Summary
Här presenterar vi ett protokoll för generering av inducerade pluripotenta stamceller (iPSCs) från Li-Fraumeni syndrom (AKU) patientens härledda fibroblaster, differentiering av iPSCs via mesenkymala stamceller (MSC) till osteoblaster, och modellering i vivo tumourigenesis med LFS patientderiverade osteoblaster.
Abstract
Li-Fraumeni syndrom (AKU) är en autosomalt dominerande ärftlig cancer sjukdom. Patienter med AKU är predisponerade för en olika typ av tumörer, inklusive osteosarkom--en av de vanligaste primära icke-hematologiska maligniteterna i barndomen och tonåren. LFS ger därför en idealmodell för att studera detta malignitet. Dra nytta av iPSC metoder, LFS-associerade osteosarkom kan modelleras framgångsrikt genom att differentiera LFS patienten iPSCs till mesenkymala stamceller (MSC), och sedan till osteoblaster--cellerna av ursprung för osteosarkom. Dessa LFS osteoblaster recapitulate onkogena egenskaperna för osteosarkom, att tillhandahålla en attraktiv modellsystem för avgränsar patogenesen av osteosarkom. Detta manuskript demonstrerar ett protokoll för generering av iPSCs från LFS patienternas fibroblaster, differentiering av iPSCs till MSCs, differentiering av MSCs att osteoblaster och i vivo uppkomst med LFS osteoblaster. Denna iPSC sjukdom modell kan förlängas för att identifiera potentiella biomarkörer eller terapeutiska mål för LFS-associerade osteosarkom.
Introduction
Mellan 2006 och 2007 ledde flera genombrott fynd från laboratorierna i Drs. Shinya Yamanaka och James A. Thomson till utvecklingen av inducerade pluripotenta stamceller (iPSCs)1,2,3. Genom en omprogrammering kroppsceller med definierade transkriptionell faktorer att formuläret iPSCs, forskare kunde generera celler med nyckelegenskaper nämligen, pluripotency och självförnyelse, som man tidigare trott att bara finnas i mänskliga embryonala stamceller (hESCs). iPSCs kan genereras från någon individ eller patienten och behövde inte härledas från embryon, kraftigt utöka repertoaren av tillgängliga sjukdomar och bakgrunder för studien. Sedan dess har patientderiverade iPSCs används för att sammanfatta fenotypen av olika mänskliga sjukdomar, från Alzheimers sjukdom4 och amyotrofisk lateralskleros5 till lång QT syndrom6,7, 8.
Dessa framsteg i iPSC forskning har också öppnat nya vägar för cancerforskning. Flera grupper har nyligen använt patienten iPSCs modell cancer utveckling under en mottagliga genetiska bakgrunden9,10,11, med framgångsrik tillämpning visat hittills i osteosarkom9, leukemi10,11,12, och kolorektal cancer13. Även om iPSC-derived cancer modeller är fortfarande i sin linda, har de visat stor potential i phenocopying sjukdom-associerade maligniteter, belysa patologiska mekanismer, och identifiera terapeutiska föreningar14.
Li-Fraumeni syndrom (AKU) är en autosomalt dominerande ärftlig cancer sjukdom orsakas av TP53 könsceller mutation15. Patienter med AKU är predisponerade för en olika typ av maligniteter inklusive osteosarkom, att göra LFS iPSCs och deras härledda celler särskilt väl lämpad för att studera detta malignitet16. En iPSC-baserade osteosarkom modell fastställdes först år 2015 med LFS patientderiverade iPSCs9 därefter differentieras efter mesenkymala stamceller (MSC) och sedan till osteoblaster, de med ursprung celler av osteosarkom. Dessa LFS osteoblaster recapitulate osteosarkom-associerade osteogent differentiering defekter och onkogena egenskaper, visar modellen potential som en ”Ben tumör i en maträtt” plattform. Intressant, genome-wide transkriptom analys avslöja aspekter av en osteosarkom gen signatur i LFS osteoblaster och som kännetecknar denna LFS gen uttryck profil är korrelerade med dålig prognos i osteosarkom9, som anger den LFS iPSCs sjukdomsmodeller potential att avslöja funktioner klinisk relevans.
Detta manuskript ger en detaljerad beskrivning av hur du använder LFS patientderiverade iPSCs till modell osteosarkom. Det Detaljer generering av LFS iPSCs, differentiering av iPSCs till MSCs och sedan till osteoblaster och användning av en i vivo xenograft modell med LFS osteoblaster. LFS sjukdom modellen består av flera fördelar, bland annat förmågan att generera obegränsad celler i alla skeden av osteosarkom utveckling för mekanistiska studier, biomarkör identifiering och drug screening9,14, 16.
Sammanfattningsvis erbjuder LFS iPSC-baserade osteosarkom modellen ett attraktivt kompletterande system för att främja osteosarkom forskning. Denna plattform ger också ett proof-of-concept för cancer modellering använder patientderiverade iPSCs. Denna strategi som beskrivs nedan kan lätt utvidgas till modell maligniteter är associerad med andra genetiska sjukdomar med anlag för cancer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
The University of Texas Health Science Center på Houston (UTHealth) djur välfärd kommittén godkände detta arbete. Experimenten utförs i strikt överensstämmelse med de normer som fastställts av UTHealth Center för försöksdjursmedicin & Care (CLAMC) som är ackrediterat av American Association för Laboratory Animal Care (AAALAC International). De mänskliga försökspersonerna i denna studie omfattas Scenario en (”No mänskliga försökspersoner forskning”) som definieras av NIH SF424 dokumentationen. Det behöver därför inte något godkännande av UTHealth mänskliga forskningsetisk kommitté.
1. generering av LFS iPSCs (figur 1A)
- Dag -2 tallrik 2 x 104 LFS patienternas fibroblaster i en brunn 6-well platta och odla cellerna med fibroblast medium (tabell 1) vid 37 ° C i en fuktad 5% CO2 inkubator. Kontrollera att fibroblaster når 50-60% sammanflödet på dagen för transduction (dag 0).
