Summary
El líquido de la célula la microscopia electrónica puede utilizarse para observar dinámicas de nanocristales en un medio líquido con una mayor resolución espacial de otras técnicas de microscopía electrónica del líquido celular. Grabado premade nanocristales y siguiendo su forma utilizando grafeno líquido celular microscopia electrónica de transmisión puede dar importante información mecanicista sobre transformaciones de nanopartículas.
Abstract
Microscopia electrónica de grafeno líquido celular ofrece la posibilidad de observar a nanoescala las transformaciones químicas y dinámicas como las reacciones se producen en entornos líquidos. Este manuscrito describe el proceso para realizando grafeno líquido células a través del ejemplo de grafeno líquido celular microscopia electrónica de transmisión (TEM) experimentos de nanocrystal oro grabado. El protocolo para la fabricación de grafeno líquidas células consiste en recubrimiento de rejillas TEM de oro, de carbón perforado con grafeno de deposición de vapor químico y luego usar las rejillas recubiertas de grafeno para encapsular líquido entre dos superficies de graphene. Estas bolsas de líquido, con los nanomateriales de interés, son imágenes en el microscopio electrónico para ver la dinámica de los procesos a nanoescala, en este caso el ataque oxidativo de nanobarras de oro. Controlando la tasa de dosis de haz electrónico que modula la especie de grabado en el líquido celular, se pueden entender mejor los mecanismos subyacentes de cómo se eliminan átomos de nanocristales para formar formas y facetas. Grafeno líquida célula TEM tiene las ventajas de la alta resolución espacial, compatibilidad con titulares tradicionales de TEM y los costos de lanzamiento bajo de grupos de investigación. Limitaciones actuales incluyen la delicada preparación, falta de capacidad de flujo y la dependencia de productos radiolysis generado por el haz de electrones para inducir reacciones. Con mayor desarrollo y control, célula líquida de grafeno puede ser una técnica omnipresente en nanomateriales y biología, y está ya siendo utilizado para el estudio de los mecanismos que rigen procesos de crecimiento, aguafuerte y uno mismo-montaje de los nanomateriales en líquido en el nivel sola partícula.
Introduction
Síntesis controllably nanocristales1 y ensamblaje de nanopartículas en grandes estructuras2,3 requieren la comprensión de los mecanismos fundamentales que gobiernan cómo átomos y nanopartículas interactúan y se unen juntos. Idealmente, los estudios de estos procesos a nanoescala se realizaría en su medio líquido nativo con la correspondiente resolución espacial necesaria para observar los fenómenos de interés, pero estos requisitos plantean desafíos debido a la longitud del nanómetro la escala en que operan estos sistemas. Investigadores durante mucho tiempo han deseado utilizar la resolución espacial de la microscopia electrónica para estos procesos de la imagen, pero el vacío de la columna de microscopio electrónico requiere encapsulación del líquido4. Algunos primeros experimentos de microscopio células líquido encapsulan líquido entre dos Silicio Nitruro membranas5,6,7,8, y este método se ha convertido en un comercialmente disponibles técnica para el estudio de procesos dinámicos de escala nanométrica.
Los titulares de silicio disponibles comercialmente nitruro líquido de la célula TEM han proporcionado la resolución necesaria para ver y comprender una variedad de interesantes fenómenos en la nanoescala9,10,11,12 , 13 , 14 , 15 , 16. algunos titulares TEM comercial líquido celular tienen capacidades adicionales tales como calefacción, flujo, y las conexiones eléctricas que expansión el Reino de los procesos a nanoescala que puede ser investigado. Sin embargo, con todas estas capacidades, los sistemas comerciales no están optimizados en lograr la máxima resolución espacial. Para investigadores que necesitan mejorar la resolución espacial, disminuye el grosor de la ventana y disminuyendo el espesor de líquido son dos posibles rutas menos dispersión del haz de electrones y mejor resolución17. Algunos grupos que utilizan las células de líquido de nitruro de silicio fabrican sus propias ventanas que produce un mayor control sobre la ventana y espesores de líquido. 18 la dispersión disminución de estas células líquidas hecho en casa ha permitido estudios de microscopia electrónica con mayor resolución espacial incluyendo resolución atómica estudios19,20,21.
Puesto que el grueso del material encapsulado es un aspecto que afecta negativamente a la resolución espacial de los experimentos de líquido celular, materiales atómicamente delgados, de baja impedancia como grafeno sería ideales encapsular materiales22, 23. hojas de grafeno son todavía lo suficientemente fuertes como para proteger los bolsillos de líquido de la diferencia de presión de la columna. Además, estas bolsas de líquido de la célula de grafeno usualmente contienen capas más finas de líquidos, mejorar la resolución espacial posible. Se han investigado muchos interesantes procesos de nanoescala grafeno líquido células incluyendo estudios siguiendo trayectorias de faceta de nanopartículas y dinámica de nanopartículas con resolución atómica23,24,25 ,26,27. Una ventaja accidental de la técnica de la célula líquida de grafeno es que esta alta resolución espacial se puede lograr sin necesidad de la compra de un titular diferentes de TEM o de fabricación de silicio especializado. Experimentos con células de nitruro de silicio que alcanzaron alta resolución también requieren grandes nanopartículas compuestas de átomos pesados, mientras que la resolución obtenida por la célula líquida de grafeno puede proporcionar la resolución atómica para sub-2 nm nanopartículas25. Además, la célula líquida del grafeno ha abierto oportunidades para el estudio de muestras biológicas con microscopia electrónica debido a la naturaleza flexible del grafeno encapsulado28,29 y la capacidad del grafeno para mitigar algunos de los efectos dañinos del electrón viga de30. Debido a estas ventajas, microscopia electrónica de grafeno líquido de la célula tiene el potencial para convertirse en una técnica estándar en la comunidad de la Nanociencia, una vez que un mayor número de investigadores comprende mejor si esta técnica puede ayudar a su investigación y cómo aplicar Esta técnica.
