Summary
ここでは、プロトコルを提案誘導多能性幹細胞 (Ips) の世代の李 Fraumeni シンドローム (LFS) 患者派生繊維芽細胞、間葉系幹細胞 (MSCs) 経由で Ips の分化から骨芽細胞、およびモデリングの体内にLFS 患者由来骨芽細胞を用いた腫瘍。
Abstract
李 Fraumeni シンドローム (LFS) は常染色体優性遺伝性の癌疾患です。LFS 患者は、各種腫瘍、骨肉腫 - 小児期と思春期の最も頻繁な主な非造血器腫瘍の 1 つを含むためにし向けられます。したがって、LFS は、この悪性腫瘍の研究に理想的なモデルを提供します。IPSC の方法論の活用 LFS 関連骨肉腫は、LFS 患者 Ips 間葉系幹細胞 (MSCs) し、骨芽細胞 ― ― osteosarcomas の元の細胞を分化によって正常にモデル化できます。これらの LFS の骨芽細胞は発癌性骨肉腫、骨肉腫の発生機序を区切るための魅力的なモデル システムを提供する要約します。この原稿は、LFS 患者線維芽細胞、MSCs では、骨芽細胞と LFS 骨芽細胞を用いた生体内で腫瘍の分化に Ips の分化から Ips の生成のためのプロトコルを示します。この iPSC 病モデルは、潜在的なバイオ マーカーや LFS 関連骨肉腫の治療上のターゲットを識別するために拡張できます。
Introduction
2006 年と 2007 の間山中伸弥夫妻とジェームス a. トムソンの研究所からいくつかの画期的な所見は誘導多能性幹細胞 (Ips)1,2,3の開発につながった。フォーム Ips に定義された転写因子と体細胞をリプログラミング研究者すなわちキー特性を持つ細胞を生成することができた、ヒト胚性幹細胞の存在、多能性と自己複製するだけで以前考えられていた(hESCs)。Ips は、個人または患者から生成される可能性があり、大幅に利用できる病気の研究のための背景のレパートリーを拡大して胚に由来するはありませんでした。以来、患者由来の Ips がアルツハイマー病4筋萎縮性側索硬化症5長い QT シンドローム6,7,から、様々 な人間の病気の表現型を要約するために使用されています。8。
IPSC 研究のこれらの進歩はまた癌研究のための新しい道を開いています。いくつかのグループ最近骨肉腫9日に成功したアプリケーション モデル発がん感受性の遺伝的背景9,10、11、下に患者の Ips を使用しています。白血病10、11,12、および大腸癌13。IPSC 由来癌モデルがまだ初期の段階、phenocopying 病関連の悪性腫瘍、病理組織学的機構の解明と治療化合物14の識別の大きな可能性を示しています。
李 Fraumeni シンドローム (LFS)、15 TP53生殖細胞の突然変異によって引き起こされる常染色体優性遺伝性の癌疾患です。LFS 患者は、この悪性腫瘍16の勉強に特に適して LFS Ips とその派生の細胞を作る各種、骨肉腫などの悪性腫瘍にし向けられます。骨肉腫の iPSC ベース モデル設立当初 2015 年に間葉系幹細胞 (MSCs) に区別されその後 LFS 患者由来 Ips9を使用して、元の細胞の骨芽細胞に、骨肉腫の。これらの LFS 骨芽細胞骨肉腫の骨分化障害とモデル"皿に骨腫瘍「プラットフォームとして可能性を示す発癌性特性を要約するでしょう。興味深いことに、ゲノム ・ トランスクリプトーム解析は、LFS 骨芽細胞骨肉腫遺伝子署名の側面を明らかにしてこの LFS 遺伝子発現プロファイルの機能は、骨肉腫9, 予後と相関を示す、潜在的な LFS Ips 疾患モデルの臨床関連性の特徴を明らかにします。
この原稿は、LFS 患者由来 Ips モデル骨肉腫を使用する方法の詳細な説明を提供します。それは世代 LFS Ips、Ips MSCs にし、骨芽細胞に分化し、LFS 骨芽細胞を用いた生体内で異種移植モデルの使用の詳細します。LFS 疾患モデルにいくつかの利点、特に解明、バイオ マーカーの同定と創薬スクリーニング9,14、骨肉腫の開発のすべての段階で無制限のセルを生成する機能が装備されています。 16。
要約すると、LFS 骨肉腫の iPSC ベース モデルは、骨肉腫の研究を推進するための魅力的な相補的なシステムを提供しています。このプラットフォームは、患者由来の Ips を用いた癌のモデル化の概念実証を提供します。以下のこの戦略は、がん素因とその他の遺伝性疾患に関連付けられているモデルの悪性腫瘍を容易に拡張することができます。
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Protocol
この作品は、テキサス大学健康科学センター ヒューストン (UTHealth) 動物福祉委員会によって承認されました。実験は、実験室の動物薬・気 (CLAMC) 研究室動物の世話 (AAALAC インターナショナル) のアメリカの協会によって認定されているため UTHealth センターによって確立された基準に厳密に従ってで実行されます。本研究の人間の題材は、NIH の SF424 のドキュメントで定義されているシナリオ、(「いいえ人間被験者研究」) の下で落ちる。したがって、それは、UTHealth 人間研究倫理委員会の承認は不要です。
1. LFS Ips (図 1 a) の生成
- -2 日 6 ウェル プレートのウェル 1 個に 2 × 104 LFS 患者線維芽細胞をプレートし、5% の加湿で 37 ° C で線維芽細胞培地 (表 1) で細胞の培養 CO2インキュベーター。繊維芽細胞伝達 (0 日) の日に 50 ~ 60% の合流点に達することを確認します。
- 0 日目にセンダイ ウイルス伝達を実行します。これを行うには、予め温めておいた線維芽細胞培地で過ごした媒体を交換してください。雪解けの氷の上 (材料の表を参照) をキット ウイルス リプログラミング商業仙台。製造元の指示に従って混合センダイ ウイルスと LFS の繊維芽細胞に感染します。
- 線維芽細胞培地 (日 1 6) で導入された細胞の維持:
