Summary
이 프로토콜에는 구두 노출 및 감염 세균성 병원 체, 과일 파리 초파리 melanogaster 하 고 전염 성 박테리아 헛간 창 자 감염을 다음의 수를 측정 하는 방법을 설명 합니다. 우리는 더 비행 생존 다음 구강 세균 감염에 면역 돌연변이의 효과 설명 합니다.
Abstract
과일 파리 초파리 melanogaster 감염 및 타고 난 면제의 최고의 개발된 모델 시스템 중 하나입니다. 대부분의 작업은 조직의 감염을 중점적으로, 구두로 파리 감염 방법이 필요로 하는 병원 균을 창 자 immunocompetence의 메커니즘에 대 한 관심의 최근 증가 되었습니다. 여기 선물이 구두로 개별 파리 기회 주의 세균성 병원 체 (녹 농 균)와 D. melanogaster (녹 entomophila)의 자연 스러운 세균성 병원 체에 노출 하는 프로토콜. 이 프로토콜의 목표는 이러한 병원 균을 남성과 여성의 파리를 노출 하는 강력한 방법을 제공. 우리는 관련 병원 체의 전송에 있는 연구에 대 한 생존 고기, 미생물 부하, 흘리기, 박테리아를 보여주는 대표적인 결과 제공 합니다. 마지막으로, 우리 확인 Dcy 돌연변이 (창 자 상피의 보호 peritrophic 매트릭스 부족) 및 돌연변이 (부족 기능 면역 결핍 (IMD) 통로) 양념, 구강 세균 감염에 걸릴 표시. 이 프로토콜은 따라서, 파리 감염, 창 자 감염 결과 세균 전송에 변화의 다양 한 유전과 환경 자원의 연구에 확장 될 수 있는 구강 경로 사용 하 여 감염 하는 강력한 방법을 설명 합니다.
Introduction
과일 파리 (로 알려진 식초 비행), D. melanogaster, 광범위 하 게 사용 되었습니다 모델 생물으로 감염 및 병원 체1,2의 다양 한에 대 한 면역에 대 한. 이 작품은 감염의 생리 적인 결과에 대 한 근본적인 통찰력을 제공 하고있다 하 고 또한 기본 parasitoid, 세균, 곰 팡이, 및 바이러스 감염에 대 한 호스트 면역 반응을 분자 경로 탈피에 개척 했다. 이 지식 뿐만 아니라 곤충과 다른 무척 추 동물의 타고 난 면역 반응을 이해 하는 데 유용 하지만 초파리 발견이는 했다 면역 메커니즘의 많은 곤충과 포유류 사이 보존 진화론은, 때문에 또한 있다 포유류에서 주요 면역 메커니즘의 인간3를 포함 하 여.
Drosophila 감염 및 면역에 대부분 작업 조직의 감염, 샤프트의 또는 분사4,,56곤충의 몸으로 직접 병원 균을 제공 하는 접종 방법을 사용 하 여에 집중 했다. 허용 제어 감염 복용량의 납품에이 방법의 장점은 명확 하 고 조직의 감염에 대 한 작업의 큰 몸에 의해 지원. 그러나 D. melanogaster 의 많은 자연적 사건 세균 병원 균 용기 immunocompetence 호스트 방어7,8, 에 중요 한 역할을 담당 하는 유기 물 분해에 먹이 통해 취득 되는, 9 , 10 , 11 , 12 , 13 , 14 , 15. 조직의 감염을 사용 하는 실험 이러한 방어를 무시 하 고, 따라서 곤충 자연 병원 균에 대 한 방어를 탑재 하는 방법의 완전히 다른 그림을 제공. 이것은 특히 관련 된 작업의 목표 어디 자연 병원 체의 사용 및 감염의 경로 중요 한16,17생태와 감염의 진화에 대 한 예측을 테스트 하는 경우 이다. 최근 작품 병원 체에 의해 크게 촬영 경로 질병 결과18,19에 미치는 영향을 강조 했다, 고유 면역 경로20,21elicits의 보호 효과 확인할 수 있습니다. endosymbionts16, 상속 그리고 심지어 플레이 호스트 방어17의 진화에 중요 한 역할을 수 있습니다.
또 다른 이유는 감염의 구두 노선 고용 배설물 배설 구강 감염22,23, 를 다음 중 세균성 흘리기를 측정 하 여 변화 조사 병원 체 전송에서 수 있다는 점입니다 24. 자연 인구25,26, 도전 호스트가 질병 전송에서의 소스를 이해 하지만 전송, 제어 실험실에서 발산 하는 병원 체 등의 구성 요소를 측정 조건27유용한 대체 접근 제공 합니다. 먹이 파리 박테리아와 유전과 환경 컨텍스트 제어 실험 조건에서의 다양 한에서 발산 하는 측정 박테리아, 전송 호스트 사이에서 변이의 소스를 식별 가능 하다.
