Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Cancer Research
Click here for the English version

Cancer Research

מידול אוסטאוסרקומה באמצעות תאי גזע Pluripotent נגזר החולה המושרה תסמונת לי-פראומני, היא תורשתית

Published: June 13, 2018 doi: 10.3791/57664
Automatic Translation
1,2, 1, 1,3, 1, 4, 1, 1,2,5,6
1Department of Integrative Biology and Pharmacology, McGovern Medical School, The University of Texas Health Science Center at Houston, 2Graduate School of Biomedical Sciences, The University of Texas MD Anderson Cancer Center UTHealth, 3Department of Musculoskeletal Oncology, The First Affiliated Hospital of Sun Yat-sen University, 4Women's Health Institute, Cleveland Clinic Foundation, 5Center for Stem Cell and Regenerative Medicine, The Brown Foundation Institute of Molecular Medicine for the Prevention of Human Diseases, The University of Texas Health Science Center at Houston, 6Center for Precision Health, School of Biomedical Informatics and School of Public Health, The University of Texas Health Science Center at Houston

Summary

כאן, אנו מציגים פרוטוקול לדור של pluripotent המושרה בתאי גזע (iPSCs) מ תסמונת לי-פראומני, היא תורשתית (הסימולטור) החולה נגזר fibroblasts, הבידול של iPSCs באמצעות גזע mesenchymal (MSCs) תאי העצם, מידול vivo tumorigenesis באמצעות תאי העצם של החולה-derived הסימולטור.

Abstract

תסמונת לי-פראומני, היא תורשתית (הסימולטור) היא הפרעת סרטן תורשתית אוטוזומלית דומיננטית. חולים עם הסימולטור הן נטייה סוג שונים של גידולים, כולל אוסטאוסרקומה--אחד הראשית בתדירות הגבוהה ביותר-המטולוגיות ממאירות ב הילדות וההתבגרות. לכן, הסימולטור מספק מודל אידיאלי ללמוד זה גידול ממאיר. ניצול של מתודולוגיות iPSC, אוסטאוסרקומה הסימולטור-הקשורים שניתן למדל בהצלחה על ידי הבחנה הסימולטור החולה iPSCs גזע mesenchymal (MSCs), ולאחר מכן תאי העצם, תאי המוצא לכל osteosarcomas. אלו תאי העצם הסימולטור מסכם את הדברים oncogenic מאפייני אוסטאוסרקומה, מתן מערכת מודל אטרקטיבי עבור בהתוויית בפתוגנזה של אוסטאוסרקומה. כתב יד זה מדגים את פרוטוקול לדור של iPSCs של הסימולטור fibroblasts החולה, הבידול של iPSCs כדי MSCs, הבידול של MSCs תאי העצם, ויוו tumorigenesis באמצעות הסימולטור תאי העצם. ניתן להרחיב מודל המחלה זה iPSC לזיהוי סמנים ביולוגיים פוטנציאליים או מטרות טיפוליות הקשורות הסימולטור אוסטאוסרקומה.

Introduction

בין 2006 ו 2007, מספר ממצאים פריצת דרך המעבדות של ד"ר Shinya יאמאנאקה, ג'יימס א. תומסון הוביל את הפיתוח של pluripotent המושרה בתאי גזע (iPSCs)1,2,3. על ידי התכנות תאים סומטיים עם גורמים תעתיק מוגדר שיש טופס iPSCs, החוקרים הצליחו לייצר תאים בעלי מאפיינים מרכזיים כלומר, pluripotency, התחדשות עצמית, אשר נחשב בעבר רק קיימים תאי גזע עובריים (hESCs). iPSCs יכולים להיווצר מכל אדם או חולה, לא היו צריכים להיגזר עוברי, במידה רבה להרחיב את הרפרטואר של מחלות זמין ורקעים לצורך המחקר. מאז, החולה, נגזר iPSCs שימשו כדי לסכם את פנוטיפ של מחלות אנושיות שונות, מחלת אלצהיימר4 ו נוירודגנרטיביות5 זמן QT תסמונת6,7, 8.

ההתפתחויות הללו במחקר iPSC גם נפתחו דרכים חדשות לחקר הסרטן. מספר קבוצות לאחרונה השתמשו iPSCs החולה מודל לפיתוח סרטן תחת הרקע הגנטי רגישים9,10,11, עם יישום מוצלח הפגינו לתאריך אוסטאוסרקומה9, לוקמיה10,11,12, סרטן המעי הגס13. למרות סרטן נגזר iPSC מודלים בחיתוליהם, הדגים פוטנציאל גדול ב phenocopying הקשורים למחלות ממאירות, שחקרתי מנגנונים פתולוגי, וזיהוי תרכובות טיפולית14.

תסמונת לי-פראומני, היא תורשתית (הסימולטור) היא הפרעת אוטוזומלית דומיננטית סרטן תורשתית הנגרמת על ידי מוטציה germline TP53 15. חולים עם הסימולטור נטייה סוג שונים של ממאירות כולל אוסטאוסרקומה, שהופך iPSCs הסימולטור תאי נגזר שלהם במיוחד מתאים היטב ללמוד זה גידול ממאיר16. מודל מבוסס iPSC אוסטאוסרקומה הוקם לראשונה בשנת 2015 באמצעות הסימולטור החולה נגזר iPSCs9 לאחר מכן הבדיל לתוך גזע mesenchymal (MSCs), ואז על תאי העצם, שמקורם תאים של אוסטאוסרקומה. אלו תאי העצם הסימולטור מסכם את הדברים הקשורים אוסטאוסרקומה בידול osteogenic פגמים ומאפיינים oncogenic, הדגמת המודל פוטנציאליים כפלטפורמה "סרטן העצמות בצלחת". מעניין, ניתוחים ברמת הגנום transcriptome להציג היבטים של חתימה ג'ין אוסטאוסרקומה בתוך הסימולטור תאי העצם, זה תכונות של פרופיל ביטוי גנטי זה הסימולטור נמצאים בקורלציה עם פרוגנוזה גרועה אצל אוסטאוסרקומה9, המציין הפוטנציאל של הסימולטור iPSCs המחלה מודלים כדי לחשוף את התכונות של הרלוונטיות הקלינית.

כתב יד זה מספק תיאור מפורט של אופן השימוש הסימולטור החולה נגזר iPSCs כדי אוסטאוסרקומה מודל. זה מפרט את הדור של הסימולטור iPSCs, הבידול של iPSCs MSCs ולאחר מכן על תאי העצם, ושימוש ויוו xenograft מודל באמצעות הסימולטור תאי העצם. המודל המחלה הסימולטור כוללת מספר יתרונות, ובראשם את היכולת לייצר תאים ללא הגבלה בכל שלבי ההתפתחות אוסטאוסרקומה מחקרים מכניסטית, סמן זיהוי של סמים הקרנת9,14, 16.