Investigadores en química, nanomateriales, biológicos y otros campos que desean una resolución espacial de transformaciones en situ pueden beneficiarse utilizando la técnica de microscopia electrónica de grafeno líquido celular. Este método en situ es especialmente valiosa para procesos de no equilibrio que requieren visualización durante la transformación. Una desventaja importante de las técnicas TEM de líquido de la célula es la generación de especies radiolysis por de haz de electrón perturbative31, que pueden inducir cambios no deseados en las muestras delicadas. Los investigadores han desarrollado modelos para intentar cuantificar la química basada en viga31,32, y se están desarrollando estrategias para mitigar estos efectos30,32. Grafeno líquida célula TEM tiene el desafío adicional de ser frágil y a menudo difícil de hacer, especialmente para los nuevos investigadores a la técnica. El objetivo de este artículo es compartir los detalles de cómo experimentos grafeno líquido celular TEM puede llevarse a cabo (figura 1), utilizando un ejemplo experimento observando grabado sola partícula de nanocristales y mostrar que esa celda líquida de grafeno experimentos están posibles para casi cualquier grupo con acceso a un microscopio electrónico. El protocolo cubre capa de grafeno de rejillas, formación líquida de la célula, uso TEM de grafeno líquido celular grabado experimentos y técnicas de análisis de imagen. Encapsulan de pasos críticos en la fabricación de las células del líquido como el tamaño de la gota, una cuidadosa consideración de contenido líquido, y uso de grafeno de transferencia directa solamente se cubrirá con consejos adicionales sobre cómo evitar repetir los errores de investigadores anteriores. Grafeno líquido celular TEM es una técnica emergente para la investigación a nanoescala, y este artículo permitirá que nuevos actores comenzar a utilizar esta técnica.
Protocol
1. fabricación de rejillas TEM de grafeno recubierto
- Cortar un áspero trozo de2 cm 2 de premade grafeno en cobre (véase Tabla de materiales) que adapta a las rejillas TEM de alrededor de 6 a 8.
Nota: Con 3 - 5 capas grafeno en lugar de una sola capa de grafeno encapsula líquidos bolsillos con mayores tasas de éxito sin perder resolución. Puesto que el grafeno es un material atómico fino, baja impedancia, más pérdida de resolución es de grueso líquido líquido células de grafeno. - Limpie el grafeno utilizando un lavado acetona (figura 2A).
Nota: Este paso está diseñado para eliminar cualquier residual PMMA [poly(methyl methacrylate)] izquierda sobre la superficie del grafeno durante el proceso de deposición. Si el usuario está seguro de que su grafeno limpio, este paso es innecesario.- Coloque la pieza de grafeno en el cobre en un plato de Petri de vidrio y llenarlo con acetona.
Nota: La acetona se utiliza porque PMMA se disuelve en acetona. - Caliente suavemente la solución de acetona (~ 50 ° C) durante 5 minutos, la solución se arremolinan periódicamente.
Nota: Asegúrese de que la acetona y temperatura para evitar un incendio. Esto debe realizarse en una campana de humos. - Retire la pieza de grafeno en cobre de la colada de acetona con pinzas y sustituir la acetona con acetona, nuevo y limpio.
Nota: Tenga cuidado de no raspar o dañar la superficie del grafeno con las pinzas. - Repita el proceso de lavado un total de 3 veces.
- Deje que el grafeno en cobre al aire completamente antes de ir al siguiente paso.
- Coloque la pieza de grafeno en el cobre en un plato de Petri de vidrio y llenarlo con acetona.
- Lisa la pieza de grafeno en cobre para eliminar cualquier arruga macroscópica (figura 2B).
Nota: Este proceso de alisado se realiza para asegurarse de que las rejillas de láminas-TEM de soporte perforado (véase la Tabla de materiales) son capaces de adherencia a la superficie del grafeno. Protuberancias y pliegues en el grafeno en cobre dificultan mantener buen contacto.- Tomar dos portaobjetos limpios y coloque un trapo doblado (véase Tabla de materiales) en la diapositiva de cristal de fondo. Sobre el paño, colocar la pieza de grafeno en cobre. Por último, colocar el segundo portaobjetos de cristal en la parte superior.
Nota: Colocar la pieza de grafeno en cobre con el lado de grafeno para arriba (tocar portaobjetos de vidrio) para evitar posibles rayones por el paño tejido. El tejido doblado se utiliza para empujar hacia fuera las arrugas y evitar doblar en nuevos pliegues gradualmente. - Presione hacia abajo en la diapositiva superior, poco a poco suaviza cualquier arruga en el pedazo de grafeno en cobre. Reducir el número de pliegues en el tejido y repetir el proceso de prensado. Continuar el proceso hasta una presión final entre los dos portaobjetos con ningún trapo de tejido.
- Tomar dos portaobjetos limpios y coloque un trapo doblado (véase Tabla de materiales) en la diapositiva de cristal de fondo. Sobre el paño, colocar la pieza de grafeno en cobre. Por último, colocar el segundo portaobjetos de cristal en la parte superior.
- Colocar rejillas TEM de la pieza de grafeno en cobre (figura 2).
- Coloque el carbón amorfo perforado apoyo rejillas aluminio-TEM (véase Tabla de materiales) hacia abajo sobre el grafeno con el carbono amorfo en contacto con el grafeno.
Nota: Tenga cuidado de no doblar o deformar las rejillas TEM al recoger con las pinzas. Rejillas TEM de doblado no enlazar correctamente el grafeno. Recogiendo las rejillas por el borde de la rejilla impide la deformación de las rejillas. Aquí, rejillas TEM de oro se utilizan para evitar que las rejillas de grabado durante el paso que elimina el cobre del grafeno en cobre. - Ponga unas gotas de isopropanol en las rejillas.
Nota: Si cualquier rejillas ser comprometidas, suavemente mueva los con la punta de unas pinzas después de poner el isopropanol en las rejillas. Tenga cuidado de no dañar la superficie del grafeno. - Deje secar por 2 + h para hacer rejillas que son adecuadamente en condiciones de servidumbre. Este proceso de secado trae el carbón amorfo perforado en mejor contacto con el grafeno.
Nota: Para comprobar si las rejillas se han adherido al grafeno, suavemente Levante la pieza de grafeno en cobre y Voltéela boca abajo. Si la gravedad no sacar las rejillas, debe ser correctamente en condiciones de servidumbre.
