
| Антибиотики (Pen/Strep) (100 x) | 5 мл |
| L-глютамин (100 x) | 5 мл |
| bFGF (10 мкг/мл) | 500 МКЛ |
| 2-меркаптоэтанол | 3.5 МКЛ |
| MSC дифференциации среднего (500 мл) | |
| Нокаут DMEM/F-12 или DMEM/F-12 | 445 мл |
| Замена сыворотки нокаут | 50 мл |
| bFGF (10 мкг/мл) | 500 мкл (10 нг/мл) |
| PDGF-AB (25 мкг/мл) | 200 мкл (10 нг/мл) |
| Заменимая аминокислота (100 x) | 5 мл |
| 2-меркаптоэтанол | 3.5 МКЛ |
| Остеобластов дифференциации среднего (ODM) (500 мл) | |
| ΑMEM | 395 мл |
| Тепло инактивированная FBS | 50 мл |
| 10 мм β-Глицерофосфат | 50 мл (1.08 g в 50 мл αMEM) |
| Дексаметазона 0,1 мкм (светочувствительных) | 10 мкл дексаметазон 5 мм |
| Аскорбиновая кислота 200 мкм (светочувствительных) | 100 мкл 1 мм аскорбиновой кислоты |
| Антибиотики (Pen/Strep) (100 x) | 5 мл |
| Раствор для нанесения покрытия Matrigel (50 мл) | |
| Матрица базальной мембраны | 2 мл |
| DMEM/F-12 (предварительно холодной 4 ° C) | 48 мл |
| Остеобластов отряд раствор (50 мл) | |
| Трипсин 0.25%-ЭДТА | 25 мл |
| Коллагеназы II решение (1 мг/мл) | 25 мл |
| Примечание: Подготовьте остеобластов отряд решение свежие прямо перед использованием. Коллагеназы II решение хранится при температуре-20 ° C до 6 месяцев. | |
Таблица 1: Композиции среднего фибробластов, MEF/MSC питательной среды, Госкомсанэпиднадзором среднего, MSC дифференциации среднего, ODM и остеобластов отряд решения.
| Название антитела | Разбавление |
| NANOG | 1: 500 |
| OCT4 | 1: 300 |
| PE-конъюгированных SSEA-4 | 1: 600 |
| TRI-1-81 | 1: 600 |
| Осел анти коза IgG | 1: 500 |
| Коза анти кролик IgG | 1: 500 |
| CD105 | 1: 500 |
| CD44 | 1: 500 |
| CD73 | 1: 500 |
| CD166 | 1: 500 |
| CD24 | 1: 500 |
Таблица 2: Антитела разрежения.
| Пластина культуры | Плотность посева | Проба |
| 12-ну пластина | 0.67x104 клетки на колодец | Щелочная фосфатаза, окрашивание (AP окрашивание) |
| Ализарин красный S окрашивание (ARS окрашивание) | ||
| 6-ну пластина | 2 x 104 клетки на колодец | -ПЦР обнаружение |
| Preosteoblast маркеры: ALPL, COL1A1 | ||
| Зрелые остеобластов маркеры: PTH1R, BGLAP | ||
| 100 мм блюдо | 3 - 4.5x105 клеток на пластину | В естественных условиях tumorigenesis |
Таблица 3: Посева плотность MSCs для дифференциации osteoblastic.
