Summary
여기, 우리 제시 프로토콜 유도 만능 줄기 세포 (Ipsc)의 세대에 대 한 Li Fraumeni 증후군 (LFS) 환자 파생된 섬유 아 세포, 중간 엽 줄기 세포 (MSCs)를 통해 Ipsc의 차별화에서에서 osteoblasts, 및 모델링 비보 tumorigenesis LFS 환자 파생 osteoblasts를 사용 하 여입니다.
Abstract
Li Fraumeni 증후군 (LFS)는 상 염색체 지배적인 유전 암 질환 이다. LFS 환자는 종양, 다리-유년기와 청소년 기에 가장 빈번한 기본 비 혈액 악성 종양 중 하나를 포함 하 여 다양 한 유형의 predisposed 이다. 따라서, LFS이이 악성을 공부 하는 이상적인 모델을 제공 합니다. IPSC 방법론의 활용 LFS 연결 다리 LFS 환자 Ipsc 중간 엽 줄기 세포 (MSCs), 그리고 osteoblasts-osteosarcomas에 대 한 원래 셀을 차별화 하 여 성공적으로 모델링할 수 있다. 이러한 LFS osteoblasts 다리, 다리의 병 인을 묘사 하는 매력적인 모델 시스템 제공의 종양 속성 정리. 이 원고는 LFS 환자 fibroblasts, MSCs osteoblasts을 vivo에서 tumorigenesis LFS osteoblasts를 사용 하 여 MSCs의 차별화를 Ipsc의 차별화에서에서 Ipsc의 세대에 대 한 프로토콜을 보여 줍니다. 잠재적인 생체 또는 LFS 연결 다리에 대 한 치료 목표를 식별 하이 iPSC 질병 모델을 확장할 수 있습니다.
Introduction
2006 년과 2007 년 사이 여러 획기적인 결과 박사 신 야 야 마나카와 제임스 A. 톰슨의 실험실에서 유도 만능 줄기 세포 (Ipsc)1,2,3의 개발을 주도. 양식 Ipsc에 정의 된 transcriptional 요인과 체세포 프로그래밍, 연구팀은 즉 주요 특성을 가진 세포를 생성할 수 있었다, pluripotency, 및 자기 갱신, 이전에 생각 되었다 인간 배아 줄기 세포에 존재 (hESCs)입니다. Ipsc 어떤 개인 이나 환자에서 생성 될 수 있는 고 배아, 광대 하 게 사용 가능한 질병 및 배경 연구에 대 한 레 퍼 토리를 확장에서 파생 될 필요가 없습니다. 이후로, 환자 파생 Ipsc Alzheimer의 질병4 와 루 경화 증5 긴 QT 증후군6,7, 에서 다양 한 인간 질병의 표현 형을 정리 하는 데 사용 되었습니다. 8.
IPSC 연구이 진보는 또한 암 연구를 위한 새로운 길을 열었습니다. 여러 그룹 최근 사용 환자 Ipsc는 취약 유전 배경9,,1011, 모델 암 개발에 다리9, 날짜에 성공적인 응용 프로그램 백혈병10,,1112, 그리고 대 장 암13. IPSC 파생 암 모델 그들의 초기에서 여전히 있지만, 그들은 phenocopying 질병 관련 된 악성 종양, 병 적인 메커니즘 elucidating 고 치료 화합물14를 식별에 큰 잠재력을 증명 하고있다.
Li Fraumeni 증후군 (LFS) TP53 생식 돌연변이15에 의해 발생 하는 상 염색체 지배적인 유전 암 질환 이다. LFS 환자는 악성 다리를 포함 하 여 다양 한 유형의 predisposed 이다 만들고 LFS Ipsc 그들의 파생된 셀이 종은16공부에 특히 적합. 중간 엽 줄기 세포 (MSCs)로 분화 이후 LFS 환자 파생 Ipsc9 를 사용 하 여 및 다음 osteoblasts, 원본 세포는 iPSC 기반 다리 모델 처음 2015 년에 설립 되었다 다리의. 이러한 LFS osteoblasts osteogenic 차별화 다리 관련 결함 및 종양 속성, "접시에 뼈 종양" 플랫폼으로 서 잠재적인 모델을 보여주는 정리. 흥미롭게도, 게놈 전체 transcriptome 분석 공개 LFS osteoblasts에 다리 유전자 서명의 측면 그리고 다리9, 빈약한 예 지와이 LFS 유전자 표현 프로필의 기능 상관 나타내는 임상 관련성의 기능을 LFS Ipsc 질병 모델의 가능성이 있습니다.
이 원고는 LFS 환자 파생 Ipsc 모델 다리를 사용 하는 방법에 대 한 자세한 설명을 제공 합니다. 그것은 LFS Ipsc, Ipsc MSCs 그리고 osteoblasts, 하의 그리고 vivo에서 이 종이 식 사용 하는 모델 LFS osteoblasts의 사용의 세대를 자세히 설명 합니다. LFS 질병 모델은 몇 가지 이점이, 특히 기계 연구, 바이오 마커 식별 및 약9,14, 심사에 대 한 다리 개발의 모든 단계에서 무제한 세포를 생성 하는 기능 16.
요약 하자면, LFS iPSC 기반 다리 모델 다리 연구 진행을 위한 매력적인 보완 시스템을 제공 합니다. 이 플랫폼은 또한 암 모델링 Ipsc 환자 파생을 사용 하 여-의 증거-개념을 제공 합니다. 아래에 설명 된이 전략 모델 악성 암 선천적인와 다른 유전 질환과 관련 된을 쉽게 확장할 수 있다.
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Protocol
이 작품의 텍사스 대학 보건 과학 센터 휴스턴 (UTHealth) 동물 복지 위원회에 의해 승인 되었다. 실험 실험 동물 의학 & 케어 (CLAMC)는 실험 동물 배려 (AAALAC 국제)에 대 한 미국의 협회 공인 UTHealth 센터 설립 기준에 따라 수행 됩니다. 이 연구에서 인체 NIH SF424 설명서에서 정의한 대로 시나리오는 ("아니 인간 대상 연구")가을. 따라서, 그것은 UTHealth 인간의 연구 윤리 위원회에 의해 어떤 승인이 필요 하지 않습니다.