여기, 우리가 구두 D. melanogaster 세균성 병원 균 감염에 대 한 프로토콜을 설명 하 고 박테리아의 성장을 측정 하 고 흘리기에 대 한 그 다음 (그림 1). 우리 두 슈 도모 나 스 박테리아에이 프로토콜 설명: 피 녹 농 균 (PA14), 기회 주의 병원 체의 악성 긴장 그리고 병원 체 P. entomophila비행 자연의 보다 적게 악성 긴장. Pseudomonads는 광범위 한 호스트 범위, 곤충, 선 충, 식물 및 척추 동물, 감염 일반적인 그람 음성 박테리아 이며 대부분 환경4,6에서 발견 된다. 장 epithelia12,13,,1415, 병리학에서 결과 초파리 피 녹 농 균 및 P. entomophila 의 장 감염 28. 그러나 우리가이 두 세균성 병원 체에 초점을, 여기에 설명 된 방법은 적용할 수 있는 원칙에 작은 수정에 대 한 관심의 모든 세균성 병원 체에. 구두 노출, 다음 우리는 감염 된 후 생존, 측정 하 고 개별 파리 내 미생물 부하 측정 그리고 가능한 미생물 환경, 콜로 니 형성 단위 (CFUs) 표현으로 창 고. 마지막으로, 발생 하기 때문에 창 자 immunocompetence 상피 방 벽 및 체액 응답의 조합에서 우리는 또한 이러한 방어 방해는 비행 거리 선의 생존을 측정 합니다. 특히, Drosocrystallin (Dcy) 돌연변이 이전 용기29에 고갈 된 peritrophic 매트릭스 때문에 구강 세균 감염에 더 취약 되도록 표시 되었습니다. 우리는 또한 IMD 통로30를 통해 그람 음성 세균에 대해 항균 성 펩 티 드 생산에서 장애가 있는 양념 (Rel) 돌연변이에 생존을 측정 합니다.
Protocol
1. 파리를 유지
- 갓 만든된 루이스 매체의 7 mL를 포함 하는 23 mL 플라스틱 튜브에 파리를 유지 (참조31;에서 수정 1 L 트리플 H2O, 6.1 g 한 천, 93.6 g 갈색 설탕, 68 g 옥수수, 18.7 g 인스턴트 이스트, 15 mL Tegosept 곰 팡이 방지 에이전트 소 주) 인큐베이터에서 25 ± 1 ° C에서 12 h:12에서 h 빛: 다크 ~ 60% 습도 주기. 비 흡수 성 목화와 튜브를 연결 합니다.
- 모든 14 일 후 발생 달걀 누워 수 있도록 2-3 일에 대 한 표면에 추가 하는 인스턴트, 건조 효 모와 20-30 성인 새로운 음식 유리병을 전송. 이 기간 후 계란의 표면에 표시 됩니다 확인 합니다. 성인 파리를 제거 합니다.
참고: 이렇게 하면 파리 튜브에 단일 세대, 인구 나이 일치 합니다. - 개발 계란을 둡니다.
참고: 25 ° C에서 성인 파리 시작 eclose pupae에서 날 11 및 12-14 일 동안 계속.
2. 준비 실험 파리
- 효 모 반죽 확산 (혼합 건조 효 모와 75 mL 애플 한 접시 (1 L 증류수 H2O, 30 g 한 천, 33 g 자당, 330 mL 사과 주스, 7 mL Tegosept 곰 팡이 방지 에이전트 트리플)에 인구/배아 컬렉션에에서 부모 세대의 달걀을 수집 땅콩 버터 같은 일관성을 물). 수 분을 제공 하기 위해 감 금 소를 물에 젖은 탈지 면을 추가 합니다.
참고: 애벌레 양육 밀도 차이 의해 발생 하는 효과 혼동을 피하기 위해, 그것은 중요 한 다른 튜브에 실험적인 파리 비슷한 밀도에 reared 있습니다. 위의 단계는 효과 혼동을 피하기 위해 수행 됩니다. - 12 h:12 h에서 25 ° C에서 24 h에 대 한 품 어 빛: 다크 사이클 계란-누워 발생 했습니다 때까지. 24 시간 후 너무 계란 경우 habituation 장기간을 제공 합니다. 애플-한 천 배지를 대체 하 고 더 24 h에 대 한 발생을 낳는 허용.
- 인구 케이지에서 계란 라덴 애플-한 천 배지를 가져가 라. Agar의 표면에서 나머지 효 모 반죽과 어떤 죽은 파리를 제거 합니다.
