Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Biochemistry

تحديد كيناز Cyclin تعتمد على 1 مواقع الفسفرة محددة من قبل كيناز في المختبر الاعتداء

doi: 10.3791/57674 Published: May 3, 2018
* These authors contributed equally

Summary

يتم تنشيط في مرحلة دورة الخلية G2 كيناز cyclin تعتمد على 1 (Cdk1) وينظم العديد من المسارات الخلوية. نقدم هنا، بروتوكولا مقايسة كيناز في المختبر مع Cdk1، مما يتيح تحديد المواقع الفسفرة Cdk1 على حدة لتحديد الأهداف الخلوية من هذا كيناز الهامة.

Abstract

كيناز cyclin تعتمد على 1 (Cdk1) هو وحدة تحكم رئيسية لدورة الخلية في جميع حقيقيات النوى، وفوسفوريلاتيس ما يقدر 8-13 ٪ من البروتين؛ ومع ذلك، العدد الأهداف المحددة ل Cdk1، لا سيما في الخلايا البشرية لا يزال منخفضا. تحديد مواقع الفسفرة Cdk1 محددة المهم، كما أنها توفر الميكانيكية ثاقبة كيف يتحكم Cdk1 دورة الخلية. تنظيم دورة الخلية أمر حاسم للعزل الصبغي المؤمنين، والعيوب في هذه العملية المعقدة تؤدي إلى الكروموزومي والسرطان.

هنا، يمكننا وصف في المختبر كيناز مقايسة المستخدمة لتحديد مواقع الفسفرة Cdk1 على حدة. في هذا التحليل، بروتين المنقي فوسفوريلاتيد في المختبر بنجاح ب Cdk1/cyclin البشرية المتاحة تجارياً الفسفرة ما يؤكده الحزب الديمقراطي الصربي صفحة، ويتم فيما بعد تحديد مواقع الفسفرة من الطيف الكتلي. ونحن أيضا وصف تنقية البروتوكولات التي تسفر عن الاستعدادات البروتين عالية نقية ومتجانسة مناسبة للمقايسة كيناز، ومقايسة ملزمة التحقق الوظيفية للمواقع المحددة الفسفرة، الذي يسبر التفاعل بين إشارة تعريب نووية كلاسيكية (أدى) وبه α كاريوفيرين مستقبلات النقل النووي. للمساعدة مع التصميم التجريبي، نقوم بمراجعة النهج للتنبؤ بمواقع الفسفرة Cdk1 محددة من تسلسل البروتين. معا هذه البروتوكولات الحالية اتباع نهج قوية جداً غلة مواقع الفسفرة Cdk1 محددة وتمكن الدراسات الميكانيكية في كيفية Cdk1 يتحكم في دورة الخلية. حيث يعتمد هذا الأسلوب على البروتينات المنقاة، يمكن تطبيقها على أي نموذج الكائن الحي وغلة نتائج يمكن الاعتماد عليها، خاصة عندما تقترن بخلية الدراسات الفنية.

Introduction

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

مؤنزم هي الإنزيمات التي نقل مجموعات الفوسفات من ATP على ركائز وتنظيم العديد من العمليات الخلوية. هذا الفسفرة يتم عكسها وسريع، يضيف تهمتين تتعلقان بالسلبية، ويخزن الطاقة الحرة وهو واحد من التعديلات بوسترانسلاشونال الأكثر شيوعاً المستخدمة من قبل الخلايا. Cdk1، ويعرف أيضا باسم دورة انقسام الخلية البروتين 2 هومولوج (cdc2) وحدة تحكم رئيسية لدورة الخلية في جميع حقيقيات النوى1،2،3،،من45، وفوسفوريلاتيس ما يقدر 8-13 ٪ من البروتين6،7.

في حين حددت الدراسات البروتين مؤخرا العديد من المواقع الفسفرة في البروتينات، في معظم الحالات، كيناز المسؤولة عن هذه التعديلات غير معروف. هو عدد أهداف Cdk1 المعروفة، لا سيما في الخلايا البشرية منخفضة7. تحديد مواقع الفسفرة Cdk1 محددة المهم، كما أنها تمكن الدراسات الميكانيكية التي تحدد كيف يتحكم Cdk1 دورة الخلية. تنظيم دورة الخلية مهم للعزل الصبغي المؤمنين وانقسام الخلية، وتحتاج إلى عدد هائل عمليات الخلوية تحدث لدعم هذه الوظيفة الفسيولوجية الهامة. وهذا يشمل وقف النسخ والترجمة قبل ظهور الانقسام، فضلا عن إعادة تنظيم هائلة في البنية الخلوية والمنظمة، مثل التفكيك النووي المغلف والتكثيف كروموسوم، والجمعية المغزل التفتلي. التحرر من القيود والأخطاء في هذه العمليات تسبب السرطان أو العيوب الخلقية أو موت الخلية الانقسامية. كانت مثبطات محددة من Cdk1 مثل رو-33068من البلدان المتقدمة النمو، التي توفر أدوات قوية للدراسات الفنية، وبعض من هذه الموانع حاليا في التجارب السريرية لعلاج السرطان (انظر9 للاستعراض).

هنا، يمكننا وصف في المختبر كيناز مقايسة التي تتيح تحديد مواقع الفسفرة Cdk1 محددة. في هذا التحليل، يستخدم ب Cdk1/cyclin البشرية المتاحة تجارياً فوسفوريلاتي هدف تنقية بروتين في المختبر. الفسفرة الركازة يزيد وزنها ويضيف تهمتين تتعلقان بالسلبية؛ ولذلك، يؤكد الفسفرة ناجحة تحول صاعد من الفرقة جل البروتين على الحزب الديمقراطي الصربي صفحة. يتم تحديد مواقع الفسفرة Cdk1 على حدة فيما بعد بتحليل الطيف الكتلي للبروتين في المختبر فوسفوريلاتيد. للمعونة مع التصميم التجريبي، نحن أيضا مراجعة الأدوات الحاسوبية ومراجع للتنبؤ بمواقع الفسفرة Cdk1 محددة من تسلسل البروتين. وعلاوة على ذلك، نحن أيضا وصف تنقية البروتوكولات التي تسفر عن البروتين عالية نقية ومتجانسة استعدادات مناسبة للمقايسة كيناز. وأخيراً، يجب التحقق من المواقع التي تم تحديدها الفسفرة بالدراسات الفنية، ومقايسة ربط بسيط يرد هنا لهذا الغرض. جنبا إلى جنب، هذا هو نهج قوية جداً غلة مواقع الفسفرة Cdk1 محددة وتمكن الدراسات الميكانيكية في كيف يتحكم Cdk110،،من711دورة الخلية. حيث يعتمد هذا الأسلوب على البروتينات المنقاة، فإنه يمكن تطبيقها على أي نموذج الكائن الحي وغلة نتائج يمكن الاعتماد عليها. مع ذلك، ينصح التحقق الوظيفية الفسفرة الحصول على مواقع في المختبر ، الخلايا لديها آليات تنظيمية إضافية في المكان، مثل التعديلات بوستترانسلاشونال أو الشركاء التفاعل التعريب الخلوية التي قد تجعل المواقع الفسفرة موجوداً أو لا يمكن الوصول إليها للاعتراف بواسطة Cdk1.

تسلم Cdk1 موقع الفسفرة توافق آراء الذي يتكون من (Ser/Thr-برو-X-ليز/Arg)، حيث X أي بقايا وأن سيرين أو ثريونين هو موقع الفسفرة. وأهمية خاصة للاعتراف بوجود برولين في الموقف + 1. وبالإضافة إلى ذلك، يفضل مخلفات الأساسية في المواقف + 2 أو + 3، مع معظم المواقع الفسفرة Cdk1 محددة تحتوي على Lys أو الأرجنتين في + 3 وضع6،12.

أحكام تنظم تفعيل Cdk1 ويؤدي إلى ظهور الانقسام1،2،3،،من45. نشاط مؤنزم cyclin تعتمد على بشكل عام يعتمد على ارتباطها مع متميزة سيكلينس (cyclin أ ب، ج، د والإلكترونية في البشر)، التي يتم التعبير عنها في تذبذب مستويات طوال دورة الخلية13. Cdk1 التعبير ثابت عبر دورة الخلية وتنظيم نشاطها يعتمد على ارتباطه بالوحدات الفرعية التنظيمية cyclin A و cyclin ب5،13،،من1415، كما فضلا عن تعديلات بوستترانسلاشونال. تشكيل المجمع ب Cdk1/cyclin مطلوب من أجل التنشيط كيناز5،15،،من1416،،من1718. في المرحلة G2، ترجم في سيتوسول ب cyclin واستيرادها إلى نواة حيث أنه يربط Cdk15،،من1415،16،،من1718؛ ومع ذلك، هو عقد ب Cdk1/cyclin المعطل الفسفرة في المخلفات Thr14 و Tyr15 مؤنزم المثبطة Cdk1 البشرية Myt1 (المرتبطة بغشاء تيروزين ثريونين محددة والمثبطة cdc2 كيناز) و Wee1، على التوالي19، ،من 2021. في أواخر المرحلة G2، ينشط نشاط المجمع ب Cdk1/cyclin كيناز ديفوسفوريليشن Thr14 و Tyr15 بدوره انقسام الخلية 25 الفوسفاتيز (cdc25) ويقوم بتشغيل بدء الانقسام12،14، 18 , 20 , 22 , 23-الفسفرة Thr161 مطلوب أيضا للتنشيط ب Cdk1/cyclin وهو توسط Cdk7، Cdk-تفعيل كيناز (الكعكة)18. تدهور ب cyclin في طور الصعود يحللها Cdk1، مما يتيح الخروج من الانقسام24،25. ولتفعيل ب Cdk1/cyclin عملية معقدة. يتم تنفيذ البروتوكول المعروضة هنا مع المتاحة تجارياً ب Cdk1/cyclin خلال المؤتلف من التعبير عن هذا التعقيد في خلايا الحشرات، وهو المنشط في فيفو مؤنزم الذاتية14،20 وما زالت نشطة في الدولة النقية. الناتج النشط، المؤتلف البشرية Cdk1/cyclin ب مناسبة في المختبر فحوصات كيناز.