לסיכום, המודל מבוסס iPSC אוסטאוסרקומה הסימולטור מציע מערכת משלים אטרקטיבי לקידום המחקר אוסטאוסרקומה. פלטפורמה זו מספקת גם הוכחה-של-קונספט דוגמנות סרטן באמצעות החולה נגזר iPSCs. אסטרטגיה זו המתוארת להלן ניתן להרחיב בקלות את מודל ממאירות הקשורות סרטן נטיות גנטיות אחרות.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

עבודה זו אושרה על ידי אוניברסיטת טקסס למדעי הבריאות במרכז יוסטון (UTHealth) חיה ועדת הרווחה. הניסויים מתבצעים בהתאמה קפדנית עם אמות המידה שנקבעו על-ידי המרכז UTHealth עבור רפואה מעבדתית חיה & טיפול (CLAMC) אשר הוסמך על ידי האגודה האמריקנית על מעבדה חיה על עצמך (AAALAC הבינלאומי). הנושאים האנושי במחקר זה נופל תחת תרחיש ("לא אנושית נושאי מחקר") כפי שהוגדרו על ידי התיעוד NIH SF424. לכן, זה לא צריך שום אישור על-ידי ועדת האתיקה של המחקר האנושי UTHealth.

1. דור של הסימולטור iPSCs (איור 1 א')

  1. ביום-2, לוחית רישוי 2 x 104 הסימולטור fibroblasts החולה לבאר אחת של צלחת 6-ובכן, ואת התרבות תאי פיברובלסט בינונית (טבלה 1) ב- 37 מעלות צלזיוס % 5 humidified CO2 מיכלים. ודא כי fibroblasts להגיע למפגש 50-60% ביום של התמרה חושית (יום 0).
  2. לבצע התמרה חושית סנדאי וירוס ביום 0. כדי לעשות זאת, החלף המדיום בילה פיברובלסט מראש ומחוממת בינוני. להפשיר את סנדאי מסחרי וירוס התכנות קיט (ראה טבלה של חומרים) על קרח. להדביק הסימולטור fibroblasts בווירוסים סנדאי מעורבים לפי הוראות היצרן.
  3. תחזוקה של התאים transduced במדיום פיברובלסט (יום 1-6):
    1. יום 1, 24 שעות לאחר התמרה חושית, להסיר את המדיום פיברובלסט המכיל וירוס סנדאי הנותרים ולהחליף אותו עם 2 מ"ל פיברובלסט טרי בינוני. תרבות של fibroblasts transduced-37 מעלות צלזיוס % 5 humidified CO2 מיכלים.
    2. לשנות את המדיום עם המדיום פיברובלסט בכל יום אחר מיום 2-6.
  4. תחזוקה של התאים transduced מצב התרבות מזין (יום 7-28):
    1. להכין פיברובלסט עובריים בעכבר CF1 לקרינה (MEF) מנות תרבות ביום השישי. לעשות את המעיל הזה שש מנות תרביות רקמה 100 מ מ על-ידי הוספת 5 מ של 0.1% ג'לטין כל צלחת בטמפרטורת החדר במשך 30 דקות תשאף הג'לטין 0.1% לאחר ציפוי.
    2. הסר MEFs מיכל חנקן נוזלי. הפשרת MEFs באמצעות מערכת שהביקושים זמינים מסחרית ההוראות של היצרן. צלחת התאים על הלוחות מצופים ג'לטין MEF/MSC תרבות בינונית (טבלה 1)-צפיפות זריעה של סביב 6.7 x 105 תאים לכל מאכל תרביות רקמה 100 מ מ.
    3. לחסן את התאים transduced על צלחות MEF (יום 7): Trypsinize את התאים transduced באמצעות 1 מ"ל של 0.25% טריפסין-EDTA לכל מנה 100 מ מ למשך 2-4 דקות בטמפרטורת החדר. לנטרל טריפסין עם 9 מ של פיברובלסט בינוני. העברת תאים חרוט צינורות ותאים צנטריפוגה ב g x 230 ב 37 מעלות צלזיוס במשך 4 דק צלחת את fibroblasts transduced על המנות MEF שש מוכן ביום השישי, תרבות אותם ב 8 מ של פיברובלסט בינוני לכל תבשיל.
      הערה: confluency של MEFs הוא בסביבות 20% לפני זריעה על צלחות MEF תא transduced.
    4. ביום 8, למחוק את המדיום פיברובלסט ולהחליף hESC בינונית (טבלה 1).
    5. המתן עד הופעתה של שיבוטים iPS ימים 9-28 (איור 1C). מחליף המדיום hESC בילה כל יום אחרים ונטר את הופעתה של שב"ס שיבוטים מתחת למיקרוסקופ. לחכות שיבוטים iPSCs גדול מספיק כדי להיות שנצפו בעין בלתי מזוינת ותפעל להרחבת iPS שיבוטים במצב מזין ללא תרבות.
  5. הרחבה של שב"ס המתגלים שיבוטים במצב מזין ללא תרבות (יום 29-79 ~ 99):
    1. כדי להכין את הצלחת מצופים מטריצה, מעיל צלחת 48-ובכן עם 120 µL של קרום המרתף מטריקס ציפוי הפתרון (טבלה 1) לכל טוב. ודא כי הפתרון קרום המרתף מטריקס ציפוי מכסה הבאר וציפוי על פני התבשיל תרבות. להשאירו בטמפרטורת החדר במשך ה 1 וביופסיה הפתרון ציפוי מיד לפני השימוש ולהוסיף µL 250 hESC בינוני לכל באר עם 2 מיקרומטר רוק מעכבי Thiazovivin.
    2. ב- 28 יום, תשאף המדיום hESC בילה ולשטוף iPS שיבוטים עם 1 x DPBS. לאסוף שיבוטים iPS גלוי עם עצה פיפטה 1 מ"ל, העברת לבאר של צלחת 48-ובכן שטופלו (שלב 1.4.1). זרע מושבה אחת לכל טוב של צלחת 48-. טוב.
    3. Centrifuge את הצלחת ב g x 230 במשך 4 דקות להקל על הקובץ המצורף התא. תרבות שיבוטים iPS ב- 37 מעלות צלזיוס % 5 humidified CO2 מיכלים.
    4. למחרת (יום 29), להסיר את המדיום hESC בילה ולהוסיף 250 µL של המדיום iPSC זמינים מסחרית כל היטב.
    5. לשמור על שיבוטים iPS ב- 37 מעלות צלזיוס % 5 humidified CO2 מגשים, ושינוי המדיום iPSC בכל יום אחר.
    6. כאשר שב ס שיבוטים מגיעים למפגש 85%, תת-תרבות תאים ב- 1:10 יחס לפי אזור התרבות. הוסף µL 60 הפתרון passaging מסחרי לנתק את התאים, דגירה ב 37 מעלות צלזיוס למשך 3 דקות.
    7. זרע מחצית iPSCs מנותק על קרום המרתף מצופים מטריצה 12-ובכן צלחת ב 1 מ"ל hESC בינוני עם 2 מיקרומטר רוק מעכבי Thiazovivin. תרבות iPS שיבוטים בצלחת 12-ובכן עם 1 מ"ל של המדיום iPSC זמינים מסחרית לכל iPSCs טוב, תת-תרבות בעשר: 1 יחס עד שיגיעו מעבר 10.
      הערה: iPSCs הם תת תרבותי כל 5-7 ימים ב- 1:10 יחס. זה לוקח עד 10 שבועות עבור שב"ס שיבוטים להגיע מעבר 10. אפיוני iPSC כולל תא מורפולוגיה, פעילות פוספטאז אלקליין (AP) הביטוי של גורמים pluripotency וסמנים hESC, יכולים להיבדק אחרי ההסרה של וירוס סנדאי iPSCs (בדרך כלל הפגינו אחרי בסביבות 10 מעברים) (איור 1B-E). נוגדן ומידע פריימר עבור אפיון iPSC כלולים בטבלה 2 ו- 4.