- 잠수함 1 인산 염 버퍼 식 염 수 (PBS) x 20 mL에 한 천 하 고 부드럽게 잘 붓으로 애플 천에서 계란을 꺼내. PBS에서 일시 중지 하는 동안 50 mL 원심 분리기 튜브에 계란을 전송 및 계란 밑에 침 몰 5 분 두고.
참고: 대부분 계란은 agar의 외부 가장자리에 있다. - 하단의 p1000 필터링 된 피 펫 팁의 4 m m 절단 하 여 제거 하 고 피 펫 팁 50 mL 원심 분리기 튜브의 아래쪽에서 가져온 솔루션의 1 mL를 사용 하 여. Microcentrifuge 1.5 mL 튜브에 이것을 전송 하 고 정착 있습니다.
참고: 때 달걀을 pipetting 스냅 해제 플런저는 부드러운 출시 보다 더 효율적인. - 하단의 p20 필터링 된 피 펫 팁의 4 m m 절단 하 여 제거 합니다. 원하는 볼륨을 피펫으로 설정 하 고 microcentrifuge 튜브의 아래쪽에서 그립니다.
참고: 연습, 5 µ L의 볼륨 약 100 계란을 포함 되어 있습니다. - 음식에 수집 된 계란을 분배 하 고 필요한 양의 시간에 대 한 개발에 그들을 두고.
3. 세균성 문화
- P. entomophila 와 P. 농 균 문화 성장, 30 ° C에서 냉동 세균성 주식 100 µ L와 Luria Bertani (파운드) 국물의 10 mL 접종 (P. entomophila) 와 37 ° C (P. 녹 농 균), 각각. 150 rpm에서 밤새 흔들어. 세균성 문화 채도 단계에 도달 하면 확인 하십시오.
- 보장 하기 위해 파리를 접종에 사용 되는 박테리아에 지 수 단계 있고 다음 아침을 원하는 볼륨의 새로운 subculture에 하룻밤 문화 접종 빠르게 복제. 사전 inoculum subculture 문화의 총 볼륨의 10% 인지 확인 합니다.
참고: 구두 감염 필요 높은 합니다. 그것은 따라서 원하는 복용량 및 실험적인 크기에 대 한 충분 한 접종 문화를 생산할 수 있도록 상당한 양의 세균성 문화를 성장 하는 데 필요한. 얼마나 많은 서브 컬쳐 방정식 MsVs 를 사용 하 여 필요한 감염 복용량을 생산 하기 위해 필요한 계산 = M나Vi, M 문화를 나타냅니다의 광학 밀도 측정 600 nm (OD600) 값과 V에서 대표는 볼륨입니다. 아래 첨자 문자 문화 subculture (s) 또는 (i) 감염 복용량으로 사용 여부를 참조 하십시오. - Subculture의 표면 플라스 크의 슬로프의 시작 부분 (대부분) 바로 위에 떨어지는 그런 볼륨에서 2 L 원뿔 플라스 크에이 하위를 성장. 그것은 박테리아의 성장을 스턴 트 것으로이 마크 위에 작성 하지 마십시오.
- OD 매 30 분을 측정 하 여 지 수 성장 단계에이 subculture에 박테리아가 확인 합니다.
참고:이 발생 후 3-5 h, subculture에 0.6-0.8 사이 세600 를 도달 하는 곳. - 이 하위의 동일한 볼륨 50 mL에 걸쳐 원심 분리기 튜브와 박테리아를 펠 렛을 4 ° C에서 15 분 동안 2500 x g에서 subculture 스핀. 일단 일지도, 제거 하 고 다시 박테리아의 대부분의 제거를 확인 하는 위의 조건에 상쾌한 스핀.
참고: 무시할 수 크기 (높이 1 m m 보다 작은)의 펠 릿이 확인합니다. - 다시 표면에 뜨는 subculture의 5 ml에서 그들을 중단 하 고 진상을 단일 50 mL 튜브에 이러한 솔루션으로 별도 튜브의 세균성 펠 릿을 결합 한다. 박테리아를 펠 렛을 4 ° C에서 15 분 동안 2500 x g에서 집중된 문화가 스핀.
- 상쾌한을 제거 하 고 다시 5% 자당 물 솔루션에서 최종 박테리아 펠 릿을 일시 중단 합니다. 마약을 확인 하 고 원하는 감염 복용량을 조정 (OD600 100 P. entomophila8 세600 = = 25 P. 농 균16,28), 다시 5%에는 펠 릿을 일시 중단 하 여 필요한 볼륨을 자당 물 솔루션입니다.
참고: 추가 5% 자당 물 솔루션의 금액 산출 될 수 있다 단계 3.2.1에서에서 방정식을 사용 하 여 (MsVs M나Vi=).