- Coloque el carbón amorfo perforado apoyo rejillas aluminio-TEM (véase Tabla de materiales) hacia abajo sobre el grafeno con el carbono amorfo en contacto con el grafeno.
- Grabado al cobre con una solución de persulfato de sodio (Figura 2D).
- Hacer una solución con 1 g de persulfato de sodio en 10 mL de agua desionizada.
- Utilizando pinzas, coloque con cuidado el pedazo de grafeno en cobre en la solución de persulfato de sodio con el lado de cobre hacia abajo. Deje que el flotador de la pieza en la parte superior de la solución de persulfato de sodio (Figura 2D).
- Mantener la solución con rejillas recubiertas de grafeno sentado toda la noche. Tenga en cuenta que la solución se convierta en azul como graba el cobre, y no habrá ningún cobre visible detrás de la hoja de grafeno ha terminado grabado (Figura 2E).
- Lave las rejillas para limpiar apagado el persulfato de sodio.
- Sacar las rejillas flotantes de la solución y encima limpio, desionizada agua (véase Tabla de materiales para filtro) en un segundo plato de Petri.
Nota: El método más fácil para las redes de transferencia implica el uso de un portaobjetos de vidrio para recoger las redes y luego colocarlos abajo en la segunda placa de Petri con agua. Algunas rejillas caerá a la parte inferior de la caja Petri durante el proceso de transferencia. Esto es generalmente un signo de que el grafeno en la cuadrícula está agrietado o dañado. - Repita este proceso 3 veces para eliminar todo residuo de persulfato de sodio de las rejillas recubiertas de grafeno.
- Recoger las redes con las pinzas, coloque el lado de grafeno de rejillas arriba sobre un papel de filtro y deje secar.
Nota: Esta transferencia final de la colada del agua puede ser difícil, como las redes a menudo se adhieren a las pinzas debido a las fuerzas capilares del agua residual.
- Sacar las rejillas flotantes de la solución y encima limpio, desionizada agua (véase Tabla de materiales para filtro) en un segundo plato de Petri.
2. líquido de la célula de hacer bolsillos
- Tomar dos rejillas TEM de grafeno recubierto y grafeno lado para arriba en un portaobjetos de vidrio. Usando una hoja de bisturí pequeño, corte el borde de una de las rejillas TEM grafeno recubierto, aproximadamente 1/4 a 1/8 del área de la cuadrícula (Figura 3A).
Nota: Corte una de las rejillas se presume para traer el grafeno en las dos rejillas en contacto más cercano para proporcionar la mejor interacción de grafeno grafeno a bolsillos de forma. - Preparar la solución que se encapsula.
Nota: La solución es específica del nanocrystal grabado experimento.- Hacer Tris HCl tampón con agua desionizada a una concentración entre 10-100 mM.
Nota: Hemos encontrado que para la preparación de soluciones acuosas de nanopartículas metálicas, tampón Tris que HCl conduce a una mayor tasa de éxito de bolsillos estables aunque se necesitan más estudios para comprender por qué Tris almacenador intermediario ácido clorhídrico ayuda a hacer bolsillos estables. Usando base de tampón Tris o ningún tampón Tris que ambos parecen tener tasas de éxito mucho menores de formación de bolsillo en este caso. Cada solvente y la muestra probablemente requerirá optimización para encontrar las condiciones que estable los bolsillos al no alterar la química que estudia. Un breve estudio de la literatura muestra éxito con Orto-diclorobenceno/oleylamine (relación 9:1),23 0.5 x Tris-borato-EDTA (TBE) y 200 mM NaCl solución,33 y acuosa 0.15 M NaCl solución30 así como el acuoso buffer Tris HCl sistema presentado aquí. - Hacer una solución de3 FECLAS de 40 mM en una solución de agua desionizada con 1.8 μl de HCl por mL de agua.
Nota: Las FECLAS3 es el grabador para este experimento grabado. Otros experimentos pueden añadir diferentes soluciones dependiendo del experimento que está realizando. - Hacer nanobarras de oro y concentrar la muestra nanorod después de la limpieza1,34.
- 0,15 ml de 0.01-0.1 m Tris almacenador intermediario ácido clorhídrico, 0.1 mL de 40 mM FECLAS3 de ácido clorhídrico y 10 μl de nanobarras.
- Hacer Tris HCl tampón con agua desionizada a una concentración entre 10-100 mM.
- Coloque la gota de ~0.5 μl de solución que se encapsula en la cuadrícula TEM no cortar grafeno recubierto. Utilice unas pinzas para sujetar el borde de la rejilla TEM colocando la gota para que las fuerzas capilares no recoja la rejilla TEM (figura 3B).
Nota: Tenga cuidado hacer la gota más pequeña posible y colocarlo como cerca del centro de la red como sea posible. - Rápidamente y con cuidado coloque la rejilla TEM grafeno recubierto con la esquina cortada encima de la gota; el objetivo es que la segunda red vienen a descansar encima de la primera red con líquido no conseguir exprimido hacia fuera (figura 3).
Nota: Tener la segunda cuadrícula ya colocada en la pinza de cierre automático puede hacer este proceso más rápido y más fácil. Este es sin duda el paso más difíciles del proceso de formación de líquido celular con muchas fallas potenciales que pueden ocurrir. Bajar la rejilla superior al quitar las pinzas es un reto como las pinzas pueden conseguir pegadas entre las dos redes. En general, colocando un borde de la parrilla superior del TEM hacia abajo y luego poco a poco soltar la red funciona mejor. Tenga en cuenta que si se ve líquido sobre el portaobjetos de cristal, luego los bolsillos probablemente no sellar correctamente. - Espere 5 minutos para permitir que la forma de bolsillos de líquido de la célula de grafeno.
Nota: Algunos evaporación del líquido puede ocurrir como se forman los bolsillos, pero una vez que se forma un sello hermético, pérdida de líquido adicional no es probable. Las concentraciones relativas de cada especie en la solución deben permanecer constante. - Traer la muestra a la temperatura para la proyección de imagen.
Nota: La cantidad de tiempo de sellado varía de investigador a investigador. Para experimentos de la aguafuerte, menos tiempo antes de que la célula líquida a la temperatura es deseable para evitar la pre-grabado.