2. הבידול של הסימולטור iPSCs על גזע Mesenchymal (MSCs) (איור 2 א)

  1. תרבות iPSC שיבוטים על צלחות MEF לפחות 2 שבועות (היום ~-14-0): להכין את הכלים MEF (100 מ מ תרביות רקמה מנות) תיאר כאמור (1.3.1 - 1.3.2). לשמור על iPSCs בינוני hESC ושנה בינוני בכל יום אחר. בכל פעם iPSCs להגיע למפגש 90%, תת-תרבות iPSCs על ידי 1:10 דילול.
  2. הסרה של MEFs מ- iPSCs (יום 0):
    1. לאחר שמירה על iPSCs על MEFs עבור 2 שבועות, תרבות iPSCs במנות תרביות רקמה 100 מ מ עד תאים להגיע למפגש 80-90%. להסיר את המדיום hESC בילה ולשטוף iPSCs עם 5 מ של 1 x DPBS. להוסיף 1 מ"ל של הפתרון ניתוק התא כדי לנתק את התאים דגירה בטמפרטורת החדר במשך 3 דקות.
    2. להוסיף 9 מיליליטר MEF/MSC תרבות בינוני הצלחת לנטרל את פעילות פתרון של ניתוק התאים ולהעביר את התאים מנותקת ל תבשיל חדש של תרביות רקמה 100 מ מ ללא ציפוי כלשהו.
    3. דגירה התאים בטמפרטורת החדר למשך 30 דקות לאפשר את MEFs לצרף הצלחת.
    4. בזהירות לאסוף את תגובת שיקוע אשר מכיל כעיגולים בצבע iPSCs, צנטריפוגה ב g x 230 ב 4 מעלות צלזיוס למשך 4 דקות.
      הערה: ברישול שטיפה בתחתית צלחת מוביל הניתוק של MEFs.
  3. הבידול של iPSCs כלפי MSCs (יום 0 - 28):
    1. מעיל משלוש בארות של צלחת 6-ובכן עם 1 מ"ל של 0.1% ג'לטין לכל טוב בטמפרטורת החדר למשך 30 דקות.
    2. הסר את תגובת שיקוע של iPSCs שנאספו 2.2.4.
    3. Resuspend iPSCs ב 6 מ של MSC בידול בינונית (טבלה 1), תאי זרע הבארות מצופה שלוש 2 מ לכל טוב (יום 0).
    4. לשנות את המדיום בידול MSC בכל יומיים כדי להסיר תאים כעיגולים בצבע ו/או מת (יום 1 - 28).
  4. ההבשלה של MSCs נגזר iPSC (יום 28-45):
    1. להסיר את המדיום בידול MSC בילה ולשטוף תאים עם 1 מ"ל של 1 x DPBS.
    2. Trypsinize MSCs 0.5 מ של 0.25% טריפסין-EDTA לכל טוב בטמפרטורת החדר במשך 3 דקות.
    3. לנטרל טריפסין מאת 1.5 מ של המדיום תרבות MEF/MSC ולאסוף MSCs משלוש בארות לתוך שפופרת אחת של חרוט 15 מ"ל. צנטריפוגה ב g x 230 ב 4 מעלות צלזיוס למשך 4 דקות.
    4. הסר את תגובת שיקוע ולאחר resuspend MSCs ב- 3 מ"ל של MEF/MSC תרבות בינוני וצלחת בצלחת 60 מ מ 0.1% מצופי ג'לטין (28 יום).
    5. תרבות MSCs במדיום תרבות MEF/MSC ושנה בינוני כל יומיים. כאשר התאים להגיע 100% הנהרות, תת-תרבות MSCs ביחס של 1:3 באמצעות 0.25% טריפסין-EDTA.
      הערה: MSCs להציג מורפולוגיה, כמו פיברובלסט (איור 2B). כאשר MSCs גדלים בצפיפות גבוהה, מוארך MSCs יכולים ליצור דפוס כמו מערבולת (איור 2B).
    6. לבצע ההכתמה immunofluorescent להעריך MSCs iPSC נגזר על ידי בחינת MSC סמני פני השטח CD44, CD73, CD105 ו- CD166 (איור 2C).
      הערה: הדילול של נוגדנים מוצגות בטבלה מס ' 2. צביעת immunofluorescent של תאים חיים מבוצעת על פי הוראות היצרן.
    7. לאחר אישור, הרחב MSCs ביחס של 1:3 במנות תרביות רקמה 100 מ מ. להקפיא את הבקבוקונים (3 מבחנות לכל מאכל תרביות רקמה 100 מ מ) תוך שימוש באמצעי קפוא המכיל דימתיל סולפוקסיד 10% ל- 90% FBS.
      הערה: כדי להעשיר את האוכלוסייה MSC, MSCs ניתן למיין בעזרת CD105+, CD24-קריטריונים מאת לזרום cytometry9,17. נגזר iPSC MSCs הבדיל באמצעות השיטה PDGF-AB מבוססי בדרך כלל יכול להישמר במשך 2-3 חודשים בתרבות ללא איבוד הזהות MSC9. להקפיא MSCs ממספר מעבר מוקדם לאחר שנוכח MSC מאפיינים.