- 1、導入後、24 h の日残りのセンダイ ウイルスを含む線維芽細胞培地を取り除き、2 mL の新鮮な線維芽細胞培地で取り付けです。5% の加湿で 37 ° C で導入された線維芽細胞を培養 CO2インキュベーター。
- 2-6 日目から一日おきの線維芽細胞培地での培地を変更します。
- フィーダーの培養条件 (7-28 日目) で導入された細胞の維持:
- 照射 CF1 マウス胚性線維芽細胞 (MEF) の培養皿 6 日目を準備します。このコートを行うには、30 分間室温で各板に 0.1% ゼラチン 5 mL を追加することによって六つの 100 mm ティッシュの培養皿は、コーティング後 0.1% ゼラチンを吸い出しなさい。
- 液体窒素容器から MEFs を削除します。MEFs 市販解凍システムの製造元の指示に従ってを使用して解凍します。ゼラチン コーティング プレート上のセルの板には、100 mm 細胞培養用ディッシュあたり 10 の5セル × 6.7 周りの播種密度で MEF/MSC 培 (表 1)。
- MEF プレート (7 日) に導入された細胞を接種する: 0.25 %1 mL を使用して導入された細胞を Trypsinize トリプシン-EDTA 室温で 2 4 分の 100 mm ディッシュあたり。9 ml の線維芽細胞中のトリプシンを中和します。円錐管に転送細胞と 4 分の 37 ° C で 230 × g で遠心分離セル 6 日目 6 MEF 料理に導入された線維芽細胞をプレートし、8 mL の線維芽細胞培地皿あたりにそれらを文化します。
注: MEFs の密度は約 20 %mef の版で導入された細胞を播種する前に。 - 8 日に線維芽細胞培地を除去し、悪名高く媒体 (表 1) に置き換えます。
- (図 1C) 9 28 日から iPS クローンの出現を待ちます。他の毎日過ごした hESC 媒体を変更し、顕微鏡下で iPS クローンの出現を監視します。Ips クローン大きさを肉眼で観察するの待つし、フィーダー フリー培養条件で iPS クローンを展開に進みます。
- フィーダー フリー培養状態でクローンの登場の iPS の拡大 (日 29 79 ~ 99)。
- マトリックス コーティング プレートを準備するには、基底膜マトリックス コート液 (表 1) ウェルあたりの 120 μ L で 48 ウェル プレートをコートします。基底膜マトリックス コーティング ソリューション井戸をカバーし、培養皿の表面をコートしていることを確認します。コーティング液の使用直前に室温 1 h. 吸引でそれを残すし、2 μ M ROCK 阻害剤 Thiazovivin とウェルあたり hESC 媒体の 250 μ L を追加します。
- 日 28 日過ごした hESC 培地を吸引し、1 x DPBS と iPS クローンを洗ってください。1 mL ピペット チップと扱われた 48 ウェル プレート (ステップ 1.4.1) の井戸に転送表示 iPS クローンを拾います。シード 48 ウェル プレートのウェルあたり 1 つの植民地。
- 細胞付着を容易にするために 4 分間、230 x g でプレートを遠心します。37 ° c 5% の加湿で iPS クローンを文化 CO2インキュベーター。
- 翌日 (日 29) 過ごした hESC 培地を取り除き、各ウェルに市販の iPSC 媒体の 250 μ L を追加します。
- 37 ° c 5% の加湿で iPS クローンを維持 CO2インキュベーターと変更 iPSC 媒体、その他の毎日。
- サブカルチャーが、1:10 で細胞 iPS クローンが 85% の合流点に達したら、文化圏の比率。セルをデタッチし、37 ° C、3 分で孵化させなさい商業 passaging ソリューションの 60 μ L を追加します。
- 基底膜マトリックス コート 12 ウェル プレート 2 μ M ROCK 阻害剤 Thiazovivin と悪名高く培地 1 mL 中に戸建の Ips の半分をシードします。1:10 とサブカルチャーの Ips あたり市販 iPSC 媒体の 1 ml 12 ウェル プレートで iPS クローン培養通路 10 に到達するまでの比率。
注: Ips は、培養ごとに 5-7 日、1:10 でサブ比率。IPS クローン通路 10 に到達するまで 10 週間かかります。(通常約 10 後示した Ips で仙台のウイルスの除去を確認後細胞の形態、アルカリフォスファターゼ (AP) 活性と多能性の要因および hESC マーカーの発現を含む iPSC の特徴を調べることができます。通路) (図 1 bE)。抗体およびプライマー iPSC の特性については、表 2および4に含まれます。
2. LFS Ips に間葉系幹細胞 (MSCs) (図 2 a) の分化
- 文化 iPSC の少なくとも 2 週間は MEF の版のクローンを作成 (日 ~-14-0): 前述したように MEF 料理 (100 mm ティッシュの培養皿) の準備 (1.3.1 - 1.3.2)。HESC 媒体で Ips を維持し、一日おきに媒体を変更します。Ips が 90% 合流、1:10 でサブカルチャー Ips に達するたびに希釈します。
- Ips (0 日) MEFs の除去:
- MEFs に Ips を 2 週間維持後、文化 Ips 細胞まで 100 mm ティッシュの培養皿で 80-90% の合流点に達する。過ごした hESC 培地を取り除き、5 ml の 1 x DPBS の Ips を洗います。セルをデタッチし、3 分間室温でインキュベート細胞剥離液の 1 mL を追加します。
- プレート細胞剥離ソリューション活動を中和し、剥離細胞を任意のコーティングなしの新しい 100 ミリメートル細胞培養用ディッシュに転送する MEF/MSC の培養液 9 mL を追加します。
- プレートに付ける MEFs ように 30 分間室温でセルを孵化させなさい。
- 未接続の Ips と 4 分の 4 ° C で 230 × g で遠心分離を含む上清を慎重に収集します。