| Сэндай – вирус праймеры | |
| Цель | Грунтовка наборы |
| SeV | Вперед: GGATCACTAGGTGATATCGAGC |
| Обратный: ACCAGACAAGAGTTTAAGAGATATGTATC | |
| КОС (KLF4/OCT4/SOX2) | Вперед: ATGCACCGCTACGACGTGAGCGC |
| Обратный: ACCTTGACAATCCTGATGTGG | |
| KLF4 | Вперед: TTCCTGCATGCCAGAGGAGCCC |
| Обратный: AATGTATCGAAGGTGCTCAA | |
| c-MYC | Вперед: TAACTGACTAGCAGGCTTGTCG |
| Обратный: TCCACATACAGTCCTGGATGATGATG | |
| RT-PCR праймеры | |
| Цель | Грунтовка наборы |
| NANOG | Вперед: TTTGTGGGCCTGAAGAAAACT |
| Обратный: AGGGCTGTCCTGAATAAGCAG | |
| SOX2 | Вперед: AGAAGAGGAGAGAGAAAGAAAGGGAGAGA |
| Обратный: GAGAGAGGCAAACTGGAATCAGGATCAAA | |
| OCT4 | Вперед: AACCTGGAGTTTGTGCCAGGGTTT |
| Обратный: TGAACTTCACCTTCCCTCCAACCA | |
| DPPA4 | Вперед: GACCTCCACAGAGAAGTCGAG |
| Обратный: TGCCTTTTTCTTAGGGCAGAG | |
| REX1 | Вперед: GCCTTATGTGATGGCTATGTGT |
| Обратный: ACCCCTTATGACGCATTCTATGT | |
| ALPL | Вперед: GGGACTGGTACTCAGACAACG |
| Обратный: GTAGGCGATGTCCTTACAGCC | |
| COL1A1 | Вперед: GTGCGATGACGTGATCTGTGA |
| Обратный: CGGTGGTTTCTTGGTCGGT | |
| PTH1R | Вперед: AGTGCGAAAAACGGCTCAAG |
| Обратный: GATGCCTTATCTTTCCTGGGC | |
| BGLAP | Вперед: GGCGCTACCTGTATCAATGG |
| Обратный: GGCGCTACCTGTATCAATGG |
Таблица 4: Грунтовка информации.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Для достижения более высокой эффективности MSC дифференциации, некоторые аспекты имеют решающее значение. Один является состояние культуры iPSCs перед началом MSC дифференциации. Протокол, представленный в рукописи основан на предыдущих исследований 9,17. iPSCs должны быть культивировали на MEFs для по крайней мере 2 недель. Поддержание iPSCs в хорошем условий на MEFs являются критическими для ячеек придает желатина покрытием пластина для дифференциации MSC. Другим важным аспектом является плотность iPSCs на MEFs до дифференциации. 80 - 90% confluency iPSCs предпочитают начать MSC дифференциации. Разрастание iPSCs нарушит выживаемость клеток в процессе дифференцировки. Последний критическая точка является плотность посева при запуске MSC дифференциации. В наших руках плотность высокая клеток способствует iPSC привязанность к пластине с покрытием желатина. Один из iPSCs 100 мм блюдо может быть заполнена в три скважины 6-ну пластины. Начало дифференцировки MSC непосредственно resuspending и покрытие iPSCs в MSC дифференциации среднего производит большой нагрузки на iPSCs, поэтому иногда приводящих к смерти тяжелой клеток после посева. Высокая плотность iPSCs увеличивает коэффициент успеха MSC дифференциации.
В отличие от MSC дифференциации процесс дифференциации osteoblastic является более простой. Для достижения результатов воспроизводимых дифференциации, убедитесь, что инициирующий чисел MSC согласуются. Результаты osteoblastic дифференциации от одной и той же линии клетки могут меняться от партии к партии, поэтому настройка дифференциации различных линий в то же время даст более сравнительные результаты среди групп. Увеличение числа MSC сократить процесс дифференциации, указали на позитивные AP и ARS окрашивания на более ранний момент времени. Кроме того обеспечить изменение средних ODM обрабатывается в нежный способ и мощная система вакуумного всасывания не рекомендуется в поздней стадии дифференцировки (день 18 - 24) из-за потенциального отряд агрегированных остеобластов процессе культуры.
Дифференцированной остеобластов, используется в vivo ксенотрансплантата эксперимента являются остеобластов на этапе 14 день дифференциации. Остеобласты позднее чем 14 дней может агрегировать и трудно отделить из-за огромного скопления коллагенов и другие кости матрица материалы, выпускаемые остеобластов. Чтобы предотвратить трудности остеобластов диссоциации, LFS MSCs может быть заполнена в 2 - 3 раза выше плотность в шаге начало дифференцировки osteoblastic для облегчения остеобластов дифференциации. LFS MSC-производные остеобластов можно отделить и собираются на день 6-10 дифференциация время точкой для в vivo tumorigenesis пробирного в день 6 - 7 дифференциации времени точки. LFS ксенотрансплантата опухоли модель демонстрирует, что LFS MSC-производные остеобластов пилки в vivo онкогенной способность, которая обеспечивает альтернативную платформу для изучения LFS-связанные остеосаркома.
Таким образом модель на основе iPSC остеосаркома LFS обеспечивает ценный обращение остеосаркома исследований. В дополнение к остеосаркома LFS пациенты страдают от различных других видов рака, таких как саркома мягких тканей, рак молочной железы и опухоли головного мозга. Таким образом, LFS модели на основе iPSC заболеванием может быть расширена для моделирования других LFS связанных злокачественных опухолей. Сочетая LFS пациента производные iPSCs и инженерии мутант p53 (mutp53) ЭСК18, LFS болезни модель также имеет большое значение при определении патогенезом злокачественных связанные mutp53 и развивающихся роман терапевтические стратегии, ориентированные онкогенных p5316.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторы не имеют ничего сообщать.