1. LFS Ipsc (그림 1A)의 생성
- 날-2, 6-잘 접시의 한 잘에 2 × 104 LFS 환자 fibroblasts 접시 하 고 37 ° c 습도 5%에서 섬유 매체 (표 1)와 셀 문화 CO2 배양 기. 섬유 아 세포 변환 (0 일)의 하루에 50-60% 합류에 도달 하는지 확인 합니다.
- 0에 센다이 바이러스 변환을 수행 합니다. 이렇게 하려면 보낸된 매체를 미리 데워 진된 섬유 매체 바꿉니다. 얼음에 ( 재료의 표참조) 키트 바이러스 프로그래밍 상업 센다이 녹여 LFS fibroblasts 제조업체의 지침에 따라 혼합 센다이 바이러스 감염.
- 섬유 매체 (주 1-6)에 transduced 셀의 유지 보수:
- 하루 1, 변환, 후 24 h에 나머지 센다이 바이러스를 포함 하는 섬유 매체를 제거 하 고 2 mL 신선한 섬유 매체와 그것을 대체 합니다. 37 ° c 습도 5%에서 transduced fibroblasts 문화 CO2 배양 기.
- 매일 하루 2-6에서에서 섬유 매체와 매체를 변경 합니다.
- Transduced 셀 피더 문화 조건 (하루 7-28)의 유지 보수:
- 준비 조사 CF1 마우스 미 발달 섬유 아 세포 (MEF) 문화 요리 주 6. 이 코트 할 30 분에 대 한 실 온에서 각 플레이트를 0.1% 젤라틴의 5 mL을 추가 하 여 6 개의 100 m m 조직 문화 요리 0.1% 젤라틴 코팅 후 발음.
- 액체 질소 용기에서 MEFs를 제거 합니다. 제조업체의 지침에 따라 상용 녹고 시스템을 사용 하 여 MEFs 녹여 100 m m 조직 문화 접시 당 105 셀 x 6.7 주위의 시드 밀도에 젤라틴 코팅 접시에 셀 MEF/MSC 문화 매체 (표 1) 접시.
- MEF 접시 (7 일)에 transduced 세포 접종: 0.25%의 1 mL를 사용 하 여 transduced 셀 Trypsinize 트립 신-EDTA 실 온에서 2-4 분 100 mm 접시 당. 트립 신 구와 매체의 9 mL를 중화. 원뿔 관에 전송 셀 및 4 분 37 ° C에서 230 x g에서 원심 분리기 세포 transduced fibroblasts 주 6에는 6 개의 MEF 요리에 접시 접시 당 섬유 매체의 8 mL에 문화.
참고: MEFs의 confluency는 약 20 %MEF 접시에 불리고 셀을 뿌리기 전에. - 8 일에 섬유 매체를 삭제 하 고 hESC 매체 (표 1)으로 바꿉니다.
- (그림 1C) 일 9 월 28 일에서에서 iPS 클론의 출현을 기다립니다. 매일 지출된 hESC 매체를 변경 하 고 현미경 iPS 클론의 출현을 모니터링. Ipsc 클론 맨 눈으로 관찰할 수 있을 만큼 큰 때까지 기다립니다 고 피더 무료 문화 조건에 iPS 클론 확장을 진행 합니다.
- 등장된 iPS의 확장 급지대 무료 문화 조건에 클론 (주 29-79 ~ 99):
- 매트릭스-코팅 접시를 준비 하려면 잘 당 지하실 멤브레인 매트릭스 코팅 솔루션 (표 1)의 120 µ L와 48-잘 접시 코트. 지하실 막 매트릭스 코팅 솔루션 잘 커버 하 고 문화 접시 표면 코트 다는 것을 확인 하십시오. 즉시 사용 하기 전에 코팅 솔루션 1 h. Aspirate에 대 한 실 온에 둬 고 2 µ M 바위 억제제 Thiazovivin와 당 hESC 매체의 250 µ L를 추가 합니다.
- 하루 28에서 보낸된 hESC 중간 발음 하 고 iPS 클론 1 x DPBS 세척 합니다. 보이는 iPS 클론 1 mL 피 펫 팁 및 치료 48-잘 접시 (단계 1.4.1)의 우물으로 이동을 선택 합니다. 48-잘 접시의 당 종자 한 식민지.
- 셀 첨부 파일을 촉진 하기 위하여 4 분 230g x에서 격판덮개 원심 37 ° c 습도 5%에서 iPS 클론 문화 CO2 배양 기.
- 다음 날 (29 일), 지출된 hESC 매체를 제거 하 고 각 잘에서 상용 iPSC 매체의 250 µ L를 추가 합니다.
- 37 ° c 습도 5%에서 iPS 클론 유지 CO2 배양 기, 그리고 변경 iPSC 매체 매일.
- 하위 1시 10분에서 세포 iPS 클론 85% 합류에 도달, 문화 영역에서 비율. 세포를 분리 하 여 3 분 동안 37 ° C에서 품 어 상업 passaging 솔루션의 60 µ L를 추가 합니다.
- 2 µ M 바위 억제제 Thiazovivin와 hESC 매체의 1 mL에 지하실 멤브레인 매트릭스 코팅 12-잘 접시에 분리 Ipsc의 씨앗. 1시 10분에서 잘하고 subculture Ipsc 당 상용 iPSC 매체의 1 mL와 함께 12-잘 접시에 iPS 클론 문화 비율 통로 10를 도달할 때까지.
참고: Ipsc는 교양 1시 10분에 5-7 일 마다 하위 비율. 그것은 통로 10 도달 iPS 클론에 대 한 10 주까지 걸립니다. iPSC characterizations 셀 형태학, 알칼리 성 인산 가수분해 효소 (AP) 활동, 및 pluripotency 요인과 hESC 마커, 표현의 Ipsc (일반적으로 약 10 후 시연에 센다이 바이러스의 제거를 확인 한 후에 시험 될 수 있다 구절) (그림 1B-E) IPSC 특성화에 대 한 항 체 및 뇌관 정보는 표 2 와 4에 포함 됩니다.