هنا، يمكننا وصف بروتوكول لتحديد مواقع الفسفرة Cdk1 على حدة في السنترومير البشرية البروتين و (سينب-F)10. سينب-و هو بروتين كينيتوتشوري الذي يتواجد في النواة خلال الجزء الأكبر من الطور البيني (G1 و S-المرحلة) ويتم تصديره إلى سيتوسول في G2 المرحلة26،،من2728 في طريقة تعتمد على Cdk110، 11. التعريب النووية هو يمنحها أدى ثنائي26. يتم التعرف كنلس قبل α كاريوفيرين عامل النقل النووي، التي، جنبا إلى جنب مع β كاريوفيرين، ورانجدب، ويسهل استيراد البضائع أدى إلى نواة29. تصدير المواد النووية في مرحلة G2 يسر عبر مسار تصدير غير معروف10. بمجرد سينب إف تكمن في سيتوسول، يتم تجنيده للمغلف النووية والمجندين بدوره في30،دينين معقد البروتين السيارات31. هذا المسار هام لوضع نواة كل منها سينتروسومي خلال المراحل الأولية للجمعية المغزل التفتلي بطريقة تعتمد على دينين، هو أمر مهم للتوقيت الصحيح لدخول الانقسامية وعملية أساسية في الدماغ التنمية30،،من3132. بدءاً من مرحلة G2، سينب-و هو أيضا تجميعها في كينيتوتشوري حيث لديها أدوار هامة للمؤمنين كروموسوم الفصل27،،من2833،34،35 . خطوة تنظيمية أساسية من هذه المسارات يتم تصدير و سينب النووية في مرحلة G2، الذي يعتمد على10،Cdk111. يصف لنا هنا بروتوكولا لتحديد مواقع الفسفرة Cdk1 على حدة في أدى من سينب-f. تبطئ الطفرات فوسفوميميتيك من هذه المواقع النووية استيراد سينب-F، مما يوحي بأن ب Cdk1/cyclin ينظم مباشرة التعريب الخلوية وسينب من الفسفرة من أدى10.

وعموما، هذا الإنزيم كيناز في المختبر يسمح تحديد ركائز محددة للبروتينات المستهدفة Cdk1. منقي كيناز فوسفوريلاتيد في المختبر بمجمع ب Cdk1/cyclin المتاحة تجارياً ومواقع الفسفرة وفي وقت لاحق حددها الكتلي. تحديد مواقع الفسفرة Cdk1 محددة تدعم الدراسات الميكانيكية التي تكشف كيف يتحكم Cdk1 دورة الخلية.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

1-التنبؤ بمواقع محددة Cdk1 الفسفرة من تسلسل البروتين

  1. قبل بدء الفحص كيناز، تحليل تسلسل البروتين لتوقع مواقع الفسفرة Cdk1 على حدة والبحث في الأدب لمواقع الفسفرة تجريبيا المنشأة مع خصوصية كيناز غير معروف. استخدم الأدوات التالية، وقواعد البيانات والمراجع التي يرد.
    1. استخدام iGPS 3.0 البرنامج36،37 (http://gps.biocuckoo.org/online_full.php) للتنبؤ بمواقع الفسفرة Cdk1 خاصة في تسلسل البروتين الهدف. استخدم الارتباط هنا لتنبؤ شامل يحتوي على شروح لهيكل الثانوية والوصول إلى السطح.
    2. في البرنامج، أدخل تسلسل البروتين في تنسيق FASTA. لخصوصية كيناز، تحقق كيناز سيرين/ثريونين، كمجك، CDK، CDC2، CDK1، وقم بإلغاء تحديد كافة الخصائص الأخرى. حدد المتوسطة العتبة وانقر فوق الزر إرسال .
    3. قارن بين المواقع المتوقعة الناتجة عن ذلك مع موقع الفسفرة توافق Cdk1 (Ser/Thr-برو-X-ليز/Arg).
    4. الأهم من ذلك، التحقق من موقع المتوقعة برولين بجوار بقايا فوسفوريلاتيد (هي فوسفوريلاتيد بعض ركائز Cdk1 في6،موقع الحد أدنى (Ser/Thr-برو)12). وبالإضافة إلى ذلك، تحقق من بقايا الأساسية، التي هي المفضلة في المواقف + 2 أو + 3، مع معظم المواقع الفسفرة Cdk1 محددة تحتوي على Lys أو الأرجنتين في6،موقف + 312.
  2. أيضا التحقق من أن الموقع الوصول للاعتراف، كما أن وجود موقع على توافق كامل في الآراء ليس كافياً الفسفرة Cdk1.
    1. تفقد الوصول إلى السطح وهيكل الثانوية التنبؤ بالشرح في الإخراج إيجبس، التي تنص على ما إذا كان الموقع هو توقع أن يكون موجوداً؛ N و C-تيرميني للبروتينات في كثير من الحالات مرنة ويمكن الوصول إليها عن الفسفرة.
    2. في حالة توفر بنية الأشعة سينية من البروتين المستهدف، التحقق من إمكانية الوصول لمواقع الفسفرة المفترضة بتفتيش مواقعها في الهيكل.
  3. البحث في الأدب لمواقع الفسفرة تجريبيا المنشأة مع خصوصية كيناز غير معروف باستخدام قاعدة بيانات أونيبروتكب/السويسرية-بروت38 (http://www.uniprot.org).
    1. أدخل اسم البروتين في مربع البحث ثم انقر فوق زر البحث . حدد إدخال التسلسل الصحيح. مواقع الفسفرة المشروح والمشار إليها في القسم التعديلات من الأحماض الأمينية .
    2. ابحث عن دراسات البروتيوميات مقتطفات الانقسامية للخلايا البشرية خطوط7،،من3940، ومفيدة بشكل خاص لأن Cdk1 تصبح نشطة في مرحلة دورة الخلية G2.
  4. تحديد أدى ثنائي من نلسمابير (اختياري).
    ملاحظة: للبروتينات التي مكوكية بين سيتوسول والنواة، هو إليه مشتركة لتنظيم التعريب الخلوية الفسفرة من أدى ثنائي في وضع فكرة رئيسية من Cdk1-1. الفسفرة يلغي التعريب النووية في G2 المرحلة10،41،،من4243.
    1. لهذه البروتينات مكوكية، تحديد الفعالة في تسلسل البروتين نلسمابير43 (http://nls-mapper.iab.keio.ac.jp/cgi-bin/NLS_Mapper_form.cgi). لصق تسلسل البروتين كنص في مربع تسلسل وتحديد نقاط وقف إنتاج المواد الانشطارية من 5.0، وينتخب للبحث عن NLS في المنطقة بأسرها. انقر فوق الزر NLS التنبؤ .
    2. قارن أدى المتوقعة الناتجة عن ذلك ضد تسلسل توافق أدى ثنائي، الذي يتكون من فكرة بسيطة (Lys-الأرجنتين)، ورابط للمخلفات على الأقل 10 والحافز الرئيسي (Lys-Lys/Arg-X-ليز/Arg)، حيث X هو أي بقايا لا يحمل صورة سلبية .
    3. تحقق إذا كان الموقع الفسفرة Cdk1 المتوقعة (*) يقع المتاخمة لفكرة رئيسية في الموقف-1 الرابط: Ser/Thr*-Pro/X-X-Lys-Lys/Arg-X-Lys/Arg.
      ملاحظة: أنشئ الفسفرة من أدى ثنائي في الموقف-1 من Cdk1 كآلية تنظيمية للتعريب الخلوية لعدة مكوكية البروتينات10،،من4142، 43.

2-التعبير عن البروتينات المؤتلف في الإشريكيّة القولونية

  1. استخدام البلازميدات التعبير من الخطوات 2.1.1-2.1.2 للتعبير عن البروتينات المؤتلف في كولاي.
    1. لإنشاء بناء الإنسان سينب-F (بقايا 2,987-3,065) التعبير، إنشاء إدراجات بتضخيم شظايا من الحمض النووي من تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR) من بناء و سينب كامل طول (انضمام بنك الجينات: U19769.1). استخدام كبسولة تفجير التالية: أجتكجججاتكككاجكاتكتااكاجاتكككج وأجتكجكتكجاجتكاتاتكتجكاججتجاتاككاكتكاتج.
      ملاحظة: قدمت بلازميد إف سينب البشرية كامل طول سخاء الدكتور تشو العاشر، معاهد "العلوم البيولوجية"، والأكاديمية الصينية للعلوم، شانغهاي، الصين.
      1. استنساخ الإدراج داخل المتجهة pGEX6p1 مع تقييد مواقع بامهي وزهوي. استخدام بلازميد هذا للتعبير عن البروتينات الطرفي ن الانصهار S-ترانسفيراز (GST) الجلوتاثيون سينب-F (بقايا 2,987-3,065).
        ملاحظة: يمكن المشقوق GST العلامة قبالة بحوزتي بريسسيشن (يشار إليها من الآن فصاعدا حوزتي PS).
    2. للبشرية بناء كاريوفيرين α التعبير، تولد إدراجات بتضخيم شظايا من الحمض النووي من بكر من قالب كدنا α2 كاريوفيرين كامل طول (تسلسل الانضمام NM_002264.3؛ وكبسولة تفجير: جكاكتاكاتاتجتككاككاكجاجاتجكتاتا و تكاكجككتكجاجتاتكاااجتااجتكككاجاجكك).
      ملاحظة: نظراً لتشابه isoforms، هذا بناء α2 كاريوفيرين يشار إلى في النص اللاحق α كاريوفيرين.
      1. استنساخ الإدراج في ناقلات برية pET28a مع تقييد مواقع ندى وزهوي.
        ملاحظة: هذا هو ناقل pET28a معدلة التي استعيض عن الترميز تسلسل لموقع الانقسام ثرومبين بسلسلة ترميز لموقع انقسام حوزتي PS. استخدام بلازميد هذا للتعبير عن بروتين انصهار من α كاريوفيرين مع ن--المحطة طرفية له6-العلامة، حيث له6-يمكن المشقوق علامة قبالة بحوزتي PS.
  2. لإنشاء نقطة طفرات البروتين المستهدف، تؤدي الطفرات الموجهة الموقع مع مجموعة.
  3. التعبير عن البروتينات المؤتلف في كولاي لتنقية اللاحقة.
    1. جعل الأرصدة التالية: 50 ملغ/مل كاناميسين (1:1، 000 الحل الأسهم)، الكلورامفينيكول 35 ملغ/مل في 70% إيثانول (1:1، 000)، 100 ملغ/مل الأمبيسلّين (1:1، 000)، و 1 م الأيزوبروبيل β-د-1-ثيوجالاكتوبيرانوسيدي (إيبتج؛ 1:5، 000).
    2. تصفية الأرصدة السمكية عقيمة وتخزينها في-20 درجة مئوية. تجنب دورات تجميد أذاب المتكررة إيبتج.
    3. تحويل 1 ميليلتر من التعبير بلازميد 50 ميليلتر من الخلايا المختصة من سلالة كولاي بليس رشيد 2 (DE3)، وفقا لإرشادات الشركة المصنعة.
    4. لوحة ثقافة أجار بيرتاني لوريا (رطل) مع الكلورامفينيكول (35 ميكروغرام/مل رطل) والامبيسلين (100 ميكروغرام/مل رطل) لبناء سينب-F، أو الكلورامفينيكول وكاناميسين (50 ميكروغرام/مل الثقافة) لبناء α كاريوفيرين. احتضان لوحات ح 12-20 عند 37 درجة مئوية.
    5. اختيار مستعمرة واحدة وتلقيح 50 مل رطل وتستكمل مع المضادات الحيوية (راجع الخطوة 2.3.4). احتضان بريكولتوري بينما تهز 160-180 لفة في الدقيقة ح 12-20 عند 37 درجة مئوية.
    6. تحضير 1 لتر من رطل حير المتوسطة في مل 2,800 قارورة فيرنباتش. جعل قوارير اثنين لكل بريكولتوري والاوتوكلاف لهم. للسماح بالتهوية، لا تعبئة قوارير على أكثر من ثلثي حجم قارورة. ويمكن استخدام قوارير Erlenmeyer كذلك.
    7. إضافة المضادات الحيوية (الخطوة 2.3.4) و 10 مل من السكر 40% (w/v) العقيمة التي تمت تصفيتها حل كل 1 لتر تبريد رطل إضافة 20 مل من بريكولتوري كل 1 لتر متوسطة رطل.
      ملاحظة: امتصاص 600 نانومتر 01:10 إضعاف بريكولتوري ينبغي أن يكون بين 0.15-0.2.
    8. احتضان قوارير بينما تهز 160-180 لفة في الدقيقة عند 37 درجة مئوية. قياس امتصاص 600 نانومتر ثقافة البكتيريا بانتظام. إذا كان امتصاص تصل إلى 0.5-0.6، حمل التعبير البروتين بإضافة 0.2 مم إيبتج (200 ميليلتر المخزون 1 م كل 1 لتر متوسطة رطل).
      ملاحظة: من المهم أن يتم فعل الخلايا في امتصاص الصحيح. وعادة ما يستغرق 3-4 ح للوصول إلى هذه المرحلة.
    9. احتضان قوارير حين تهتز ح 3 في 37 درجة مئوية. حصاد الخلايا بالطرد المركزي (15 دقيقة، 4,100 س ز، 4 درجة مئوية، والدوار البديل التدريجي). تجاهل المادة طافية. ريسوسبيند الكريات الخلية في 20 مل ملزم GST المخزن المؤقت (سينب-F) أو له6-ربط المخزن المؤقت (كاريوفيرين α) كل 1 لتر ثقافة. تخزين الخلايا في-80 درجة مئوية.
      1. إعداد المخزن المؤقت ملزم ضريبة السلع والخدمات (10 ملم تريس pH 8.0 عند 25 درجة مئوية، 150 مم كلوريد الصوديوم، ديثيوثريتول 1 مم (DTT)، يدتا 0.5 مم) وله6-ربط المخزن المؤقت (10 ملم تريس pH 8.0 عند 25 درجة مئوية، 250 ملم كلوريد الصوديوم، 5 ملم ايميدازول pH 8.0، 5 مم β-mercaptoethanol (BME)) في وقت مبكر.