- Utföra Sendai virus transduktion dag 0. Gör detta genom att ersätta använt medlet med pre värmde fibroblast medium. Tina den kommersiella Sendai virus omprogrammering kit (se Tabell för material) på is. Infektera LFS fibroblaster med blandade Sendai virus enligt tillverkarens anvisningar.
- Underhåll av transduced celler i fibroblast medium (dag 1-6):
- Dag 1, 24 h efter transduktion, ta bort fibroblast mediet som innehåller återstående Sendai virus och ersätta det med 2 mL färsk fibroblast medium. Kultur transduced fibroblaster vid 37 ° C i en fuktad 5% CO2 inkubator.
- Ändra på medellång med fibroblast medium varannan dag från dag 2-6.
- Underhåll av transduced celler i mataren kultur skick (dag 7-28):
- Förbereda bestrålade CF1 mus embryonala fibroblast (MEF) kultur rätter på dag 6. För att göra denna päls aspirera sex 100 mm vävnadsodling rätter genom att tillsätta 5 mL 0,1% gelatin i varje platta i rumstemperatur i 30 min. 0,1% gelatin efter beläggning.
- Ta bort MEFs från flytande kväve behållare. Tina MEFs använder kommersiellt tillgängliga upptining systemet följa tillverkarens instruktioner. Platta celler med gelatin-belagda plattorna med MEF/MSC odlingsmedium (tabell 1) vid en sådd täthet av runt 6,7 x 105 celler per 100 mm vävnadsodling maträtt.
- Inokulera transduced cellerna på MEF tallrikar (dag 7): Trypsinize transduced celler med 1 mL 0,25% Trypsin-EDTA per 100 mm maträtt för 2-4 min i rumstemperatur. Neutralisera trypsin med 9 mL fibroblast medium. Överföring till koniska rör och centrifugera celler vid 230 x g vid 37 ° C i 4 min. platta transduced fibroblaster på de sex MEF rätter tillagade på dag 6 och kultur dem i 8 mL fibroblast medium per maträtt.
Obs: Konfluens av MEFs är omkring 20% före sådd sensorik cell på MEF tallrikar. - Dag 8, kassera fibroblast medium och ersätta med hESC medium (tabell 1).
- Vänta för uppkomsten av iPS kloner från dag 9-28 (figur 1C). Ändra det förbrukade hESC mediet varannan dag och övervaka uppkomsten av iPS kloner under mikroskopet. Vänta på iPSCs kloner tillräckligt stor för att observeras med blotta ögat och sedan fortsätta att expandera iPS kloner i feeder-fri kultur skick.
- Expansion av framkom iPS kloner i feeder-fri kultur skick (dag 29-79 ~ 99):
- För att förbereda matrix-belagd plattan, coat en 48-well platta med 120 µL av basalmembranet beläggning modellösning (tabell 1) per brunn. Kontrollera beläggning basalmembranet modellösning täcker väl och rockar kultur maträtt ytan. Lämna den i rumstemperatur i 1 h. Aspirera beläggning lösningen omedelbart före användning och tillsätt 250 µL per brunn med 2 µM ROCK hämmare Thiazovivin medium på hESC.
- På dag 28, sug ut det förbrukade hESC mediet och tvätta iPS kloner med 1 x DPBS. Plocka upp synliga iPS kloner med en 1 mL pipettspetsen och överföring i en väl behandlade 48-well platta (steg 1.4.1). Utsäde en koloni per brunn av 48-väl plattan.
- Centrifugera plattan vid 230 x g i 4 min att underlätta cell fastsättning. Kultur iPS kloner vid 37 ° C i en fuktad 5% CO2 inkubator.
- Följande dag (dag 29), ta bort det förbrukade hESC mediet och tillsätt 250 µL av kommersiellt tillgängliga iPSC medium i varje brunn.
- Upprätthålla iPS kloner vid 37 ° C i en fuktad 5% CO2 inkubator och ändra iPSC medium varannan dag.
- När iPS kloner nå 85% sammanflödet, subkultur celler på en 1:10 förhållandet i kulturområde. Tillsätt 60 µL av den kommersiella passaging lösningen att lossa cellerna och inkubera vid 37 ° C i 3 min.
- Kärna ur hälften av den fristående iPSCs på en basalmembranet matrix-belagd 12-well platta i 1 mL hESC medium med 2 µM ROCK hämmare Thiazovivin. Kultur iPS kloner i en 12-well platta med 1 mL av kommersiellt tillgängliga iPSC medium per brunn och subkultur iPSCs på en 1:10 baserat på tills de når passage 10.
Obs: iPSCs är sub odlade varje 5-7 dagar på en 1:10 baserat. Det tar upp till 10 veckor för iPS kloner att nå passage 10. iPSC karakteriseringar inklusive cellmorfologi, alkaliskt fosfatas (AP) aktivitet och uttryck för pluripotens faktorer och hESC markörer, kan undersökas efter bekräftar Sendai viruset i iPSCs (vanligtvis visat efter runt 10 passager) (figur 1B-E). Information om antikropp och primer för iPSC karakterisering ingår i tabell 2 och 4.
2. differentiering av LFS iPSCs att mesenkymala stamceller (MSC) (figur 2A)
- Kultur iPSC kloner på MEF tallrikar i minst 2 veckor (dag ~ -14-0): förbereda MEF rätter (100 mm vävnadsodling rätter) som tidigare beskrivits (1.3.1 - 1.3.2). Upprätthålla iPSCs i hESC medium och ändra medium varannan dag. När iPSCs nå 90% confluence, subkultur iPSCs av 1:10 utspädning.
- Borttagning av MEFs från iPSCs (dag 0):
- Efter att upprätthålla iPSCs på MEFs för 2 veckor, kultur iPSCs i 100 mm vävnadsodling rätter tills celler når 80-90% sammanflödet. Ta bort det förbrukade hESC mediet och tvätta iPSCs med 5 mL av 1 x DPBS. Tillsätt 1 mL av cell avlossning lösningen att lossa cellerna och odla i rumstemperatur i 3 min.