2. 차별화 LFS Ipsc 중간 엽 줄기 세포 (MSCs) (그림 2A)에
- 적어도 2 주 동안 MEF 접시에 복제 하 문화 iPSC (하루 ~-14-0): 앞에서 설명한 MEF 요리 (100 m m 조직 문화 접시) 준비 (1.3.1-1.3.2). Ipsc hESC 매체에 유지 하 고 매일 매체를 변경. 때마다 Ipsc 도달 90% 합류, subculture Ipsc 1:10 희석.
- Ipsc (0 일)에서 MEFs의 제거:
- Ipsc MEFs에 2 주 동안 유지, 후 셀까지 100 m m 조직 문화 요리에서 문화 Ipsc 합류 80-90%에 도달 합니다. 보낸된 hESC 매체를 제거 하 고 1 x DPBS의 5 mL와 Ipsc를 씻어. 세포를 분리 하 여 3 분 동안 실 온에서 품 어 세포 분리 솔루션의 1 mL를 추가 합니다.
- 세포 분리 솔루션 활동을 중화 하 고 어떤 코팅 없이 새로운 100 m m 조직 문화 접시에 분리 된 세포를 전송 하는 접시 MEF/MSC 문화 매체의 9 mL를 추가 합니다.
- 접시에 연결할 MEFs 수 있도록 30 분 동안 실내 온도에 세포를 품 어.
- 신중 하 게 첨부 되지 않은 Ipsc, 및 4 분 4 ° C에서 230 x g에서 원심 분리기를 포함 하는 상쾌한을 수집 합니다.
참고: MEFs의 분리를 리드 살짝 접시 바닥을 홍 조.
- MSCs (하루 0-28)를 향해 Ipsc의 차별화:
- 30 분 동안 실내 온도에 잘 당 0.1% 젤라틴의 1 mL와 함께 6 잘 플레이트의 3 웰 스 코트.
- 2.2.4에서 수집된 Ipsc의 상쾌한을 제거 합니다.
- 잘 (0 일) 당 2 mL와 MSC 차별화 매체 (표 1) 및 3 개의 코팅 스 씨 셀의 6 ml에서 Ipsc resuspend.
- 연결 되지 않은 및 죽은 세포 (주 1-28)를 제거 하 MSC 차별화 매체 매 2 일 변경.
- IPSC 파생 MSCs (하루 28-45)의 성숙:
- 보낸된 MSC 차별화 매체를 제거 하 고 씻어 1 x DPBS의 1 mL로 세포.
- 0.25%의 0.5 mL와 MSCs trypsinize 트립 신-EDTA 3 분 동안 실내 온도에 잘 당.
- MEF/MSC 문화 매체의 1.5 mL에 의해 트립 신을 무력화 하 고 한 15 mL 원뿔 튜브에 3 개의 우물에서 MSCs를 수집 합니다. 4 분 4 ° C에서 230 x g에서 원심 분리기.
- 제거는 상쾌한 고 MEF/MSC 문화 매체와 한 60 m m 0.1% 젤라틴 코팅 접시 (28 일)에 격판덮개의 3 mL에서 MSCs를 resuspend.
- MEF/MSC 문화 매체에서 MSCs 문화 그리고 매체 매 2 일 변경. 셀 100% 합류, 0.25%를 사용 하 여 1:3 비율로 subculture MSCs를 도달 하는 때 트립 신-EDTA.
참고: MSCs 표시 구와 같은 형태 (그림 2B). MSCs는 고밀도에 성장, 길쭉한 MSCs 소용돌이 모양의 패턴 (그림 2B)를 형성할 수 있습니다. - MSC 표면 마커 CD44, CD73, CD105, 및 CD166를 검사 하 여 iPSC 파생 MSCs를 평가 하기 위해 immunofluorescent 얼룩 수행 (그림 2C).
참고: 항 체의 희석 표 2에 표시 됩니다. 라이브 셀의 immunofluorescent 얼룩 제조업체의 지침에 따라 수행 됩니다. - 확인 후 100 m m 조직 문화 요리에서 1:3 비율로 MSCs를 확장 합니다. 튜브 (100 m m 조직 문화 접시 당 3 튜브) 아래로 고정 10 %DMSO 90%를 포함 하는 동결 매체를 사용 하 여 FBS.
참고: MSC 인구 풍부 하 MSCs 정렬할 수 있습니다 CD105를 사용 하 여+, CD24-조건 흐름 cytometry9,17. iPSC 파생 MSCs 분화 PDGF AB-기반 메서드를 사용 하 여 일반적으로 MSC 정체성9의 손실 없이 문화에 2-3 개월 동안 유지할 수 있습니다. MSC 특성을 확인 한 후 초기 통로 번호에서 MSCs를 고정 합니다.
3. Osteoblasts (그림 3A)를 LFS MSCs의 차별화
- MSCs osteogenic 차별화 (주-1)에 대 한 준비
- Osteogenic 분화 프로토콜을 완료 하려면 셀의 충분 한 수량을 유지 하려면 100 m m 조직 문화 요리 95% 합류를 경작 하는 MSCs로 시작 합니다. 소비 문화 매체를 제거 하 고 1 x DPBS의 5 mL와 MSCs를 씻어.
- 3 분 동안 실 온에서 100 mm 접시 당 0.25% trypsin EDTA의 1 mL와 MSCs를 trypsinize. 셀 이상 trypsinized 하지 있도록 셀 초연의 50%는 현미경 관찰 trypsinization 중지.
- MEF/MSC 문화 매체의 9 mL에 의해 트립 신을 무력화 하 고 한 15 mL 원뿔 튜브로 3 우물에서 MSCs를 수집 합니다. 4 분 4 ° C에서 230 x g에서 원심 분리기.
- 발음은 상쾌한, MSC 매체의 5 mL에 MSCs를 resuspend 하 고 셀의 수를 계산 하는 hemocytometer에 의해.
- 플레이트 문화 접시에 MSCs의 적절 한 번호
참고: 셀 수가 12-잘 접시, 6 잘 플레이트, 그리고 100 m m 조직 문화 접시의 표 3에 요약 되어 있습니다.