3. carga y grafeno líquido celular la proyección de imagen
Nota: la operación del microscopio electrónico de transmisión seguido los procedimientos estándar encontrados el manual del usuario. Cada TEM tendrá procedimientos de alineación diferente.
- Lugar la célula líquida de grafeno en una tradicional solo TEM incline soporte (figura 4).
Nota: Otros titulares estándar como doble inclinación los titulares o los titulares de la calefacción puede ser utilizada también. Los titulares que utilizan un mecanismo de tornillo-como para fijar la rejilla TEM pueden imponer una fuerza que destruye la célula líquida de grafeno. - Cargue el soporte TEM en la columna TEM.
Nota: Puesto que la célula líquida de grafeno contiene un pequeño volumen de líquido con ningún depósito y tiene bolsillos separados, no hay rigurosamente busque fugas como experimentos de líquido celular de nitruro de silicio. Aunque el estallido de un bolsillo de líquido de la célula de grafeno, sólo una muy pequeña cantidad de líquido se libera y así no estrellaría la aspiración TEM. - Uso de las nanopartículas y carbono amorfo en la muestra correctamente alinear el haz TEM (inclinación de la pistola, alineación de abertura del condensador y condensador stigmation), y (Z-altura ajuste, stigmation objetiva, alineación del centro de rotación y aberración de imagen Corrector de sintonía si es aplicable). Luego retire el soporte de la trayectoria de viga y calibrar la tasa de dosis de haz de electrones.
- Encienda el filamento TEM de al menos 20 minutos antes de calibración para permitir que se estabilice para dosis reproducibles; este tiempo de espera puede variar según el sistema TEM y tipo de cañón de electrones.
Nota: Microscopistas de elección suelen ser dosis para referirse al número de electrones entregado por unidad de área por unidad de tiempo (e–/Å2s). En la comunidad de la química de radiación, esto se conoce como la densidad de flujo, y tasa de dosis se define como la cantidad de energía absorbida por unidad de área por unidad de tiempo. Desde el cálculo de la cantidad de energía absorbida por una muestra es difícil para geometrías complejas encontradas células de líquido, y para mantener la coherencia con la comunidad TEM, elegimos utilizar la tasa de dosis para referirse a electrones por unidad de área por unidad de tiempo. - Condensar el haz a la cantidad más condensado, más alta tasa de dosis, necesaria para el experimento utilizando la pantalla de visualización (figura 5A). Leer y guárdelo lente actual para la viga condensada.
Nota: Para pasos 3.3.2 para 3.3.5, fue escrito un script personalizado micrografía digital que toma el control del sistema condensador de TEM para calibrar la lente de condensador (C2) segundo actual con la tasa de dosis de electrones entregados. Esto permite al investigador establecer reproducible la tasa de dosis de electrónica a valores arbitrarios durante el experimento. - Extienda la viga a la mayor cantidad de extensión más baja tasa de dosis, es necesaria para el experimento utilizando la pantalla de visualización (figura 5B). Leer y guárdelo el objetivo actual para la propagación de la viga.
- Dividir el rango de las corrientes de la lente de condensador de 10 valores equidistantes y recoger imágenes para cada valor de la lente de condensador con la cámara CCD.
- Convertir cuentas de CCD para usando CCD sensibilidad y aumento de calibración para cada lente actual de tasa de dosis.
- Utilizar los datos del flujo de electrones en corrientes diferentes de la lente para hacer una curva de calibración. Utilice esta curva de calibración para el resto del experimento para controlar el haz de electrones el flujo deseado.
- Vuelva a insertar la muestra a la trayectoria de viga.
- Encienda el filamento TEM de al menos 20 minutos antes de calibración para permitir que se estabilice para dosis reproducibles; este tiempo de espera puede variar según el sistema TEM y tipo de cañón de electrones.
- Comenzar búsqueda de nanopartículas en los bolsillos de líquido manteniendo la tasa de dosis baja (generalmente alrededor de 20 e–/Å2s).
Nota: Mantener la tasa de dosis baja impide que las nanopartículas grabado mientras buscaba las nanopartículas. - Cuando una nanopartícula se encuentra en un bolsillo de líquido, afinar el enfoque en la nanopartícula manteniendo una tasa de dosis baja.
Nota: Para determinar si una nanopartícula es un bolsillo de líquido puede ser difícil, pero la presencia de burbujas o el movimiento de las partículas a menudo es una buena señal de un bolsillo de líquido estable. A veces, en lugar de líquido, los bolsillos se asemejan a un gel muy denso con burbujas moviéndose muy lentamente. Estas situaciones son causadas por la evaporación del líquido potencialmente debido a grietas en el grafeno o bolsillos sin sellar. Es bastante fácil distinguir entre geles no entornos de movimiento y líquido con burbujas rápidamente moviendo y cambiando de forma. Puede haber algunos evaporación durante la formación de bolsillos de buen líquido celular, pero concentraciones relativas entre reactivos permanece constante. - Uso de la calibración de la curva (véase el paso 3.3 para esto) para ajustar la lente de condensador actual para la tasa de dosis deseada (figura 5).
Nota: Se utiliza un guión interno lente condensador actual y parámetros de adquisición de imagen - Comenzar a colectar una serie de tiempo de imágenes TEM con metadatos de sellos de tasa y el tiempo de dosis incrustado en el archivo de imagen.
- Después de que la partícula haya grabado, extiende la viga y comenzar buscando otras nanopartículas en los bolsillos de líquido.
- Cuando se han recogido una cantidad suficiente de nanopartículas grabado videos, retire el soporte TEM de la TEM siguiendo procedimientos estándar de TEM. Tomar la célula líquida de grafeno de soporte TEM.
Nota: Una sesión de imagen típica dura alrededor de 2-3 h con aproximadamente 30 videos tomados. El número de videos con datos utilizables depende de la calidad de las bolsas y el tipo de experimento de la aguafuerte.
4. imagen análisis de TEM vídeos utilizando el Software computacional
Nota: Videos TEM son 2 dimensiones proyecciones de formas 3-dimensional, análisis cuidadoso de imágenes deben hacerse para extraer las tasas de grabado o cambios de la forma.
- Convertir la DM3 nativo archivos de video a un avi con ImageJ y el formato de importación de los vídeos avi en software computacional (véase Tabla de materiales).