3-تنقية البروتين المؤتلف الجلوتاثيون-التقارب اللوني وهلام الترشيح

  1. جعل الأرصدة التالية: 1 م DTT (1:1، الأسهم 000، العقيمة التي تمت تصفيتها مع حجم المسام ميكرومتر 0.2، ويطرد)؛ فلوريد فينيلميثيلسولفونيل 250 ملم (بمسف؛ 1:1,000 الأسهم في ديميثيلسولفوكسيدي). مخزن في-20 درجة مئوية. تجنب دورات تجميد أذاب المتكررة.
  2. جعل المخازن المؤقتة التالية وبارد منهم إلى 4 درجات مئوية.
    1. إعداد المخزن المؤقت ملزم ضريبة السلع والخدمات باستخدام 10 ملم تريس pH 8.0 عند 25 درجة مئوية، 150 مم كلوريد الصوديوم، 1 مم DTT، يدتا 0.5 مم.
    2. إعداد ضريبة المبيعات-شطف المخزن المؤقت باستخدام 10 مم خفض الجلوتاثيون (0.15 غ/50 مل) حلت في مخزن مؤقت من 50 مم تريس 8.0 درجة الحموضة عند 25 درجة مئوية، 150 مم كلوريد الصوديوم، 1 مم DTT. التأكد من أن الرقم الهيدروجيني للمخزن المؤقت النهائي 8.0 واستخدامها في نفس اليوم أنه تم.
    3. تحضير هلام الترشيح المخزن المؤقت باستخدام 20 مم تريس درجة الحموضة 7.5 عند 25 درجة مئوية، 60 ملم كلوريد الصوديوم، 2 مم DTT. عقيمة تصفية المخزن المؤقت مع عامل تصفية أعلى زجاجة (0.2 ميكرون حجم المسام). ديغا المخزن المؤقت أثناء التحريك تحت الفراغ (-6 psi) لمدة 15 دقيقة.
    4. إضافة DTT إلى كل شيء المخازن المؤقتة في يوم الاستخدام.
  3. ذوبان الجليد الخلايا من القسم 2 التي تحتوي على بنية سينب إف. ضبط حجم الصوت إلى 40 مل مع المخزن المؤقت ملزم ضريبة السلع والخدمات. أضف 1 مم DTT، 0.25 مم بمسف، 0.5 مم يدتا (0.5 م حل الأسهم، pH 8.0)، 7 ملغ بينزاميديني هيدروكلوريد (1 مم) ومن الميثيونين 40 مجم د/لتر.
    ملاحظة: للحد من تدهور proteolytic، تنفيذ كافة الخطوات في 4 درجات مئوية، يفضل أن تكون في غرفة باردة، إلا إذا ذكر خلاف ذلك. الاحتفاظ بالخلايا وليساتيس والكسور البروتين المنقي على الجليد في جميع الأوقات، وإضافة مثبطات البروتياز. لمنع أكسدة بقايا السيستين والميثيونين، أضف تأشيب مثل DTT والميثيونين في يوم التجربة. للحد من تدهور proteolytic، العمل من خلال الخطوات بسرعة.
  4. ليس الخلايا في سونيكاتور كالتالي. ملء كوب زجاج مع وتزج أنه في حمام الماء المثلج. Sonicate الثقافة (1 دقيقة 40 ثانية، في إخراج W (50 ٪) 100/السعة، مع 10 s البقول وق 10 بقية دورات). إضافة 250 ميكرون بمسف بعد سونيكيشن. فحص الخلية، التي ينبغي أن تبدو أكثر شفافية وأن لم يعد لزج.
  5. واضح التي سينتريفوجينج في 12,000-40,000 س ز، 25 دقيقة، 4 درجة مئوية. استخدام أنابيب الطرد المركزي القاع المستديرة ودوار زاوية ثابتة.
  6. أداء الموازنة بإضافة 2 مل من الجلوتاثيون [اغروس] 1:1 الملاط إلى عمود الفصل لوني للتخلص منها. وسيكون العمود الناتج حجم 1 مل. أغسل العمود مع 25 مل من الماء عالي النقاوة و 25 مل من المخزن المؤقت ملزم ضريبة السلع والخدمات.
  7. تنفيذ الربط كما يلي. العمل في غرفة باردة أو مربع الباردة، صب من الكريات. تصفية ليستي (حجم المسام 0.2 ميكرون) ومن أجل ذلك على العمود توصيله. كاب العمود واحتضان أنه حين نوتاتينج برفق لمدة 30 دقيقة في 4 درجات مئوية.
  8. يغسل السماح العمود، وضعت على رف، الراتنج تسوية، وجمع في التدفق من خلال. أغسل العمود مرتين مع 25 مل من المخزن المؤقت ملزم ضريبة السلع والخدمات.
  9. الوت بالانقسام وبروتيوليتيك.
    1. قم بتوصيل العمود. إضافة 400 ميليلتر من المخزن المؤقت ملزم GST و 250 ميليلتر من مبطلات PS (الأسهم 2 مغ/مل مع نشاط 1,000 U/ملغ، أما تنقية في المختبر أو شراؤها؛ انظر الجدول للمواد).
    2. كاب العمود ودوامه بلطف ريسوسبيند الراتنج في المخزن المؤقت. احتضان أعمدة ح 16-20 في 4 درجات مئوية. قم بإضافة 4 مل من المخزن المؤقت ملزم ضريبة السلع والخدمات إلى الوت يفتت و سينب بروتيوليتيكالي ملصوق من العمود.
  10. شطف الجلوتاثيون
    1. توصيل العمود وإضافة 4 مل من ضريبة المبيعات-شطف المخزن المؤقت (من وحدات تخزين العمود 4)، واحتضان لمدة 10 دقيقة علامة GST المنضم الوت. جمع النذرة. إعادة إنشاء الأعمدة قبل إعادة استخدامها كما هو موضح من قبل الشركة المصنعة.
  11. تحليل PS حوزتي شطف الكسر والكسر شطف الجلوتاثيون من الحزب الديمقراطي الصربي صفحة على 16% الاكريلاميد المواد الهلامية. تنفيذ التفريد في 25 الخامس/سم ل 45 دقيقة وصمة عار المواد الهلامية بأخذ الأزرق. الكسر حوزتي PS سيتضمن الجزء سينب إف المنقي، حين كسر الجلوتاثيون الذي سوف تحتوي على علامة ملصوق ضريبة السلع والخدمات. فحص هلام لتقييم كفاءة الانقسام بروتيوليتيك.
  12. تركز PS النذرة حوزتي إلى 0.5 مل باستخدام وحدات الطرد المركزي تصفية مع وزن الجزيئي كاتشين 3 قطع (انظر الجدول للمواد). إضافة النذرة في المقصورة العلوية من عامل التصفية والطرد المركزي أنه في تزايدات 10-15 دقيقة في 4,100 س ز، 4 درجة مئوية (البديل التدريجي الدوار) تركيز العينة. مزيج من بيبيتينج بعد كل زيادة.
  13. الاتصال مناسبة جل العمود الترشيح (انظر الجدول للمواد لشراء المعلومات) لنظام لوني سائل (فبلك) بروتين سريعة، وحجته أنه مع حجم العمود 1 من هلام الترشيح المخزن المؤقت.
  14. الطرد المركزي الجزء سينب إف تتركز في ميكروسينتريفوجي (20 دقيقة، 21,700 س ز، 4 درجة مئوية). إدخال العينة في العمود والوت أنه مع حجم العمود 1 من هلام الترشيح المخزن المؤقت. جمع الكسور 0.6 مل.
    ملاحظة: المخزن المؤقت هلام الترشيح هو الأمثل للتوافق مع الإنزيم كيناز اللاحقة. اختبار ما إذا كان البروتين المستهدف مستقر في هذا المخزن المؤقت. إذا لم يكن مستقرا، حاول إضافة المزيد من كلوريد الصوديوم.
  15. تحليل الكسور الذروة من الحزب الديمقراطي الصربي صفحة (الخطوة 3.11). تجمع الكسور الذروة التي تحتوي على أجزاء و سينب نقية. تركز الشظايا سينب إف المنقي إلى 3.3 ملغ/مل (الخطوة 3، 12). تحليل الشظايا سينب إف المنقي من الحزب الديمقراطي الصربي صفحة (الخطوة 3.11).
  16. تحديد تركيز البروتين
    1. يضعف عينة 1: 100 في الماء عالي النقاوة ووضعه في مرو الصغرى-ومبومو. سجل الأطياف في نطاق الطول موجي من 220-300 نانومتر في جهاز المطياف الضوئي.
      ملاحظة: يتم اشتقاق ج تركيز البروتين (مغ/مل) من المعادلة التالية:
      Equation
  17. جعل 50 ميليلتر مختبرين للبروتين المنقي في microtubes 0.5 مل و تجميد فلاش لهم في نيتروجين سائل. تخزين مختبرين في-80 درجة مئوية.