- Tillsätt 9 mL odlingsmedium MEF/MSC på plattan att neutralisera aktiviteten cell avlossning lösning och överföra fristående cellerna till en ny 100 mm vävnadsodling maträtt utan någon beläggning.
- Inkubera cellerna i rumstemperatur i 30 min till tillåta MEFs att fästa plattan.
- Omsorgsfullt samla supernatanten som innehåller okopplade iPSCs och centrifugera vid 230 x g vid 4 ° C under 4 minuter.
Obs: Slarvigt rodnad botten plattan leder till avlossning av MEFs.
- Differentiering av iPSCs mot MSCs (dag 0 - 28):
- Coat tre brunnar 6-well platta med 1 mL 0,1% gelatin per brunn i rumstemperatur i 30 min.
- Ta bort supernatanten av de insamlade iPSCs från 2.2.4.
- Återsuspendera iPSCs i 6 mL MSC differentiering medium (tabell 1) och utsäde celler i de tre belagda brunnarna med 2 mL per brunn (dag 0).
- Ändra det MSC differentiering mediet varannan dag för att ta bort lös eller döda celler (dag 1 - 28).
- Mognaden av iPSC-derived MSCs (dag 28-45):
- Ta bort det förbrukade MSC differentiering mediet och tvätta cellerna med 1 mL av 1 x DPBS.
- Trypsinize MSCs med 0,5 mL av 0,25% Trypsin-EDTA per brunn i rumstemperatur i 3 min.
- Neutralisera trypsin av 1,5 mL odlingssubstrat MEF/MSC och samla MSCs från tre brunnar i en 15 mL koniska rör. Centrifugera vid 230 x g vid 4 ° C under 4 minuter.
- Avlägsna supernatanten och återsuspendera MSCs i 3 mL MEF/MSC odlingsmedium och plattan på en 60 mm 0,1% gelatin-belagd plåt (dag 28).
- Kultur MSCs i MEF/MSC odlingsmedium och ändra medium varannan dag. När cellerna når 100% confluence, subkultur MSCs i förhållandet 1:3 med 0,25% Trypsin-EDTA.
Obs: MSCs visas en fibroblast-liknande morfologi (figur 2B). När MSCs växer i en hög densitet, långsträckt MSCs kan det bildas en virvel-liknande mönster (figur 2B). - Utföra Immunofluorescerande färgningen för att utvärdera iPSC-derived MSCs genom att undersöka ytmarkörer MSC CD44, CD73, CD105 och CD166 (figur 2 c).
Obs: Utspädning av antikroppar visas i tabell 2. Immunofluorescerande färgning av levande celler utförs enligt tillverkarens anvisningar. - Efter bekräftelse, expandera MSCs i förhållandet 1:3 i 100 mm vävnadsodling rätter. Frysa ner injektionsflaskor (3 flaskor per 100 mm vävnadsodling maträtt) använder frysning mediet som innehåller 10% DMSO och 90% FBS.
Obs: För att berika MSC befolkningen, MSCs kan sorteras med hjälp av CD105+, CD24-kriterier av flöde flödescytometri9,17. iPSC-derived MSCs differentierade metoden PDGF-AB-baserade vanligen kan bibehållas för 2-3 månader i kultur utan förlust av MSC identitet9. Frysas MSCs från en tidig passage nummer efter bekräftar MSC egenskaper.
3. differentiering av LFS MSCs att osteoblaster (figur 3A)
- Beredning av MSCs för osteogent differentiering (dag -1)
- För att säkerställa en tillräcklig mängd celler för att slutföra protokollet osteogent differentiering, börja med MSCs odlade i 100 mm vävnadsodling rätter till 95% sammanflödet. Ta bort det förbrukade odlingsmediet och tvätta MSCs med 5 mL av 1 x DPBS.
- Trypsinize MSCs med 1 mL av 0,25% trypsin-EDTA per 100 mm maträtt i rumstemperatur i 3 min. För att säkerställa cellerna inte är över trypsinized, stoppa trypsinization när 50% av cell avskildheten observeras under mikroskopet.
- Neutralisera trypsin 9 ml av MEF/MSC odlingsmedium och samla MSCs från 3 brunnar i en 15 mL koniska rör. Centrifugera vid 230 x g vid 4 ° C under 4 minuter.
- Aspirera supernatanten och återsuspendera MSCs i 5 mL MSC medium räkna antalet celler av en hemocytometer.
- Plattan rätt antal MSCs på en kultur-tallrik.
Obs: Detaljerna i cell nummer 12-well plate, 6 väl-plattan och 100 mm vävnadsodling rätter sammanfattas i tabell 3.
- Induktion av osteogent differentiering av osteoblast differentiering medium (ODM) (tabell 1), (dag 0 - 24):
- Aspirera MEF/MSC odlingsmedium och ersätta med korrekta volymen av ODM (1 mL, 2 mL och 8 mL för varje brunn av 12-well platta, varje brunn 6-väl plattan och 100 mm vävnadsodling maträtt, respektive) att skilja MSCs att osteoblaster (dag 0).
- Aspirera förbrukade ODM och ersätta med korrekta volymen av ODM varannan dag under processen osteogent differentiering.
- Utföra den alkaliskt fosfatas (AP) och Alizarin Red S (ARS) färgning för att upptäcka ben-associerade alkaliskt fosfatas produceras av preosteoblasts och mineral nedfall produceras av mogen osteoblaster, respektive, dag 3, 6, 9, 12, 15, 18, 21 och 24 ( Figur 3B).
Obs: AP färgning och ARS färgning utförs med hjälp av kommersiellt tillgängliga kit följande tillverkare protokoll. - Undersöka uttrycksnivåerna för preosteoblast och mogen osteoblast markörer (ALPL och COL1A1 för preosteoblasts; PTH1R och BGLAP för mogen osteoblaster) av qRT-PCR (figur 3 c).