- Osteoblast 차별화 매체 (ODM) (표 1) (0-24 일)에 의해 osteogenic 분화의 유도:
- MEF/MSC 문화 매체를 발음 하 고 ODM의 적절 한 볼륨으로 바꿉니다 (1 mL, 2 mL와 8 mL 12-잘 접시의 각 잘, 6 잘 플레이트, 그리고 100 m m 조직 문화의 각 음에 대 한 접시, 각각) osteoblasts (0 일)를 MSCs를 차별화 하는 데.
- 보낸된 ODM 발음 고 osteogenic 차별화 과정에서 매 2 일 ODM의 적절 한 볼륨으로 바꿉니다.
- 알칼리 성 인산 가수분해 효소 (AP)를 수행 하 고 3, 6, 9, 12, 15, 18, 21, 및 24 ( 일에 알리자린 레드 S (ARS) 뼈 관련 알칼리 성 인산 가수분해 효소 preosteoblasts에 의해 생산 및 무기물 공 술 서 제작한 감지 하 얼룩 성숙 osteoblasts, 각각, 그림 3B).
참고: AP 얼룩 및 ARS 얼룩 상용 키트 다음 제조 업체 프로토콜을 사용 하 여 수행 됩니다. - Preosteoblast 하 고 성숙한 osteoblast 마커 (ALPL 및 preosteoblasts;에 대 한 COL1A1 식 수준 검사 PTH1R 및 BGLAP에 대 한 성숙 osteoblasts) qRT-PCR (그림 3C)에 의해.
참고: 긍정적인 AP 얼룩이 지는 하루 9 osteogenic 차별화의 후와 긍정적인 ARS 얼룩 osteogenic 차별화의 날 21 후 예상 될 수 있다. MSCs MEF/MSC 문화 매체에 성장 AP 얼룩 및 ARS 얼룩의 부정적인 컨트롤로 제공 됩니다.
4. LFS MSC 파생 Osteoblasts (그림 4A)의 Tumorigenesis Vivo에서 공부를 종이 식 모델
- Osteoblasts LFS MSCs의 차별화:
- 시드 3-4.5 x 100 m m 조직 문화 접시에 105 MSCs입니다. 1 피하 주입에 대 한 5 개의 요리를 준비 합니다.
- 하루 14까지 3.2에 설명 된 대로 osteoblasts를 MSCs를 차별화 하는 ODM에 문화 MSCs.
- 피하 주사에 대 한 차별화 된 osteoblasts의 준비:
- Osteoblast 분리 솔루션 (표 1)를 준비 하려면 1 g 유형 II 콜라 콜라 II 솔루션 (1 mg/mL) αMEM 매체의 1000 mL에 녹. -20 ° c.에 콜라 II 솔루션을 유지 0.25% 믹스는 osteoblasts 분리 솔루션으로 만들기 위해 트립 신-EDTA와 1:1 비율로 콜라 II 솔루션.
- 보낸된 ODM를 제거 하 고 100 mm 접시 당 1 x DPBS의 5 mL와 함께 차별화 된 osteoblasts 세척.
- 100 mm 접시 당 osteoblast 분리 솔루션의 1.5 mL를 추가 하 고 요리 30 분 검사에 대 한 37 ° c를 품 어 현미경 검사 법에 의해 osteoblast 분리를 보장.
- ODM에 의해 osteoblasts 분리 솔루션을 무력화 하 고 50 mL 원뿔 튜브에서 분리 osteoblasts 수집 합니다. 5 분 동안 4 ° C에서 230 x g에서 원심 분리기.
- 상쾌한을 제거 하 고 ODM 매체의 25 mL에 있는 세포를 resuspend. 집계 된 세포를 제거 하는 70 µ m 셀 스 트레이너를 통해 세포를 전달 합니다. hemocytometer를 사용 하 여 셀 수를 계산 합니다.
- 1 x 107 osteoblasts 피하 주입, 및 4 ° C에서 230 x g에서 원심 분리기 세포 당 4 분에 대 한 준비.
- 50 µ L 얼음 1에에서 1 × 107 osteoblasts resuspend x DPBS. 믹스는 osteoblasts 페 놀 레드 무료 지하실 멤브레인 매트릭스 (osteoblasts 펜션과 지하실 멤브레인 매트릭스 1:1 비율로 혼합)의 50 µ L로 분화 하 고 주입 전에 얼음 osteoblasts를 유지 합니다.
-
Vivo에서 이 종이 식 종양 모델 LFS MSC 파생 osteoblasts의:
- 1 L/min의 산소 (CLAMC에서 제공)에서 5% (v/v) 흡입 isoflurane 공급 챔버에 8 주 오래 된 여성 immunocompromised 뉴/뉴 마우스 anesthetize 동물 휴식 후, 원뿔, 공급 200 mL/min의 산소 (CLAMC에서 제공)에서 2% (v/v) 흡입 isoflurane 마 취 전달 시스템 전환 합니다. 쥐를 만들기 위해 각 막 및 페달 반사 충분히 마 취 및 수술 중 불편에서 고통을 하지 확인 하 여 마 취의 깊이 모니터링 합니다.
- 액체 및 70% 소 프로 파 놀의 대체 면봉으로 주입 영역을 치료. 26 G 바늘을 사용 하 여 8 주 된 immunocompromised 뉴/뉴 마우스 (그림 4A)의 뒷 다리의 한쪽으로 지하실 멤브레인 매트릭스 혼합 LFS osteoblasts의 피하 주사를 수행.
- 피하 결 밀도의 성장을 위한 사출 사이트에서 주간 촉진을 수행 하 여 마우스를 모니터링 합니다. 종양의 형성 (그림 4B) 주입 후 약 6-10 주를 관찰할 수 있습니다.
- 뒤에 자 궁 경부 전위 이산화탄소 질 식 방법으로는 마우스를 안락사. 개발 된 종양을 해 부. 다양 한 착 색 방법 (예: Hematoxylin과 오신 (H & E) 얼룩, Picro 시리우스 레드 얼룩, 및 von Kossa 각각 얼룩)으로 종양 급료와 차별화 인덱스, preosteoblasts, 및 성숙한 osteoblasts를 결정 합니다.