4-تنقية البروتين المؤتلف اللوني تقارب ني-جاتا

  1. جعل المخازن المؤقتة التالية وباردة إلى 4 درجات مئوية.
    1. إعداد له6-المخزن المؤقت ملزم باستخدام 10 ملم تريس pH 8.0 عند 25 درجة مئوية، 250 ملم كلوريد الصوديوم، 5 ملم ايميدازول pH 8.0، 5 ملم BME. إضافة BME لكافة المخازن المؤقتة في يوم الاستخدام.
    2. إعداد له6-المخزن المؤقت للمياه والصرف الصحي بنفس الطريقة كما له6-ربط المخزن المؤقت ولكن باستخدام 20 مم ايميدازول.
    3. تعد له6-شطف المخزن المؤقت بنفس الطريقة كالمخزن المؤقت ملزم ولكن استخدام 150 مم ايميدازول.
  2. ذوبان الجليد في الخلايا من القسم 2 التي تحتوي على α كاريوفيرين بناء وضبط مستوى الصوت إلى 40 مل مع له6-ربط المخزن المؤقت. إضافة 5 مم BME 0.250 مم بمسف، 7 ملغ بينزاميديني هيدروكلوريد (1 مم) والميثيونين 40 مجم د/لتر.
    1. المضي قدما كما هو موضح في الخطوات 3.4 3.8 مع الاختلافات التالية: استخدام له6-ربط المخزن المؤقت بدلاً من المخزن المؤقت GST ملزمة لجميع الخطوات. استخدام بدلاً من الجلوتاثيون [اغروس]، 4 مل تقارب النيكل هلام (انظر الجدول للمواد) لجعل العمود، الذي سوف يكون حجم عمود 2 مل.
      ملاحظة: النيكل تقارب الأعمدة غير متوافقة مع DTT ويدتا. بدلاً من الجل تقارب النيكل، ني2 +-نيتروتراياكتيك حامض (NTA) [اغروس] يمكن أن تستخدم، في حالة زيادة تركيز ايميدازول في المخزن المؤقت شطف إلى 250 ملم (انظر الجدول للمواد).
  3. المياه والصرف الصحي الأعمدة مع 8 مل من بلده6-المخزن المؤقت للمياه والصرف الصحي.
  4. الوت α كاريوفيرين مع 12 مل له6-شطف المخزن المؤقت وتحليل النذرة بالحزب الديمقراطي الصربي صفحة (الخطوة 3.11).
  5. إضافة 250 ميليلتر من مبطلات PS (الخطوة 3، 9) النذرة واحتضانها ح 16-20 في 4 درجات مئوية. وفي الوقت نفسه، دياليزي النذرة مرتين ضد 1 لتر من بلده6-ربط المخزن المؤقت لح 2-20، استخدام غشاء الديال مع وزن الجزيئي كاتشين 6-8 قطع.
  6. تجديد النيكل تقارب جل العمود كما هو موضح من قبل الشركة المصنعة. حجته العمود مع 25 مل من بلده6-ربط المخزن المؤقت. إضافة البروتين دياليزيد إلى العمود ونفذ الخطوة ملزمة كما هو موضح في الخطوة 3، 7.
  7. التدفق من خلال جمع، الذي يتضمن α كاريوفيرين المنقي (مع له6-العلامة المشقوق قبالة)، والوت البروتين المتبقية مع مل 4 إضافية له6-ربط المخزن المؤقت. تجمع هذه الكسور. ثم الوت الأعمدة مع 12 مل له6-شطف المخزن المؤقت. ويتضمن هذا الكسر من الشوائب.
  8. تحليل α كاريوفيرين أونكليفيد وملصوق من الخطوات 4.4-4.5 والكسور شطف اثنين من هذه الخطوة من جانب الحزب الديمقراطي الصربي صفحة (الخطوة 3.11) لتقييم كفاءة له6-الوسم الانقسام والنقاء.
  9. تركز α كاريوفيرين إلى 8 ملغ/مل و فلاش-التجميد في النيتروجين السائل (خطوات 3.15-3.17).

5. في المختبر بالانزيم كيناز Cdk1/Cyclin ب

  1. في المختبر بالانزيم كيناز
    ملاحظة: عند وصولهم كيناز، جعل مختبرين الصغيرة وتجميد فلاش لهم في النتروجين السائل وتخزينها في-80 درجة مئوية. استخدام في غضون 6 أشهر. أن الوزن الجزيئي كاتشين 34 ل Cdk1 وكاتشين 48 باء cyclin، فالوزن الجزيئي الظاهر من cyclin ب على الحزب الديمقراطي الصربي صفحة كاتشين حوالي 60.
    1. إعداد 10 × PK باستخدام المخزن المؤقت (مع كيناز) 0.5 م تريس-HCl، 0.1 م MgCl2، 1 مم يدتا، 20 مم DTT، 0.1% 35 بريج، ودرجة الحموضة 7.5 عند 25 درجة مئوية.
    2. إعداد 10 × ATP المخزون: جعل حلاً من 4 مم ATP في 1 × PK المخزن المؤقت، والتحقق من الرقم الهيدروجيني النهائي للمخزون. تخزين في مختبرين الصغيرة في-20 درجة مئوية، وتجنب تجميد أذاب دورات.
    3. تجزئة ميليلتر 40 مزيج من سينب-F (في تركيز من 3.3 ملغ/مل، أو 400 ميكرون)، ميليلتر 6 10 x PK المخزن المؤقت 3 ميليلتر عالي النقاوة، ATP ميليلتر 6 10 x الأوراق المالية والمياه والإنسان 5 ميليلتر ب Cdk1/cyclin (1 ميكروغرام، 100 ش) في microtube 0.5 مل.
      ملاحظة: قد بلغة سينب إف كتلة مولى من 8.6 كاتشين وأربعة مواقع الفسفرة Cdk1 محددة. لركيزة جديدة، قم بضبط تركيز كيناز في المقايسة وفقا للتركيز المولى للبروتين، ووفقا للعدد من المواقع الفسفرة. نشاط الأسهم ب Cdk1/cyclin الماشوب البشري هو 20,000 يو/مليلتر، والنشاط المحدد هو 1,000,000 U/ملغ-1 يو يعرف مقدار ب Cdk1/cyclin المطلوبة لتحفيز نقل pmol 1 من الفوسفات إلى الركيزة الببتيد Cdk1 بكتبكاكل-NH2 (50 ميكرومتر) في 1 دقيقة عند 30 درجة مئوية (انظر الجدول للمواد).
    4. إعداد رد فعل تحكم دون إينكوباتي ب Cdk1/cyclin ردود فعل في حمام مائي ح 1-16 في 30 درجة مئوية.
  2. تحليل ميليلتر 2.5 من رد فعل الإنزيم كيناز وميليلتر 2.5 من سيطرة الحزب الديمقراطي الصربي صفحة (الخطوة 3.11)، استخدام هلام الاكريلاميد 16%. لزيادة دقة، تمديد الوقت قيد التشغيل.
  3. إضافة وحدة تخزين مساوية للحل هيدروكلوريد غوانيدين م 6 إلى رد فعل الإنزيم كيناز المتبقية (وإلى عنصر التحكم). وسيكون تركيز هيدروكلوريد غوانيدين النهائي م 3 تحليل هذه العينات بالطيف الكتلي (المادة 6) تحديد المواقع الفسفرة أو إرسال العينات إلى منشأة الكتلي لتحليل ثم قم بتنفيذ دالة التحقق ( القسم 7).
    ملاحظة: لتحليل الطيف الكتلي اللاحقة، من المهم جداً أن كفاءة الفسفرة من المواقع الفردية على أعلى مستوى ممكن، ويفضل 100%، وعلى خلاف ذلك لا يمكن تعيين مواقع الفسفرة. أن يعزز إلى حد كبير كفاءة الفسفرة، إضافة كميات أكبر من ب Cdk1/cyclin وزيادة وقت الحضانة إلى ح 16. يمكن أيضا مضاعفة تركيز ATP.
  4. لاستكشاف الأخطاء وإصلاحها، نفذ في المختبر كيناز مقايسة من سينب-F (بقايا 2,987-3,065) كعنصر إيجابي. استخدام دفعات جديدة من ب Cdk1/cyclin مع أنشطة عالية.

6-تحديد مواقع الفسفرة Cdk1 محددة من الطيف الكتلي

  1. لتجريدها وتحلية عينات البروتين، نفذ ميكروبوري عكس المرحلة اللوني السائل مع عمود PLRP300.
  2. للحصول على عدد المواقع الفسفرة في الجزء سينب إف، تحليل سليمة في المختبر فوسفوريلاتيد سينب و 84-مير ب44، اليكتروسبراي التأين فخ أيون الطيف الكتلي (ESI-ITMS)45.
  3. لتقييم موقع موقع حمض فوسفوامينو و سينب، فوسفوريلاتيد إعداد النبذ التربسين في المختبر عينات البروتين و سينب. تحلية النبذ التربسين مع نصائح بيبيت الملحي.
  4. تحليل النبذ تريبتيك وسينب التأين اليكتروسبراي فورييه تحويل أيون سيكلوترون الرنين الكتلي (أي إس أي-فتيكر مللي ثانية). إجراء تحليل على مطياف شامل دليل الاستدامة الاقتصادية-فتيكر مع وقت تراكم من 169 المايكروثانيه.
    ملاحظة: دقة الجماهير التي يحددها دليل الاستدامة الاقتصادية-فتيكر مرض التصلب العصبي المتعدد داخل اتحاد المغرب العربي 0.005. لتحديد نسبة كل الأنواع فوسفوريلاتيد كل منهما بمبلغ إجمالي البروتين، تحديد مرتفعات الذروة من أطياف الجماعية.

7-وظيفية التحقق: اختبار آثار الطفرات فوسفوميميتيك على تفاعلات البروتين البروتين بالتحليل حجم الاستبعاد اللوني

ملاحظة: للتحقق الوظيفية للمواقع الفسفرة Cdk1 الخاصة التي تم تحديدها، طفرات فوسفوميميتيك من الشظايا سينب-و تم إنشاؤها بالاستعاضة عن المواقع التي تم تحديدها الفسفرة مع أسبارتاتيس. شحنة سالبة من اسبارتاتي يحاكي آثار الفسفرة. وقد أنشئت متحولة S3048D الجزء و سينب (بقايا 2,987-3,065).