- Analizar cada nanorod en cada fotograma del vídeo.
- Para determinar el contorno de la nanorod umbral la imagen (Figura 7A).
Nota: El alto contraste de las nanopartículas metálicas facilita análisis de imagen. Para el estudio de sistemas con menor contraste, filtros adicionales se pueden necesitar antes de umbralización. - Desde el contorno de la nanorod, determinar el eje mayor y menor de la elipse de forma más cercana (figura 7B).
Nota: El software de análisis de imagen integrado para determinar el eje mayor y menor asume que la forma es una elipse. Para un nanorod, que no es una elipse, estos no se deben utilizar valores cuando tamaño de nanopartículas. - Use el eje principal para cortar el contorno nanorod en dos mitades (figura 7).
- Con cada una de estas mitades, determinar el volumen y la superficie de la forma de ese contorno alrededor del eje principal de rotación.
Nota: Este método de cálculo se denomina a veces como el método de los anillos. Este método de análisis sólo funciona si el nanorod es simétrica alrededor del eje mayor. Tener dos mitades para comparar volúmenes y áreas superficiales proporciona cierta tranquilidad que la nanorod es verdaderamente rotación simétrica.
- Para determinar el contorno de la nanorod umbral la imagen (Figura 7A).
- Después de extraer el volumen y la superficie de la nanorod para cada fotograma del vídeo, compilar e interpretar los datos.
Nota: Este método de esquematización también permite el análisis de las facetas de nanocristales con formas definidas.
Representative Results
Fotogramas de un video representativo de un nanorod grabado bajo una tasa de dosis de haz de electrón de 800 e–/ Å2s se muestran en la figura 6. La solución requiere alrededor de 20 s de iluminación rayo antes de que comience la nanorod sometidos a ataque oxidativo. Después de grabado el nanorod, la tasa de remoción de los átomos permanece constante mientras el nanorod también mantiene una proporción constante. Las nanobarras normalmente no tienen movimiento significativo durante los videos que es consistente con trabajos previos de la TEM de líquido celular usando nanopartículas de este tamaño24. Puesto que las nanopartículas no mueven mucho, burbuja generación y movimiento de la burbuja son generalmente las mejores maneras de determinar si una nanopartícula es un bolsillo de líquido. Como el nanorod se convierte en pequeño, el nanorod comienza girando y moviendo dentro y fuera del plano focal, confirmando que el nanorod es en un medio líquido.
La falla más común de células líquido grafeno es la incapacidad para encapsular estables bolsillos de líquido. A veces esto puede llevar a secar completamente caracterizado por sin burbujas y sin movimiento de nanopartículas o cambio de tamaño de bolsillo. Además, un bolsillo puede comenzar con el líquido y las burbujas pero posteriormente secar antes de la nanopartícula graba completamente. Generalmente para una buena celda líquida, cada bolsillo es estable por alrededor 2-3 min en la tasa de dosis de ataque, y bolsillo de secado sólo se convierte en un problema para gran nanopartículas o procesos de la aguafuerte lenta. A veces, líquido puede evaporarse de un bolsillo y dejar atrás una solución parecida al gel con una concentración salina muy alta. Estos geles son generalmente evidentes cuando proyección de imagen debido al alto contraste de la solución y muy lento movimiento de las burbujas y las partículas. Los datos recogidos en estas soluciones de gel-como no se puede confiables.
Después de recoger el líquido celular datos TEM, se analizan los videos con grabado de nanopartículas. Los volúmenes, superficies y facetas (si corresponde) pueden ser extraídas y evaluaron más (figura 7). Una indicación de un bolsillo del secado es considerable desaceleración de la tasa de ataque en el tiempo, para trazar el volumen contra el tiempo puede ser un método eficaz para comprobar la estabilidad de la bolsa y la confiabilidad de los datos. Otros resultados subóptimos incluyen grabado no simétrica indicativo del contenido de bolsillo no homogénea y precipitaciones indeseables de especies de hidróxido de hierro desde el grabador de cloruro de hierro. En general, la clave más importante para éxito grafeno células líquido es un medio líquido estable que lleva a dinámicas de nanocrystal reproducible sobre múltiples nanopartículas y bolsillos de líquido.
Figura 1 . Esquema de grafeno líquido celular técnica TEM. (A) para montar una célula líquida de grafeno, una gota de solución se coloca en una rejilla TEM de carbón perforado recubierto de grafeno. Una segunda rejilla de grafeno recubierto se coloca sobre la gota para formar un bolsillo. Tenga en cuenta que esta imagen no está a escala y la gota de líquido es demasiado grande alrededor del 33%. (B) Zoomed-en esquema de un bolsillo de líquido durante la proyección de imagen de TEM de nanobarras de oro. Esta historieta también no es de la escala. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2 . Proceso para la fabricación de grafeno recubierto rejillas TEM (A) lavado el grafeno en cobre pieza en acetona caliente (B) quitar arrugas macroscópicas aplanando grafeno en cobre entre dos portaobjetos. Un pañuelo de papel se coloca debajo de la pieza de grafeno en cobre con el fin de no doblar las arrugas nuevas. (C) colocación de rejillas TEM de amorfo carbón perforado sobre grafeno en cobre con lateral de carbono amorfo de rejillas TEM tocando el grafeno. (D) flotante rejillas de cobre/grafeno/TEM en sodio persulfato reactivo. Esto elimina el cobre de las rejillas. (E) grafeno recubierto rejillas TEM después del grabado de cobre. La solución es azul y queda sin cobre en las rejillas recubiertas de grafeno. Para referencia del tamaño, el diámetro del placa de Petri de vidrio es de aproximadamente 6 cm y el portaobjetos de cristal es 7,5 cm por 2,5 cm. haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3 . Proceso para la fabricación de grafeno células líquidas (A) dos grafeno recubierto rejillas TEM preparadas en un portaobjetos de cristal con un borde cortan de una de ellas. El bisturí quirúrgico utilizado para cortar la red está en la parte superior derecha de la imagen. (B) gota de encapsular solución en una rejilla recubierta de grafeno. La gota en la parrilla superior es del tamaño adecuado y ha hecho un buen grano en el grafeno. La gota en la rejilla inferior ha sangrado por el grafeno, posiblemente