4. 구두 파리 감염
- 을 보장 하기 위해 구강 감염 박테리아에 노출 하기 전에 2-4 h에 대 한 파리 파리 표준 한 천 병 (1 리터 트리플 증 7 mL Tegosept 곰 팡이 방지 에이전트, 84 g 갈색 설탕, 20 g 한 천, H2O)를 전송 하 여 굶 어.
- 파리는 굶 어 되는 하는 동안 감염 병을 준비 합니다. 슈 도모 나 스 감염 병의 표준 설탕 agar pipetting 500 µ L에 의해 7 mL 샘플 튜브의 뚜껑으로 만들고 건조 두고. 뚜껑에 필터 종이의 디스크를 놓고 100 µ L 세균성 문화 필터 디스크에 직접의 플라스틱. 제어 감염, 세균성 문화를 같은 볼륨 필터 종이에 5% 자당 물 솔루션을 바꿉니다.
- 샘플 튜브를 단일 파리를 추가 하 고 18-24 h에 대 한 둡니다.
- 구강 감염을 확인, 처음 세균 노출 후 즉시 파리 표면 소독, 20-30 미에 대 한 70% 에탄올의 100 µ L에 그들을 배치 하 여 제거 하는 에탄올 고 추가 100 µ L 트리플의 증류수 20-30 s 물을 제거 하기 전에. 1 x PBS의 100 µ L을 추가 하 고 비행을 균질.
- 96 잘 접시의 맨 위 행에는 homogenate를 전송 하 고 아래 모든 잘을 1 x PBS의 90 µ L를 추가 합니다.
- 직렬 CFU의 범위 값을 구별 하는 것이 샘플 희석. 최고 잘에는 homogenate의 10 µ L 고 아래 우물이 추가. 이 단계를 반복 두 번째 잘, 잘, 세 번째에 10 µ L를 전송 하 고, 필요에 따라 많은 직렬 희석에 대 한.
참고: 그것은 중요 한 새로운 피 펫 팁 희석의 각 집합에 대해 사용 됩니다. - 모든 방울 이산 유지 되도록 5 µ L 방울에 파운드 영양 한 천 배지에서 직렬 희석 접시
- P. entomophila 와 P. 녹 농 균, 하룻밤 30 ° C에서 37 ° C 파운드 한 천 배지를 각각 품 어 및 볼 수 CFUs.
참고: 지금까지 초파리 본질적인 미생물에서는 뚜렷한 혐 기성 성장 조건에 필요에 선택적 매체, 예를 들면 녹 절연 매체 (PIM), 슈 도모 나 스 CFUs만 계산 되도록 사용할 수 있습니다. - 10-60 CFUs 명확 하 게 볼 수 있습니다 직렬 희석에 식민지의 수를 계산 하 여 비행 당 CFUs의 수를 계산 합니다. 다음 비행 당 박테리아의 수를 계산 하려면 현재 희석 비율을 곱하면 됩니다.
- 통계 분석을 수행 합니다. 필요한 경우, 정규 분포를 비행 당 CFUs를 변환 합니다. 이렇게 로그 변환 합니다. 일단 변환, 일반화 선형 모델 (GLMs)30,,3132 를 사용 하 여 어떻게 치료 그룹 비행 (R33등 일반적으로 사용 가능한 통계 소프트웨어 패키지를 사용 하 여) 당 CFUs에 다른 테스트.
참고: 나머지 비행 homogenate 양이 많은 반전 녹음 방송 PCR (RT-정량) 분석을 통해 유전자 발현을 측정 하는 데 사용할 수 있습니다. RNA 분리 시 약의 50 µ L에는 homogenate를 수정, RNA, 추출 및 실시간 정량 Pcr에 의해 특정 면역 유전자 titers 계량 ( 예를 들어, 참조 자세한 프로토콜에 대 한 굽타와 베일16 ). 특정 면역 유전자 성적 표현 한다 내부 관리 유전자 (즉, rp49)의 증명서 수준에 정상화 하 고 배 2−ΔΔCt 메서드31를 사용 하 여 제어 파리 기준 변경으로 표현 32,,3334.
5. 녹음 Survivorship 감염 다음
- 4.2 단계에 설명 된 대로 구두로 감염 파리.
- 감염 전송 또는 표준 루이스 리 바이 알 및 빛-어둠 12 h:12 h에서 25 ° C에서 인큐베이터에서 유지에 그들의 각각 감염 병에서 제어 파리 주기 (혹은 조건). 그들은 죽은 때까지 파리를 유지.
- 살아있는 또는 죽은 파리 각 유리병 매일, 또는 필요에 따라 자주의 수를 계산 합니다.