  1. للتحقق الوظيفي، مقارنة الربط من البرية من نوع والشظايا فوسفوميميتيك و سينب إلى كاريوفيرين α. استخدام ترشيح جل تحليلية المقايسة ملزمة. للترشيح جل التحليلية، تنقية سينب و أجزاء من الجلوتاثيون التقارب اللوني (3.1-3.12 الخطوات)، وتخطي الخطوة هلام الترشيح.
  2. التركيز البروتين إلى 5-6 مغ/مل. فلاش-تجميد مختبرين البروتين في النتروجين السائل (الخطوات 3، 3، 15-17).
  3. شظايا ميكس إف سينب المنقي (0.1 مغ، البرية من نوع أو البديل S3048D) وتنقيته α كاريوفيرين (0.7 ملغ) بنسبة 1:1 مولى. ضبط حجم العينة على 200 ميليلتر مع هلام الترشيح المخزن المؤقت. احتضان العينة لمدة 30 دقيقة على الجليد وتصفية العينة (0.2 ميكرون حجم المسام)، ومسح العينة بالطرد المركزي (25 دقيقة، 21,700 س ز، 4 درجة مئوية)
  4. فصل عينة بحجم الاستبعاد اللوني (خطوات 3.13-3.14). استخدام المخزن مؤقت هلام ترشيح المكونة من 20 مم حبيس، درجة الحموضة 7.5، كلوريد الصوديوم، 150 مم و 2 مم DTT. القيام بتجارب الترشيح جل التحليلية تحت ظروف مماثلة لجميع العينات.
  5. معايرة العمود الترشيح جل التحليلية مع معايير الوزن الجزيئي من كتلة المولى المعروفة كما هو موضح من قبل الشركة المصنعة.
  6. تحليل الكسور شطف بنسبة 16% الحزب الديمقراطي الصربي صفحة (الخطوة 3.11).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

أننا استخدمت مؤخرا في المختبر كيناز مقايسة (الشكل 1) لتحديد المواقع الفسفرة Cdk1 على حدة في جزء سينب-و التي تحتوي على أدى10. يمنح هذا الإشارة التعريب النووية من سينب-و خلال الجزء الأكبر من الطور البيني. في المرحلة G2، يتم تصدير سينب إف من النواة سيتوسول بطريقة تعتمد على Cdk1. للحصول على رؤى آليا على كيف ينظم Cdk1 التعريب الخلوية من سينب-F، قمنا بتحليل تسلسل سينب-F للتنبؤ بمواقع الفسفرة Cdk1 على حدة، باستخدام ال36،الخادم إيجبس37. ضمن الفعالة من سينب-F، كانت توقع ثلاثة مواقع الفسفرة Cdk1 على حدة في بقايا 3,042، 3045، و 3,048 (الجدول 1). كما كان متوقعا الموقع الفسفرة Cdk1 محددة أخرى لبقايا 3,007 (الجدول 1)10. ولذلك، افترضنا أن ينظم Cdk1 سينب و التعريب مباشرة عن طريق الفسفرة أدى به.

وقد تم تحليل لاختبار ما إذا كان أدى سينب-و ركيزة ل Cdk1، وأجرينا في المختبر كيناز مقايسة مع الجزء و سينب البشرية النقية (بقايا 2,987-3,065) والبشرية Cdk1/cyclin باء في المختبر فوسفوريلاتيد و سينب على 16% الحزب الديمقراطي الصربي صفحة، جنبا إلى جنب مع عنصر تحكم سلبية التي تفتقر إلى كيناز Cdk1 (الشكل 2A)10. في المختبر فوسفوريلاتيد سينب-F، يلاحظ تحول تصاعدي واضح للفرقة في جل مراقبة سلبية بالمقارنة. هذا نموذجي للبروتينات فوسفوريلاتيد كل مجموعة الفوسفات بإضافة اثنين من تهمة السلبية ووسائل إضافية. وتوحي هذه النتائج أن سينب-و هو فوسفوريلاتيد Cdk1/cyclin ب10.

لتحديد عدد المواقع الفسفرة و سينب وتقدير كفاءة الفسفرة من هذه المواقع، وقد تم تحليل سليمة في المختبر فوسفوريلاتيد و سينب الجزء (84-مير) بالطيف الكتلي (ESI-ITMS)10. لاحظ أيون ESI فخ كتلة الطيف (الشكل 2) تقترح أن يفتت و سينب سليمة هو فوسفوريلاتيد في أربعة مواقع (الجدول 1)10.

تم تقييم مواقع الأحماض الأمينية فوسفوريلاتيد في تسلسل و سينب بدراسة الملخصات تريبتيك بالسيدة فتيكر ESI التربسين كليفس سلاسل البروتين بعد ليسينيس وأرجينينيس، وخلاصة التربسين الجزء سينب إف أدت إلى عدة الببتيدات، بما في ذلك الوارد بقايا 052 3,031-3،. أطياف الشامل لهذا الببتيد و سينب كانت متسقة مع الفسفرة في بقايا T3042، T3045، و S3048، التي تقع داخل الفعالة (الجدول 1)10. أطياف الشامل لآخر تريبتيك الببتيد (بقايا 2,995-3,016) كانت متسقة مع الفسفرة في S3007 (الجدول 1)10. كانت كما توقعت جميع المواقع الفسفرة الخاصة Cdk1 أربعة من التسلسل. ركائز محددة Cdk1 تحتوي غالباً على برولين جوار هذه البقايا التي فوسفوريلاتيد6، كما لاحظ لبقايا T3042 و T3045 و S3007. من الجدير أن S3048 موقع الفسفرة Cdk1 على حدة إلى حد غير عادي، كما فينيلألانين يقع بجوار سيرين. وختاما، تشير النتائج إلى أن سينب إف فوسفوريلاتيد هو على وجه التحديد في بقايا 3,007، 3,042، 3,045، و 3,048 كيناز Cdk1. ثلاثة من هذه المخلفات تقع ضمن الفعالة من سينب-F (الجدول 1)، مما يشير إلى أن Cdk1 قد تنظم سينب و التعريب الخلوية عن طريق الفسفرة أدى في مرحلة G2، عندما يصبح Cdk1 النشطة10.

للتحقق من أن هذه المواقع الفسفرة Cdk1 محددة لها وظيفة فسيولوجية، قمنا بإنشاء متغير فوسفوميميتيك S3048D10. الطفرات فوسفوميميتيك تحاكي آثار الفسفرة من مخلفات مشحونة سلبا. المقبل، ونحن تنقية الإصدار فوسفوميميتيك من الجزء و سينب الواردة أدى. أدى سينب وتعترف به α كاريوفيرين مستقبلات النقل النووي، الذي يربط مع تقارب عالية ومطلوب من أجل استيراد النووية سينب-f. لاختبار ما إذا كانت الطفرة فوسفوميميتيك يضعف التفاعل بين الفعالة من سينب إف مع النقل النووي مستقبلات كاريوفيرين α، أجرينا مقايسة (الشكل 3) ملزمة10. في هذه التجارب، جزء سينب إف المنقي (البرية-النوع أو البديل S3048D) كانت مختلطة مع α المنقي كاريوفيرين البشرية، وكان فصل المخلوط بالتحليلي حجم الاستبعاد اللوني. وبالإضافة إلى ذلك، تم أيضا تحليل البروتينات على حدة. وكشف تحليل الحزب الديمقراطي الصربي صفحة الكسور شطف أن يفتت و سينب البرية من نوع مع أدى يتفاعل بشدة مع α كاريوفيرين، حيث شارك الوت كلا البروتينات (الشكل 3)10. بيد أن كمية ضئيلة فقط من الجزء S3048D و سينب بربط α كاريوفيرين وهذه البروتينات الوت على حدة (الشكل 3)10. تشير هذه النتائج إلى أن الفسفرة من بقايا 3,048 الفعالة من سينب و سيكون لها أثر قوي على التفاعل مع α كاريوفيرين عامل النقل النووي. تجدر الإشارة إلى أن أسعار الواردات النووية تعتمد اعتماداً كبيرا على التقارب من إشارة التعريب النووية نحو عامل نقل النووي46، وعليه، فمن المتوقع أن تبطئ هذه الطفرات في استيراد النووية10.

Figure 1
رقم 1: التمثيل التخطيطي Cdk1 في المختبر الإنزيم كيناز- الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Figure 2
رقم 2: هو فوسفوريلاتيد و سينب باء Cdk1/cyclin (أ) تحديد Cdk1 مواقع محددة الفسفرة، الإنزيم كيناز في المختبر وأجرى مع المنقي سينب إف (بقايا 2,987-3,065). ويرد تحليل الحزب الديمقراطي الصربي صفحة عنصر التحكم السلبي دون ب Cdk1/cyclin في الممر الأيسر (-Cdk1)، وبعد ذلك إلى في المختبر فوسفوريلاتيد سينب-و في حارة الحق (+ Cdk1). وترد معايير الوزن الجزيئي. ملاحظة التحول الصاعد وسينب فوسفوريلاتيد على صفحة الحزب الديمقراطي الصربي، وما يتسق مع الفسفرة ناجحة. Cdk1 وب cyclin تظهر كعصابات باهتة في 34 كاتشين وكاتشين 60. (ب) استخدمت أيون ESI فخ الكتلي لحالها و سينب فوسفوريلاتيد من (أ) لتحديد تحميل الفوسفات فوسفوريلاتيد سليمة سينب-F (84-مير). يظهر الطيف الشامل المطابق. المرسومة الكثافة مقابل نسبة الكتلة بتهمة (m/z). يظهر الطيف + 10 إلى + 14 تهمة الدول الجزء سينب إف سليمة بعد الفسفرة. أنها تشير إلى عدد سكانها أنواع مع 0، 1، 2، 3، و 4 استرات الفوسفات. لتحديد نسبة كل نوع من الأنواع إلى كمية البروتين الكلي، مرتفعات ذروة مصممون ومقارنة (الجدول 1). وهذا الرقم تم تعديل من10 واستنسخ بإذن من الناشر تايلور وفرانسيس. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Figure 3
الشكل 3: التحقق الوظيفي: الطفرات فوسفوميميتيك من سينب و يقلل بشدة التفاعل مع α كاريوفيرين مستقبلات النقل النووي. (ومنألف) تنقية الشظايا و سينب (بقايا 2,987-3,065) (0.1 ملغ) وتنقية كاريوفيرين α (0.7 ملغ) وكانت مختلطة بنسبة 1:1 المولى وتحليلها بواسطة حجم الاستبعاد اللوني. تم أيضا تحليل الشظايا سينب-F و α كاريوفيرين فردياً. ويرد تحليل الحزب الديمقراطي الصربي صفحة من الكسور الذروة. يتم الإشارة إلى شطف وحدات التخزين في الجزء السفلي (بزيادات مقدارها 0.6 مل). على اليسار، يتم الإشارة إلى مواقع الفرق علامة الوزن الجزيئي وكتلها في كاتشين. علامات نجمية آثار متبقية ضريبة السلع والخدمات (الجلوتاثيون S-ترانسفيراز). (أ) كاريوفيرين α-(ب) شطف التشكيلات الجانبية. امتصاص في 280 nm المرسومة مقابل حجم شطف. يتم تراكب الشخصية شطف ل α كاريوفيرين (أحمر) مع التشكيلات شطف مخاليط من α كاريوفيرين مع الشظايا و سينب (البرية من نوع: الأخضر؛ والمسخ فوسفوميميتيك S3048D: الأزرق). لاحظ أن إضافة جزء سينب إف البرية من نوع التحولات حجم شطف ذروة α كاريوفيرين إلى كتلة أعلى، وما يتسق مع ربط الجزء البري من نوع سينب-F. لم يلاحظ هذا التحول عند إضافة جزء سينب إف مع الطفرة فوسفوميميتيك S3048D، مما يوحي بأن الطفرة فوسفوميميتيك يقلل إلى حد كبير التفاعل بين سينب و كاريوفيرين α-(ج) يفتت البرية من نوع إف سينب (wt) و كاريوفيرين α-(د) يفتت wt سينب إف. (ه) S3048D و سينب يفتت وكاريوفيرين α. S3048D و سينب (F) جزء. تم إنشاء هذا الرقم مع البيانات من10. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