debido a una grieta en el grafeno. (C) red de grafeno recubierto segundo colocado encima de primera rejilla con gotas de solución. Esta célula líquida de grafeno está ahora lista para cargar en un TEM. Para referencia del tamaño, el portaobjeto es 7,5 cm por 2,5 cm. haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 4 . Carga de líquido celular de grafeno en soporte de inclinación único estándar TEM. La célula líquida del grafeno cabe en un soporte estándar de TEM solo-inclinación de la misma manera una rejilla TEM normal encaja en el soporte. Para referencia del tamaño, la rejilla TEM tiene un diámetro de 3 mm. haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 5 . Control de haz TEM. (A) condensada haz de electrones para la calibración de la tasa de dosis usando la pantalla fluorescente. (B) ampliada haz de electrones para la calibración de la tasa de dosis ve con pantalla fluorescente. Intensidad disminuye a medida que los electrones por área por tiempo disminuyen por el haz de electrones es muy débil. (C) curva de calibración relaciona la tasa de dosis del haz de electrón la lente de condensador actual. Esta curva de calibración se utiliza para controlar la tasa de dosis del haz durante proyección de imagen. (D) parámetros utilizados al recoger videos TEM de nanopartículas en las células líquidas de grafeno. Valores específicos para cada parámetro pueden cambiar dependiendo del material que se va a examinar y la resolución necesaria. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 6 . Nanorod oro grabado en un bolsillo de líquido de la célula de grafeno. Fotogramas de un vídeo representativo de TEM de un oro nanorod grabado en dosis de 800 e–/ Å s2. Después de un período inicial de ningún ataque, la nanorod graba a una velocidad constante. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 7 . Método para el análisis de fotogramas de vídeo (A) esbozar la nanorod mediante umbralización en software de análisis de imagen. (véase Tabla de materiales) Esto separa la nanopartícula de fondo y proporciona una forma para el análisis cuantitativo. (B) la determinación de los ejes mayores y menores de la nanorod. (C) extracción de cada uno la mitad del contorno 2D de corte a lo largo del eje principal. Con estos contornos, reconstruir la forma 3D girando el contorno alrededor del eje x. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Discussion
El líquido de la célula la microscopia electrónica puede proporcionar información mecanicista sobre el crecimiento de nanocristales y grabado con alta resolución espacial, pero puesto que la fabricación de grafeno células líquidas puede ser difícil y delicado, la técnica requiere atención al detalle para extraer datos utilizables. Incluso después de la extensa práctica haciendo grafeno líquidas células, solamente cerca de una mitad a una cuarta parte de las células de líquido hechas con éxito encapsular la solución líquida. El paso crítico en la formación de células de líquido está colocando la segunda rejilla encima de la gota de líquido. Errores comunes incluyen conseguir las pinzas entre las dos cuadrículas, cayendo la segunda rejilla demasiado lejos fuera del centro y a partir con una gota que es demasiado grande. Puesto que la Asamblea de grafeno líquido células es delicada y requiere habilidades motoras finas, generalmente requiere práctica para realizar con éxito los bolsillos de líquido. Debido al costo de rejillas TEM de grafeno recubierto, se recomienda encarecidamente que nuevo grafeno líquido celular primera práctica usuarios la célula líquida de proceso de fabricación de rejillas TEM de carbono amorfo, cobre tradicional para ahorrar dinero.
Determinación de las causas de fallo en las células de líquido puede ser difícil porque el investigador no puede saber si cada paso ha sido exitosa hasta la muestra al final de la proyección de imagen, y errores, como rayar el grafeno, pueden pasar desapercibidas. El error más fácil de identificar es un montaje incorrecto porque el investigador verá inmediatamente fugas líquido fuera de la célula líquida de grafeno. Problemas con hacer el grafeno en rejillas de cobre, como agrietamiento de grafeno, pueden ser más difícil de identificar. La calidad del grafeno puede comprobarse antes y después de las rejillas TEM usando la espectroscopia de Raman de la capa, pero el grafeno está generalmente inutilizable después de esta prueba. Además, es importante utilizar grafeno transferencia directa porque las dos caras del grafeno está poniendo juntos deben ser limpios para formar correctamente un sello mediante fuerzas de Van der Waals. Fabricación de rejillas recubiertas de grafeno a través de métodos de transferencia de polímero puede dejar residuos de polímero en el grafeno que se espera que unen. Si se sigue el procedimiento correcto utilizando las rejillas TEM correcto, falta de éxito con la célula líquida de grafeno es generalmente debido a mal manejo del grafeno y rejillas durante el montaje y fabricación.
Grafeno líquido celular que TEM avances técnicas TEM de líquido celular existentes mediante el uso de un diluyente encapsulado material que puede utiliza en cualquier soporte TEM tradicional, haciendo de alta resolución y la trayectoria de la faceta experimentos de seguimiento mucho más fácil. Con la resolución de células de líquido de membrana de nitruro de silicio comerciales, gran parte de la faceta y la información cinética que puede alcanzarse por aguafuerte nanocristales en la célula líquida de grafeno sería perdido. Grafeno también se pueden realizar experimentos de líquido de la célula TEM en existente solo incline titulares TEM negando la necesidad de costosos nuevos titulares especializados. Además, la célula líquida de grafeno se puede poner en cualquier soporte que acepta las muestras de rejilla TEM para experimentos de líquido de la célula a realizar en avanzada titulares (calefacción, doble inclinación, refrigeración, crio, catodoluminiscencia) donde líquido de nitruro de silicio las células no han sido diseñadas. Además, las células líquido grafeno no plantean el riesgo de estrellarse el vacío de la columna TEM si rompen los bolsillos como otras técnicas TEM de líquido de la célula. Aunque la célula líquida del grafeno no es una técnica omnipresente en los campos de nanocrystal, su facilidad de uso y resolución espacial hará que sea mucho más ampliamente utilizado en el futuro.