- 파리에 전송 새로운 튜브 5 일 마다 음식에 갇혀 지 고 파리를 피하기 위해.
- 카 플 란-마이어 (KM) 생존 곡선으로이 데이터를 제시 하거나 ± SE 비례 생존 음모를 의미 합니다. 분석 하려면 여러 가지 요소와 그들의 각각 상호 작용의 효과 콕스 비례 위험 모델35등 생존 분석을 실행 하려면 통계 패키지 (예를 들어 패키지 R33에서 "생존")를 사용 합니다.
6. 세균 부하 측정
- 원하는 시간 시점에서 살 균 1.5 mL microcentrifuge 튜브를 하나의 감염 된 비행을 전송 합니다.
- 표면 소독 파리 4.4 단계에서 설명한 대로.
- 비행을 균질 하 고 세균성 부하 단계 4.5-4.10에에서 설명 된 프로토콜을 사용 하 여 계량.
7. 측정 세균성 흘리기
- 내부 부하와 함께 피 눈물을 측정 합니다.
- 감염 후 단일 파리 1.5 mL microcentrifuge 튜브 포함 된 50 µ L 24 h에 대 한 루이스 매체의 전송.
- 내부 부하 측정에 대 한 파리를 제거 (하십시오 6 단계 참조) 무 겁 게 3에 대 한 vortexing에 의해 1 x PBS의 100 µ L 튜브를 세척 하 고 s.
- 이 세척에 CFUs 파운드 영양 한 천 4.6-4.8 단계에서 설명한 대로 동일한 프로토콜을 사용 하 여, 도금 측정.
- 감염 후 단일 파리 1.5 mL microcentrifuge 튜브 포함 된 50 µ L 24 h에 대 한 루이스 매체의 전송.
- 파리 여를 전송 추가 24 h. 세척에 대 한 루이스 매체의 ~ 50 µ L을 포함 하는 새로운 microcentrifuge 튜브 100 µ L 1 x PBS의 오염 된 튜브 vortexing 무 겁 게 3에 대 한 s.
- 이 세척에 CFUs 파운드 영양 한 천 4.6-4.8 단계에서 설명한 동일한 프로토콜을 사용 하 여, 도금 측정.
- 모든 전송에서 단계 7.2와 7.3 및 기록 비행 사망률을 반복 합니다.
Representative Results
여기, 선물이 실험에서 설명 결과 D. melanogaster P. 농 균 또는 P. entomophila구두로 감염 되었다. 그림 2 설명 OD600 의 세균성 문화에 12h 또는 24h 노출 기간에 따라 파리의 성공적인 구강 감염 = 25, 100 P. 녹 농 균 (그림 2A)을 P. entomophila (그림 2B C), 각각. 그림 2B P. entomophila, 파리 큰 광학 밀도의 세균성 문화에 노출 되 면 세균성 부하에서 증가 의해 표시의 더 집중된 문화 사용의 중요성을 보여 줍니다. 남성과 여성의 오 레 곤 R (OreR) 파리 같은 속도 (그림 3) P. 녹 농 균 감염 하 고 피 농 균 CFUs (그림 4A)의 동일한 수를 창 고. 그러나 P. entomophila 감염, 남성과 여성의 OreR 파리 (그림 4B) 시간에 따라 변화 하는 방식으로 박테리아 헛간의 수에 차이가 있습니다. 남성과 여성 서로 다른 속도로 P. 녹 농 균 (그림 5A), P. entomophila (그림 5B)에서 죽어. 우리는 또한 Dcy 돌연변이 (이 창 자 상피의 보호 peritrophic 매트릭스 부족) 및 양념 돌연변이 (이 기능 IMD 면역 통로 부족), 다음 P. entomophila 및 P. 농 균 감소 생존 표시 참조 구강 감염 (그림 5C).