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Representative Results
이 프로토콜 등 LFS iPSC 세대, MSC 차별화, osteoblast 차별화, vivo에서 tumorigenesis 분석 결과 osteoblasts LFS MSC 파생을 사용 하 여 절차를 제공 합니다.
LFS Ipsc 키트 프로그래밍 상용 센다이 바이러스를 사용 하 여 섬유 아 세포에서의 세대에 대 한 스키마는 그림 1A에 표시 됩니다. 야 마나카 4 요인의 센다이 바이러스 기반 배달 비 통합 재활 방법입니다. 따라서, 안정적인 LFS iPSC 클론 센다이 바이러스 게놈 및 외 인 OCT4, SOX2, KLF4, 및 특정 뇌관 (그림 1B)를 사용 하 여 RT-PCR에 의해 시험 될 수 있는 c-MYC transgenes의 손실의 무료 되어야 합니다. 그것은 제조 업체의 지침에 좋습니다, 세대 센다이 바이러스 무료 Ipsc의 문화 및 통과 조건에 따라 달라 집니다. 이 프로토콜에서 설명된 문화 조건 10 구절 (그림 1B) 후 Ipsc 일반적으로에서 센다이 바이러스의 제거를 검색할 수 있습니다. 설립된 LFS iPSC 클론 전형적인 hESC 형태를 전시 하 고 긍정적인 AP 활동 (그림 1C)을 표시 해야 합니다. LFS Ipsc 높은 pluripotency 요소 mRNAs (NANOG, OCT4, SOX2, DPPA4및 REX1), 익스프레스 hESC H1 라인 비교 및 부모의 섬유 아 세포 (그림 1D) 보다 훨씬 높다. Pluripotency (NANOG, OCT4) 요인과 hESC 마커 (SSEA4 및 TRA-1-81)의 표현 또한 immunofluorescent 얼룩 (그림 1E)에 의해 시험 수 있습니다.
Ipsc는 MEFs에 MSC 차별화 (그림 2A)을 시작 하기 전에 적어도 14 일 동안 유지 됩니다. MSC 차별화 중 세포 죽음의 많은 일, 하지만 차별화 된 셀의 셀 문화 접시에 표시 되 고 셀의 가장자리에 섬유 모양의 MSCs 하루 28에서 관찰 될 수 있다. (그림 2B)입니다. 후 하위 경작 MEF/MSC 문화 매체에서 세포 분화, 차별화 된 MSCs 신속 하 게 확산 하루 35, 주위 섬유 모양의 형태를 표시 하 고 점차적으로 길쭉한 모양 및 하루 40 (그림 2B에서 소용돌이 모양의 패턴을 형성 ). 차별화 된 LFS MSCs MSC 마커, CD44, CD73, CD105, 및 CD166를 포함 하 여 면역 형광 염색 법 (그림 2C)로 표현 한다.
그림 3A osteoblastic 감 별 법을 설명합니다. MSCs osteogenic 차별화 신호를 받게 되 면 차별화 된 셀 하루 9 (그림 3B) 긍정적인 알칼리 성 인산 가수분해 효소 활동을 보기 시작 합니다. 성숙한 osteoblasts 제작한 미네랄 증 착 감지 하 ARS 얼룩을 사용할 수 있습니다. 밝은 붉은 색 대신에 갈색 얼룩 얼룩 하루 21 (그림 3B) 후 관찰 될 수 있는 ARS 얼룩의 긍정적인 결과 나타냅니다. 차별화 osteoblasts osteogenic 차별화 동안 증가 식 preosteoblast 유전자 (ALPL 및 COL1A1)와 성숙한 osteoblast 유전자 (BGLAP 및 PTH1R)의 수준을 표시합니다.
이 종이 식 모델 vivo에서 피하 LFS MSC 파생 osteoblasts 뉴/뉴 마우스 (그림 4A)에 주입 하 여 설정할 수 있습니다. 종양 피하 주사 (그림 4B) 후 6-10 주를 관찰할 수 있습니다. LFS osteoblast 파생 종양 부정적인 강화 (von Kossa 얼룩) (그림 4C) 하지만 미숙한 osteoblast 특성, 긍정적인 AP 활동 (AP 얼룩), 긍정적인 콜라겐 매트릭스 증 착 (picrosirius 빨간 얼룩) 시연 .