Incluso con sus muchas ventajas, grafeno líquido celular TEM tienen limitaciones sobre los tipos de experimentos que se pueden realizar. Un líquido se evapora como bolsillos de forma, por lo que es difícil determinar exactamente la concentración de especies en solución, sin considerar efectos de haz de electrones. Grafeno líquido las células también tienen tamaños al azar, alturas y distribuciones de bolsitas, para que células de caudalómetro de nitruro de silicio tienen la ventaja de concentraciones cuantificables de la vigas y capas líquidas grandes y uniformes. Como se describe en este trabajo, muestras precargadas sólo pueden verse con grafeno líquido celular en el TEM, así que no es posible fluir en otras soluciones para desencadenar las reacciones químicas. Las especies radiolysis generadas por la interacción de los electrones con el líquido son el gatillo único que se puede utilizar para iniciar una reacción. Aunque no demostrado aún, podrían activarse térmicamente iniciados procesos en células de líquido grafeno usando titulares de calefacción estándar. Efectos de radiolysis inducida por el haz de electrones no se entienden y pueden ser difíciles de controlar. Los investigadores han desarrollado modelos cinéticos para determinar el contenido de bolsas de líquido de la célula después de la interacción de la viga31,32, pero su exactitud es limitada por el número de reacciones incluida en el modelo y una concentración desconocida cambios debido a la sequía. Contenido de bolsillo inicial complejo con muchas especies reaccionan como FECLAS3, tampón Tris e incluso grafeno30, puede ser difícil de comprender mediante un modelo cinético. Otra desventaja de la microscopia electrónica de células de líquido es que es difícil de caracterizar la composición de los cristales formados durante procesos dinámicos. Por ejemplo, en experimentos de crecimiento de sistemas de varios componentes, puede ser imposible distinguir Qué fases o especies crecen si el nuevo nanocristales están amorfo o no en el eje de la zona. Esta es otra razón por qué es deseable aguafuerte forma nanocristales de composición conocida sentado sobre un eje de zona conocida. Por último, todavía hay algunos argumentos que reacciones inducidas por el rayo en una celda líquida de grafeno no representan las condiciones de las reacciones de ex situ en un matraz.
Grafeno futuro líquido celular experimentos ayudarán a aliviar algunas de estas preocupaciones, también mediante TEM nuevo progresa a más sonda los misterios subyacentes de nanocristales. Correlativos ex situ nanocrystal síntesis y grabado experimentos será fundamentales para corroborar los mecanismos vistos en experimentos de líquido de la célula TEM. Además, los investigadores han comenzado a trabajar en la adición de capacidades de flujo al grafeno líquido de la célula TEM35 y haciendo más bolsillos controlada36 incluyendo arreglos de grafeno líquidas células uso litográfico prepararon agujeros37. Avances en microscopia electrónica resolución y cámara de velocidad hará que el grafeno líquido células más capaces de estudiar la dinámica atómica durante las transformaciones de nanocrystal. Bolsitas de líquido en un material atómico delgado como el grafeno para su uso en microscopía electrónica tiene multitud de posibles aplicaciones y sin duda se convertirá en un elemento básico de la investigación de la Nanociencia en el futuro.
Disclosures
Los autores no tienen nada que revelar.
Acknowledgments
El trabajo fue financiado por el Departamento de energía de Estados Unidos, oficina de ciencia, oficina de ciencias básicas de energía, Ciencias de materiales y división de ingeniería, bajo contrato no. DE-AC02-05-CH11231 dentro de la química física del programa de nanoestructuras inorgánicas (KC3103).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2-propanol (Isopropanol) | Sigma Aldrich | 190764-4L | |
| Acetone | Fisher Chemical | A949-4 HPLC Grade | |
| FeCl3 | Sigma Aldrich | 44944-250g | |
| Gold Quantifoil, Amorphous Carbon TEM Grids | SPI Supplies | 4230G-XA | 300 Mesh Gold, R1.2/1.3- Often extensively on back-order |
| Graphene | ACS Materials | GnVCu3~5L-4x2in | We special order this to get graphene only on one side. The double sided product number is CVCU3022. Usually, we use 3-5 layer graphene for making Graphene Liquid Cells. If researchers need single layer graphene for their liquid cells, we have been using Grolltex recently |
| Hot Plate | IKA | C-MAG HS 7 Digital | |
| Hydrochlorid Acid | Fisher Chemical | 7647-01-0 | |
| Kimwipe Tissues | Kimberly-Clark | 34120 | |
| Matlab | Mathworks | ||
| Millipore Water Filter | Millipore | F4NA85846D | |
| Sodium Persulfate | Sigma Aldrich | 71890-500g | |
| Surgical Scalpel Blade | Swann-Morton | No. 6 | |
| TEM | FEI | Tecnai T20 S-Twin | TEM needs to be linked to camera acquisition software to allow for dose rate calibration procedures. |
| TEM Cameara for in situ data collection | Gatan | Orius SC200 | Custom digital micrograph scripts (written in house) for calibrating the C2 lens value to dose rate and collect in situ datasets |
| TEM Single Tilt Sample Holder | FEI | ||
| Tris(hydroxymethyl)aminomethane hydrochloride (Tris Buffer HCl) | Fisher Biotech | 1185-53-1 | |
| Tweezers | Excelta | 7-SA |
References
- O'Brien, M. N., Jones, M. R., Brown, K. A., Mirkin, C. A. Universal Noble Metal Nanoparticle Seeds Realized Through Iterative Reductive Growth and Oxidative Dissolution Reactions. Journal of American Chemical Society. 136 (21), 7603-7606 (2014).
- Alivisatos, A. P., et al. Organization of "Nanocrystal Molecules" Using DNA. Nature. , 609-611 (1996).
- Mirkin, C. A., Letsinger, R. L., Mucic, R. C., Storhoff, J. J. A DNA-Based Method for Rationally Assembling Nanoparticles into Macroscopic Materials. Nature. , 607-609 (1996).
- Abrams, I. M., McBain, J. W. A Closed Cell for Electron Microscopy. Journal of Applied Physics. 15 (8), 607-609 (1944).
- Williamson, M. J., Tromp, R. M., Vereecken, P. M., Hull, R., Ross, F. M. Dynamic Microscopy of Nanoscale Cluster Growth at the Solid-Liquid Interface. Nature Materials. 2 (8), 532-536 (2003).
- Radisic, A., Ross, F. M., Searson, P. C. In situ Study of the Growth Kinetics of Individual Island Electrodeposition of Copper. Journal of Physical Chemistry B. 110 (15), 7862-7868 (2006).