注: はうっかりフラッシュ プレート下部 MEFs の剥離につながります。
- MSCs (日 0 - 28) に向かって Ips の分化:
- 1 ml あたり 30 分間室温でも 0.1% ゼラチンの 6 ウェル プレートの 3 つの井戸をコートします。
- 2.2.4 から収集した Ips の上澄みを削除します。
- ウェル (0 日) あたり 2 ml の MSC 分化培地 (表 1) と 3 つのコーティングされた井戸シード細胞 6 mL で Ips を再懸濁します。
- 2 日毎の MSC 分化培地を変更すると、未接続や死んだ細胞 (日 1 - 28) を削除します。
- IPSC 由来 Msc (日 28-45) の成熟:
- 過ごした MSC 分化培地を削除し、1 mL 1 x DPBS で血球を洗浄します。
- 0.25% の 0.5 mL で MSCs を trypsinize 3 分間室温でウェルあたりトリプシン-EDTA。
- MEF/MSC の培養液 1.5 mL のトリプシンを中和し、3 つの井戸から 1 つ 15 mL の円錐管に MSCs を収集します。4 ° C で 230 x g で 4 分間遠心します。
- 上澄みを除去し、MEF/MSC の培養培地 3 mL、1 60 mm 0.1% ゼラチン コーティング プレート (28 日) でプレートで MSCs を再懸濁します。
- MSCs を MEF/MSC 培地の文化し、中 2 日ごとに変更します。電池が 100% 合流、0.25% を使用して 1:3 の比率でサブカルチャー MSCs に達するときトリプシン-EDTA。
注: MSCs は、線維芽細胞のような形状 (図 2 b) を表示します。MSCs は、高密度が大きくなる、細長い MSCs は、渦巻状のパターン (図 2 b) を形成できます。 - MSC 表面マーカー CD44、CD73、CD105、CD166 を調べることによって iPSC 由来 Msc を評価する免疫蛍光染色を実行します (図 2)。
注: 抗体の希釈は表 2のとおりです。生きた細胞の免疫蛍光染色が製造元の指示に従って実行されます。 - 確認後、100 mm ティッシュの培養皿に 1:3 の比率で MSCs を展開します。バイアル (100 mm 培養皿あたり 3 バイアル) フリーズ 10 %dmso および 90% を含む凍結媒体を使用して政府短期証券。
注: MSC 人口を豊かにする MSCs 並べ替えることができます CD105 を使用して+流れ cytometry9,17CD24 条件。iPSC 由来 Msc 区別される一般的 PDGF ベース AB メソッドを使用しては、MSC の id9の損失なしの文化で 2-3 ヶ月維持できます。初期の通路番号から MSC 特性を確認した後 MSCs をフリーズします。
3. 骨芽細胞 (図 3 a) に LFS の分化
- MSCs の osteogenic 微分 (日-1) のための準備
- 細胞培養プロトコルを完了するための十分な量を確保するため、mscs では 95% の合流に 100 mm ティッシュの培養皿で培養を開始します。使用済み培を外し、MSCs を 1 x DPBS 5 mL で洗います。
- 1 ml あたり 3 分間室温で 100 mm ディッシュ 0.25% トリプシン-EDTA の MSCs を trypsinize します。細胞の剥離の 50% が顕微鏡下で観察すると、細胞がトリプシン以上ないように trypsinization を停止します。
- MEF/MSC の培養液 9 mL のトリプシンを中和し、3 井戸から 1 つ 15 mL の円錐管に MSCs を収集します。4 ° C で 230 x g で 4 分間遠心します。
- 上清を吸引、MSC 培地 5 mL で MSCs を再懸濁します、診断してセルの個数を数えます。
- プレート培養プレート上の MSCs の適切な番号。
注: 12 ウェル プレートのウェル プレート、100 mm ティッシュの培養皿の 6 の携帯電話番号の詳細を表 3にまとめます。
- 骨芽細胞分化培地 (ODM) (表 1) (日 0 - 24) による骨分化誘導の誘導:
- MEF/MSC の培養液を吸引し、ODM の適切なボリュームに置き換えます (1 mL、2 mL、8 mL 12 ウェル プレートの各ウェル、6 ウェル プレート 100 mm 組織文化の皿それぞれ) 骨芽細胞 (0 日) に MSCs を区別するために。
- 使用済の ODM を吸引し、骨分化プロセス中に 2 日毎 ODM の適切なボリュームに置き換えます。
- アルカリフォスファターゼ (AP) を実行し、preosteoblasts によって生成される骨関連するアルカリホスファターゼおよび鉱物の堆積によって生成されたを検出する染色アリザリン赤 S (ARS) 成熟骨芽細胞、それぞれ、3、6、9、12、15、18、21、24 (日図 3B)。
注: AP 染色とアルス染色、次のプロトコルをメーカー市販のキットを使用してを実行するされます。 - (ALPL と preosteoblasts; の COL1A1 preosteoblast と成熟した骨芽細胞マーカーの発現量を調べるPTH1R との BGLAP 骨芽細胞が成熟) qRT pcr (図 3)。
注: 肯定的な AP 染色による骨分化の日 9 の後と骨分化誘導の日 21 後陽性アルスが期待できます。MEF/MSC の培養培地で成長している MSCs は AP の染色とアルス染色陰性対照として楽しめます。
4. LFS MSC 由来骨芽細胞 (図 4 a) の生体内で腫瘍を勉強する異種移植モデル
- LFS MSCs の骨芽細胞への分化:
- シード 3 4.5 x 100 mm 細胞培養用ディッシュ 105 MSCs。1 皮下注射用の 5 つの料理を準備します。
- 14 日まで 3.2 で説明されているように、骨芽細胞に MSCs を区別するために ODM 文化 MSCs。