Obs: Positiva AP färgning förväntas efter dag 9 osteogent differentiering och positiva ARS färgning kan förväntas efter dag 21 i osteogent differentiering. De MSCs växer i MEF/MSC odlingsmedium kan serveras som en negativ kontroll av AP färgning och ARS färgning.
4. Xenograft-modell för att studera In Vivo uppkomst av LFS MSC-derived osteoblaster (figur 4A)
- Differentiering av LFS MSCs att osteoblaster:
- Seed 3-4,5 x 105 MSCs i 100 mm vävnadsodling maträtt. Förbereda fem rätter till en subkutan injektion.
- Kultur MSCs i ODM att skilja MSCs att osteoblaster som beskrivs i 3.2 fram till dag 14.
- Beredning av differentierade osteoblaster för subkutan injektion:
- För att bereda osteoblast avlossning lösning (tabell 1), lös 1 g typ II kollagenas i 1000 mL αMEM medium att göra kollagenas II lösning (1 mg/mL). Hålla kollagenas II lösningen vid-20 ° C. Blanda 0,25% Trypsin-EDTA och kollagenas II lösning i förhållandet 1:1 att göra osteoblaster avlossning lösning.
- Ta bort den förbrukade ODM och tvätta differentierade osteoblaster med 5 mL av 1 x DPBS per 100 mm maträtt.
- Tillsätt 1,5 mL osteoblast avlossning lösning per 100 mm maträtt och inkubera rätter vid 37 ° C i 30 min. granska och säkerställa osteoblast avskildheten av mikroskopi.
- Neutralisera osteoblaster avlossning lösningen av ODM och samla de fristående osteoblaster i en 50 mL konisk tub. Centrifugera vid 230 x g vid 4 ° C i 5 min.
- Avlägsna supernatanten och återsuspendera cellerna i 25 mL ODM medium. Passera cellerna genom en 70 µm cell SIL att avlägsna aggregerade celler. Räkna den cell nummer med hjälp av en hemocytometer.
- Förbereda 1 x 107 osteoblaster per subkutan injektion och centrifugera celler vid 230 x g vid 4 ° C för 4 min.
- Återsuspendera de 1 x 107 osteoblaster i 50 µL iskall 1 x DPBS. Blanda differentierade osteoblaster med 50 µL av fenol-röd Gratis basalmembranet matris (osteoblaster fjädring och basalmembranet matrix var blandade i förhållandet 1:1) och underhålla osteoblaster på is före injektion.
-
In vivo xenograft tumör modell av LFS MSC-derived osteoblaster:
- Söva 8-vecka-gammal immunsupprimerade NU/NU honmöss i en kammare som levererar 5% (v/v) inandning isofluran i 1 L/min av syre (tillhandahålls av CLAMC). Efter djuret blir recumbent, växla bedövningsmedel leveranssystemet till näsan konen, leverera 2% (v/v) inandning isofluran i 200mL/min av syre (tillhandahålls av CLAMC). Övervaka djup anestesi genom att kontrollera den hornhinnan och pedal reflexer att göra mössen är tillräckligt sövd och inte lider av obehag under förfarandet.
- Desinficera området att injiceras med alternerande kompresser klorhexidin och 70% isopropanol. Använd 26 G nål för att utföra subkutan injektion av basalmembranet matrix-blandade LFS osteoblaster i ena bakben av 8 veckor gamla immunsupprimerade NU/NU möss (figur 4A).
- Övervaka möss genom att utföra weekly palpation på injektionsställen för tillväxt av subkutan nodulär densiteter. Tumörbildning kan observeras runt 6-10 veckor efter injektion (figur 4B).
- Euthanize möss av koldioxid kvävning metod följt av cervikal dislokation. Dissekera utvecklade tumörer. Fastställa tumör betyget och differentiering index, preosteoblasts och mogen osteoblaster genom olika färgning metoder (t.ex. Hematoxylin och Eosin (H & E) färgning, Picro Sirius röd färgning och von Kossa färgning respektive).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Detta protokoll presenterar de förfaranden som bland annat LFS iPSC generation MSC differentiering, osteoblast differentiering och i vivo tumourigenesis assay med LFS MSC-derived osteoblaster.
Systemet för generering av LFS iPSCs från fibroblaster med hjälp av ett kommersiellt tillgängliga Sendai virus omprogrammering kit visas i figur 1A. Sendai virus-baserat leverans av Yamanaka fyra faktorer är en icke-integrering omplanering metod. Stabil LFS iPSC kloner bör därför gratis Sendai virusgenom och förlust av exogena OCT4, SOX2, KLF4 och c-MYC transgener, som kan undersökas med RT-PCR med specifika primers (figur 1B). Som det föreslås i tillverkarens instruktioner, beror generation av Sendai virusfria iPSCs på både kultur och passage villkor. De villkor som beskrivs kultur i detta protokoll, kan Sendai viruset i iPSCs vanligtvis upptäckas efter 10 passager (figur 1B). De etablerade LFS iPSC klonerna bör uppvisar typiska hESC morfologi och visar den positiva AP aktiviteten (figur 1 c). LFS iPSCs mycket express pluripotency faktor mRNA (NANOG, OCT4, SOX2, DPPA4och REX1), jämförbar med hESC H1 linje och mycket högre än föräldrarnas fibroblaster (figur 1 d). Uttryck för pluripotens faktorer (NANOG, OCT4) och hESC markörer (SSEA4 och TRA-1-81) kan också prövas av Immunofluorescerande färgning (figur 1E).
iPSCs bibehålls på MEFs i minst 14 dagar innan MSC differentiering (figur 2A). Även om en hel del celldöd hända under MSC differentiering, massor av differentierade celler är synliga på cell kultur plattan och fibroblast-liknande MSCs vid kanten av cell massorna kan observeras vid dag 28. (Figur 2B). Efter sub odlingsskålar differentierade celler i MEF/MSC odlingsmedium, differentierade MSCs förökar sig snabbt och Visa fibroblast-liknande morfologi runt dag 35, och sedan gradvis representerar en avlång form och bildar en virvel-liknande mönster på dag 40 (figur 2B ). Differentierade LFS MSCs express MSC markörer, inklusive CD44, CD73, CD105 och CD166 genom immunofluorescens färgning (figur 2 c).