Acknowledgments
Р. з. поддерживается UTHealth инновации для Pre-Doctoral рака профилактики исследований подготовки программы стипендий (профилактика рака и исследовательский институт штата Техас Грант RP160015). Ярно Трулли поддерживается программой КЭ Лин первый аффилированным больница из Sun Yat-sen University. D.-ф.л. CPRIT ученый в области исследований рака и поддерживается NIH путь к независимости премии R00 CA181496 и RR160019 CPRIT премии.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Plastic ware | |||
| 100 mm Dish | Corning | 430107 | |
| 60 mm Dish | Corning | 430166 | |
| 6-well Plate | Falcon | 353046 | |
| 12-well Plate | Falcon | 353043 | |
| 48-well Plate | Falcon | 353078 | |
| 1 mL Pipet Tip | USA Scientific | 1111-2721 | |
| 200 µL Pipet Tip | USA Scientific | 1111-0706 | |
| 10 µL Pipet Tip | USA Scientific | 1111-3700 | |
| 5 mL Serological Pipette | SARSTEDT | 86.1253.001 | |
| 10 mL Serological Pipette | SARSTEDT | 86.1254.001 | |
| 25 mL Serological Pipette | SARSTEDT | 86.1685.001 | |
| 50 mL Tube, PP | SARSTEDT | 62.547.100 | |
| 15 mL Tube, PP | SARSTEDT | 62.554.100 | |
| Culture materials and Reagents | |||
| CytoTune- iPS 2.0 Sendai Reprogramming Kit | Invitrogen | A16517 | Commercial Sendai virus reprogramming kit |
| Corning hESC-Qualified Matrix | Corning | 354277 | Basement membrane matrix |
| CF1 MEFs, irradiated | ThermoFisher | A34180 | |
| DMEM | Sigma-Aldrich | D5671 | |
| DMEM/F12 | Corning | 10-090-CV | |
| αMEM | Corning | 10-022-CV | |
| StemMACS iPS-Brew XF | Miltenyi Biotec | 130-104-368 | Commercial iPSC medium |
| KnockOut DMEM/F-12 | ThermoFisher | 12660012 | |
| FBS Opti-Gold | GenDEPOT | F0900-050 | |
| KnockOut Serum Replacement | ThermoFisher | A3181502 | |
| Penicillin-Streptomycin | Sigma-Aldrich | P4333 | |
| MEM Nonessential Amino Acids | Corning | 25-025-CI | |
| L-Glutamine Solution | Sigma-Aldrich | G7513 | |
| 2-Mercaptoethanol | Sigma-Aldrich | M3148 | |
| Human FGF-basic (bFGF) | PEPROTECH | 100-18B | |
| Recombinant Human PDGF-AB | PEPROTECH | 100-00AB | |
| β-Glycerophosphate | Sigma-Aldrich | G9422 | |
| Dexamethasone | Sigma-Aldrich | A4902 | |
| Ascorbic Acid | Sigma-Aldrich | A5960 | |
| Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline, 1x (DPBS) | Corning | 21-031-CV | |
| StemMACS Passaging Solution XF | Miltenyi Biotec | 130-104-688 | Commercial passaging solution |
| Accutatse Cell Detachment Solution | Corning | 25-058-CI | Cell detachment solution |
| Thiazovivin (ROCK Inhibitor) | Calbiochem | 420220 | |
| 0.25% Trypsin-EDTA Solution | Sigma-Aldrich | T4049 | |
| Collagenase, Type II | ThermoFisher | 17101015 | |
| Human NANOG Antibody | R&D System | AF1997 | |
| OCT4 Antibody (H-134) | Santa Cruz | sc-9081 | |
| Human/Mouse SSEA-4 PE-conjugated Antibody | R&D System | FAB1435P | |
| Alexa Fluor 555 Mouse Anti-Human TRA-1-81 Antigen | DB Biosciences | 560123 | |
| Alexa Fluor 488 Donkey Anti-Goat IgG (H+L) | Jackson ImmunoResearch | 705-545-003 | |
| Alexa Fluor 488 Goat Anti-Rabbit IgG (H+L) | Jackson ImmunoResearch | 111-545-144 | |
| PE Mouse Anti-Human CD105 | eBioscience | 12-1057-42 | |
| FITC Mouse Anti-Human CD44 | DB Biosciences | 555478 | |
| PE Mouse Anti-Human CD73 | DB Biosciences | 550257 | |
| PE Mouse Anti-Human CD166 | DB Biosciences | 560903 | |
| FITC Mouse Anti-Human CD24 | DB Biosciences | 555427 | |
| Donkey Serum | Jackson ImmunoResearch | 017-000-121 | |