3. הבידול של הסימולטור MSCs כדי תאי העצם (איור 3 א)

  1. הכנה של MSCs הבידול osteogenic (יום-1)
    1. להקפיד על כמות נאותה של תאים כדי להשלים את פרוטוקול בידול osteogenic, מתחילים עם MSCs תרבותי במנות תרביות רקמה 100 מ מ עד 95% הנהרות. להסיר את המדיום תרבות מבוזבז, לשטוף MSCs עם 5 מ של 1 x DPBS.
    2. Trypsinize MSCs עם 1 מ"ל של 0.25% טריפסין-EDTA לכל מנה 100 מ"מ בטמפרטורת החדר במשך 3 דקות. כדי להבטיח שהתאים הם לא מעל trypsinized, להפסיק trypsinization כאשר 50% של הניתוק תא נצפית במיקרוסקופ.
    3. לנטרל טריפסין מאת 9 מיליליטר MEF/MSC תרבות בינוני ולאסוף MSCs 3 בארות לתוך שפופרת אחת של חרוט 15 מ"ל. צנטריפוגה ב g x 230 ב 4 מעלות צלזיוס למשך 4 דקות.
    4. וארוקן את תגובת שיקוע, resuspend MSCs ב 5 מ של MSC בינוני, לספור את מספר התאים על ידי hemocytometer.
    5. צלחת תקין מספר MSCs על צלחת תרבות.
      הערה: הפירוט של מספרי הטלפון הנייד של צלחת 12-ובכן, 6 פלייט-טוב ומנות 100 מ מ תרביות רקמה מסוכמים בטבלה3.
  2. אינדוקציה של בידול osteogenic על ידי אוסטאובלסט בידול בינוני (ODM) (טבלה 1) (יום 0 - 24):
    1. תשאף MEF/MSC תרבות בינוני והחלף עוצמת הקול הנכון של ODM (1 מ"ל, 2 מ ל ו מ ל 8 עבור כל טוב של צלחת 12-. ובכן, כל טוב של תרביות רקמה 100 מ מ, ורוטב בצלחת 6-ובכן צלחת, בהתאמה) להבדיל MSCs כדי תאי העצם (יום 0).
    2. האחות ה-ODM בילה והחלף עוצמת הקול הנכון של ODM בכל יומיים במהלך תהליך התמיינות osteogenic.
    3. לבצע את phosphatase אלקליין (AP) ולומדים Alizarin האדום S (ARS) צביעת לזהות העצם-הקשורים phosphatase אלקליין מתוצרת preosteoblasts ומשקעים מינרליים המיוצר על ידי תאי העצם, בהתאמה, ביום 3, 6, 9, 12, 15, 18, 21, ו 24 ( איור 3B).
      הערה: AP מכתים, ARS מכתים מבוצעות באמצעות ערכת זמינים מסחרית ע פ הפרוטוקול היצרן.
    4. לבדוק את רמות הביטוי של סמנים אוסטאובלסט preosteoblast ובוגר (ALPL ו COL1A1 עבור preosteoblasts; PTH1R ו- BGLAP עבור מבוגרים תאי העצם) על ידי לרביעיית-PCR (איור 3C).
      הערה: AP חיובי מכתים צפוי אחרי יום 9 של בידול osteogenic, צביעת ARS חיובי ניתן לצפות לאחר 21 יום של בידול osteogenic. ניתן להגיש את MSCs גדל במדיום תרבות MEF/MSC פקד שלילי של AP מכתים, ARS מכתים.

4. המודל Xenograft ללמוד Tumorigenesis In Vivo של הסימולטור MSC-derived תאי העצם (איור 4A)

  1. בידול של MSCs הסימולטור תאי העצם:
    1. הזרע 3-4.5 x 105 MSCs בצלחת תרביות רקמה 100 מ מ. היכונו חמש מנות זריקה תת עורית אחת.
    2. תרבות MSCs ב ODM להבדיל MSCs כדי תאי העצם, כמתואר ב- 3.2 עד 14 יום.
  2. הכנה של תאי העצם הבדיל להזרקה תת–עורית:
    1. כדי להכין אוסטאובלסט ניתוק פתרון (טבלה 1), לפזר collagenase II סוג 1 g ב- 1,000 מיליליטר בינוני αMEM כדי להפוך את הפתרון השני collagenase (1 mg/mL). לשמור את הפתרון השני collagenase ב-20 ° C. לערבב 0.25% טריפסין-EDTA ולאפשר הפתרון השני collagenase ביחס של 1:1. תאי העצם ניתוק פתרון.
    2. להסיר את ה-ODM בילה ולשטוף הבדיל תאי העצם עם 5 מ של 1 x DPBS לכל מנה 100 מ מ.
    3. להוסיף 1.5 מיליליטר אוסטאובלסט ניתוק פתרון לכל מנה 100 מ מ, דגירה מנות ב 37 מעלות צלזיוס במשך 30 דקות לבחון ולהבטיח הניתוק אוסטאובלסט באמצעות מיקרוסקופ.
    4. לנטרל את הפתרון ניתוק תאי העצם על ידי ODM ולאסוף את תאי העצם מנותקת צינור חרוטי 50 מ. צנטריפוגה ב g x 230 ב 4 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות.
    5. הסר את תגובת שיקוע ולאחר resuspend בתאים 25 מ של ODM בינוני. עוברים את התאים דרך מסננת תא מיקרומטר 70 כדי להסיר תאים צבורים. לספור את מספרי הטלפון הנייד באמצעות של hemocytometer.
    6. היכונו תאי העצם7 עונה 1 פרק 10 לכל בזריקה תת עורית ותאים צנטריפוגה ב g x 230 ב 4 ° C 4 דקות.
    7. Resuspend של תאי העצם7 עונה 1 פרק 10 ב 50 µL קר כקרח 1 x DPBS. מיקס הבדיל תאי העצם עם 50 µL של קרום המרתף חינם פנול אדום מטריקס (מטריקס הבולם, קרום המרתף, מעורבים ביחס של 1:1 תאי העצם) ולשמור על תאי העצם על הקרח לפני ההזרקה.
  3. In vivo xenograft הגידול דגם של הסימולטור MSC-derived תאי העצם:
    1. עזים ומתנגד בן שבוע 8 NU/NU נקבה עכברים immunocompromised בחדר הספקת איזופלוריין 5% (v/v) בשאיפה ב- 1 ליטר/דקה של חמצן (שסופק על-ידי CLAMC). לאחר שבעל החיים הופך שכיבה, לעבור את מערכת משלוח הרדמה קונוס האף, אספקת 2% (v/v) בשאיפה איזופלוריין ב 200mL/min של חמצן (שסופק על-ידי CLAMC). נטר את העומק של הרדמה על ידי בדיקת הרפלקסים הקרנית, פדלים כדי להפוך העכברים הם מרדימים מספיק ואני לא סובלים אי נוחות במהלך ההליך.
    2. לחטא את האזור להיות מוזרק עם מטליות לסירוגין של אלכוהול איזופרופיל chlorhexidine ו- 70%. השתמש 26 גרם מחט כדי לבצע הזרקה תת עורית של קרום המרתף מעורב-מטריקס הסימולטור תאי העצם לתוך צד אחד של הרגליים האחוריות של עכברים NU/NU immunocompromised (איור 4A) בן שבוע 8.
    3. לפקח על עכברים על-ידי ביצוע מישוש שבועי באתרי הזרקה לצמיחה של צפיפויות קשרי תת עורית. היווצרות הגידול יכול להיות שנצפו בסביבות 6-10 שבועות לאחר ההזרקה (איור 4B).
    4. המתת חסד העכברים בשיטה חנק פחמן דו-חמצני, ואחריו נקע בצוואר הרחם. לנתח גידולים מפותחים. לקבוע הגידול כיתה בידול אינדקס, preosteoblasts, ואת תאי העצם בוגרת באמצעות שיטות שונות מכתימים (למשל Hematoxylin ואאוזין (H & E) צביעת אדום סיריוס Picro מכתים, פון Kossa מכתים בהתאמה).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

פרוטוקול זה מציג את ההליכים לרבות הסימולטור iPSC הדור, MSC בידול, בידול אוסטאובלסט ויוו tumorigenesis assay באמצעות הסימולטור MSC-derived תאי העצם.