- Niu, W., et al. Selective Synthesis of Single-Crystalline Rhombic Dodecahedral, Octahedral, and Cubic Gold Nanocrystals. Journal of American Chemical Society. 131 (2), 697-703 (2009).
- de Jonge, N., Ross, F. M. Electron Microscopy of Specimens in Liquid. Nature Nanotechnology. 6 (11), 695-704 (2011).
- Liao, H. G., Cui, L., Whitelam, S., Zheng, H. Real-Time Imaging of Pt3Fe Nanorod Growth in Solution. Science. 336 (2012), 1011-1014 (2012).
- Grogan, J. M., Schneider, N. M., Ross, F. M., Bau, H. H. Bubble and Pattern Formation in Liquid Induced by an Electron Beam. Nano Letters. 14, 359-364 (2013).
- Tan, S. F., et al. Real-Time Imaging of the Formation of Au-Ag Core-Shell Nanoparticles. Journal of American Chemical Society. 138, 5190 (2016).
- Woehl, T. J., Evans, J. E., Arslan, I., Ristenpart, W. D., Browning, N. D. Direct in situ Determination of the Mechanisms Controlling Nanoparticle Nucleation and Growth. ACS Nano. 6 (10), 8599-8610 (2012).
- Sutter, E., et al. In situ Liquid-Cell Electron Microscopy of Silver-palladium Galvanic Replacement Reactions on Silver Nanoparticles. Nature Communications. 5, 4946 (2014).
- Mehdi, B. L., et al. Observation and Quantification of Nanoscale Processes in Lithium Batteries by Operando Electrochemical (S)TEM. Nano Letters. 15 (3), 2168-2173 (2015).
- Nielsen, M. H., Aloni, S., De Yoreo, J. J. In situ TEM Imaging of CaCO3 Nucleation Reveals Coexistence of Direct and Indirect Pathways. Science. 345 (6201), 1158-1162 (2014).
- Ahmad, N., Wang, G., Nelayah, J., Ricolleau, C., Alloyeau, D. Exploring the Formation of Symmetric Gold Nanostars by Liquid-Cell Transmission Electron Microscopy. Nano Letters. , (2017).
- Ross, F. M. Opportunities and Challenges in Liquid Cell Electron Microscopy. Science. 350 (6267), (2015).
- Niu, K. Y., Liao, H. G., Zheng, H. Revealing Dynamic Processes of Materials in Liquids Using Liquid Cell Transmission Electron Microscopy. Journal of Visualized Experiments. (70), (2012).
- Liao, H. G., et al. Facet Development during Platinum Nanocube Growth. Science. 345 (6199), 916-919 (2014).
- Jungjohann, K. L., Evans, J. E., Aguiar, J. A., Arslan, I., Browning, N. D. Atomic-Scale Imaging and Spectroscopy for In situ Liquid Scanning Transmission Electron Microscopy. Microscopy and Microanalysis. 18 (3), 621-627 (2012).
- Li, D., et al. Direction-Specific Interactions Control Crystal Growth by Oriented Attachment. Science. 336 (6084), 1014-1018 (2012).
- Yuk, J. M., et al. Graphene Veils and Sandwiches. Nano Letters. 11 (8), 3290-3294 (2011).
- Yuk, J. M., et al. High-Resolution EM of Colloidal Nanocrystal Growth Using Graphene Liquid Cells. Science. 336 (6077), 61-64 (2012).
- Ye, X., et al. Single-Particle Mapping of Nonequilibrium Nanocrystal Transformations. Science. 354 (6314), 874-877 (2016).
- Park, J., et al. 3D Structure of Individual Nanocrystals in Solution by Electron Microscopy. Science. 349 (6245), 290-295 (2015).
- Shin, D., et al. Growth Dynamics and Gas Transport Mechanism of Nanobubbles in Graphene Liquid Cells. Nature Communications. 6, 1-6 (2015).
- Jeong, M., Yuk, J. M., Lee, J. Y. Observation of Surface Atoms during Platinum Nanocrystal Growth by Monomer Attachment. Chemistry of Materials. , 3200-3202 (2015).
- Wojcik, M., Hauser, M., Li, W., Moon, S., Xu, K. Graphene-Enabled Electron Microscopy and Correlated Super-Resolution Microscopy of Wet Cells. Nature Communications. 6 (1), 7384 (2015).
- Dahmke, I. N., et al. Graphene Liquid Enclosure for Single-Molecule Analysis of Membrane Proteins in Whole Cells Using Electron Microscopy. ACS Nano. 11 (11), 11108-11117 (2017).
- Cho, H., et al. The Use of Graphene and Its Derivatives for Liquid Phase Transmission Electron Microscopy of Radiation-Sensitive Specimens. Nano Letters. 17 (1), 414-420 (2016).
- Schneider, N. M., et al. Electron-Water Interactions and Implications for Liquid Cell Electron Microscopy. Journal of Physical Chemistry C. 118 (38), 22373-22382 (2014).
- Park, J. H., et al. Control of Electron Beam-Induced Au Nanocrystal Growth Kinetics through Solution Chemistry. Nano Letters. 15 (8), 5314-5320 (2015).
- Chen, Q., et al. 3D Motion of DNA-Au Nanoconjugates in Graphene Liquid Cell Electron Microscopy. Nano Letters. 13 (9), 4556-4561 (2013).
- Nikoobakht, B., El-Sayed, M. A. Preparation and Growth Mechanism of Gold Nanorods (NRs) Using Seed-Mediated Growth Method. Chemistry of Materials. 15 (10), 1957-1962 (2003).
- Rasool, H., Dunn, G., Fathalizadeh, A., Zettl, A. Graphene-Sealed Si/SiN Cavities for High-Resolution in situ Electron Microscopy of Nano-Confined Solutions. Phys status solidi. 253 (12), 2351-2354 (2016).
- Wadell, C., et al. Nanocuvette: A Functional Ultrathin Liquid Container for Transmission Electron Microscopy. ACS Nano. 11 (2), 1264-1272 (2017).
- Kelly, D. J., et al. Nanometer Resolution Elemental Mapping in Graphene-Based TEM Liquid Cells. Nano Letters. , (2018).