| Goat Serum | Jackson ImmunoResearch | 005-000-121 | |
| Alkaline Phosphatase Staining Kit II | Stemgent | 00-0055 | |
| Alizarin Red S | Sigma-Aldrich | A5533 | |
| TRIzol Reagent | ThermoFisher | 15596018 | |
| Chloroform | ThermoFisher | C298-500 | |
| 2-Propanol | ThermoFisher | A416-4 | |
| Ethanol, Absolute, Molecular Biology Grade | ThermoFisher | BP28184 | |
| DNase I, RNase-free (1 U/µL) | ThermoFisher | EN0521 | |
| iScript cDNA Synthesis Kit | BioRad | 1708891BUN | |
| iQ SYBR Green Supermix | BioRad | 1708884 | |
| Matrigel Matrix High Concentration (HC), Phenol-Red Free | Corning | 354262 | |
| 1 mL Slip Tip Syringe, 26 Gauge x 5/8 Inch | DB Biosciences | 309597 |
References
- Takahashi, K., Yamanaka, S. Induction of pluripotent stem cells from mouse embryonic and adult fibroblast cultures by defined factors. Cell. 126 (4), 663-676 (2006).
- Takahashi, K., et al. Induction of pluripotent stem cells from adult human fibroblasts by defined factors. Cell. 131 (5), 861-872 (2007).
- Yu, J., et al. Induced pluripotent stem cell lines derived from human somatic cells. Science. 318 (5858), 1917-1920 (2007).
- Yagi, T., et al. Modeling familial Alzheimer's disease with induced pluripotent stem cells. Hum Mol Genet. 20 (23), 4530-4539 (2011).
- Dimos, J. T., et al. Induced pluripotent stem cells generated from patients with ALS can be differentiated into motor neurons. Science. 321 (5893), 1218-1221 (2008).
- Moretti, A., et al. Patient-specific induced pluripotent stem-cell models for long-QT syndrome. N Engl J Med. 363 (15), 1397-1409 (2010).
- Itzhaki, I., et al. Modelling the long QT syndrome with induced pluripotent stem cells. Nature. 471 (7337), 225-229 (2011).
- Carvajal-Vergara, X., et al. Patient-specific induced pluripotent stem-cell-derived models of LEOPARD syndrome. Nature. 465 (7299), 808-812 (2010).
- Lee, D. F., et al. Modeling familial cancer with induced pluripotent stem cells. Cell. 161 (2), 240-254 (2015).
- Mulero-Navarro, S., et al. Myeloid Dysregulation in a Human Induced Pluripotent Stem Cell Model of PTPN11-Associated Juvenile Myelomonocytic Leukemia. Cell Rep. 13 (3), 504-515 (2015).
- Kotini, A. G., et al. Functional analysis of a chromosomal deletion associated with myelodysplastic syndromes using isogenic human induced pluripotent stem cells. Nat Biotechnol. 33 (6), 646-655 (2015).
- Kotini, A. G., et al. Stage-Specific Human Induced Pluripotent Stem Cells Map the Progression of Myeloid Transformation to Transplantable Leukemia. Cell Stem Cell. 20 (3), 315-328 (2017).
- Crespo, M., et al. Colonic organoids derived from human induced pluripotent stem cells for modeling colorectal cancer and drug testing. Nat Med. 23 (7), 878-884 (2017).
- Gingold, J., Zhou, R., Lemischka, I. R., Lee, D. F. Modeling Cancer with Pluripotent Stem Cells. Trends Cancer. 2 (9), 485-494 (2016).
- Lin, Y. H., et al. Osteosarcoma: Molecular Pathogenesis and iPSC Modeling. Trends Mol Med. 23 (8), 737-755 (2017).
- Zhou, R., et al. Li-Fraumeni Syndrome Disease Model: A Platform to Develop Precision Cancer Therapy Targeting Oncogenic p53. Trends Pharmacol Sci. 38 (10), 908-927 (2017).
- Lian, Q., et al. Derivation of clinically compliant MSCs from CD105+, CD24- differentiated human ESCs. Stem Cells. 25 (2), 425-436 (2007).
- Zhou, R., et al. A homozygous p53 R282W mutant human embryonic stem cell line generated using TALEN-mediated precise gene editing. Stem Cell Res. 27, 131-135 (2018).