그림 1 : LFS 환자의 섬유 아 세포에서 iPSC 세대. (A) iPSC 세대의 회로도. (B) 센다이 바이러스 게놈 및 transgenes RT-PCR 탐지 (KOS (KLF4, OCT4, 및 SOX2), KLF4, 및 c-MYC) 10 구절 (왼쪽)과 섬유 후 감염 후 재설정된 iPSC에서에서 하루 11 (오른쪽, 긍정적인 통제)입니다. LFS iPSC 클론 10 구절 후 센다이 바이러스 무료입니다. GAPDH 는 내부 통제로 표시 됩니다. (C) 셀 LFS Ipsc 및 AP 얼룩의 형태. 스케일 바, NANOG, SOX2, OCT4, DPPA4및 REX1 mRNA 식 LFS Ipsc의 50 µ m (D) qRT-PCR. hESC H1 라인과 부모의 LFS fibroblasts 각각 양수와 음수 제어로 사용 됩니다. MRNA 식 GAPDH 식 정규화 됩니다. 상대 mRNA 식 hESC H1 라인 1로 조정 됩니다. HESC 만능 녹음 방송 요인 (NANOG OCT4) 및 hESC 표면 표식 (SSEA4와 TRA-1-81)에 LFS Ipsc의 (E) Immunostaining. 스케일 바, 50 µ m입니다. 이 연구에 사용 된 항 체의 희석 표 2에 표시 됩니다. 뇌관 시퀀스는 표 4에 나와 있습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 2 : MSCs LFS Ipsc의. (A) PDGF AB 유도 MSC 차별화의 회로도. (B) 세포 분화 하루 28, 하루 36, 그리고 하루 40 + LFS iPSC 파생 MSCs의 형태. 눈금 막대, 100 µ m. (C) 면역 형광 염색 차별화 LFS MSCs CD44 전시 보여 줍니다+, CD73+, CD105+, CD166+, 및 CD24- 서명. 스케일 바, 30 µ m입니다. 이 연구에 사용 된 항 체의 희석 표 2에 표시 됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 3 : Osteoblasts LFS MSCs의. (A) osteogenic 차별화의 회로도. (B) AP 및 ARS 얼룩 다른 시간 포인트 (3, 6, 9, 12, 15, 18, 21, 및 24 일)에서 수행 됩니다. LFS MSC 파생 osteoblasts osteoblastic 감 별 법 긍정적인 AP 하루 9와 긍정적인 ARS 하루 21에 얼룩 얼룩으로 이어질 전망 이다. (C) qRT-PCR 분석 osteogenic 차별화 도중 사전 osteoblast (ALPL 및 COL1A1)와 성숙한 osteoblast (PTH1R 및 BGLAP) 유전자의 증가 표현식을 보여 줍니다. MRNA 식 GAPDH 식 정규화 됩니다. 식 수준을 차별화 0에서 셀을 기준으로 했다. 뇌관 시퀀스는 표 4에 나와 있습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 4 : Vivo에서 LFS MSC 파생 osteoblasts의 tumorigenesis. (A) LFS osteoblasts의 종양이 종이 식의 회로도. (B) 뉴/뉴 마우스 피하 주입의 10 주 후 LFS osteoblast 파생 된 종양을 부담. (C) LFS osteoblast 파생 종양 H에 의해 시험 되었다 & 전자, AP, picrosirius 빨강, 및 형태학에 대 한 얼룩 von Kossa 뼈-관련 AP, 콜라겐, 그리고 미네랄 예금, 각각. LFS 파생 종양 긍정적인 AP 활동, 긍정적인 콜라겐, 부정적인 미네랄 강화를 보여주는 미 숙 osteoblast 특성을 나타냅니다. 눈금 막대, 1 m m. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
| 섬유 매체 (500 mL) | |
| DMEM | 440ml |
| 열 비활성화 FBS | 50 mL |
| Antibiotics(Pen/Strep) (100 x) | 5 mL |
| 불필요 한 아미노산 (100 x) | 5 mL |
| 2-Mercaptoethanol | 3.5 Μ L |
| MEF/MSC 문화 매체 (500 mL) | |
| DMEM | 440ml |
| 열 비활성화 FBS | 50 mL |
| Antibiotics(Pen/Strep) (100 x) | 5 mL |
| L-글루타민 (100 x) | 5 mL |
| hESC 매체 (500 mL) | |
| DMEM/F-12 | 384.5 m l |
| 녹아웃 혈 청 교체 | 100 mL (총: 20%) |
| 불필요 한 아미노산 (100 x) | 5 mL |
| 항생제 (펜/Strep) (100 x) | 5 mL |
| L-글루타민 (100 x) | 5 mL |
| bFGF (10 µ g/mL) | 500 Μ L |
| 2-Mercaptoethanol | 3.5 Μ L |
| MSC 차별화 매체 (500 mL) | |
| 녹아웃 DMEM/F-12 또는 DMEM/F-12 | 445 mL |
| 녹아웃 혈 청 교체 | 50 mL |
| bFGF (10 µ g/mL) | 500 µ L (10 ng/mL) |
| PDGF AB (25 µ g/mL) | 200 µ L (10 ng/mL) |
| 불필요 한 아미노산 (100 x) | 5 mL |
| 2-Mercaptoethanol | 3.5 Μ L |
| Osteoblast 차별화 매체 (ODM) (500 mL) | |
| ΑMEM | 395 mL |
| 열 비활성화 FBS | 50 mL |
| 10 m m β-Glycerophosphate | 50 mL (1.08 g 50 mL αMEM에서) |
| 0.1 µ M dexamethasone (빛 구분) | 5mm dexamethasone의 10 µ L |
| 200 µ M 의약품 (빛 구분) | 1mm 의약품의 100 µ L |
| 항생제 (펜/Strep) (100 x) | 5 mL |
| Matrigel 코팅 솔루션 (50 mL) | |
| 지하실 막 매트릭스 | 2 mL |
| DMEM/F-12 (전 찬 4 ° C) | 48 mL |
| Osteoblast 분리 솔루션 (50 mL) | |
| 0.25 %trypsin-EDTA | 25 mL |
| 콜라 II 솔루션 (1 mg/mL) | 25 mL |
| 참고: osteoblast 분리 솔루션 신선한 오른쪽 사용 하기 전에 준비. 콜라 II 솔루션-20 ° C에서 최대 6 개월까지 저장 됩니다. | |
표 1: 섬유 매체, MEF/MSC 문화 매체, hESC 매체, MSC 차별화 매체, ODM, 그리고 osteoblast 분리 솔루션의 작곡.
| 항 체 이름 | 희석 |
| NANOG | 1: 500 |
| OCT4 | 1:300 |
| SSEA-4 PE 활용 | 1:600 |
| 트라이-1-81 | 1:600 |
| 당나귀 안티 염소 IgG | 1: 500 |
| 염소-토끼 IgG | 1: 500 |
| CD105 | 1: 500 |
| CD44 | 1: 500 |
| CD73 | 1: 500 |
| CD166 | 1: 500 |
| CD24 | 1: 500 |
표 2: 항 체 희석.
| 문화 접시 | 시드 밀도 | 분석 결과 |
| 12-잘 접시 | 잘 당 0.67x104 셀 | 알칼리 성 인산 가수분해 효소 (AP 얼룩) 얼룩 |
| 알리자린 레드 S (ARS 얼룩) 얼룩 | ||
| 6 잘 플레이트 | 잘 당 2 x 104 의 세포 | RT-PCR 탐지 |
| Preosteoblast 마커: ALPL, COL1A1 | ||
| 성숙한 osteoblast 마커: PTH1R, BGLAP | ||
| 100 mm 접시 | 3-접시 당 4.5x105 셀 | Vivo에서 tumorigenesis |
표 3: 시드 osteoblastic 감 별 법에 대 한 MSCs의 밀도.