Figur 3A beskriver osteoblastiska differentiering. När MSCs utsätts för osteogent differentiering signaler, börjar differentierade cellerna Visa positiva alkaliskt fosfatasaktiviteten på dag 9 (figur 3B). ARS färgning kan användas för att identifiera mineral nedfall produceras av mogen osteoblaster. Ljusa röda färg färgning istället för brun färg färgning anger det positiva resultatet av ARS färgning, som kan observeras efter dag 21 (figur 3B). De särskiljande osteoblaster Visa ökande uttryck nivå av preosteoblast gener (ALPL och COL1A1) och mogen osteoblast gener (BGLAP och PTH1R) under osteogent differentiering.
In vivo xenograft modell kan fastställas genom att injicera subkutant LFS MSC-derived osteoblaster i NU/NU möss (figur 4A). Tumörer kan observeras 6-10 veckor efter subkutan injektion (figur 4B). LFS osteoblast-derived tumörer visade omogna osteoblast egenskaper, positiv AP verksamhet (AP färgning), positiv kollagen matris nedfall (picrosirius röda färgning) men negativa mineralisering (von Kossa färgning) (figur 4 c) .
Figur 1 : iPSC generation från LFS patienternas fibroblaster. (A) Schematisk bild av iPSC generation. ()B) RT-PCR-detektion av Sendai virusgenom och transgener (KOS (KLF4, OCT4, och SOX2), KLF4, och c-MYC) i de omprogrammerade iPSC klonen efter 10 passager (vänster) och fibroblast efter infektion dag 11 (höger, positiv kontroll). LFS iPSC klon är Sendai virusfria efter 10 passager. GAPDH visas som intern kontroll. (C) Cell morfologi av LFS iPSCs och AP färgning. Skalstapeln, 50 µm (D) qRT-PCR NANOG, SOX2, OCT4, DPPA4och REX1 mRNA uttryck i LFS iPSCs. hESC H1 linje och föräldrarnas LFS fibroblaster används som en positiv och en negativ kontroll, respektive. Det mRNA-uttrycket är normaliserat till GAPDH uttryck. Det relativa mRNA-uttrycket justeras till hESC H1 linje som 1. (E) immunfärgning av hESC pluripotenta transkriptionsfaktorer (NANOG och OCT4) och hESC yta markörer (SSEA4 och TRA-1-81) i LFS iPSCs. Skalstapeln, 50 µm. Utspädning av antikroppar som används i denna studie visas i tabell 2. Primer sekvenser visas i tabell 4. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2 : Differentiering av LFS iPSCs till MSCs. (A) Schematisk bild av PDGF-AB-inducerad MSC differentiering. (B) Cell morfologi av LFS iPSC-derived MSCs på differentiering dag 28, dag 36 och dag 40 +. Skalstapeln, 100 µm. (C) immunofluorescens färgning visar att differentierade LFS MSCs uppvisar CD44+, CD73+, CD105+, CD166+, och CD24– signatur. Skalstapeln, 30 µm. Utspädning av antikroppar som används i denna studie visas i tabell 2. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3 : Differentiering av LFS MSCs att osteoblaster. (A) Schematisk bild av osteogent differentiering. (B) AP och ARS färgning utförs vid olika tidpunkter (dag 3, 6, 9, 12, 15, 18, 21 och 24). Osteoblastiska differentiering av LFS MSC-derived osteoblaster förväntas leda till positiva AP färgning runt dag 9 och positiva ARS färgning på dag 21. (C), qRT-PCR analys visar det ökat uttrycket av före osteoblast (ALPL och COL1A1) och mogen osteoblast (PTH1R och BGLAP) gener under osteogent differentiering. Det mRNA-uttrycket är normaliserat till GAPDH uttryck. Uttrycksnivåerna var i förhållande till celler på differentiering dag 0. Primer sekvenser visas i tabell 4. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 4 : In vivo uppkomst av LFS MSC-derived osteoblaster. (A) Schematisk bild av tumör xenografts i LFS osteoblaster. (B) NU/NU möss bära LFS osteoblast-derived tumörer efter 10 veckor av subkutan injektion. (C), LFS osteoblast-derived tumörer undersöktes av H & E, AP, picrosirius röda, och von Kossa färgning för morfologi, ben-associerade AP, kollagen och mineralfyndigheter, respektive. LFS-derived tumörer utgör omogna osteoblast egenskaper visar positiva AP aktivitet, positiva kollagen och negativa mineral mineralisering. Skalstapeln, 1 mm. vänligen klicka här för att visa en större version av denna siffra.