그림 1: 생존, 흘리기, 그리고 초파리 melanogaster구강 감염 다음 내부 세균 부하를 측정 하기 위한 프로토콜의 개요 개요. 3 잠재적인 실험 D. melanogaster의 구강 감염을 다음의 그림. 튜브를 단일 파리를 전송 하 고 감염 된 그들의 수명을 기록 하 여 '생존'을 측정 합니다. '피 눈물' 단일 파리 1.5 mL microcentrifuge 튜브 뚜껑에 루이스 매체의 50 µ L 전송 하 여 측정 합니다. 튜브에서 24 시간 후 비행 및 소용돌이 1 x PBS의 100 µ L로 튜브를 제거 합니다. 제거 하 고 파운드 영양 한 천 세균성 흘리기 계산 하에이 솔루션을 접시. 흘리기 동일한 비행에 경도, 24 h 후 뚜껑에 루이스 매체와 신선한 튜브에 파리를 전송 하 고 세척 하 고 지금 오염 된 튜브를 도금 하 여 측정 합니다. 파리의 '내부 부하'는 감염 된 비행, 표면 살 균, 그리고 마지막으로 파운드 영양 한 천에 homogenate를 도금 하기 전에 조직 하 여 측정할 수 있습니다. 이 계산에 측정 되었다 흘리기 후 수행할 수 있습니다 어떻게 '내부 부하'와 발산 상관. 이 그림에 사용 된 플라이 그림 원래 B. Nuhanen36에 의해 그려진 했다. 저자는 위키미디어37에서 찍은 예 카 플 란-마이어 곡선을 동반 하는 그것을 수정 했습니다. 다른 모든 삽화는 원래. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 2: 다음 구강 감염 박테리아의 감염 복용량. (A) 남성 및 여성의 오 레 곤-R의 감염 복용량 P. 농 균 문화에 노출 다음 파리 (OD600 = 25) 12 h에 대 한. 평균 및 SE 3 남성 3 여성에서 계산 했다. 4 P. entomophila 문화 중 하나에 노출 다음 outcrossed 야생 형 암컷의 (B) 감염 복용량 (OD600 = 100, 75, 50, 그리고 25) 24 시간 5% 자당 해결책을 제어 또는. 통계적 차이 (F3,76 = 18.567, p < 0.001) 노출 치료 사이 감염 복용량에 바 위에 다른 문자로 표시 됩니다. 수단 OD600 5 파리에서 계산 된 = 0 복용량, 및 모든 다른 복용량에 대 한 18-20. (C) 남성과 여성의 오 레 곤-R의 감염 복용량 P. entomophila 문화에 노출 다음 파리 (OD600 = 100) 24 h에 대 한. 평균 및 SE 20 남성 및 20 여성에서 계산 했다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 3: 내부 P. 농 균 부하 구강 감염 후 파리에서. 남성 및 여성의 오 레 곤-R의 평균 ± SE 세균성 부하 P. 농 균 구강 감염 다음 파리 (OD600 = 25) 최대 168 h 후 감염. 평균 고 각 시간 점의 SE 3 개인에서 계산 됩니다. 파리의 내부 세균 부하 시간에 따라 크게 변화 (p < 0.001). 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 4: 구강 감염에 따라 발산 하는 박테리아. (A) P. 농 균 같은 파리 하는 데 사용 그림 3에서에서 최대 120 h 후 감염에 의해 창 고. 평균 및 SE 3 남성 3 여성에서 계산 했다. 남성과 여성의 오 레 곤-R에 의해 창 고 (B) P. entomophila P. entomophila 구강 감염 다음 파리 (OD600 = 100) 감염 된 후 120 h까지. 평균 및 SE 34 남성과 38 여성에서 계산 했다. P. 녹 농 균 및 P. entomophila, 비행에 의해 CFUs 헛간의 수는 크게 시간에 따라 변화 (p < 0.001). 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 5: 구강 세균 감염 다음 파리의 생존. 카 플 란-마이어 (KM) (A) 오 레 곤-R 남성과 여성의 생존 곡선 P. 농 균 구강 감염 다음 파리 (OD600 = 25) 또는 5% 자당 해결책을 제어. KM 생존 곡선 처리 그룹 당 20 파리의 4 튜브에서 계산 했다. (B) 남성 및 여성 OreR P. entomophila 구강 감염 후 파리 (OD600 = 100). KM 생존 곡선 4 단일 제어 파리와 남성과 여성 모두에 대 한 34 감염 된 파리에서 계산 했다. (C) 면역 돌연변이: Dcy (Drosocrystallin-peritrophic 매트릭스 돌연변이) 및 Rel (양념-IMD 돌연변이), P. entomophila (Pe), P. 녹 농 균 (Pa14), 또는 제어 5% 자당 솔루션에 노출. 모든 감염 된 그룹 컨트롤 파리 보다 더 빨리 크게 다이 (p < 0.001). 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
Discussion
우리는 안정적으로 구두로 D. melanogaster 세균성 병원 균 감염에 대 한 프로토콜을 제시. 우리 피 녹 농 균 및 P. entomophila에 초점을 맞추고 있지만이 프로토콜 쉽게 다른 세균 종, 예를 들어, Serratia marcescens7. 의 감염 수 있도록 적용할 수 이 프로토콜의 주요 측면은 세균성 종 사이 달라 집니다. 따라서, 가장 효율적인 감염 복용량, 해당 독성 및 호스트 유전자 감수 해야 모두 간주 되며 이상적으로 파일럿 연구에서 테스트. 다양 한 광학 밀도의 세균성 문화에 파리를 제공 하 고 그들의 감염 복용량 및 생존 측정 새로운 세균성 종 또는 비행 라인 작업할 때 적절 한 시작 지점입니다.