| 센다이 바이러스 뇌관 | |
| 대상 | 뇌관 세트 |
| SeV | 앞으로: GGATCACTAGGTGATATCGAGC |
| 역: ACCAGACAAGAGTTTAAGAGATATGTATC | |
| KOS (KLF4/OCT4/SOX2) | 앞으로: ATGCACCGCTACGACGTGAGCGC |
| 역: ACCTTGACAATCCTGATGTGG | |
| KLF4 | 앞으로: TTCCTGCATGCCAGAGGAGCCC |
| 역: AATGTATCGAAGGTGCTCAA | |
| c-MYC | 앞으로: TAACTGACTAGCAGGCTTGTCG |
| 역: TCCACATACAGTCCTGGATGATGATG | |
| RT-PCR 뇌관 | |
| 대상 | 뇌관 세트 |
| NANOG | 앞으로: TTTGTGGGCCTGAAGAAAACT |
| 역: AGGGCTGTCCTGAATAAGCAG | |
| SOX2 | 앞으로: AGAAGAGGAGAGAGAAAGAAAGGGAGAGA |
| 역: GAGAGAGGCAAACTGGAATCAGGATCAAA | |
| OCT4 | 앞으로: AACCTGGAGTTTGTGCCAGGGTTT |
| 역: TGAACTTCACCTTCCCTCCAACCA | |
| DPPA4 | 앞으로: GACCTCCACAGAGAAGTCGAG |
| 역: TGCCTTTTTCTTAGGGCAGAG | |
| REX1 | 앞으로: GCCTTATGTGATGGCTATGTGT |
| 역: ACCCCTTATGACGCATTCTATGT | |
| ALPL | 앞으로: GGGACTGGTACTCAGACAACG |
| 역: GTAGGCGATGTCCTTACAGCC | |
| COL1A1 | 앞으로: GTGCGATGACGTGATCTGTGA |
| 역: CGGTGGTTTCTTGGTCGGT | |
| PTH1R | 앞으로: AGTGCGAAAAACGGCTCAAG |
| 역: GATGCCTTATCTTTCCTGGGC | |
| BGLAP | 앞으로: GGCGCTACCTGTATCAATGG |
| 역: GGCGCTACCTGTATCAATGG |
표 4: 뇌관 정보입니다.
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Discussion
MSC 차별화 능률을 달성 하기 위해 여러 측면은 중요 합니다. 하나는 MSC 차별화를 시작 하기 전에 Ipsc의 문화 상태 이다. 원고에 제시 하는 프로토콜은 이전 연구 9,17를 기반으로 합니다. Ipsc는 적어도 2 주 동안 MEFs에 교양 있이 필요가 있다. 유지 좋은 Ipsc MEFs에 조건은 MSC 차별화 젤라틴 코팅 접시에 연결할 셀에 대 한 중요 한입니다. 또 다른 중요 한 측면은 차별 전에 MEFs에 Ipsc의 밀도. 80-Ipsc의 90% confluency MSC 차별화 시작 선호 된다. Ipsc의 자라 난 차별화 과정에서 세포 생존에 악영향을 줄 것 이다. MSC 차별화를 시작할 때 마지막 중요 한 포인트는 시드 밀도입니다. 우리의 손, 높은 세포 밀도 iPSC 젤라틴 코팅 접시에 첨부 파일을 촉진합니다. 한 100 mm 접시 Ipsc 6 잘 플레이트의 세 우물에 시드할 수 있습니다. 직접 resuspending 및 Ipsc MSC 차별화 매체에 도금 하 여 MSC 차별화의 개시 Ipsc, 따라서 때때로 뿌리기 후 심한 세포 죽음 결과에 큰 긴장을 생성 합니다. Ipsc의 고밀도 MSC 차별화의 성공률을 증가 시킵니다.
MSC 차별화, 달리 osteoblastic 감 별 법 과정은 더 간단 합니다. 재현할 수 차별화 결과 얻기 위해 시작 MSC 숫자는 일치를 확인 합니다. 동일한 셀 라인에서 osteoblastic 감 별 법의 결과 일괄 처리에서 일괄 달라질 수 있습니다, 그리고 따라서, 동시에 다른 라인에 대 한 차별화를 설정 시간 줄 것 이다 그룹 간의 비교 결과 더 합니다. MSC 숫자의 증가 이전 시간에서 AP와 ARS 긍정적인 얼룩이 지기에 의해 표시 된 차별화 과정 단축. 또한, ODM 매체의 변화에서 부드러운 방식으로 처리 하 고 강력한 진공 흡입 시스템 문화 과정 집계 osteoblasts의 잠재적인 분리 때문에 후반 차별화 단계 (하루 18-24) 권장 하지 않습니다 확인 합니다.
이 종이 식 실험 vivo에서 사용 하는 차별화 된 osteoblasts osteoblasts 하루 14 차별화 시간 시점에서 있습니다. 하루 14 보다 나중 osteoblasts 집계 하 고 collagens 및 osteoblasts 제작한 기타 뼈 매트릭스 자료의 거 대 한 축적으로 인해 해리 하기 어려울 수 있습니다. LFS MSCs 2-시드 수 osteoblast 분리의 어려움을 방지 하기 위해, 3 높은 밀도 osteoblast 차별화를 촉진 하기 위하여 osteoblastic 감 별 법의 개시 단계에서. LFS MSC 파생 osteoblasts 해리 고 하루 6-7 차별화 시간 포인트에서 6-10 차별화 시간 포인트 tumorigenesis vivo에서 시험 하루에 수집 될 수 있습니다. LFS이 종이 식 종양 모델 LFS MSC 파생 osteoblasts LFS 연결 다리를 공부 하는 다른 플랫폼을 제공 하는 비보 tumorigenic 기능에 정리 하는 방법을 보여 줍니다.
요약 하자면, LFS iPSC 기반 다리 모델 다리 연구를 위한 귀중 한 수단을 제공합니다. 뿐만 아니라 다리, LFS 환자 같은 연 조직 육 종 암, 유방암, 뇌종양의 다른 다양 한 종류에서 고통. 따라서, LFS iPSC 기반 질환 모델을 확장할 수 있습니다 다른 LFS 모델 관련 악성. LFS 환자 파생 Ipsc 결합 및 돌연변이 p53 엔지니어링 (mutp53) hESCs18, LFS 질병 모델 또한 mutp53 관련 된 악성 종양의 병 인을 묘사 하 고 종양을 대상으로 새로운 치료 전략을 개발에 큰 가치를가지고 p5316.
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Disclosures
저자는 공개 없다.
Acknowledgments
R. Z. 친목을 위한 암 예방 연구 훈련 프로그램 Pre-Doctoral (암 예방과 연구 연구소의 텍사스 RP160015 부여) UTHealth 혁신에 의해 지원 됩니다. Jt는 첫 번째 제휴 병원의 썬 얏-센 대학교의 애 린 프로그램에 의해 지원 됩니다. D. 플로리다 암 연구에서 CPRIT 학자 이며 독립 수상 R00 CA181496 및 CPRIT 수상 RR160019 NIH 통로에서 지 원하는.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Plastic ware | |||
| 100 mm Dish | Corning | 430107 | |
| 60 mm Dish | Corning | 430166 | |
| 6-well Plate | Falcon | 353046 | |
| 12-well Plate | Falcon | 353043 | |
| 48-well Plate | Falcon | 353078 | |
| 1 mL Pipet Tip | USA Scientific | 1111-2721 | |
| 200 µL Pipet Tip | USA Scientific | 1111-0706 | |
| 10 µL Pipet Tip | USA Scientific | 1111-3700 | |
| 5 mL Serological Pipette | SARSTEDT | 86.1253.001 | |
| 10 mL Serological Pipette | SARSTEDT | 86.1254.001 | |
| 25 mL Serological Pipette | SARSTEDT | 86.1685.001 | |
| 50 mL Tube, PP | SARSTEDT | 62.547.100 | |
| 15 mL Tube, PP | SARSTEDT | 62.554.100 | |
| Culture materials and Reagents | |||
| CytoTune- iPS 2.0 Sendai Reprogramming Kit | Invitrogen | A16517 | Commercial Sendai virus reprogramming kit |
| Corning hESC-Qualified Matrix | Corning | 354277 | Basement membrane matrix |
| CF1 MEFs, irradiated | ThermoFisher | A34180 | |
| DMEM | Sigma-Aldrich | D5671 | |
| DMEM/F12 | Corning | 10-090-CV | |
| αMEM | Corning | 10-022-CV | |
| StemMACS iPS-Brew XF | Miltenyi Biotec | 130-104-368 | Commercial iPSC medium |
| KnockOut DMEM/F-12 | ThermoFisher | 12660012 | |
| FBS Opti-Gold | GenDEPOT | F0900-050 | |
| KnockOut Serum Replacement | ThermoFisher | A3181502 | |
| Penicillin-Streptomycin | Sigma-Aldrich | P4333 | |
| MEM Nonessential Amino Acids | Corning | 25-025-CI | |
| L-Glutamine Solution | Sigma-Aldrich | G7513 | |
| 2-Mercaptoethanol | Sigma-Aldrich | M3148 | |
| Human FGF-basic (bFGF) | PEPROTECH | 100-18B | |
| Recombinant Human PDGF-AB | PEPROTECH | 100-00AB | |
| β-Glycerophosphate | Sigma-Aldrich | G9422 | |
| Dexamethasone | Sigma-Aldrich | A4902 | |
| Ascorbic Acid | Sigma-Aldrich | A5960 | |
| Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline, 1x (DPBS) | Corning | 21-031-CV | |
| StemMACS Passaging Solution XF | Miltenyi Biotec | 130-104-688 | Commercial passaging solution |
| Accutatse Cell Detachment Solution | Corning | 25-058-CI | Cell detachment solution |
| Thiazovivin (ROCK Inhibitor) | Calbiochem | 420220 | |
| 0.25% Trypsin-EDTA Solution | Sigma-Aldrich | T4049 | |
| Collagenase, Type II | ThermoFisher | 17101015 | |
| Human NANOG Antibody | R&D System | AF1997 | |
| OCT4 Antibody (H-134) | Santa Cruz | sc-9081 | |
| Human/Mouse SSEA-4 PE-conjugated Antibody | R&D System | FAB1435P | |
| Alexa Fluor 555 Mouse Anti-Human TRA-1-81 Antigen | DB Biosciences | 560123 | |
| Alexa Fluor 488 Donkey Anti-Goat IgG (H+L) | Jackson ImmunoResearch | 705-545-003 | |
| Alexa Fluor 488 Goat Anti-Rabbit IgG (H+L) | Jackson ImmunoResearch | 111-545-144 | |
| PE Mouse Anti-Human CD105 | eBioscience | 12-1057-42 | |
| FITC Mouse Anti-Human CD44 | DB Biosciences | 555478 | |
| PE Mouse Anti-Human CD73 | DB Biosciences | 550257 | |
| PE Mouse Anti-Human CD166 | DB Biosciences | 560903 | |
| FITC Mouse Anti-Human CD24 | DB Biosciences | 555427 | |
| Donkey Serum | Jackson ImmunoResearch | 017-000-121 | |
| Goat Serum | Jackson ImmunoResearch | 005-000-121 | |
| Alkaline Phosphatase Staining Kit II | Stemgent | 00-0055 | |
| Alizarin Red S | Sigma-Aldrich | A5533 | |
| TRIzol Reagent | ThermoFisher | 15596018 | |
| Chloroform | ThermoFisher | C298-500 | |
| 2-Propanol | ThermoFisher | A416-4 | |
| Ethanol, Absolute, Molecular Biology Grade | ThermoFisher | BP28184 | |
| DNase I, RNase-free (1 U/µL) | ThermoFisher | EN0521 | |
| iScript cDNA Synthesis Kit | BioRad | 1708891BUN | |
| iQ SYBR Green Supermix | BioRad | 1708884 | |
| Matrigel Matrix High Concentration (HC), Phenol-Red Free | Corning | 354262 | |
| 1 mL Slip Tip Syringe, 26 Gauge x 5/8 Inch | DB Biosciences | 309597 |
References
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