| Fibroblast Medium (500 mL) | |
| DMEM | 440 mL |
| Värmeinaktiverade FBS | 50 mL |
| Antibiotics(Pen/STREP) (100 x) | 5 mL |
| Onödiga aminosyra (100 x) | 5 mL |
| 2-merkaptoetanol | 3.5 ΜL |
| MEF/MSC odlingsmedium (500 mL) | |
| DMEM | 440 mL |
| Värmeinaktiverade FBS | 50 mL |
| Antibiotics(Pen/STREP) (100 x) | 5 mL |
| L-glutamin (100 x) | 5 mL |
| hESC medium (500 mL) | |
| DMEM/F-12 | 384.5 mL |
| KnockOut Serum ersätter | 100 mL (totalt: 20%) |
| Onödiga aminosyra (100 x) | 5 mL |
| Antibiotika (penna/Strep) (100 x) | 5 mL |
| L-glutamin (100 x) | 5 mL |
| bFGF (10 µg/mL) | 500 ΜL |
| 2-merkaptoetanol | 3.5 ΜL |
| MSC differentiering Medium (500 mL) | |
| KnockOut DMEM/F-12 eller DMEM/F-12 | 445 mL |
| KnockOut Serum ersätter | 50 mL |
| bFGF (10 µg/mL) | 500 µL (10 ng/mL) |
| PDGF-AB (25 µg/mL) | 200 µL (10 ng/mL) |
| Onödiga aminosyra (100 x) | 5 mL |
| 2-merkaptoetanol | 3.5 ΜL |
| Osteoblast differentiering Medium (ODM) (500 mL) | |
| ΑMEM | 395 mL |
| Värmeinaktiverade FBS | 50 mL |
| 10 mM β-glycerofosfat | 50 mL (1,08 g 50 mL αMEM) |
| 0.1 µM dexametason (ljuskänsligt) | 10 µL 5 mM dexametason |
| 200 µM askorbinsyra (ljuskänsligt) | 100 µL av 1 mM askorbinsyra |
| Antibiotika (penna/Strep) (100 x) | 5 mL |
| Matrigel beläggning lösning (50 mL) | |
| Basalmembranet matris | 2 mL |
| DMEM/F-12 (pre kallt 4 ° C) | 48 mL |
| Osteoblast avlossning lösning (50 mL) | |
| 0,25% trypsin-EDTA | 25 mL |
| Kollagenas II lösning (1 mg/mL) | 25 mL |
| Obs: Förbereda osteoblast avlossning lösning färska precis innan användning. Kollagenas II lösning förvaras vid-20 ° C i upp till 6 månader. | |
Tabell 1: Kompositioner av fibroblast medium, MEF/MSC odlingsmedium, hESC medium, MSC differentiering medium, ODM och osteoblast avlossning lösning.
| Antikropp namn | Utspädning |
| NANOG | 1: 500 |
| OCT4 | 1:300 |
| SSEA-4 PE-konjugerad | 1:600 |
| TRI-1-81 | 1:600 |
| Åsnan anti get IgG | 1: 500 |
| Geten anti-kanin IgG | 1: 500 |
| CD105 | 1: 500 |
| CD44 | 1: 500 |
| CD73 | 1: 500 |
| CD166 | 1: 500 |
| CD24 | 1: 500 |
Tabell 2: Antikropp utspädning.
| Kultur plattan | Seedning densitet | Assay |
| 12-well Plate | 0.67x104 celler per brunn | Alkaliskt fosfatas färgning (AP färgning) |
| Alizarin Röd S färgning (ARS färgning) | ||
| 6-well Plate | 2 x 104 celler per brunn | RT-PCR-detektion |
| Preosteoblast markörer: ALPL, COL1A1 | ||
| Mogen osteoblast markörer: PTH1R, BGLAP | ||
| 100 mm maträtt | 3 - 4.5x105 celler per platta | In vivo uppkomst |
Tabell 3: Sådd täthet av MSCs för osteoblastiska differentiering.
| Sendai Virus grundfärger | |
| Mål | Primer uppsättningar |
| SeV | Fram: GGATCACTAGGTGATATCGAGC |
| Omvänd: ACCAGACAAGAGTTTAAGAGATATGTATC | |
| KOS (KLF4/OCT4/SOX2) | Fram: ATGCACCGCTACGACGTGAGCGC |
| Omvänd: ACCTTGACAATCCTGATGTGG | |
| KLF4 | Fram: TTCCTGCATGCCAGAGGAGCCC |
| Omvänd: AATGTATCGAAGGTGCTCAA | |
| c-MYC | Fram: TAACTGACTAGCAGGCTTGTCG |
| Omvänd: TCCACATACAGTCCTGGATGATGATG | |
| RT-PCR Primers | |
| Mål | Primer uppsättningar |
| NANOG | Fram: TTTGTGGGCCTGAAGAAAACT |
| Omvänd: AGGGCTGTCCTGAATAAGCAG | |
| SOX2 | Fram: AGAAGAGGAGAGAGAAAGAAAGGGAGAGA |
| Omvänd: GAGAGAGGCAAACTGGAATCAGGATCAAA | |
| OCT4 | Fram: AACCTGGAGTTTGTGCCAGGGTTT |
| Omvänd: TGAACTTCACCTTCCCTCCAACCA | |
| DPPA4 | Fram: GACCTCCACAGAGAAGTCGAG |
| Omvänd: TGCCTTTTTCTTAGGGCAGAG | |
| REX1 | Fram: GCCTTATGTGATGGCTATGTGT |
| Omvänd: ACCCCTTATGACGCATTCTATGT | |
| ALPL | Fram: GGGACTGGTACTCAGACAACG |
| Omvänd: GTAGGCGATGTCCTTACAGCC | |
| COL1A1 | Fram: GTGCGATGACGTGATCTGTGA |
| Omvänd: CGGTGGTTTCTTGGTCGGT | |
| PTH1R | Fram: AGTGCGAAAAACGGCTCAAG |
| Omvänd: GATGCCTTATCTTTCCTGGGC | |
| BGLAP | Fram: GGCGCTACCTGTATCAATGG |
| Omvänd: GGCGCTACCTGTATCAATGG |
Tabell 4: Primer information.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
För att uppnå högre MSC differentiering effektivitet, är flera aspekter kritiska. En är iPSCs kultur skick innan MSC differentiering. Protokollet presenteras i manuskriptet är baserat på tidigare studier 9,17. iPSCs behöver vara odlade på MEFs i minst 2 veckor. Att upprätthålla iPSCs i bra är villkor på MEFs kritiska för celler att fästa på gelatin-belagd plattan för MSC differentiering. En annan viktig aspekt är tätheten av iPSCs på MEFs innan differentiering. 80 - 90% konfluens av iPSCs föredras att inleda MSC differentiering. Överväxt av iPSCs kommer försämra cellöverlevnad under processen differentiering. Den sista kritiska punkten är sådd tätheten när du startar MSC differentiering. I våra händer främjar hög cell densiteten iPSC fastsättning till gelatin-belagd plattan. En 100 mm maträtt iPSCs kan vara seedad i tre brunnar i plattan 6-brunnar. Inledande av MSC differentiering av direkt omblandning och plätering iPSCs i MSC differentiering medium producerar höga påfrestningar på iPSCs, därför ibland resulterar i svår celldöd efter sådd. Hög täthet av iPSCs ökar andelen framgångsrika MSC differentiering.