- 皮下注射用分化した骨芽細胞の作製:
- 骨芽細胞剥離ソリューション (表 1) を準備するには、アルファ MEM 媒体コラゲナーゼ II ソリューション (1 mg/mL) 1,000 mL に 1 g タイプ II コラゲナーゼを溶解します。-20 ° C でコラゲナーゼ II ソリューションを維持します。ミックス 0.25% トリプシン-EDTA と 1:1 の比率でコラゲナーゼ II ソリューション、骨芽細胞を剥離に希釈します。
- 過ごした ODM を削除し、100 mm 皿あたり 5 ml の 1 x DPBS の分化した骨芽細胞を洗浄します。
- 100 mm ディッシュごと骨芽細胞剥離溶液 1.5 mL を追加 30 分調査の 37 ° C で料理を孵化させなさいし、顕微鏡による骨芽細胞の剥離を確保します。
- ODM による骨芽細胞の剥離溶液を中和し、50 mL の円錐管に戸建の骨芽細胞を収集します。4 ° C で 230 x g で 5 分間遠心します。
- 上澄みを除去し、ODM 媒体の 25 の mL の細胞を再懸濁します。集計セルを削除するには、70 μ m セルこし器を通って細胞を通過します。診断を使用して細胞の数をカウントします。
- 4 分の 1 × 107骨芽細胞皮下注射と 4 ° C で 230 × g で遠心分離セルあたりを準備します。
- 50 μ L 冷たい 1 で 1 × 107骨芽細胞を再懸濁します x DPBS。ミックスは-フェノールレッド フリー基底膜マトリックス (1:1 の比率で混合した懸濁液および基底膜マトリックスに骨芽細胞) の 50 μ L で骨芽細胞の分化および骨芽細胞注入前に氷の上を維持します。
-
生体内で異種移植腫瘍モデル LFS MSC 由来の骨芽細胞の:
- 1 L/分の酸素 (CLAMC によって提供される) の 5% (v/v) 吸入イソフルランを供給室で 8 週齢女性免疫不全 NU/NU マウスを麻酔します。動物は側臥位になると、鼻の円錐形に麻酔の配信システムを切り替えると、2% を供給 (v/v) 吸入酸素 (CLAMC によって提供される) の 200 mL/分でイソフルラン。麻酔の深さを監視するには、マウスをする角膜とペダルの反射神経は十分に麻酔し、プロシージャの間に不快感なく苦しんでいるをチェックします。
- クロルヘキシジンと 70% イソプロパノールの交互の綿棒を注入すること領域を消毒します。26 G 針を使用して、8 週齢免疫不全 NU/NU マウス (図 4 a) の後ろ足の 1 つの側面に基底膜マトリックス混合 LFS 骨芽細胞の皮下注射を行います。
- 皮下結節性密度の成長のため注射部位での毎週の触診を実行してマウスを監視します。腫瘍の形成には、注入 (図 4 b) 後 6-10 週頃が観察できます。
- 頚部転位続いて二酸化炭素窒息法によるマウスを安楽死させます。開発した腫瘍を解剖します。様々 な染色法 (例えばヘマトキシリンとエオシン (H & E) 染色、Picro シリウス赤染色、およびコッサ染色それぞれ) によって腫瘍の異型度や分化インデックス、preosteoblasts、および成熟した骨芽細胞を決定します。
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Representative Results
このプロトコルは、LFS iPSC 世代、MSC 分化、骨芽細胞分化・ LFS MSC 由来骨芽細胞を用いた腫瘍生体内で試金プロシージャを示します。
LFS リプログラミング キット市販センダイ ウイルスを用いた線維芽細胞から Ips の生成のための方式は、図 1 aに表示されます。山中 4 因子のセンダイ ウイルス ベースの配布は、非統合プログラムし直す方法です。したがって、安定した LFS iPSC クローンはセンダイ ウイルス ゲノムと外因性 OCT4、SOX2、KLF4、C-MYC 遺伝子 (図 1 b) 特異的プライマーを用いた RT-PCR 法により検査することができるの損失無料する必要があります。製造元の指示にお勧め、センダイ ウイルス無料 Ips の世代文化と通路の両方の条件に依存します。このプロトコルで記述されている培養条件下で 10 の通路 (図 1 b) 後通常の Ips で仙台のウイルスの除去を検出できます。確立された LFS iPSC クローンは hESC の典型的な形態を展示し、肯定的な AP 活性 (図 1) を表示ください。LFS Ips 非常エクスプレス多能性因子 Mrna (NANOG、 OCT4、 SOX2、 DPPA4、およびREX1) hESC H1 ラインに匹敵して親線維芽細胞 (図 1) よりはるかに高い。多能性因子 (NANOG、OCT4) および悪名高くマーカー (SSEA4 とトラ-1-81) の式は、免疫蛍光染色 (図 1E) で調べることができます。
Ips は、MSC 分化 (図 2 a) を開始する前に、少なくとも 14 日間 MEFs に維持されます。MSC 分化時に起こる細胞死の多くが分化した細胞の塊が細胞培養プレート上に表示されると日 28 で線維芽細胞のような細胞の固まりの端に MSCs を観察できます。(図 2 b)。MEF/MSC の培養液中の細胞を分化サブ養殖後、分化 MSCs すばやく増殖日 35、周りの線維芽細胞のような形態を示すと徐々 に細長い形状を表すし、日 40 (図 2 b で渦巻き模様のようなパターンを形成).差別化された LFS MSCs エクスプレス MSC マーカー、蛍光抗体法 (図 2) を染色によって CD166、CD105、CD73 CD44 を含みます。