프로토콜 단계와 같은 비행 수 유 전에 기아 고 5% 자당 해결책에 다시 중단 세균성 펠 릿 평범 구강 감염에 노출7,8, 중 세균 감염의 안정성 향상 9 , 그러나 10., 그것은 노출, 동안 파리 본질적으로 살고 있는 세균성 문화의 표면에 주의 하는 것이 중요. 이 문화에 산책 하는 과정에서 박테리아 파리의 표면, 특히 표 피 또는 bristles24주위에 박 혀 될 것 이다. 이 epicuticular 박테리아, 성공적인 장 감염을 반영 하지 않습니다 하지만 여전히 비행 균질 및 도금에 의해 검출 될 것. 잘못 된 반응에 대 한 가능성을 줄이기 위해, 그것은 표면에 필수 최대 1 분 동안 70% 에탄올에 침수를 통해 파리를 소독.
세균의 발산 속도 고려할 때 구강 감염 필수적 이다. 호스트 환경에 출시 하는 병원 균의 수는 종종 측정 하기 어려운 고 내부 부하 따라서 전송26,27감염의 심각도 대 한 프록시로 종종 이루어집니다. 세균성 피 눈물 함께 측정 세균성 부하 질병의 심각도 및 확산38의 이러한 두 가지 중요 한 구성 요소 사이의 관계의 시험을 수 있습니다. 제시 하는 방법의 한 가지 한계는 파괴적인 샘플링을 필요 시 금 파리의 내부 세균 부하 이다. 이것은 병원 체 성장과 동일한 개인 내의 클리어런스의 경도 동향 조사를 어려운 있습니다. 그러나, 각 코 호트에서 평균 미생물 부하 주어진 내에서 경도 병원 체 역학을 반영 한다는 가정 아래 감염의 다른 단계에서 개인의 파괴적 샘플링 동료에 의해이 제한을 극복 하기 위해 가능 하다 개별. 세균성 피 눈물 같은 한계에서 고통을 하지 않습니다 그리고 우리가 어떻게 발산 수 정해질 횡단면 샘플에서 또는 경도 조사 어떻게 개인 내에서 시간이 지남에 따라 발산 하의 예를 제공 합니다.
많은 호스트와 병원 체 특성은 공동으로 질병25,,2639를 전송 하는 개인의 성향을 결정 합니다. 가능성이 이러한 특성의 의미 호스트 병원 체 시스템 사이 변화 한다, 하는 동안 흘리는 찌 끼 구두 전송의 주요 결정 가능성이 높습니다. 세균성 흘리기를 측정 하는 능력이이 가설을 테스트 하는 기회를 엽니다. 플라이 라인의 원하는 패널에서 호스트 병원 체 역학, 성격 경험 수 구두 감염 개인, 그리고 그들의 전염 성 기간 동안 감염, 감염 호스트와 함께 그들을 배치. 이러한 '받는 사람' 파리 직접 전송 측정의 방법으로 다양 한 시간 점에서 내부 세균 부하에 대 한 분석 다음 수 있습니다.
Acknowledgments
이 작품 면역, 감염 및 진화 (http://ciie.bio.ed.ac.uk; 그랜트 참조 번호 095831)에 대 한 센터를 위한 Wellcome 트러스트에서 전략적 수상에 의해 지원 되었다. PFV는 브 랑 코와 이즈 친교 (https://brancoweissfellowship.org/)와 장관의 친목 (생물 과학의 학교에 딘 버 러의 대학);에 의해 지원 되었다 JASJ는 NERC E3 DTP 박사 재학에 의해 지원 되었다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Vials | Sarstedt Ltd. | 58.490 | Polystyrene flat base tube 75mm x 23.5mm, 23ml |
| Agar | Sigma-Aldrich | A7002 | Agar, ash 2.0-4.5% |
| Brown sugar | Bidvest | 66032 | Light brown soft sugar |
| Maize | Dove's Farm | Organic maize flour | |
| Fermipan yeast | Bidvest | 96360 | Dry, instant yeast |
| Methyl-4-hydroxybenzoate | Sigma-Aldrich | H5501 | >=99.0%, crystalline |
| Sucrose | Sigma-Aldrich | 84097 | Sucrose BioUltra, for molecular biology, >=99.5% (HPLC) |
| Petri dishes | Fisher Scientific UK Ltd. | 15788517 | X600 Petri Dish 90 X 16.2MM Sterile Triple Vent |
| Falcon tubes (50ml) | Greiner Bio-one Inc | 210261 | Centrifuge tube, 50ml, skirted, bagged, sterile |
| Eppendorf tube (0.5ml) | Sarstedt Ltd. | 72.699 | Sarstedt Micro Tube Conical Base Push Cap 0.5ml Standard Neutral |
| Eppendorf tube (1.5ml) | Sarstedt Ltd. | 72.690.001 | Sarstedt Micro Tube Conical Base Push Cap 1.5ml Standard Neutral |
| Ethanol | VWR International Ltd. | 20821.33 | ETHANOL ABSOLUTE ANALAR NP ACS/R.PE - Analytical Grade |
| 2 L Conical Flask | VWR International Ltd. | 214-0038 | Narrow neck, 2 L Erlenmeyer flask |
| Sterile filter paper | Fisher Scientific UK Ltd. | 1001-020 | Plain circle and sheets; Particle Retention: greater than11um; Filtration speed: 150 herzberg; Air flow: 10.5s/100mL/in2; Medium porosity; Smooth surface; Grade 1; Type: circle; Dia: 20mm |