Till skillnad från MSC differentiering är osteoblastiska differentiering processen mer okomplicerat. För att få reproducerbara differentiering resultat, säkerställa initierande MSC siffrorna överensstämmer. Resultaten av osteoblastiska differentiering från samma cell linje kan variera från batch till batch, därför ställa in differentiering för olika linjer på samma tid kommer ge fler jämförande resultat bland grupper. Ökningen av MSC nummer förkorta differentiering processen indikeras av positiva AP och ARS färgning vid en tidigare tidpunkt. Kontrollera också förändringen av ODM medium hanteras på ett skonsamt sätt och kraftfull vakuum sug system rekommenderas inte i hur differentiering sent (dag 18 - 24) på grund av den potentiella avlossning av aggregerade osteoblaster under kultur.
De differentierade osteoblaster som används för in-vivo xenograft experiment är osteoblaster den dag 14 differentiering tidpunkt. Osteoblaster senare än dag 14 maj aggregera och vara svårt att skilja på grund av de enorma ansamlingar av kollagen och andra ben matris material produceras av osteoblaster. För att förhindra svårigheten att osteoblast dissociation, LFS MSCs kan vara seedad i 2 - 3 gånger högre densitet i det inledande steget i osteoblastiska differentiering att underlätta osteoblast differentiering. LFS MSC-derived osteoblaster kan skiljas och samlas in på dag 6-10 differentiering tidpunkt för in-vivo tumourigenesis assay på dag 6 - 7 differentiering tidpunkt. LFS xenograft tumör modellen visar LFS MSC-derived osteoblaster recapitulate i vivo tumörframkallande förmåga, vilket ger en alternativ plattform för att studera LFS-associerade osteosarkom.
Sammanfattningsvis ger en LFS iPSC-baserade osteosarkom modell en värdefull tillgång för osteosarkom forskning. Utöver osteosarkom lider LFS patienter av olika andra typer av cancer såsom mjukdelssarkom, bröstcancer och hjärntumör. Därför LFS iPSC-baserade sjukdomsmodeller kan utvidgas att modellera andra LFS relaterade maligniteter. Att kombinera LFS patientderiverade iPSCs och konstruerade muterat p53 (mutp53) hESCs18, LFS sjukdom modell har också stort värde i avgränsar patogenes mutp53 associerade maligniteter och utveckla nya terapeutiska strategier inriktning onkogena p5316.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har något att avslöja.
Acknowledgments
R. Z. stöds av UTHealth Innovation för Cancer Prevention Research Utbildning Program Pre-Doctoral Fellowship (förebyggande av Cancer och Research Institute of Texas bevilja RP160015). J.T. stöds av Ke Lin programet av första anslutna sjukhus av Sun Yat-sen University. D.-F.L. är den CPRIT vetenskapsman inom cancerforskningen och stöds av NIH väg till självständighet Award R00 CA181496 och CPRIT Award RR160019.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Plastic ware | |||
| 100 mm Dish | Corning | 430107 | |
| 60 mm Dish | Corning | 430166 | |
| 6-well Plate | Falcon | 353046 | |
| 12-well Plate | Falcon | 353043 | |
| 48-well Plate | Falcon | 353078 | |
| 1 mL Pipet Tip | USA Scientific | 1111-2721 | |
| 200 µL Pipet Tip | USA Scientific | 1111-0706 | |
| 10 µL Pipet Tip | USA Scientific | 1111-3700 | |
| 5 mL Serological Pipette | SARSTEDT | 86.1253.001 | |
| 10 mL Serological Pipette | SARSTEDT | 86.1254.001 | |
| 25 mL Serological Pipette | SARSTEDT | 86.1685.001 | |
| 50 mL Tube, PP | SARSTEDT | 62.547.100 | |
| 15 mL Tube, PP | SARSTEDT | 62.554.100 | |
| Culture materials and Reagents | |||
| CytoTune- iPS 2.0 Sendai Reprogramming Kit | Invitrogen | A16517 | Commercial Sendai virus reprogramming kit |
| Corning hESC-Qualified Matrix | Corning | 354277 | Basement membrane matrix |
| CF1 MEFs, irradiated | ThermoFisher | A34180 | |
| DMEM | Sigma-Aldrich | D5671 | |
| DMEM/F12 | Corning | 10-090-CV | |
| αMEM | Corning | 10-022-CV | |
| StemMACS iPS-Brew XF | Miltenyi Biotec | 130-104-368 | Commercial iPSC medium |
| KnockOut DMEM/F-12 | ThermoFisher | 12660012 | |
| FBS Opti-Gold | GenDEPOT | F0900-050 | |
| KnockOut Serum Replacement | ThermoFisher | A3181502 | |
| Penicillin-Streptomycin | Sigma-Aldrich | P4333 | |
| MEM Nonessential Amino Acids | Corning | 25-025-CI | |
| L-Glutamine Solution | Sigma-Aldrich | G7513 | |
| 2-Mercaptoethanol | Sigma-Aldrich | M3148 | |
| Human FGF-basic (bFGF) | PEPROTECH | 100-18B | |
| Recombinant Human PDGF-AB | PEPROTECH | 100-00AB | |
| β-Glycerophosphate | Sigma-Aldrich | G9422 | |
| Dexamethasone | Sigma-Aldrich | A4902 | |
| Ascorbic Acid | Sigma-Aldrich | A5960 | |
| Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline, 1x (DPBS) | Corning | 21-031-CV | |