図 3 aは、骨芽細胞の分化をについて説明します。MSCs は、骨分化誘導信号を受けるが、分化した細胞は日 9 (図 3 b) で肯定的なアルカリホスファターゼ活性を表示を開始します。アルスの染色は、成熟した骨芽細胞によって生成されるミネラルの沈着の検出に使用できます。代わりに茶色の色染色染色、鮮やかな赤い色は、21 日 (図 3 b) 後観察することができますアルスが染色の肯定的な結果を示します。差別化の骨芽細胞は、骨分化誘導の preosteoblast 遺伝子 (ALPLとCOL1A1) と成熟した骨芽細胞の遺伝子 (BGLAPおよびPTH1R) のレベル増加式を表示します。
異種移植モデル体内は NU/NU マウス (図 4 a) で LFS MSC 由来骨芽細胞を皮下注射することによって確立できます。腫瘍 (図 4 b) 皮下注射後 6-10 週を観察できます。LFS 骨芽細胞由来腫瘍は否定的な鉱化作用 (コッサ染色) (図 4) が未熟な骨芽細胞特性、肯定的な AP 活性 (AP 染色)、肯定的なマトリックスのコラーゲン (picrosirius 赤染色) を実証.
図 1: LFS 患者線維芽細胞からの iPSC 生成します。(A) iPSC 世代の模式図。(B) センダイ ウイルスのゲノムと遺伝子の RT-PCR 検出 (コス (KLF4、OCT4、とSOX2)、KLF4、およびC-MYC) 10 通路 (左) と線維芽細胞感染後にプログラムし直された iPSC クローンで一日 11 (右、肯定的な制御)。LFS iPSC クローンは 10 継代後センダイ ウイルス無料です。GAPDHは内部コントロールとして表示されます。(C) セルの LFS Ips と AP 染色の形態。スケール バー、 NANOG、 SOX2、 OCT4、 DPPA4、LFS Ips でREX1 mRNA 発現の 50 μ m (D) qRT PCR。hESC H1 ラインと親 LFS 線維芽細胞は、それぞれ正と負の制御として使用されます。MRNA の発現は、 GAPDH式に正規化されます。相対の mRNA の発現は 1 として悪名高く H1 ラインに調整されます。(E) hESC 多能性転写因子 (NANOG、OCT4) と LFS Ips の表面マーカー (SSEA4 とトラ-1-81) を hESC の免疫染色。スケール バー、50 μ m。本研究で使用される抗体の希釈は、表 2のとおりです。プライマー シーケンスは、表 4のとおりです。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 2: MSCs に LFS Ips の分化します。(A) PDGF 誘起 AB MSC 分化の模式図。(B) 細胞の分化の日 28 日 36 ・日 40 + で LFS iPSC 由来 Msc の形態。スケール バーは CD44 を差別化された LFS MSCs に展示を示します 100 μ m。 (C) 蛍光染色+CD73+CD105+CD166+、および CD24-署名。スケール バー、30 μ m。本研究で使用される抗体の希釈は、表 2のとおりです。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 3: LFS の骨芽細胞に分化します。(A) 骨分化誘導の模式図。(B) AP とアルスの染色は、異なる時間ポイント (3、6、9、12、15、18、21、24 日) で行われます。LFS MSC 由来の骨芽細胞の骨芽細胞の分化は 9 日と 21 日で染色陽性アルス周辺汚染肯定的な AP に期待されています。(C) qRT PCR 解析は、骨分化誘導 (ALPLとCOL1A1) 前骨芽細胞および成熟した骨芽細胞 (PTH1R 、 BGLAP) 遺伝子の発現の増加を示しています。MRNA の発現は、 GAPDH式に正規化されます。発現レベルが細胞分化 0 日で。プライマー シーケンスは、表 4のとおりです。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 4:生体内でLFS MSC 由来の骨芽細胞の腫瘍形成します。(A) LFS 骨芽細胞の腫瘍異種移植の模式図。(B) NU/NU マウス皮下注射の 10 週間後の LFS 骨芽細胞由来腫瘍の負担。LFS (C) 骨芽細胞由来の腫瘍は H で調べた & E、AP、赤、picrosirius、コッサ染色形態、骨関連 AP、コラーゲン ・ ミネラル堆積物、それぞれ。LFS 由来腫瘍は、肯定的な AP 活性、肯定的なコラーゲンおよび否定的なミネラル鉱化作用を示す未熟な骨芽細胞の特性を表します。スケール バー、1 mm.この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
| 線維芽細胞培地 (500 mL) | |
| DMEM | 440 mL |
| FBS の熱不活化 | 50 mL |
| Antibiotics(Pen/Strep) (100 倍) | 5 mL |
| 非必須アミノ酸 (100 倍) | 5 mL |
| 2-メルカプトエタノール | 3.5 Μ L |
| MEF/MSC の培養液 (500 mL) | |
| DMEM | 440 mL |
| FBS の熱不活化 | 50 mL |
| Antibiotics(Pen/Strep) (100 倍) | 5 mL |
| L-グルタミン (100 倍) | 5 mL |
| hESC 媒体 (500 mL) | |
| DMEM/F-12 | 384.5 mL |
| ノックアウト血清交換 | 100 mL (合計: 20%) |
| 非必須アミノ酸 (100 倍) | 5 mL |
| 抗生物質 (ペン/連鎖球菌) (100 倍) | 5 mL |
| L-グルタミン (100 倍) | 5 mL |
| bFGF (10 μ G/ml) | 500 Μ L |
| 2-メルカプトエタノール | 3.5 Μ L |
| MSC 分化培地 (500 mL) | |
| ノックアウト DMEM/F-12 または DMEM/F-12 | 445 mL |
| ノックアウト血清交換 | 50 mL |
| bFGF (10 μ G/ml) | 500 μ L (10 ng/mL) |