ערכת לדור של הסימולטור iPSCs מ fibroblasts באמצעות וירוס סנדאי זמינים מסחרית התכנות ערכת מוצג איור 1A. מבוסס סנדאי וירוס משלוח של הגורמים יאמאנאקה ארבע היא שיטה התיכנות ללא שילוב. לכן, שיבוטים iPSC הסימולטור יציב צריך להיות ללא גנום הוירוס סנדאי ואובדן אקסוגני OCT4, SOX2, KLF4 ו- transgenes c-MYC, אשר יכולים להיבדק על ידי RT-PCR באמצעות תחל ספציפי (איור 1B). כפי הוא הציע בהוראות היצרן, דור של iPSCs סנדאי מוירוסים תלוי תרבות והן מעבר לתנאים. תחת התנאים המתוארים תרבות של פרוטוקול זה, הסרת וירוס סנדאי ב iPSCs בדרך כלל ניתן להבחין לאחר 10 קטעים (איור 1B). הסימולטור שהוקמה iPSC שיבוטים עליו התערוכה המורפולוגיה hESC טיפוסי, להראות את פעילות AP חיובי (איור 1C). הסימולטור iPSCs מאוד לבטא mRNAs פקטור pluripotency (NANOG, OCT4, SOX2, DPPA4, REX1), מקביל לקו hESC H1 והרבה יותר גבוה מאשר הורים fibroblasts (איור 1D). הביטוי של גורמים pluripotency (NANOG, OCT4) וסמנים hESC (SSEA4 ו- TRA-1-81) יכול להיבדק גם על ידי immunofluorescent מכתים (איור 1E).

iPSCs מתוחזקים על MEFs לפחות 14 ימים לפני ביצוע MSC בידול (איור 2 א). למרות הרבה של מוות של תאים לקרות במהלך התמיינות MSC, המוני תאים גלויים על הצלחת התרבות תאים, כמו פיברובלסט MSCs בקצה של ההמונים התא יכול להיות שנצפו בגיל 28 יום. (איור 2B). לאחר sub culturing הבדיל תאים במדיום תרבות MEF/MSC, MSCs הבדיל להתרבות במהירות ולא להראות כמו פיברובלסט מורפולוגיה סביב 35 יום, ואז בהדרגה מייצג צורה מוארכת ויוצרים דפוס כמו מערבולת בגיל 40 יום (איור 2B ). הבדיל הסימולטור MSCs אקספרס סמנים MSC, כולל CD44, CD73, CD105 ו- CD166 על ידי immunofluorescence מכתים (איור 2C).

איור 3A מתווה בידול osteoblastic. כאשר MSCs נחשפים לאותות בידול osteogenic, התאים הבדיל מתחילים להראות פעילות פוספטאז אלקליין חיובי-יום 9 (איור 3B). ארס מכתים יכול לשמש לזיהוי מינרלים התצהיר המיוצר על ידי תאי העצם בוגרת. צבע אדום בהיר מכתים במקום צבע חום מכתים מציין תוצאה חיובית של ארס מכתים, אשר יכול להיות שנצפו לאחר 21 יום (איור 3B). . תאי העצם המבדילים הצג ביטוי הגוברת ברמה של גנים preosteoblast (ALPL ו- COL1A1), הגנים אוסטאובלסט בוגרת (BGLAP ו- PTH1R) במהלך התמיינות osteogenic.

In vivo xenograft דגם יכול להתבסס על ידי הזרקת subcutaneously נגזר MSC הסימולטור תאי העצם בעכברים NU/NU (איור 4A). גידולים יכולים להיות שנצפו 6-10 שבועות לאחר הזרקה תת-עוריים (איור 4B). הגידולים נגזר אוסטאובלסט הסימולטור הפגינו אוסטאובלסט ילדותי מאפיינים, פעילות AP חיובי (AP צביעת), התצהיר מטריצת קולגן חיובי (picrosirius אדום צביעת) אבל שלילי מינרליזציה (פון Kossa מכתים) (איור 4C) .

Figure 1
איור 1 : דור iPSC מ fibroblasts החולה הסימולטור. (א) תרשים סכמטי של iPSC הדור. (B) RT-PCR לזיהוי של גנום הוירוס סנדאי, transgenes (קוס (KLF4, OCT4, , SOX2), KLF4, ו- c-MYC) שיבוט iPSC היו לאחר 10 מעברים (משמאל) ו פיברובלסט לאחר הפגיעה יום 11 (מימין, בקרה חיובית). הסימולטור iPSC שיבוט הוא סנדאי וירוס בחינם לאחר 10 קטעים. GAPDH מוצג בקרה פנימית. (ג) תא המורפולוגיה של הסימולטור iPSCs ו- AP מכתים. סולם בר, 50 מיקרומטר (D) לרביעיית-PCR של NANOG', ' SOX2', ' OCT4', DPPA4, REX1 mRNA ביטוי הסימולטור iPSCs. קו hESC H1 ו fibroblasts הסימולטור הורים משמשים חיובי ופקד שלילי, בהתאמה. הביטוי mRNA הוא מנורמל לביטוי GAPDH . הביטוי יחסי mRNA מכוון hESC H1 קו 1. Immunostaining (E) של גורמי pluripotent hESC של שעתוק (NANOG ו- OCT4), hESC משטח סמני (SSEA4 ו- TRA-1-81) iPSCs הסימולטור. סולם בר, 50 מיקרומטר. הדילול של נוגדנים השתמשו במחקר זה מוצגות בטבלה מס ' 2. רצפי פריימר מוצגים בטבלה4. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Figure 2
איור 2 : הבידול של הסימולטור iPSCs כדי MSCs. (א) תרשים סכמטי של בידול MSC PDGF-AB-induced. (B) תא המורפולוגיה של הסימולטור נגזר iPSC MSCs-בידול 28 יום, 36 יום ויום 40 +. סרגל קנה מידה, 100 מיקרומטר. (ג) Immunofluorescence מכתים מדגים כי הבדיל הסימולטור MSCs התערוכה CD44+, CD73+, CD105+, CD166+, ואת CD24 חתימה– . סולם בר, 30 מיקרומטר. הדילול של נוגדנים השתמשו במחקר זה מוצגות בטבלה מס ' 2. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Figure 3
איור 3 : הבידול של הסימולטור MSCs כדי תאי העצם. (א) תרשים סכמטי של בידול osteogenic. AP (B) ו- ARS מכתים מתבצעות בנקודות זמן שונות (יום 3, 6, 9, 12, 15, 18, 21, ו 24). הבידול osteoblastic של תאי העצם הסימולטור MSC-derived צפוי להוביל חיובי AP מכתים סביב יום 9 ו- ARS חיובי מכתים-21 יום. (ג) לרביעיית-PCR ניתוח מדגים ביטוי מוגבר של טרום אוסטאובלסט (ALPL ו- COL1A1) וגם הגנים אוסטאובלסט בוגרת (PTH1R ו- BGLAP) במהלך התמיינות osteogenic. הביטוי mRNA הוא מנורמל לביטוי GAPDH . רמות הביטוי היו יחסית תאים על בידול יום 0. רצפי פריימר מוצגים בטבלה4. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Figure 4
איור 4 : אין ויוו tumorigenesis של תאי העצם נגזר הסימולטור MSC. (א) תרשים סכמטי של הגידול xenograft של הסימולטור תאי העצם. (B) NU/NU עכברים לשאת הסימולטור נגזר אוסטאובלסט גידולים לאחר 10 שבועות של הזרקה תת עורית. (ג) הסימולטור נגזר אוסטאובלסט גידולים נבחנו על ידי H & E, AP, picrosirius אדום, פון Kossa מכתים על מורפולוגיה, עצם הקשורים AP, קולגן, מחצבים, בהתאמה. הגידולים נגזר הסימולטור מייצגים מאפיינים אוסטאובלסט ילדותי מציג פעילות AP חיובי קולגן חיובי, שלילי מינרליזציה מינרלי. סולם בר, 1 מ מ. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