| StemMACS Passaging Solution XF | Miltenyi Biotec | 130-104-688 | Commercial passaging solution |
| Accutatse Cell Detachment Solution | Corning | 25-058-CI | Cell detachment solution |
| Thiazovivin (ROCK Inhibitor) | Calbiochem | 420220 | |
| 0.25% Trypsin-EDTA Solution | Sigma-Aldrich | T4049 | |
| Collagenase, Type II | ThermoFisher | 17101015 | |
| Human NANOG Antibody | R&D System | AF1997 | |
| OCT4 Antibody (H-134) | Santa Cruz | sc-9081 | |
| Human/Mouse SSEA-4 PE-conjugated Antibody | R&D System | FAB1435P | |
| Alexa Fluor 555 Mouse Anti-Human TRA-1-81 Antigen | DB Biosciences | 560123 | |
| Alexa Fluor 488 Donkey Anti-Goat IgG (H+L) | Jackson ImmunoResearch | 705-545-003 | |
| Alexa Fluor 488 Goat Anti-Rabbit IgG (H+L) | Jackson ImmunoResearch | 111-545-144 | |
| PE Mouse Anti-Human CD105 | eBioscience | 12-1057-42 | |
| FITC Mouse Anti-Human CD44 | DB Biosciences | 555478 | |
| PE Mouse Anti-Human CD73 | DB Biosciences | 550257 | |
| PE Mouse Anti-Human CD166 | DB Biosciences | 560903 | |
| FITC Mouse Anti-Human CD24 | DB Biosciences | 555427 | |
| Donkey Serum | Jackson ImmunoResearch | 017-000-121 | |
| Goat Serum | Jackson ImmunoResearch | 005-000-121 | |
| Alkaline Phosphatase Staining Kit II | Stemgent | 00-0055 | |
| Alizarin Red S | Sigma-Aldrich | A5533 | |
| TRIzol Reagent | ThermoFisher | 15596018 | |
| Chloroform | ThermoFisher | C298-500 | |
| 2-Propanol | ThermoFisher | A416-4 | |
| Ethanol, Absolute, Molecular Biology Grade | ThermoFisher | BP28184 | |
| DNase I, RNase-free (1 U/µL) | ThermoFisher | EN0521 | |
| iScript cDNA Synthesis Kit | BioRad | 1708891BUN | |
| iQ SYBR Green Supermix | BioRad | 1708884 | |
| Matrigel Matrix High Concentration (HC), Phenol-Red Free | Corning | 354262 | |
| 1 mL Slip Tip Syringe, 26 Gauge x 5/8 Inch | DB Biosciences | 309597 |
References
- Takahashi, K., Yamanaka, S. Induction of pluripotent stem cells from mouse embryonic and adult fibroblast cultures by defined factors. Cell. 126 (4), 663-676 (2006).
- Takahashi, K., et al. Induction of pluripotent stem cells from adult human fibroblasts by defined factors. Cell. 131 (5), 861-872 (2007).
- Yu, J., et al. Induced pluripotent stem cell lines derived from human somatic cells. Science. 318 (5858), 1917-1920 (2007).
- Yagi, T., et al. Modeling familial Alzheimer's disease with induced pluripotent stem cells. Hum Mol Genet. 20 (23), 4530-4539 (2011).
- Dimos, J. T., et al. Induced pluripotent stem cells generated from patients with ALS can be differentiated into motor neurons. Science. 321 (5893), 1218-1221 (2008).
- Moretti, A., et al. Patient-specific induced pluripotent stem-cell models for long-QT syndrome. N Engl J Med. 363 (15), 1397-1409 (2010).
- Itzhaki, I., et al. Modelling the long QT syndrome with induced pluripotent stem cells. Nature. 471 (7337), 225-229 (2011).
- Carvajal-Vergara, X., et al. Patient-specific induced pluripotent stem-cell-derived models of LEOPARD syndrome. Nature. 465 (7299), 808-812 (2010).
- Lee, D. F., et al. Modeling familial cancer with induced pluripotent stem cells. Cell. 161 (2), 240-254 (2015).
- Mulero-Navarro, S., et al. Myeloid Dysregulation in a Human Induced Pluripotent Stem Cell Model of PTPN11-Associated Juvenile Myelomonocytic Leukemia. Cell Rep. 13 (3), 504-515 (2015).
- Kotini, A. G., et al. Functional analysis of a chromosomal deletion associated with myelodysplastic syndromes using isogenic human induced pluripotent stem cells. Nat Biotechnol. 33 (6), 646-655 (2015).
- Kotini, A. G., et al. Stage-Specific Human Induced Pluripotent Stem Cells Map the Progression of Myeloid Transformation to Transplantable Leukemia. Cell Stem Cell. 20 (3), 315-328 (2017).
- Crespo, M., et al. Colonic organoids derived from human induced pluripotent stem cells for modeling colorectal cancer and drug testing. Nat Med. 23 (7), 878-884 (2017).
- Gingold, J., Zhou, R., Lemischka, I. R., Lee, D. F. Modeling Cancer with Pluripotent Stem Cells. Trends Cancer. 2 (9), 485-494 (2016).
- Lin, Y. H., et al. Osteosarcoma: Molecular Pathogenesis and iPSC Modeling. Trends Mol Med. 23 (8), 737-755 (2017).
- Zhou, R., et al. Li-Fraumeni Syndrome Disease Model: A Platform to Develop Precision Cancer Therapy Targeting Oncogenic p53. Trends Pharmacol Sci. 38 (10), 908-927 (2017).
- Lian, Q., et al. Derivation of clinically compliant MSCs from CD105+, CD24- differentiated human ESCs. Stem Cells. 25 (2), 425-436 (2007).
- Zhou, R., et al. A homozygous p53 R282W mutant human embryonic stem cell line generated using TALEN-mediated precise gene editing. Stem Cell Res. 27, 131-135 (2018).