| PDGF AB (25 μ g/mL) | 200 μ L (10 ng/mL) |
| 非必須アミノ酸 (100 倍) | 5 mL |
| 2-メルカプトエタノール | 3.5 Μ L |
| 骨芽細胞分化培地 (ODM) (500 mL) | |
| アルファ MEM | 395 mL |
| FBS の熱不活化 | 50 mL |
| 10 mM の β-グリセロリン酸 | 50 mL (50 mL アルファ MEM で 1.08 g) |
| 0.1 μ M デキサメタゾン (光感受性) | 5 mM デキサメタゾン 10 μ L |
| 200 μ M アスコルビン酸 (光感受性) | 1 mM アスコルビン酸の 100 μ L |
| 抗生物質 (ペン/連鎖球菌) (100 倍) | 5 mL |
| マトリゲル コーティング液 (50 mL) | |
| 基底膜マトリックス | 2 mL |
| DMEM/F-12 (前寒い 4 ° C) | 48 mL |
| 骨芽細胞剥離液 (50 mL) | |
| 0.25% トリプシン-EDTA | 25 mL |
| コラゲナーゼ II ソリューション (1 mg/mL) | 25 mL |
| 注: 使用する前に骨芽細胞剥離ソリューション新鮮な権利を準備します。コラゲナーゼ II ソリューションは、-20 ° C で 6 ヶ月までに格納されます。 | |
線維芽細胞培地、MEF/MSC の培養培地、hESC 媒体、MSC 分化培地、ODM、骨芽細胞剥離ソリューションの表 1: 組成。
| 抗体名 | 希釈 |
| NANOG | 1: 500 |
| OCT4 | 1: 300 |
| SSEA 4 PE 共役 | 1:600 |
| トライ-1-81 | 1:600 |
| ロバの反やぎ IgG します。 | 1: 500 |
| ヤギ抗うさぎ IgG します。 | 1: 500 |
| CD105 | 1: 500 |
| CD44 | 1: 500 |
| CD73 | 1: 500 |
| CD166 | 1: 500 |
| CD24 | 1: 500 |
表 2:抗体希釈します。
| 培養プレート | 播種密度 | アッセイ |
| 12 ウェル プレート | 0.67x10 細胞/ウェル | アルカリフォスファターゼ (AP 染色) 染色による |
| アリザリンレッド S 染色 (アルス染色) | ||
| 6 ウェル プレート | ウェルあたり 2 x 10 の4セル | RT-PCR 検出 |
| Preosteoblast マーカー: ALPL、COL1A1 | ||
| 成熟した骨芽細胞マーカー: PTH1R、BGLAP | ||
| 100 mm ディッシュ | 3 - プレートあたり 4.5x105セル | 生体内で腫瘍 |
テーブル 3:骨芽細胞分化の MSCs の密度を播種します。
| センダイ ウイルス プライマー | |
| ターゲット | プライマー セット |
| SeV | フォワード: GGATCACTAGGTGATATCGAGC |
| 逆: ACCAGACAAGAGTTTAAGAGATATGTATC | |
| コス (KLF4、OCT4、SOX2) | フォワード: ATGCACCGCTACGACGTGAGCGC |
| 逆: ACCTTGACAATCCTGATGTGG | |
| KLF4 | フォワード: TTCCTGCATGCCAGAGGAGCCC |
| 逆: AATGTATCGAAGGTGCTCAA | |
| c MYC | フォワード: TAACTGACTAGCAGGCTTGTCG |
| 逆: TCCACATACAGTCCTGGATGATGATG | |
| RT-PCR のプライマー | |
| ターゲット | プライマー セット |
| NANOG | フォワード: TTTGTGGGCCTGAAGAAAACT |
| 逆: AGGGCTGTCCTGAATAAGCAG | |
| SOX2 | フォワード: AGAAGAGGAGAGAGAAAGAAAGGGAGAGA |
| 逆: GAGAGAGGCAAACTGGAATCAGGATCAAA | |
| OCT4 | フォワード: AACCTGGAGTTTGTGCCAGGGTTT |
| 逆: TGAACTTCACCTTCCCTCCAACCA | |
| DPPA4 | フォワード: GACCTCCACAGAGAAGTCGAG |
| 逆: TGCCTTTTTCTTAGGGCAGAG | |
| REX1 | フォワード: GCCTTATGTGATGGCTATGTGT |
| 逆: ACCCCTTATGACGCATTCTATGT | |
| ALPL | フォワード: GGGACTGGTACTCAGACAACG |
| 逆: GTAGGCGATGTCCTTACAGCC | |
| COL1A1 | フォワード: GTGCGATGACGTGATCTGTGA |
| 逆: CGGTGGTTTCTTGGTCGGT | |
| PTH1R | フォワード: AGTGCGAAAAACGGCTCAAG |
| 逆: GATGCCTTATCTTTCCTGGGC | |
| BGLAP | フォワード: GGCGCTACCTGTATCAATGG |
| 逆: GGCGCTACCTGTATCAATGG |
表 4: プライマー情報。
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Discussion
MSC 分化効率化を実現するには、いくつかの側面が重要です。MSC 分化を開始する前に Ips の培養条件であります。原稿で示されるプロトコルは、前研究9,17に基づいています。Ips は、少なくとも 2 週間は MEFs に培養する必要があります。良い Ips を維持する MEFs の条件は MSC 分化用ゼラチン コーティング プレートを付けるように細胞にとって重要です。もう一つの重要な側面は、分化前に、MEFs に Ips の密度です。80 - Ips の 90% の confluency MSC 分化を開始するためお勧めします。Ips の増殖は分化過程の細胞生存率が低下します。MSC 分化を開始するとき、最後の重要なポイントは播種密度です。私たちの手で細胞密度の高いゼラチン コーティング プレートに iPSC 添付ファイルを推進しています。1 つ 100 mm ディッシュ Ips は、6 ウェル プレートの 3 つの井戸にシードすることができます。直接再と MSC 分化培地で Ips のめっきによる MSC 分化の開始は、Ips、したがって時折播種後深刻な細胞死で、その結果に大きな応力を生成します。Ips の高密度は、MSC 分化の成功率を増加します。
MSC の分化とは異なり、骨芽細胞の分化過程はより簡単です。再現性のある差別化の結果を達成するために開始の MSC の番号が一致しているを確認します。同じ細胞から骨芽細胞分化の結果がバッチからバッチを異なる場合があります、したがって、同じ路線のため差別化を設定する時間を与えるグループの間でより多くの比較の結果。MSC の数の増加は、以前の時点で AP とアルス染色によって示される分化プロセスを短縮します。また、ODM 媒体の変更は穏やかな方法で処理され、文化プロセス中に集約された骨芽細胞の潜在的な剥離により分化後期 (日 18 - 24) で強力な真空吸引システムは推奨されませんを確認します。
異種移植実験体内に使われて分化した骨芽細胞が骨芽細胞分化日 14 時時点です。14 日以降骨芽細胞は、集計し、コラーゲンおよび骨芽細胞によって生成される他の骨のマトリックス材料の巨大な蓄積により解離しにくい場合があります。2 - シードできる LFS MSCs 骨芽細胞解離の難しさを防ぐためには、骨芽細胞分化を促進する骨芽細胞の分化の開始ステップで 3 倍の高密度。LFS MSC 由来骨芽細胞を分離し、日 6 日目 - 7 分化の時点でアッセイの腫瘍生体内で6-10 分化の時点で収集できます。LFS 異種移植腫瘍モデルは、LFS MSC 由来骨芽細胞を生体内発癌性の能力は、骨肉腫の LFS 関連を勉強する代替プラットフォームを提供します要約を示します。
要約するでは、LFS 骨肉腫の iPSC ベース モデルは、骨肉腫の研究のための貴重な手段を提供します。LFS 患者にに加えて骨肉腫、軟部肉腫などの癌、乳癌、脳腫瘍・その他各種苦しみます。そのため、LFS iPSC ベースの疾患モデルを拡張できます他の LFS をモデルに関連する悪性腫瘍。LFS 患者由来 Ips を組み合わせると変異 p53 をエンジニア リング (mutp53) hESCs18LFS 病モデルも mutp53 関連付けられている悪性腫瘍の病因の輪郭を描くと発癌性対象と新規治療戦略の開発の価値があります。p5316。
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Disclosures
著者が明らかに何もありません。
Acknowledgments
R. Z.、がん予防の研究研修プログラム呼称される交わり (がん予防・ RP160015 を与えるテキサスの研究所) UTHealth 技術革新によってサポートされます。JT は、最初提携病院の孫逸仙大学の柯林プログラムによってサポートされます。D. f. l. は、がん研究の CPRIT 学者で NIH 経路独立賞 R00 CA181496 と CPRIT 賞 RR160019 でサポートされています。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Plastic ware | |||
| 100 mm Dish | Corning | 430107 | |
| 60 mm Dish | Corning | 430166 | |
| 6-well Plate | Falcon | 353046 | |
| 12-well Plate | Falcon | 353043 | |
| 48-well Plate | Falcon | 353078 | |
| 1 mL Pipet Tip | USA Scientific | 1111-2721 | |
| 200 µL Pipet Tip | USA Scientific | 1111-0706 | |
| 10 µL Pipet Tip | USA Scientific | 1111-3700 | |
| 5 mL Serological Pipette | SARSTEDT | 86.1253.001 | |
| 10 mL Serological Pipette | SARSTEDT | 86.1254.001 | |
| 25 mL Serological Pipette | SARSTEDT | 86.1685.001 | |
| 50 mL Tube, PP | SARSTEDT | 62.547.100 | |
| 15 mL Tube, PP | SARSTEDT | 62.554.100 | |
| Culture materials and Reagents | |||
| CytoTune- iPS 2.0 Sendai Reprogramming Kit | Invitrogen | A16517 | Commercial Sendai virus reprogramming kit |
| Corning hESC-Qualified Matrix | Corning | 354277 | Basement membrane matrix |
| CF1 MEFs, irradiated | ThermoFisher | A34180 | |
| DMEM | Sigma-Aldrich | D5671 | |
| DMEM/F12 | Corning | 10-090-CV | |
| αMEM | Corning | 10-022-CV | |
| StemMACS iPS-Brew XF | Miltenyi Biotec | 130-104-368 | Commercial iPSC medium |
| KnockOut DMEM/F-12 | ThermoFisher | 12660012 | |
| FBS Opti-Gold | GenDEPOT | F0900-050 | |
| KnockOut Serum Replacement | ThermoFisher | A3181502 | |
| Penicillin-Streptomycin | Sigma-Aldrich | P4333 | |
| MEM Nonessential Amino Acids | Corning | 25-025-CI | |
| L-Glutamine Solution | Sigma-Aldrich | G7513 | |
| 2-Mercaptoethanol | Sigma-Aldrich | M3148 | |
| Human FGF-basic (bFGF) | PEPROTECH | 100-18B | |
| Recombinant Human PDGF-AB | PEPROTECH | 100-00AB | |
| β-Glycerophosphate | Sigma-Aldrich | G9422 | |
| Dexamethasone | Sigma-Aldrich | A4902 | |
| Ascorbic Acid | Sigma-Aldrich | A5960 | |
| Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline, 1x (DPBS) | Corning | 21-031-CV | |
| StemMACS Passaging Solution XF | Miltenyi Biotec | 130-104-688 | Commercial passaging solution |
| Accutatse Cell Detachment Solution | Corning | 25-058-CI | Cell detachment solution |
| Thiazovivin (ROCK Inhibitor) | Calbiochem | 420220 | |
| 0.25% Trypsin-EDTA Solution | Sigma-Aldrich | T4049 | |
| Collagenase, Type II | ThermoFisher | 17101015 | |
| Human NANOG Antibody | R&D System | AF1997 | |
| OCT4 Antibody (H-134) | Santa Cruz | sc-9081 | |
| Human/Mouse SSEA-4 PE-conjugated Antibody | R&D System | FAB1435P | |
| Alexa Fluor 555 Mouse Anti-Human TRA-1-81 Antigen | DB Biosciences | 560123 | |
| Alexa Fluor 488 Donkey Anti-Goat IgG (H+L) | Jackson ImmunoResearch | 705-545-003 | |
| Alexa Fluor 488 Goat Anti-Rabbit IgG (H+L) | Jackson ImmunoResearch | 111-545-144 | |
| PE Mouse Anti-Human CD105 | eBioscience | 12-1057-42 | |
| FITC Mouse Anti-Human CD44 | DB Biosciences | 555478 | |
| PE Mouse Anti-Human CD73 | DB Biosciences | 550257 | |
| PE Mouse Anti-Human CD166 | DB Biosciences | 560903 | |
| FITC Mouse Anti-Human CD24 | DB Biosciences | 555427 | |
| Donkey Serum | Jackson ImmunoResearch | 017-000-121 | |
| Goat Serum | Jackson ImmunoResearch | 005-000-121 | |
| Alkaline Phosphatase Staining Kit II | Stemgent | 00-0055 | |
| Alizarin Red S | Sigma-Aldrich | A5533 | |
| TRIzol Reagent | ThermoFisher | 15596018 | |
| Chloroform | ThermoFisher | C298-500 | |
| 2-Propanol | ThermoFisher | A416-4 | |
| Ethanol, Absolute, Molecular Biology Grade | ThermoFisher | BP28184 | |
| DNase I, RNase-free (1 U/µL) | ThermoFisher | EN0521 | |
| iScript cDNA Synthesis Kit | BioRad | 1708891BUN | |
| iQ SYBR Green Supermix | BioRad | 1708884 | |
| Matrigel Matrix High Concentration (HC), Phenol-Red Free | Corning | 354262 | |
| 1 mL Slip Tip Syringe, 26 Gauge x 5/8 Inch | DB Biosciences | 309597 |
References
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