פיברובלסט בינוני (500 mL)
DMEM 440 מ
FBS חום-לא פעיל 50 מ
Antibiotics(Pen/Strep) (100 x) 5 מ
חומצת אמינו שאינן חיוניות (100 x) 5 מ
מרקפטואתנול 3.5 ΜL
MEF/MSC תרבות בינוני (500 mL)
DMEM 440 מ
FBS חום-לא פעיל 50 מ
Antibiotics(Pen/Strep) (100 x) 5 מ
-גלוטמין (100 x) 5 מ
hESC בינוני (500 mL)
DMEM/F-12 מ ל 384.5
החלפת סרום נוקאאוט 100 מ ל (סה כ: 20%)
חומצת אמינו שאינן חיוניות (100 x) 5 מ
אנטיביוטיקה (עט/דלקת) (100 x) 5 מ
-גלוטמין (100 x) 5 מ
bFGF (10 µg/mL) 500 ΜL
מרקפטואתנול 3.5 ΜL
MSC בידול בינוני (500 mL)
נוקאאוט DMEM/F-12 או DMEM/F-12 445 מ
החלפת סרום נוקאאוט 50 מ
bFGF (10 µg/mL) µL 500 (10 ng/mL)
PDGF-AB (25 µg/mL) µL 200 (10 ng/mL)
חומצת אמינו שאינן חיוניות (100 x) 5 מ
מרקפטואתנול 3.5 ΜL
אוסטאובלסט בידול בינוני (ODM) (500 mL)
ΑMEM 395 מ
FBS חום-לא פעיל 50 מ
10 מ מ β-Glycerophosphate 50 מ ל (1.08 גרם בαmem 50 מ ל)
דקסאמתאזון מיקרומטר 0.1 (רגיש אור) 10 µL של 5 מ מ דקסמתזון
חומצה אסקורבית 200 מיקרומטר (רגיש אור) µL 100 של חומצה אסקורבית 1 מ מ
אנטיביוטיקה (עט/דלקת) (100 x) 5 מ
פתרון ציפוי Matrigel (50 מ"ל)
מטריקס קרום המרתף 2 מ
DMEM/F-12 (טרום קר 4 ° C) 48 מ"ל
אוסטאובלסט ניתוק פתרון (50 מ"ל)
0.25% טריפסין-EDTA 25 מ
Collagenase II פתרון (1 מ"ג/מ"ל) 25 מ
הערה: להכין אוסטאובלסט ניתוק פתרון הנכונה טריים לפני השימוש. הפתרון השני collagenase מאוחסן ב-20 ° C עד 6 חודשים.

טבלה 1: קומפוזיציות של פיברובלסט בינוני, בינוני תרבות MEF/MSC, hESC בינוני, MSC בידול בינוני, ODM ו אוסטאובלסט ניתוק פתרון.

נוגדנים שם דילול
NANOG שבערך
OCT4 1:300
SSEA-4 מצומדת-PE 1:600
TRI-1-81 1:600
החמור עז נגד אג שבערך
ארנב נגד עז אג שבערך
CD105 שבערך
CD44 שבערך
CD73 שבערך
CD166 שבערך
CD24 שבערך

בטבלה 2: דילול נוגדן.

צלחת תרבות צפיפות זריעה Assay
12. ובכן צלחת 0.67x104 תאים לכל טוב אלקליין פוספטאז מכתים (צביעת AP)
Alizarin אדום S מכתים (ARS צביעת)
לוח 6-ובכן 2 x 10 תאים4 לאדם טוב RT-PCR לזיהוי
סמנים preosteoblast: ALPL, COL1A1
בוגר אוסטאובלסט סמנים: PTH1R, BGLAP
100 מ מ מאכל 3 - 4.5x105 תאים לכל צלחת In vivo tumorigenesis

טבלה 3: זריעה צפיפות של MSCs עבור בידול osteoblastic.

סנדאי וירוס תחל
היעד פריימר סטים
SeV קדימה: GGATCACTAGGTGATATCGAGC
הפוך: ACCAGACAAGAGTTTAAGAGATATGTATC
קוס (KLF4/OCT4/SOX2) קדימה: ATGCACCGCTACGACGTGAGCGC
הפוך: ACCTTGACAATCCTGATGTGG
KLF4 קדימה: TTCCTGCATGCCAGAGGAGCCC
הפוך: AATGTATCGAAGGTGCTCAA
c-MYC קדימה: TAACTGACTAGCAGGCTTGTCG
הפוך: TCCACATACAGTCCTGGATGATGATG
RT-PCR תחל
היעד פריימר סטים
NANOG קדימה: TTTGTGGGCCTGAAGAAAACT
הפוך: AGGGCTGTCCTGAATAAGCAG
SOX2 קדימה: AGAAGAGGAGAGAGAAAGAAAGGGAGAGA
הפוך: GAGAGAGGCAAACTGGAATCAGGATCAAA
OCT4 קדימה: AACCTGGAGTTTGTGCCAGGGTTT
הפוך: TGAACTTCACCTTCCCTCCAACCA
DPPA4 קדימה: GACCTCCACAGAGAAGTCGAG
הפוך: TGCCTTTTTCTTAGGGCAGAG
REX1 קדימה: GCCTTATGTGATGGCTATGTGT
הפוך: ACCCCTTATGACGCATTCTATGT
ALPL קדימה: GGGACTGGTACTCAGACAACG
הפוך: GTAGGCGATGTCCTTACAGCC
COL1A1 קדימה: GTGCGATGACGTGATCTGTGA
הפוך: CGGTGGTTTCTTGGTCGGT
PTH1R קדימה: AGTGCGAAAAACGGCTCAAG
הפוך: GATGCCTTATCTTTCCTGGGC
BGLAP קדימה: GGCGCTACCTGTATCAATGG
הפוך: GGCGCTACCTGTATCAATGG