الجدول 1 ألف. وتوقع تسلسل الجزء و سينب (بقايا 2987-3065) مع مواقع الفسفرة Cdk1 على حدة وأبرز حجم خط أكبر. العبارات الشظايا تريبتيك وأبرزت بخط غامق.
جبلجسققسكقدسرجسبلجبففبجبSبيبسفتيكرلسجقنكاس
جكرقرسجيوينججبتيالسلطة الفلسطينيةتيبيSفسكسكافمسجيهباي
الجدول 1 باء. تحليل الطيف الكتلي لحالها سينب-F
مير 84 بعد الفسفرة في المختبر مع ب Cdk1/cyclin
# الفسفرة المواقع (ع) تم الكشف عن تحميل الفوسفات أعربت كنسبة مئوية من مجموع البروتين
سينب إف 2987-3065 ف 0 6%
1 ف 37%
ف 2 40%
ف 3 15 ٪
ف 4 3%
الجدول 1 تحليل الطيف الكتلي من الببتيدات تريبتيك سينب-وبعد الفسفرة في المختبر مع ب Cdk1/cyclin
# مواقع الفسفرة تحميل الفوسفات
فوسفوبيبتيدي تريبتيك، ف 0 57 في المائة
بقايا 2995-3016 1 ف 43%
فوسفوبيبتيدي تريبتيك، ف 0 7 في المائة
بقايا 3031-3052 1 ف 64%
ف 2 29 في المائة
ف 3 1%

الجدول 1: كتلة تحليل الطيف الجزء سينب إف بعد الفسفرة في المختبر مع باء Cdk1/cyclin تم إنشاء هذا الجدول مع بيانات من10.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

لدينا الإنزيم كيناز في المختبر هو وسيلة قوية جداً لتحديد أهداف جزيئية كيناز Cdk1، الذي هو وحدة تحكم رئيسية لدورة الخلية وينظم العديد من العمليات الخلوية الهامة. الأسلوب يحدد إذا كان بروتين المنقي هو ركيزة ل Cdk1، ويسمح لتحديد مواقع محددة الفسفرة. وهذا يسهل الدراسات الميكانيكية لتنظيم العمليات الخلوية من الفسفرة من خلال Cdk1.

العامل الأهم لنجاح تحديد المواقع الفسفرة من الطيف الكتلي هو كفاءة الفسفرة الإنزيم كيناز. كفاءة الفسفرة من المواقع الفردية التي ينبغي أن تكون على أعلى مستوى ممكن، يفضل أن تكون 100%. يمكن تحقيق هذا بزيادة مقدار ب Cdk1/cyclin وزيادة فترة الحضانة إلى ح 16. عند حساب مبلغ Cdk1/cyclin ب حاجة إلى التركيز المولى للبروتين وعدد الفسفرة ينبغي النظر في مواقع. وهذا مهم بشكل خاص إذا كانت مواقع الفسفرة متعددة موجودة في البروتين الهدف. كما تجدر أن نشاط ب Cdk1/cyclin التجارية يمكن أن تختلف من دفعة إلى دفعة، وأن كيناز يمكن أن تفقد النشاط سريعاً. إذا لم تنجح في المختبر الفسفرة، من المستحسن اختبار نشاط كيناز. يمكن أن تستخدم كعنصر إيجابي لاستكشاف الأخطاء وإصلاحها، في المختبر الفسفرة من سينب-F (بقايا 2,987-3,065). كعنصر تحكم سلبية، ينبغي إجراء رد فعل دون إضافة ب Cdk1/cyclin وتحليلها. التحكم السلبي مفيد آخر هو استخدام متحولة كيناز-الميت من Cdk1، وحفازه نشطة، بسبب48،47،طفرة نقطة بسيطة (D146N)49. وبالإضافة إلى ذلك، للتحقق من المواقع التي تم تحديدها الفسفرة، إصدار فوسفونيجاتيفي من البروتين المستهدف يمكن إنشاء، حيث يتم استبدال المواقع الفسفرة الانينيس. إذا كانت المواقع الفسفرة المحددة صحيحة، لا يمكن أن يكون المسخ فوسفونيجاتيفي المقابلة فوسفوريلاتيد في المختبر.

أداة بسيطة للكشف عن الفسفرة ناجحة من البروتين المستهدف هو مقايسة تحول جل الحزب الديمقراطي الصربي صفحة بسيطة الموصوفة هنا. عادة تهاجر البروتينات فوسفوريلاتيد أبطأ في الحزب الديمقراطي الصربي صفحة من نظرائهم أونفوسفوريلاتيد، نظراً لحجم المضافة والرسوم السلبية. لاحظ أن للبروتينات الكبيرة، مطلوب الأمثل لتحليل صفحة الحزب الديمقراطي الصربي لتعزيز القرار بما فيه الكفاية لتصور التحول هلام. أداة مفيدة لفصل محدد من البروتينات فوسفوريلاتيد ملزم الفوسفات الوسم (العلامة فوس) الحزب الديمقراطي الصربي صفحة. هي تصور البروتينات فوسفوريلاتيد في جل أعد مع الاكريلاميد فوس، العلامة كنطاقات ترحيل أبطأ بالمقارنة مع المقابلة ديفوسفوريلاتيد البروتينات50،51.

للحصول على الأطياف عالية الجودة الشامل، من المهم جداً أن البروتين للمقايسة كيناز في المختبر نقية ومتجانسة. لدينا بروتوكول تنقية يحقق ذلك من خلال الجمع بين العديد من الخطوات اللوني انتقائية للغاية، ومنع تدهور البروتين والأكسدة عن طريق إضافة مثبطات البروتياز وتاشيب. يمكن تعديل البروتوكول تنقية الوت البروتين بواسطة الجلوتاثيون (أي، مع علامة GST سليمة)؛ بيد أنه ينبغي الإشارة إلى أن يضيف علامة GST كاتشين 25 آخر، والبروتينات الكبيرة هي تحدي أهداف الطيف الكتلي. وبدلاً من ذلك، لدينا بروتوكول تنقية لبلده6-يمكن أيضا استخدام علامة الانصهار البروتينات.

يمكن تعديل هذا البروتوكول أيضا على تحديد مواقع الفسفرة التي محددة لأخرى مؤنزم. والشرط الوحيد أن كيناز النقية المتاحة ونشطة ومستقرة بما فيه الكفاية. شروط المقايسة تحتاج إلى تعديل لكل كيناز لتحقيق أقصى قدر من النشاط. وتشمل المعلمات لتحسين الكمية في كيناز ورد فعل المخزن المؤقت (درجة الحموضة وتركيز الملح)، وقت الحضانة، ورد فعل درجة الحرارة وتركيز ATP. وقد استخدمت بنجاح في المختبر فحوصات كيناز لتحديد مواقع الفسفرة للعديد من مؤنزم بما في ذلك بلكس (مثل بولو مؤنزم)52،،من5354، و MAPK/إيرك مؤنزم (mitogen تنشيط البروتين مؤنزم/خارج الخلية-إشارة-وينظم مؤنزم)،من5556.

أن قوة هذا الأسلوب لتحديد مواقع محددة الفسفرة في بروتين المنقي، فتجدر الإشارة إلى أن موقع الفسفرة التي تعد هدفا ل Cdk1 في المختبر قد لا تكون بالضرورة فوسفوريلاتيد في فيفو. O في فيف، آليات تنظيمية إضافية في مكان، والتي يمكن أن تجعل موقع الفسفرة غير قابلة للوصول للاعتراف من جانب Cdk1. على سبيل المثال، قد يكون الشركاء التفاعل الإضافي الحالي في فيفو، التي يمكن أما إخفاء موقع الفسفرة أو جعله متاحاً من خلال التغيرات الهيكلية. وعلاوة على ذلك، يلزم الركيزة كولوكاليزي ب Cdk1/cyclin في النواة في مرحلة G2 كي تكون فوسفوريلاتيد. وبالإضافة إلى ذلك، يمكن أن تؤثر التعديلات بوستترانسلاشونال أو غيرها من العمليات التنظيمية تأكيد الهدف البروتين في فيفو، التي يمكن أن تجعل موقع الفسفرة التي يتعذر الوصول إليها. يمكن التغلب على هذه القيود من خلال تصميم التجارب المناسبة في الخلايا أو النماذج الحيوانية التي تتحقق من أن المواقع المحددة الفسفرة لها وظيفة فسيولوجية. هنا، نحن نستخدم مقايسة ربط بسيط للتحقق الوظيفية، حيث يقلل من الفسفرة تفاعل و سينب مع كاريوفيرين α-وظيفية التحقق أيضا ينبغي أن يجري في سياق الخلايا أو نموذج حيوان. ولذلك، نحن أيضا transfected البروتينات الفلورية الانصهار سينب-واﻷجزاء الواردة أدى إلى خلايا هيلا10. الطفرات فوسفوميميتيك داخل أدى سينب إف تضاءل التعريب النووية، التي أكدت وظيفة فسيولوجية من هذه المواقع الفسفرة10.

تتوفر أدوات عدة لوظيفية التحقق من مواقع الفسفرة في الخلايا أو في نماذج حيوانية. الطفرات فوسفوميميتيك، التي تحاكي آثار الفسفرة التي تهم السلبية، تستخدم على نطاق واسع لهذا الغرض. لهذه، يتم استبدال الموقع الفسفرة (سيرين أو ثريونين) اسبارتاتي أو الغلوتامات. الميزة أن المطلوب فقط طفرة نقطة من البروتين الهدف. من الجدير، بينما الطفرات فوسفوميميتيك استخدمت بنجاح في كثير من الحالات للتحقق الوظيفية، أنها خاصة تعمل في الحالات التي تكون فيها التغييرات تهمة المساهم الغالبة للتنظيم بدلاً من تغيير هيكلي. الطفرات فوسفوميميتيك تفشل لمحاكاة آثار الفسفرة في العديد من الحالات الأخرى (مثلاً، 11). ومع ذلك، النهج الأخرى متوفرة للتحقق الوظيفي الفسفرة المواقع، بما في ذلك استخدام الطفرات فوسفونيجاتيفي: منع هذه الطفرات الفسفرة بالاستعاضة عن مواقع الفسفرة مع ألانين. آخر نهجاً مفيداً للتحقق الوظيفية في سياق الخلوية هو تعبير عن متحولة كيناز-الميت من Cdk1، الذي هو غير نشط48،47،نقطة سهلة لإدخال طفرة (D146N)49. جدير بالذكر أن عدة مثبطات Cdk1 جزيء صغير متوفرة تجارياً مثل فلافوبيريدول وعماني-3306، التي يمكن استخدامها في الدراسات الوظيفية أما في الخلايا أو نماذج حيوانية7،،من811. هذه الموانع تتسم جيدا، وعدد في التجارب السريرية لعلاج السرطان (انظر استعراض9).