| Bijou sample container | Fisher Scientific UK Ltd. | 129A | 7ml polystyrene sample container |
| Pseudomonas isolation agar | Sigma-Aldrich | 17208 | Contains agar 13.6 g/L, magnesium chloride 1.4 g/L, peptic digest of animal tissue 20g/L, potassium sulfate 10g/L, triclosan 0.025g/L |
| LB broth, Miller | Fisher Scientific UK Ltd. | BP1426 | Contains 10g tryptone, 5g yeast extract, 10g sodium chloride per litre |
| Large Embryo Collection Cages | Scientific Laboratory Supplies Ltd. | 59-101 | Flystuff- fits 100mm petri dish |
| TRI reagent solution | Life Technologies | AM9738 | |
| 96-well microplate | Scientific Laboratory Supplies Ltd. | 353072 | Falcon 96 Well Clear Flat Bottom TC-Treated Polystyrene Cell Culture Microplate with Lid Sterile |
| Pestle | Fisher Scientific UK Ltd | 12649595 | Pestle, Presterilized; Axygen; Tissue grinder; Blue; Inert polypropylene construction; Fits 1.5 and 2.0mL centrifuge tubes; Individually wrapped; 100/Pk |
| Glycerol | Scientific Laboratory Supplies Ltd. | CHE2068 | Glycerol A.R. 99.5% 2.5 L |
| Cotton wool- non absorbent | Cowens Ltd | ABL | Non Absorbent Large quantity 20 bags x 500 |
| Cotton wool- absorbent | Cowens Ltd | ABS | BP small quantity 20 bags x 500 |
| Vortex | Fisherbrand | Whirlimixer 75W 50-6-Hz 220-240V | |
| Orbital incubator | Gallenkamp | INR-200-010V | 220 V, 50 Hz, 5 A. Nominal temperature: 70ºC. Shaking frequency: 0...400 rpm. |
| Absorbance Microplate Reader | Biotek Instruments Ltd | ELx808™ Absorbance Microplate Reader | |
| Gen 5 Microplate Reader and Imager Software | Biotek Instruments Ltd | For Absorbance Microplate Reader | |
| Centrifuge | Beckman Coulter | 392304 | Allegra X-12R Benchtop Centrifuge, refridgerated 50Hz 230V |
| Step One Plus Real Time qPCR System | Thermofisher Scientific | 4376600 | Applied biosystems Step One Plus real time qPCR system |
| Step One Software 2.3 | Thermofisher Scientific | For Stepone and SteponePlus real time qPCR systems | |
| R Statistical Software | https://cran.r-project.org/ | ||
| 10 µL pipette tips | Greiner Bio-one Inc | 741015 | Easlyload gilson-style. Graduated, clear, refill, 960 pcs |
| 200 µL pipette tips | Greiner Bio-one Inc | 741065 | Easlyload gilson-style. Graduated, clear, refill, 960 pcs |
| 1000 µL pipette tips | Greiner Bio-one Inc | 741045 | Easlyload gilson-style. Graduated, clear, refill, 960 pcs |
| 20 µL filtered pipette tips | Greiner Bio-one Inc | 774288 | Filter tip gilson-style. Clear, rack blue, single packed, R/Dnase free, 10 racks of 96pcs |
| 200 µL filtered pipette tips | Greiner Bio-one Inc | 739288 | Filter tip gilson-style. Clear, rack blue, single packed, R/Dnase free, 10 racks of 96pcs |
| 1000 µL filtered pipette tips | Greiner Bio-one Inc | 740288 | Filter tip gilson-style. Clear, rack blue, single packed, R/Dnase free, 10 racks of 60pcs |
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