טבלה 4: פריימר מידע.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

כדי להשיג יעילות גבוהה יותר של בידול MSC, מספר היבטים הם קריטיים. אחת היא התנאי התרבות של iPSCs לפני ביצוע MSC בידול. פרוטוקול שהוצג בחוברת מתבסס על מחקרים קודמים 9,17. iPSCs צריך להיות בתרבית על MEFs לפחות 2 שבועות. שמירה על iPSCs טובים תנאים על MEFs הם קריטיים עבור תאים לצרף בצלחת מצופים ג'לטין לקבלת MSC בידול. היבט חשוב נוסף הוא הצפיפות של iPSCs על MEFs לפני בידול. 80 - 90% confluency של iPSCs היא העדיפה ליזום MSC בידול. יתר של iPSCs יפגום הישרדות cell במהלך תהליך התמיינות. הנקודה האחרונה היא צפיפות זריעה בעת הפעלת MSC בידול. בידיים שלנו, צפיפות גבוהה תא מקדם iPSC מצורף לצלחת מצופה ג'לטין. IPSCs מנה אחת של 100 מ מ יכול להיות נזרע לתוך משלוש בארות צלחת 6-ובכן. חניכה של בידול MSC ישירות resuspending, ציפוי iPSCs במדיום בידול MSC מייצרת מדגיש נהדר על iPSCs, ולכן מדי פעם והתוצאה מוות תאי חמור לאחר זריעה. צפיפות גבוהה של iPSCs מגבירה את שיעור ההצלחה של בידול MSC.

בניגוד בידול MSC, תהליך התמיינות osteoblastic הוא יותר ישירה. כדי להשיג תוצאות בידול לשחזור, להבטיח שהמספרים MSC ייזום עקביים. התוצאות של בידול osteoblastic מהקו באותו התא עשויים להשתנות אצווה כדי אצווה, לכן, הגדרת בידול לקווים שונים באותו הזמן ייתן עוד תוצאות השוואתי בין קבוצות. העלייה של מספרים MSC לקצר את תהליך התמיינות שצוין על-ידי חיובי AP, ARS מכתים בנקודת זמן קודמת. בנוסף, ודא השינוי של ODM בינוני מתבצע בצורה עדינה מערכת שאיבה ואקום חזק אינו מומלץ בשלב בידול מאוחר (יום 18 - 24) עקב הניתוק פוטנציאלי של תאי העצם צבורים בתהליך התרבות.

תאי העצם הבדיל בשימוש ויוו xenograft בניסוי הם תאי העצם בנקודת הזמן בידול 14 יום. . תאי העצם יאוחר מ 14 יום עלול לצבור ולהיות קשה מביצועם עקב הצטברויות ענק של collagens וחומרים אחרים העצם מטריקס המיוצר על ידי תאי העצם. כדי למנוע את הקושי אוסטאובלסט הדיסוציאציה, הסימולטור MSCs יכול להיות נזרע ב- 2 - 3-fold צפיפות גבוהה יותר בשלב הייזום של בידול osteoblastic כדי להקל על אוסטאובלסט בידול. הסימולטור MSC-derived תאי העצם יכול להיות חלופה מועדפת ונאסף ביום 6-10 בידול נקודת זמן ויוו tumorigenesis assay בבית יום 6 - 7 בידול נקודת זמן. הדגם גידול xenograft הסימולטור מדגים נגזר MSC הסימולטור תאי העצם לסכם ביכולת tumorigenic vivo , אשר מספק פלטפורמה אלטרנטיבית ללמוד אוסטאוסרקומה הקשורים הסימולטור.

לסיכום, מספק מודל מבוסס iPSC אוסטאוסרקומה הסימולטור של הזדקקות בעל ערך למחקר אוסטאוסרקומה. בנוסף אוסטאוסרקומה, הסימולטור חולים סובלים שונים סוגים אחרים של סרטן כגון סרקומה של רקמות רכות, סרטן השד, גידול במוח. לכן, ניתן להרחיב מודלים מבוססי iPSC המחלה הסימולטור לדגם הסימולטור אחרים הקשורים ממאירות. שילוב של הסימולטור החולה נגזר iPSCs ומתוכננים מוטציות p53 hESCs (mutp53)18, המודל של המחלות הסימולטור יש גם ערך רב בהתוויית בפתוגנזה של ממאירות mutp53 הקשורים ולפתח אסטרטגיות טיפוליות הרומן מיקוד oncogenic p5316.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

המחברים אין לחשוף.