بينما تم تحديد عدد كبير من المواقع الفسفرة البروتين في دراسات البروتين، خصوصية كيناز في معظم الحالات غير معروف، والمقايسة كيناز في المختبر إحدى الطرق القليلة المتاحة للتعرف على ركائز Cdk1. وقد استخدمت أيضا نهج أخرى. وحددت أهداف Cdk1 باستخدام إنزيم Cdk1 هندسيا. جيب ملزم الركيزة أكبر ويقبل إصدارات ضخمة أكثر من ATP ك الركيزة6. لا يمكن ربط هذه الركيزة الضخمة مؤنزم البرية من نوع. استخراج إضافة ATP الضخمة راديولابيليد لخلية التي تحتوي على الإنزيم Cdk1 معدلة وبالتالي يؤدي إلى العلامات المحددة لركائز مباشرة من Cdk1. وحددت أهدافا Cdk1 200 في مهدها الخميرة مع هذا الأسلوب؛ ومع ذلك، أنه لا يمكن تطبيق إلى خلايا الثدييات، الذي هو حد حاسم. في دراسة أخرى، حددت ركائز Cdk1 في خلايا زراعة الأنسجة البشرية عن طريق إجراء تحليل كمي فوسفوبروتيوميكس استخدام مثبطات جزيء صغير اثنين من Cdk1 وفلافوبيريدول و 3306 ريال عماني. 1215 فوسفوبيبتيديس على البروتينات 551 خفضت إلى حد كبير عند إضافة مثبطات Cdk17. هذا الأسلوب يمكن أن الشاشة البروتين كامل لأهداف Cdk1 المحتملة، ولكن ينتج عنه ضرورة أهداف يمكن التحقق منها، مثلاً، كيناز في المختبر الاعتداء.

في المستقبل، سيتم المحتمل أن الجمع بين الإنزيم كيناز في المختبر مع شاشات عالية الإنتاجية لركائز Cdk1 التي حاليا قيد التطوير. نظراً للعدد الكبير من ركائز Cdk1 في البروتين، العديد من ركائز Cdk1 البشرية تظل هويته، والمقايسة كيناز في المختبر ستكون أداة هامة لتحديد وتعيين، وتحقق من هذه المواقع.

والرزن كيناز في المختبر أداة قوية لتحديد أهداف كيناز Cdk1 وتحديد مواقع محددة الفسفرة. ويمكن تحديد هذه المواقع الفسفرة الدراسات الميكانيكية لتنظيم العمليات الخلوية التي Cdk1.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

الكتاب ليس لها علاقة بالكشف عن.

Acknowledgments

ونحن نشكر الدكتور ديفيد كينغ، معهد هاوارد هيوز الطبي، جامعة كاليفورنيا في بيركلي لتحليل الطيف الكتلي وتعليقات مفيدة. ونحن نشكر الدكتور تشو شوليان، شانغهاي، معاهد "العلوم البيولوجية"، والأكاديمية الصينية للعلوم، شنغهاي، الصين لتوفير بنية سينب إف كاملة طول. وأخيراً، نشكر الدكتورة سوزان لعنة، والدكتور ريان كالاهان، والدكتور كريستوف جريوير في جامعة بنغهامتون للحصول على المعدات. تم تمويل هذا البحث من "مؤسسة البحوث" لجامعة ولاية نيويورك، وقسم الكيمياء، "الدولة جامعة نيويورك" في بنغهامتون.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
2800 mL baffled Fernbach flask Corning 44232XL
ampicillin Gold Biotechnology A-301-25
ATP Fisher Scientfiic BP413-25
benzamidine hydrochloride Millipore Sigma B6506-25
bottletop filter Corning 431161
Cdk1/cyclin B recombinant, human 20,000 U/mL New England Biolabs P6020
Cdk1/cyclin B (alternate source) EMD Millipore 14-450
Cdk1/cyclin B (alternate source) Invitrogen PV3292
Cdk1/cyclin B + 10x PK buffer New England Biolabs P6020
CENP-F (residues 2987 – 3065) pGEX6P1 plasmid Available upon request.
centrifuge: Heraeus Multifuge X3R, cooled, with TX-1000 swing-out rotor Thermo Scientific 10033-778
centrifugal filter units: Amicon Ultra-15 centrifugal filter units, 3 kDa cutoff, Ultracel-PL membranes EMD Millipore UFC900324
chlorampenicol Gold Biotechnology C-105-100
D/L methionine Agros Organics / Fisher 125650010
desalting pipet tips: Zip tips Millipore Sigma ZTC18S008
disposable chromatography columns, Econo-Pac 1.5 x 12 cm Biorad 7321010
dithiothreitol Gold Biotechnology DTT50
E. coli Rosetta 2(DE3)pLysS strain EMD Millipore 71403
electrospray ionization Fourier transform ion Bruker Amazon Apex III
cyclotron resonance mass spectrometer
electrospray ionization ion trap mass spectrometer Bruker Amazon custom
fixed angle rotor: Fiberlite F15-8x-50cy Thermo Scientific 97040-276
FPLC system: Äkta Pure FPLC GE Healthcare 29032697
Gel filtration column: Superdex 200 Increase 10/300 GL GE Healthcare 28990944
glutathione agarose Pierce 16101
glutathione, reduced Millipore Sigma G4251-50g
incubation shaker: multitron shaker Infors I10102
isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside Gold Biotechnology I2481C50
kanamycin Gold Biotechnology K-120-25
karyopherin α pet-28a pres plasmid Available upon request.
Luria Bertani medium Fisher Scientfiic BP1426-2
microcentrifuge 5418R, refrigerated Eppendorf 5401000013
microtubes (0.5 mL) Eppendorf 30121023
microtubes (1.5 mL) Eppendorf 30120086
Nickel affinity gel: His-Select Nickel affinity gel Millipore Sigma P6611-100ml
pGEX-6P-1 plasmid Millipore Sigma GE28-9546-48
phenylmethylsulfonyl fluoride Gold Biotechnology P470-10
PS protease: PreScission protease GE Healthcare 27084301
Phos-tag acrylamide Wako Pure Chem. Ind. 304-93521
reduced gluthathione Millipore Sigma G4251-50g
roundbottom centrifuge tubes (Oakridge tubes) Fisher Scientfiic 055291D
site-directed mutagenesis kit: QuikChange Lightning Agilent 210518
Site-Directed Mutagenesis Kit
sonifier: Branson S-250D sonifier Branson 15 338 125
Spectra/Por 1RC dialysis membrane (6-8 kDa cutoff) Spectrum Labs 08 670B
swing out rotor TX-1000 Thermo Scientific 10033-778

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Nurse, P. Cyclin dependent kinases and cell cycle control (Nobel Lecture). ChemBioChem. 3, (7), 596-603 (2002).
  2. Lee, M. G., Nurse, P. Complementation used to clone a human homologue of the fission yeast cell cycle control gene cdc2. Nature. 327, 31 (1987).
  3. Lohka, M. J., Hayes, M. K., Maller, J. L. Purification of maturation-promoting factor, an intracellular regulator of early mitotic events. Proc Natl Acad of Sci U S A. 85, (9), 3009-3013 (1988).
  4. Gautier, J., Norbury, C., Lohka, M., Nurse, P., Maller, J. Purified maturation-promoting factor contains the product of a Xenopus homolog of the fission yeast cell cycle control gene. Cell. 54, (3), 433-439 (1988).
  5. Gautier, J., Minshull, J., Lohka, M., Glotzer, M., Hunt, T., Maller, J. L. Cyclin is a component of maturation-promoting factor from Xenopus. Cell. 60, (3), 487-494 (1990).
  6. Ubersax, J. A., Woodbury, E. L., Quang, P. N., Paraz, M., Blethrow, J. D., Shah, K., Shokat, K. M., Morgan, D. O. Targets of the cyclin-dependent kinase Cdk1. Nature. 425, (6960), 859-864 (2003).
  7. Petrone, A., Adamo, M. E., Cheng, C., Kettenbach, A. N. Identification of Candidate Cyclin-dependent kinase 1 (Cdk1) Substrates in Mitosis by Quantitative Phosphoproteomics. Mol Cell Proteomics. 15, (7), 2448-2461 (2016).
  8. Vassilev, L. T., Tovar, C., Chen, S., Knezevic, D., Zhao, X., Sun, H., Heimbrook, D. C., Chen, L. Selective small-molecule inhibitor reveals critical mitotic functions of human CDK1. Proc Natl Acad of Sci U S A. 103, (28), 10660-10665 (2006).
  9. Balakrishnan, A., Vyas, A., Deshpande, K., Vyas, D. Pharmacological cyclin dependent kinase inhibitors: Implications for colorectal cancer. World J Gastroenterol. 22, (7), 2159-2164 (2016).
  10. Loftus, K. M., Coutavas, E., Cui, H., King, D., Ceravolo, A., Pereiras, D., Solmaz, S. Mechanism for G2 phase-specific nuclear export of the kinetochore protein CENP-F. Cell Cycle. 16, (15), 1414-1429 (2017).
  11. Baffet, A. D., Hu, D. J., Vallee, R. B. Cdk1 activates pre-mitotic nuclear envelope dynein recruitment and apical nuclear migration in neural stem cells. Dev Cell. 33, (6), 703-716 (2015).
  12. Songyang, Z., Blechner, S., Hoagland, N., Hoekstra, M. F., Piwnica-Worms, H., Cantley, L. C. Use of an oriented peptide library to determine the optimal substrates of protein kinases. Curr Biol. 4, (11), 973-982 (1994).
  13. Malumbres, M. Cyclin-dependent kinases. Genome Biol. 15, (6), 122 (2014).
  14. Peeper, D. S., Parker, L. L., Ewen, M. E., Toebes, M., Hall, F. L., Xu, M., Zantema, A., van der Eb, A. J., Piwnica-Worms, H. A- and B-type cyclins differentially modulate substrate specificity of cyclin-cdk complexes. EMBO J. 12, (5), 1947-1954 (1993).
  15. Trembley, J., Ebbert, J., Kren, B., Steer, C. Differential regulation of cyclin B1 RNA and protein expression during hepatocyte growth in vivo. Cell Growth Differ. 7, (7), 903-916 (1996).
  16. Pines, J., Hunter, T. The differential localization of human cyclins A and B is due to a cytoplasmic retention signal in cyclin B. EMBO J. 13, (16), 3772-3781 (1994).
  17. Morgan, D. O. Principles of CDK regulation. Nature. 374, 131 (1995).
  18. Larochelle, S., Merrick, K. A., Terret, M. -E., Wohlbold, L., Barboza, N. M., Zhang, C., Shokat, K. M., Jallepalli, P. V., Fisher, R. P. Requirements for Cdk7 in the assembly of Cdk1/cyclin B and activation of Cdk2 revealed by chemical genetics in human cells. Mol cell. 25, (6), 839-850 (2007).
  19. Parker, L. L., Sylvestre, P. J., Byrnes, M. J., Liu, F., Piwnica-Worms, H. Identification of a 95-kDa WEE1-like tyrosine kinase in HeLa cells. Proc Natl Acad of Sci U S A. 92, (21), 9638-9642 (1995).
  20. Atherton-Fessler, S., Parker, L. L., Geahlen, R. L., Piwnica-Worms, H. Mechanisms of p34cdc2 regulation. Mol Cell Biol. 13, (3), 1675-1685 (1993).
  21. Liu, F., Stanton, J. J., Wu, Z., Piwnica-Worms, H. The human Myt1 kinase preferentially phosphorylates Cdc2 on threonine 14 and localizes to the endoplasmic reticulum and Golgi complex. Mol Cell Biol. 17, (2), 571-583 (1997).
  22. McGowan, C. H., Russell, P. Human Wee1 kinase inhibits cell division by phosphorylating p34cdc2 exclusively on Tyr15. EMBO J. 12, (1), 75-85 (1993).
  23. Strausfeld, U., Labbé, J. C., Fesquet, D., Cavadore, J. C., Picard, A., Sadhu, K., Russell, P., Dorée, M. Dephosphorylation and activation of a p34cdc2/cyclin B complex in vitro by human CDC25 protein. Nature. 351, 242 (1991).
  24. Leuken, R., Clijsters, L., Wolthuis, R. To cell cycle, swing the APC/C. Biochim Biophys Acta. 1786, (1), 49-59 (2008).
  25. Acquaviva, C., Pines, J. The anaphase-promoting complex/cyclosome: APC/C. J Cell Sci. 119, (12), 2401-2404 (2006).
  26. Zhu, X., Chang, K. -H., He, D., Mancini, M. A., Brinkley, W. R., Lee, W. -H. The C-terminus of mitosin is essential for its nuclear localization, centromere/kinetochore targeting, and dimerization. J Biol Chem. 270, (33), 19545-19550 (1995).
  27. Liao, H., Winkfein, R. J., Mack, G., Rattner, J. B., Yen, T. J. CENP-F is a protein of the nuclear matrix that assembles onto kinetochores at late G2 and is rapidly degraded after mitosis. J Cell Biol. 130, (3), 507-518 (1995).
  28. Rattner, J. B., Rao, A., Fritzler, M. J., Valencia, D. W., Yen, T. J. CENP-F is a ca 400 kDa kinetochore protein that exhibits a cell-cycle dependent localization. Cell Motil Cytoskeleton. 26, (3), 214-226 (1993).
  29. Christie, M., Chang, C. -W., Rona, G., Smith, K. M., Stewart, A. G., Takeda, A. A. S., Fontes, M. R. M., Stewart, M., Vertessy, B. G., Forwood, J. K., Kobe, B. Structural biology and regulation of protein import into the nucleus. J Mol Biol. 428, (10A), 2060-2090 (2016).
  30. Zuccolo, M., Alves, A., Galy, V., Bolhy, S., Formstecher, E., Racine, V., Sibarita, J. B., Fukagawa, T., Shiekhattar, R., Yen, T., Doye, V. The human Nup107/160 nuclear pore subcomplex contributes to proper kinetochore functions. EMBO J. 26, 1853-1864 (2007).
  31. Bolhy, S., Bouhlel, I., Dultz, E., Nayak, T., Zuccolo, M., Gatti, X., Vallee, R., Ellenberg, J., Doye, V. A Nup133-dependent NPC-anchored network tethers centrosomes to the nuclear envelope in prophase. J Cell Biol. 192, (5), 855-871 (2011).
  32. Hu, D. J., Baffet, A. D., Nayak, T., Akhmanova, A., Doye, V., Vallee, R. B. Dynein recruitment to nuclear pores activates apical nuclear migration and mitotic entry in brain progenitor cells. Cell. 154, (6), 1300-1313 (2013).
  33. Vergnolle, M. S., Taylor, S. S. Cenp-F links kinetochores to Ndel1/Nde1/Lis1/Dynein microtubule motor complexes. Curr Biol. 17, (13), 1173-1179 (2007).
  34. Yang, Z. Y., Guo, J., Li, N., Qian, M., Wang, S. N., Zhu, X. L. Mitosin/CENP-F is a conserved kinetochore protein subjected to cytoplasmic dynein-mediated poleward transport. Cell Res. 13, (4), 275-283 (2003).
  35. Yang, Z., Guo, J., Chen, Q., Ding, C., Du, J., Zhu, X. Silencing mitosin induces misaligned chromosomes, premature chromosome decondensation before anaphase onset, and mitotic cell death. Mol Cell Biol. 25, (10), 4062-4074 (2005).
  36. Xue, Y., Ren, J., Gao, X., Jin, C., Wen, L., Yao, X. GPS 2.0, a tool to predict kinase-specific phosphorylation sites in hierarchy. Mol Cell Proteomics. 7, (9), 1598-1608 (2008).
  37. Song, C., Ye, M., Liu, Z., Cheng, H., Jiang, X., Han, G., Songyang, Z., Tan, Y., Wang, H., Ren, J., Xue, Y., Zou, H. Systematic analysis of protein phosphorylation networks from phosphoproteomic data. Mol Cell Proteomics. 11, (10), 1070-1083 (2012).
  38. UniProt-Consortium. UniProt: the universal protein knowledgebase. Nucleic Acids Res. 45, (D1), D158-D169 (2017).
  39. Olsen, J. V., Vermeulen, M., Santamaria, A., Kumar, C., Miller, M. L., Jensen, L. J., Gnad, F., Cox, J., Jensen, T. S., Nigg, E. A., Brunak, S., Mann, M. Quantitative phosphoproteomics reveals widespread full phosphorylation site occupancy during mitosis. Science Signal. 3, (104), ra3 (2010).
  40. Dephoure, N., Zhou, C., Villén, J., Beausoleil, S. A., Bakalarski, C. E., Elledge, S. J., Gygi, S. P. A quantitative atlas of mitotic phosphorylation. Proc Natl Acad of Sci U S A. 105, (31), 10762-10767 (2008).
  41. Rona, G., Marfori, M., Borsos, M., Scheer, I., Takacs, E., Toth, J., Babos, F., Magyar, A., Erdei, A., Bozoky, Z., Buday, L., Kobe, B., Vertessy, B. G. Phosphorylation adjacent to the nuclear localization signal of human dUTPase abolishes nuclear import: structural and mechanistic insights. Acta Cryst D. 69, (12), 2495-2505 (2013).
  42. Harreman, M. T., Kline, T. M., Milford, H. G., Harben, M. B., Hodel, A. E., Corbett, A. H. Regulation of nuclear import by phosphorylation adjacent to nuclear localization signals. J Biol Chem. 279, (20), 20613-20621 (2004).
  43. Kosugi, S., Hasebe, M., Tomita, M., Yanagawa, H. Systematic identification of cell cycle-dependent yeast nucleocytoplasmic shuttling proteins by prediction of composite motifs. Proc Natl Acad Sci U S A. 106, (25), 10171-10176 (2009).
  44. McLachlin, D. T., Chait, B. T. Analysis of phosphorylated proteins and peptides by mass spectrometry. Curr Opin Chem Biol. 5, (5), 591-602 (2001).
  45. Van Berkel, G. J., Glish, G. L., McLuckey, S. A. Electrospray ionization combined with ion trap mass spectrometry. Anal Chem. 62, (13), 1284-1295 (1990).
  46. Hodel, A. E., Harreman, M. T., Pulliam, K. F., Harben, M. E., Holmes, J. S., Hodel, M. R., Berland, K. M., Corbett, A. H. Nuclear localization signal receptor affinity correlates with in vivo localization in Saccharomyces cerevisiae. J Biol Chem. 281, (33), 23545-23556 (2006).
  47. Hong, K. U., Kim, H. -J., Kim, H. -S., Seong, Y. -S., Hong, K. -M., Bae, C. -D., Park, J. Cdk1-Cyclin B1-mediated Phosphorylation of Tumor-associated Microtubule-associated Protein/Cytoskeleton-associated Protein 2 in Mitosis. J Biol Chem. 284, (24), 16501-16512 (2009).
  48. Meraldi, P., Lukas, J., Fry, A. M., Bartek, J., Nigg, E. A. Centrosome duplication in mammalian somatic cells requires E2F and Cdk2–Cyclin A. Nature Cell Biol. 1, 88 (1999).
  49. Heuvel, S., Harlow, E. Distinct roles for cyclin-dependent kinases in cell cycle control. Science. 262, (5142), 2050-2054 (1993).
  50. Kinoshita, E., Kinoshita-Kikuta, E., Takiyama, K., Koike, T. Phosphate-binding Tag, a New Tool to Visualize Phosphorylated Proteins. Mol Cell Proteomics. 5, (4), 749-757 (2006).
  51. Takeda, H., Kawasaki, A., Takahashi, M., Yamada, A., Koike, T. Matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight mass spectrometry of phosphorylated compounds using a novel phosphate capture molecule. Rapid Commun Mass Spectrom. 17, (18), 2075-2081 (2003).
  52. Linder, M. I., Köhler, M., Boersema, P., Weberruss, M., Wandke, C., Marino, J., Ashiono, C., Picotti, P., Antonin, W., Kutay, U. Mitotic Disassembly of Nuclear Pore Complexes Involves CDK1- and PLK1-Mediated Phosphorylation of Key Interconnecting Nucleoporins. Dev Cell. 43, (2), (2017).
  53. Arai, T., Haze, K., Iimura-Morita, Y., Machida, T., Iida, M., Tanaka, K., Komatani, H. Identification of β-catenin as a novel substrate of polo-like kinase 1. Cell Cycle. 7, (22), 3556-3563 (2008).
  54. Hansen, D. V., Tung, J. J., Jackson, P. K. CaMKII and Polo-like kinase 1 sequentially phosphorylate the cytostatic factor Emi2/XErp1 to trigger its destruction and meiotic exit. Proc Natl Acad of Sci U S A. 103, (3), 608-613 (2006).
  55. Zhang, Y., Dong, Z., Nomura, M., Zhong, S., Chen, N., Bode, A. M., Dong, Z. Signal Transduction Pathways Involved in Phosphorylation and Activation of p70S6K Following Exposure to UVA Irradiation. J Biol Chem. 276, (24), 20913-20923 (2001).
  56. Richard, D. E., Berra, E., Gothié, E., Roux, D., Pouysségur, J. p42/p44 Mitogen-activated Protein Kinases Phosphorylate Hypoxia-inducible Factor 1α (HIF-1α) and Enhance the Transcriptional Activity of HIF-1. J Biol Chem. 274, (46), 32631-32637 (1999).
تحديد كيناز Cyclin تعتمد على 1 مواقع الفسفرة محددة من قبل كيناز <em>في المختبر</em> الاعتداء
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Cui, H., Loftus, K. M., Noell, C. R., Solmaz, S. R. Identification of Cyclin-dependent Kinase 1 Specific Phosphorylation Sites by an In Vitro Kinase Assay. J. Vis. Exp. (135), e57674, doi:10.3791/57674 (2018).More

Cui, H., Loftus, K. M., Noell, C. R., Solmaz, S. R. Identification of Cyclin-dependent Kinase 1 Specific Phosphorylation Sites by an In Vitro Kinase Assay. J. Vis. Exp. (135), e57674, doi:10.3791/57674 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
simple hit counter