Acknowledgments

ר צ נתמך על ידי חדשנות UTHealth עבור סרטן מניעה מחקר הכשרה תוכנית Pre-Doctoral לאגודה (מניעת סרטן, טקסס של מכון המחקר להעניק RP160015). ג'יי. טי נתמך על-ידי התוכנית לין הקי של האוניברסיטה הראשונה המזוהה עם בית החולים של סון יאט-סן. ד-F.L. המלומד CPRIT בחקר הסרטן, נתמך על ידי NIH השביל המוביל אל העצמאות פרס R00 CA181496 ו- CPRIT פרס RR160019.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Plastic ware
100 mm Dish Corning 430107
60 mm Dish Corning 430166
6-well Plate Falcon 353046
12-well Plate Falcon 353043
48-well Plate Falcon 353078
1 mL Pipet Tip USA Scientific 1111-2721
200 µL Pipet Tip USA Scientific 1111-0706
10 µL Pipet Tip USA Scientific 1111-3700
5 mL Serological Pipette SARSTEDT 86.1253.001
10 mL Serological Pipette SARSTEDT 86.1254.001
25 mL Serological Pipette SARSTEDT 86.1685.001
50 mL Tube, PP SARSTEDT 62.547.100
15 mL Tube, PP SARSTEDT 62.554.100
Culture materials and Reagents
CytoTune- iPS 2.0 Sendai Reprogramming Kit Invitrogen A16517 Commercial Sendai virus reprogramming kit
Corning hESC-Qualified Matrix Corning 354277 Basement membrane matrix
CF1 MEFs, irradiated ThermoFisher A34180
DMEM Sigma-Aldrich D5671
DMEM/F12 Corning 10-090-CV
αMEM Corning 10-022-CV
StemMACS iPS-Brew XF Miltenyi Biotec 130-104-368 Commercial iPSC medium
KnockOut DMEM/F-12 ThermoFisher 12660012
FBS Opti-Gold GenDEPOT F0900-050
KnockOut Serum Replacement ThermoFisher A3181502
Penicillin-Streptomycin Sigma-Aldrich P4333
MEM Nonessential Amino Acids Corning 25-025-CI
L-Glutamine Solution Sigma-Aldrich G7513
2-Mercaptoethanol Sigma-Aldrich M3148
Human FGF-basic (bFGF) PEPROTECH 100-18B
Recombinant Human PDGF-AB PEPROTECH 100-00AB
β-Glycerophosphate Sigma-Aldrich G9422
Dexamethasone Sigma-Aldrich A4902
Ascorbic Acid Sigma-Aldrich A5960
Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline, 1x (DPBS) Corning 21-031-CV
StemMACS Passaging Solution XF Miltenyi Biotec 130-104-688 Commercial passaging solution
Accutatse Cell Detachment Solution Corning 25-058-CI Cell detachment solution
Thiazovivin (ROCK Inhibitor) Calbiochem 420220
0.25% Trypsin-EDTA Solution Sigma-Aldrich T4049
Collagenase, Type II   ThermoFisher 17101015
Human NANOG Antibody R&D System AF1997
OCT4 Antibody (H-134) Santa Cruz sc-9081
Human/Mouse SSEA-4 PE-conjugated Antibody R&D System FAB1435P
Alexa Fluor 555 Mouse Anti-Human TRA-1-81 Antigen DB Biosciences 560123
Alexa Fluor 488 Donkey Anti-Goat IgG (H+L) Jackson ImmunoResearch 705-545-003
Alexa Fluor 488 Goat Anti-Rabbit IgG (H+L) Jackson ImmunoResearch 111-545-144
PE Mouse Anti-Human CD105 eBioscience 12-1057-42
FITC Mouse Anti-Human CD44 DB Biosciences 555478
PE Mouse Anti-Human CD73 DB Biosciences 550257
PE Mouse Anti-Human CD166 DB Biosciences 560903
FITC Mouse Anti-Human CD24 DB Biosciences 555427
Donkey Serum Jackson ImmunoResearch 017-000-121
Goat Serum Jackson ImmunoResearch 005-000-121
Alkaline Phosphatase Staining Kit II Stemgent 00-0055
Alizarin Red S Sigma-Aldrich A5533
TRIzol Reagent ThermoFisher 15596018
Chloroform ThermoFisher C298-500
2-Propanol ThermoFisher A416-4
Ethanol, Absolute, Molecular Biology Grade ThermoFisher BP28184
DNase I, RNase-free (1 U/µL) ThermoFisher EN0521
iScript cDNA Synthesis Kit BioRad 1708891BUN
iQ SYBR Green Supermix BioRad 1708884
Matrigel Matrix High Concentration (HC), Phenol-Red Free Corning 354262
1 mL Slip Tip Syringe, 26 Gauge x 5/8 Inch DB Biosciences 309597

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Takahashi, K., Yamanaka, S. Induction of pluripotent stem cells from mouse embryonic and adult fibroblast cultures by defined factors. Cell. 126 (4), 663-676 (2006).
  2. Takahashi, K., et al. Induction of pluripotent stem cells from adult human fibroblasts by defined factors. Cell. 131 (5), 861-872 (2007).
  3. Yu, J., et al. Induced pluripotent stem cell lines derived from human somatic cells. Science. 318 (5858), 1917-1920 (2007).
  4. Yagi, T., et al. Modeling familial Alzheimer's disease with induced pluripotent stem cells. Hum Mol Genet. 20 (23), 4530-4539 (2011).
  5. Dimos, J. T., et al. Induced pluripotent stem cells generated from patients with ALS can be differentiated into motor neurons. Science. 321 (5893), 1218-1221 (2008).
  6. Moretti, A., et al. Patient-specific induced pluripotent stem-cell models for long-QT syndrome. N Engl J Med. 363 (15), 1397-1409 (2010).
  7. Itzhaki, I., et al. Modelling the long QT syndrome with induced pluripotent stem cells. Nature. 471 (7337), 225-229 (2011).
  8. Carvajal-Vergara, X., et al. Patient-specific induced pluripotent stem-cell-derived models of LEOPARD syndrome. Nature. 465 (7299), 808-812 (2010).
  9. Lee, D. F., et al. Modeling familial cancer with induced pluripotent stem cells. Cell. 161 (2), 240-254 (2015).
  10. Mulero-Navarro, S., et al. Myeloid Dysregulation in a Human Induced Pluripotent Stem Cell Model of PTPN11-Associated Juvenile Myelomonocytic Leukemia. Cell Rep. 13 (3), 504-515 (2015).
  11. Kotini, A. G., et al. Functional analysis of a chromosomal deletion associated with myelodysplastic syndromes using isogenic human induced pluripotent stem cells. Nat Biotechnol. 33 (6), 646-655 (2015).
  12. Kotini, A. G., et al. Stage-Specific Human Induced Pluripotent Stem Cells Map the Progression of Myeloid Transformation to Transplantable Leukemia. Cell Stem Cell. 20 (3), 315-328 (2017).
  13. Crespo, M., et al. Colonic organoids derived from human induced pluripotent stem cells for modeling colorectal cancer and drug testing. Nat Med. 23 (7), 878-884 (2017).
  14. Gingold, J., Zhou, R., Lemischka, I. R., Lee, D. F. Modeling Cancer with Pluripotent Stem Cells. Trends Cancer. 2 (9), 485-494 (2016).
  15. Lin, Y. H., et al. Osteosarcoma: Molecular Pathogenesis and iPSC Modeling. Trends Mol Med. 23 (8), 737-755 (2017).
  16. Zhou, R., et al. Li-Fraumeni Syndrome Disease Model: A Platform to Develop Precision Cancer Therapy Targeting Oncogenic p53. Trends Pharmacol Sci. 38 (10), 908-927 (2017).
  17. Lian, Q., et al. Derivation of clinically compliant MSCs from CD105+, CD24- differentiated human ESCs. Stem Cells. 25 (2), 425-436 (2007).
  18. Zhou, R., et al. A homozygous p53 R282W mutant human embryonic stem cell line generated using TALEN-mediated precise gene editing. Stem Cell Res. 27, 131-135 (2018).

Tags

חקר הסרטן גיליון 136 iPSCs תסמונת לי-פראומני היא תורשתית התכנות בידול בתאי גזע mesenchymal תאי העצם אוסטאוסרקומה xenograft
מידול אוסטאוסרקומה באמצעות תאי גזע Pluripotent נגזר החולה המושרה תסמונת לי-פראומני, היא תורשתית
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Zhou, R., Xu, A., Tu, J., Liu, M.,… More

Zhou, R., Xu, A., Tu, J., Liu, M., Gingold, J. A., Zhao, R., Lee, D. F. Modeling Osteosarcoma Using Li-Fraumeni Syndrome Patient-derived Induced Pluripotent Stem Cells. J. Vis. Exp. (136), e57664, doi:10.3791/57664 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter