Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove

Biology

זיהום חיידקי הפה ו Shedding ב דרוזופילה melanogaster

doi: 10.3791/57676 Published: May 31, 2018

Summary

פרוטוקול זה מתאר שיטות כדי לחשוף ולהדביק את זבוב הפירות הים דרוזופילה melanogaster עם פתוגנים חיידקיים אורלית, וכדי למדוד את מספר חיידקים זיהומיות המחסן בעקבות זיהום במעיים. בהמשך נתאר את ההשפעה של החיסון מוטציות על הישרדות לעוף בעקבות זיהום חיידקי הפה.

Abstract

אחת המערכות המפותחות דגם הטוב ביותר של זיהום, מולדת חסינות זבוב הפירות melanogaster דרוזופילה . בעוד רוב העבודה התמקדה זיהומים מערכתית, חלה עלייה לאחרונה עניין בהמנגנון של immunocompetence בטן פתוגנים, אשר דורשים שיטות להדביק אורלית זבובים. כאן אנו מציגים פרוטוקול לחשוף אורלית זבובים בודדים של פתוגן חיידקי הזדמנותית (Pseudomonas aeruginosa), פתוגן חיידקי הטבעי של ד melanogaster (Pseudomonas entomophila). המטרה של פרוטוקול זה היא כדי לספק שיטה חזקה לחשוף זבובים זכרים ונקבות למחלות אלה. אנו מספקים תוצאות נציג מציג פנוטיפים הישרדות, חיידק המון ובקטריאלי ששפך, אשר רלוונטי לצורך המחקר של הטרוגניות הפתוגן בשידור. לבסוף, אנו מאשרים מוטציות Dcy (שחסר המטריקס peritrophic מגן בתוך האפיתל הבטן), התענגת על מוטציות (שחסר שביל פונקציונלי חיסוני (IMD)), להראות רגישות מוגברת לזיהומים אוראלי חיידקי. פרוטוקול זה, לכן, מתאר שיטה חזקה כדי להדביק זבובים באמצעות תוואי אוראלי של זיהום, אשר ניתן להרחיב את המחקר של מקורות גנטיים וסביבתיים מגוון של וריאציה של תוצאות זיהום מעיים ושידור חיידקי.

Introduction

זבוב הפירות (המכונה גם חומץ הזבוב), melanogaster ד, כבר בשימוש נרחב עבור זיהום, חסינות מפני מגוון רחב של פתוגנים1,2כאורגניזם מודל. עבודה זו הציעה תובנות יסוד ההשלכות הפיזיולוגיות של זיהום וחלוציות היה גם ב להתיר מסלולים מולקולריים שבבסיס התגובה החיסונית מארח נגד זיהומים חיידקים, פטריות, נגיפי צירעת האפידיוס. הידע הזה הוא לא רק שימושי להבין את התגובה החיסונית מולדת של חרקים, פרוקי רגליים אחרים, אבל מכיוון רבים של מנגנוני החיסון אבולוציונית נשמרים בין חרקים, יונקים, דרוזופילה יש גם התיישר גילוי מנגנוני החיסון הגדולות אצל יונקים, כולל בני אדם3.

רוב העבודה על זיהום דרוזופילה וחסינות התמקדה זיהומים מערכתית, תוך שימוש בשיטות חיסון לספק פתוגנים ישירות לתוך גופו של החרק על-ידי לדקור או הזרקה4,5,6. היתרון בשיטות אלה לאפשר המסירה של מנה זיהומיות מבוקר הוא נתמך על ידי גוף גדול של עבודה על זיהומים מערכתית וברורה. עם זאת, רבים פתוגנים חיידקיים טבעי של melanogaster ד נרכשים באמצעות האכלה על מפרקים את החומר האורגני שבו הבטן immunocompetence ממלאת תפקיד משמעותי מארח ההגנה7,8, 9 , 10 , 11 , 12 , 13 , 14 , 15. ניסויים שמעסיקים זיהומים מערכתית לעקוף את ההגנות האלה, לכן, מספקים תמונה שונה לגמרי של מה חרקים לטעון כנגד פתוגנים טבעי. זה רלוונטי במיוחד אם מטרת העבודה היא לבחון את תחזיות לגבי האקולוגיה והאבולוציה של זיהום, השימוש של פתוגנים טבעי ומסלולי לזיהום איפה חשוב16,17. העבודה האחרונה הדגישה איך המסלול נלקחה על ידי פתוגנים באופן משמעותי משפיע על המחלה התוצאה18,19, מעורר המסלולים החיסונית ברורים20,21, ניתן לקבוע את ההשפעה המגנה של בירושה endosymbionts16, עשוי גם לשחק תפקיד חשוב באבולוציה של המארח ההגנה17.

עוד סיבה להעסיק. את נתיבי דרך הפה של זיהום הוא שזה מאפשר החקירה של וריאציה הפתוגן בשידור על ידי מדידת ששפך חיידקי במהלך הפרשה בצואה בעקבות זיהום אוראלי22,23, 24. הבנת המקורות של המארח הטרוגניות תוך העברת המחלה מאתגר אוכלוסיות טבעי25,26, אך מדידת רכיבים של שידור, כגון הפתוגן ששפך, תחת מעבדתית מבוקרת תנאים מציע גישה חלופית שימושי27. על ידי חיידקים זבובים האכלה, מדידה בקטריאלי ששפך תחת מגוון רחב של הקשרי גנטיים וסביבתיים בתנאים מבוקרים ניסיוני, זה ניתן לזהות מקורות של וריאציה של העברה בין מחשבים מארחים.

כאן, אנו מתארים את פרוטוקול אורלית שמאחורי הדבקת melanogaster ד עם פתוגנים חיידקיים, עבור לכימות את התפתחות חיידקים ושפך שעוקבת אחר (איור 1). אנו מתארים את פרוטוקול זה על שני החיידקים Pseudomonas : זן מדבק של המחלה הזדמנותית aeruginosa פ (PA14), זן פחות ארסית של הטבעי לטוס הפתוגן entomophila פ. Pseudomonads חיידקים גראם שליליים משותף עם מגוון המארחת רחב, להדביק חרקים, נמטודות, הצומח, בעלי חוליות, מצויים במרבית סביבות4,6. זיהום המעית של דרוזופילה aeruginosa פ ו entomophila פ תוצאות בפתולוגיה מעיים epithelia12,13,14,15, 28. בעוד אנו מתמקדים פתוגנים חיידקיים שני אלה, בשיטות המתוארות כאן באופן עקרוני ניתן להחיל על כל פתוגן חיידקי עניין עם שינויים מזעריים. בעקבות החשיפה אוראלי, אנו למדוד הישרדות לאחר הפגיעה, ולמדוד את העומס חיידק בתוך זבובים בודדים ושפך החיידקים קיימא לסביבה, הביע במושבה ויוצרים יחידות (CFUs). בסופו של דבר, כי הבטן immunocompetence היא תוצאה של שילוב של מחסום האפיתל ותגובות ההורמונאלית, אנו מודדים גם את ההישרדות של קווים לטוס לאן את ההגנות האלה הם שיבשו. באופן ספציפי, Drosocrystallin (Dcy) מוטציות בעבר הוכחו להיות רגישים יותר לזיהום חיידקי הפה עקב מטריצה peritrophic מדולדל הבטן29. אנחנו גם למדוד הישרדות מוטציה תבלינים (Rel) אשר מופרעת מיצירת פפטידים מיקרוביאלית כנגד חיידקים גראם שליליים באמצעות מסלול30IMD.

Protocol

1. לשמור על זבובים

  1. לשמור על זבובים 23 mL צלוחיות פלסטיק המכיל 7 מ של טרי בינוני לואיס (שונה מהפניה31; 1 ליטר triple מזוקקים H2O 6.1 g אגר, 93.6 גר' סוכר חום, תירס 68 g, 18.7 g מיידית שמרים, סוכן אנטי-פטרייתי Tegosept 15 mL) בחממות ב 25 ± 1 ° C, ב- h:12 12 מחזור אור h: כהה עם ~ 60% לחות. חבר את הבקבוקונים עם צמר גפן-בעל כושר ספיגה.
  2. אחרי כל 14 יום העברה 20 – 30 מבוגרים בקבוקון מזון חדש, עם שמרים מיידית, יבש הוסיף אל פני השטח, למשך 2-3 ימים כדי לאפשר להטלת ביצים להתרחש. לאחר פרק זמן זה, ודא כי הביצים הן על פני השטח של המזון. הסר את הזבוב הבוגר.
    הערה: פעולה זו שומרת זבובים על הבקבוקונים כמו דור אחד, אוכלוסיות גיל מתאימים.
  3. להשאיר את הביצים כדי לפתח.
    הערה: 25 ° c, הזבוב הבוגר להתחיל eclose מן הגלמים ביום 11 ולהמשיך בימים 12-14.

2. מכינים זבובים ניסיוני

  1. לאסוף את הביצים של הדור האב בכלוב אוסף אוכלוסייה/העובר על צלחת תפוח-אגר 75 מ ל (1 ליטר טריפל H מזוקקים2O, 30 גרם אגר, 33 גרם סוכרוז, 330 מ ל מיץ תפוחים, סוכן אנטי-פטרייתי Tegosept 7 mL) עם שמרים הדבקה כפולה (לערבב שמרים יבשים עם מים כדי עקביות כמו חמאת בוטנים.) להוסיף צמר גפן ספוג במים הכלוב כדי לספק לחות.
    הערה: כדי למנוע בלבול אפקטים הנגרמת על ידי הבדלים בצפיפות לגידול זחל, חשוב כי זבובים ניסיוני בקבוקונים שונים גדלים בצפיפויות דומה. הצעד הנ ל מבוצע כדי למנוע בלבול אפקטים.
  2. תקופת דגירה של 24 שעות 25 ° c ב- h 12 h:12 מחזור אור: כהה עד להטלת ביצים אירעה. אם יש גם כמה ביצים לאחר 24 שעות, מספקים habituation מרשו. להחליף צלחות אפל-אגר ולאפשר להטלת ביצים להתרחש עבור ה 24 שעות נוספות.
  3. סעו עמוסי ביצים אפל-אגר לוחות הכלוב האוכלוסייה. להסיר את העיסה שמרים הנותרים זבובים מתים ממשטח של אגר.
  4. להטביע את אגר ב- 20 מ של 1 x באגירה פוספט תמיסת מלח (PBS) ועוקרות בעדינות את הביצים של אפל-אגר עם מברשת משובחים. בעוד הושעה ב- PBS, להעביר את הביצים שפופרת צנטרפוגה 50 מ ל, להשאיר למשך 5 דקות אז שקעו הביצים.
    הערה: רוב הביצים נמצאים בקצה החיצוני אגר.
  5. להסיר על ידי חיתוך התחתון 4 מ מ של קצה פיפטה מסוננים p1000, שימוש בקצה פיפטה לצייר 1 מ"ל של פתרון, שנלקחו לתחתית הצינור צנטריפוגה 50 מ. להעביר זה צינור microcentrifuge 1.5 mL ולאפשר להתיישב.
    הערה: כאשר pipetting את ביצי, snap-שחרור הבוכנה הוא יעיל יותר שחרור עדין.
  6. להסיר על ידי חיתוך התחתון 4 מ מ של קצה פיפטה מסוננים p20. להגדיר את פיפטה לאמצעי הרצוי וצייר מהחלק התחתון של הצינור microcentrifuge.
    הערה: עם התרגול, נפח של 5 µL מכיל בערך 100 ביצים.
  7. לוותר על הביצים שנאספו על גבי המזון ולהשאיר אותם לפתח הכמות הנדרשת של הזמן.

3. התרבות חיידקי

  1. לגדול entomophila פ פ aeruginosa תרבויות, לחסן 10 מ ל מרק לוריא-Bertani (ליברות) עם 100 µL מניה חיידקי קפוא ב 30 ° C (entomophila פ) ו- ° 37 C (aeruginosa פ), בהתאמה. לנער בן לילה-150 סל ד. לוודא התרבות חיידקי יגיע השלב רוויה.
  2. כדי להבטיח החיידקים המשמשים מזריקים את הזבובים בשלב מעריכית, שכפול במהירות, לחסן את התרבות לילה. לתוך גלובלי חדש, של אמצעי אחסון הרצוי, למחרת בבוקר. ודא inoculum מראש 10% מהנפח הכולל של התרבות תת-תרבות.
    הערה: זיהום אוראלי מחייבת גבוהה. לכן הדרוש כדי לגדל נפח משמעותי של התרבות חיידקי כך מספיק תרבות חיסון יכול להיות מיוצר לפרטים המינון הרצוי ואת גודל ניסיוני. לחשב כמה תת-תרבות יש צורך לייצר במינונים זיהומיות נדרש שימוש את משוואת MsVs = MאניVאני, כאשר M מייצגת תרבות של צפיפות אופטית נמדד ב 600 nm (OD600) ערך ו- V מייצג שלה נפח. אותיות כתב תחתי להתייחס אם התרבות משמש גלובלי (s) או מנה זיהומיות (i).
  3. לגדול זו תת-תרבות בבקבוקון חרוט 2 ל' באמצעי אחסון כזה כי פני השטח של תת-תרבות נופל (לכל היותר) מעל תחילתו של המדרון של הבקבוק. המתבקשים לעיל הסימן כפי פעלולים זה יהיה את התפתחותם של חיידקים.
  4. ודא החיידקים בתוך תת-תרבות זו בשלב הגידול האקספוננציאלי על ידי מדידת OD כל 30 דקות.
    הערה: מצב זה מתרחש לאחר 3-5 h, איפה תת-תרבות מגיע עם יתר600 בין 0.6-0.8.
  5. יוצקים נפחים שווים של תת-תרבות זו על פני 50 מ ל צינורות צנטריפוגה ולסובב את תת-תרבות ב g x 2,500 למשך 15 דקות ב 4 ° C כדי הצניפה החיידקים. ברגע מגורען, הסר ולאחר מכן לסובב את תגובת שיקוע שוב בכל התנאים שלעיל כדי לאשר את ההסרה של הרוב המכריע של חיידקים.
    הערה: גלולה בגודל זניח (קטן מ- 1 מ מ גובה) מאשרת זאת.
  6. לשלב את כדורי חיידקי הצינורות נפרד על ידי השעיית אותם מחדש ב 5 מ של תת-תרבות supernatant שילוב מחדש פתרונות אלו צינור בודד 50 מ. ספין תרבות זו מרוכזים ב g x 2,500 למשך 15 דקות ב 4 ° C כדי הצניפה החיידקים.
  7. להסיר את תגובת שיקוע, מחדש להשעות בגדר חיידקים סופי בפתרון מים של 5% סוכרוז. בדוק OD ולהתאים את המינון הרצוי זיהומיות (OD600 = 100 עבור entomophila פ8 ו- OD600 = 25 עבור aeruginosa פ16,28), על ידי השעיית מחדש את כדורי ב- 5% סוכרוז מים לפתרון האחסון הנדרש.
    הערה: הסכום של 5% סוכרוז מים פתרון שיתווספו ניתן לחשב בעזרת המשוואה בשלב 3.2.1 (MsVs = MאניVאני).

4. אורלית מדביק זבובים

  1. כדי להבטיח זיהום אוראלי, ברעב הזבובים עבור 2-4 שעות לפני חשיפה חיידקים על ידי העברת הזבובים בקבוקונים אגר רגיל (1 ליטר triple מזוקקים H2O 20 גרם אגר, סוכר חום 84 g, סוכן אנטי-פטרייתי Tegosept 7 mL).
  2. מכינים צלוחיות זיהום בזמן זבובים הם הרעבה. להפוך בקבוקון Pseudomonas זיהום על-ידי pipetting µL 500 של סוכר רגיל אגר למכסה של שפופרת מדגם 7 mL ולהשאיר לו להתייבש. הכנס דיסק נייר סינון המכסה, פיפטה 100 µL של התרבות חיידקי ישירות על גבי הדיסק מסנן. עבור בקרת זיהומים, החלף את התרבות חיידקי באותו אמצעי אחסון של 5% סוכרוז פתרון מים על נייר הסינון.
  3. להוסיף זבובים בודדת ברכבת התחתית מדגם ולהשאיר עבור 18 – 24 שעות.
  4. כדי לאשר זיהום אוראלי, תחילה לעקר השטח של הזבובים מיד לאחר החשיפה חיידקי, על-ידי הצבתם 100 µL של 70% אתנול במשך 20-30 ס להסיר האתנול ולהוסיף 100 מים עבור 20 – 30 s מזוקקים µL של שלוש פעמים לפני הסרת את המים. להוסיף 100 µL ל- PBS 1 x, homogenize הזבוב.
  5. להעביר את homogenate בשורה העליונה של צלחת 96-ובכן ולהוסיף µL 90 ל- 1 x PBS כל טוב מתחת.
  6. באופן סדרתי לדלל את הדוגמית הזו. כדי להבחין בין ערכים של טווח של CFU. לקחת 10 µL של homogenate הבאר העליון ולהוסיף זה הבאר להלן. חזור על שלב זה בשנייה, העברת 10 µL השלישי, וכן הלאה, עבור רבים דילולים טורי כנדרש.
    הערה: זה חשוב כי עצות פיפטה חדשות משמשים עבור כל ערכה של דילולים.
  7. לוחית רישוי של דילולים טורית על צלחת אגר מזין ק ג ב- 5 טיפות µL, כדי להבטיח שכל טיפות יישארו דיסקרטית.
  8. דגירה הלוחות LB אגר בן לילה-30 ° C ו 37 ° C entomophila פ ו פ aeruginosa, בהתאמה, נחשב CFUs גלוי.
    הערה: בעוד החיידקים במעיים דרוזופילה דורשים תנאי הגידול אנאירובי מובהק, בינוני סלקטיבית, לדוגמה Pseudomonas בידוד בינוני (PIM), עשוי לשמש כדי לוודא שרק Pseudomonas CFUs נספרים.
  9. לחשב את מספר CFUs לכל זבוב על-ידי ספירת מספר מושבות נוכח דילול טורי לאן 10 – 60 CFUs הם נראים בבירור. אז תכפיל ב הגורם דילול הנוכחי כדי לחשב את מספר החיידקים לכל זבוב.
  10. לבצע ניתוח סטטיסטי. במקרה הצורך, המר את CFUs לכל טס בהתפלגות רגילה. לעשות זאת באמצעות יומן-טרנספורמציה. ברגע טרנספורמציה, השתמש מוכללת מודלים ליניאריים (GLMs)30,31,32 כדי לבדוק כמה קבוצות הטיפול נבדלים CFUs לכל זבוב (באמצעות חבילות תוכנה סטטיסטית זמין נפוץ כמו R33).
    הערה: homogenate לעוף הנותרים יכול לשמש למדידת ביטוי גנים דרך ניתוח כמותי שעתוק במהופך PCR (RT-qPCR). לתקן את homogenate 50 µL של RNA בידוד ריאגנט לחלץ RNA, לכמת titers גנים ספציפיים המערכת החיסונית על ידי RT-qPCR (ראה למשלגופטה ועוד Vale16 עבור פרוטוקול מפורט). הביטוי של גנים ספציפיים המערכת החיסונית הפרוטוקולים צריכה להיות מנורמל את רמות תעתיק של גנים משק בית (קרי, rp49) והביע כמו קיפול לשנות יחסי שליטה זבובים באמצעות שיטה 2−ΔΔCt 31, 32,33,34.

5. הקלטה שאירים בעקבות זיהום

  1. להדביק זבובים אורלית כפי שמתואר בשלב 4.2.
  2. להעביר את הנגועים או שליטה זבובים המבחנות זיהום בהתאמה לתוך תקן לואיס שבקבוקי ולשמור באינקובטור 25 ° c ב- h 12 h:12 בהירה-כהה מחזור (או הרצוי תנאים). שמור זבובים עד שהם ימותו.
  3. לספור את מספר זבובים חיים או מתים כל מבחנה מדי יום, או לעיתים קרובות כנדרש.
  4. להעביר את הזבובים בקבוקונים חדשים כל 5 ימים כדי למנוע את הזבובים להיתקע על האוכל.
  5. להציג נתונים אלה כמו עקומות הישרדות קפלן-מאייר (ק מ) או מתכוון ± SE ההישרדות ביחס לחלקות. כדי לנתח השפעת הגומלין המתאימים שלהם אחד עם השני עם מספר גורמים ו/או להשתמש חבילה סטטיסטי (לדוגמה, חבילת "הישרדות" ב R33) כדי להפעיל ניתוח הישרדות כגון דגם מפגעים פרופורציונלי קוקס35.

6. מדידת עומס חיידקי

  1. בנקודת הזמן הרצויים, להעביר זבוב נגוע אחד צינור microcentrifuge mL 1.5 סטרילי.
  2. משטח לעקר את הזבובים כפי שמתואר בשלב 4.4.
  3. Homogenize הזבוב ולכמת את העומס חיידקי באמצעות פרוטוקול המתואר צעדים 4.5 – 4.10.

7. למדוד ששפך חיידקי

  1. למדוד את שפיכת לצד עומס פנימי.
  2. לאחר ההדבקה, העברת הזבובים יחיד 1.5 mL microcentrifuge צינורות המכיל ~ 50 µL של לואיס בינונית במשך 24 שעות ביממה.
  3. הסר את הזבובים עבור המידה עומס פנימי (ראה שלב 6) ולשטוף את הצינורות עם µL 100 ל- PBS 1 x מאת vortexing בכבדות עבור 3 s.
  4. למדוד את CFUs בכביסה הזה על ידי ציפוי על אגר מזין LB שימוש באותו הפרוטוקול כמתואר בצעדים 4.6-4.8.
  5. לאחר ההדבקה, העברת הזבובים יחיד 1.5 mL microcentrifuge צינורות המכיל ~ 50 µL של לואיס בינונית במשך 24 שעות ביממה.
  6. להעביר הזבובים צינורות microcentrifuge חדש המכיל ~ 50 µL של לואיס בינונית עבור ה 24 נוספת לשטוף הצינורות מזוהמים עם µL 100 ל- PBS 1 x מאת vortexing בכבדות עבור 3 s.
  7. למדוד את CFUs בכביסה הזה על ידי ציפוי על אגר מזין LB באמצעות פרוטוקול אותו תיאר בשלבים 4.6-4.8.
  8. חזור על השלבים 7.2 ו- 7.3 ו שיא התמותה לעוף על כל העברה.

Representative Results

כאן, אנו מציגים המחשה תוצאות של ניסויים שבהם melanogaster ד בעל פה היה נגוע בווירוס aeruginosa פ או פ entomophila. איור 2 מדגים את הזיהום אוראלי מוצלחת של הזבובים בעקבות תקופת החשיפה של 12 שעות או 24 שעות לתרבויות חיידקי של יתר600 = 25 ו-100 עבור פ aeruginosa (איור 2 א) ו- entomophila פ (איור 2B ג), בהתאמה. איור 2B ממחיש את החשיבות של שימוש תרבות מרוכז יותר של entomophila פ, שמוצג על ידי הגידול חיידקי עומס כאשר זבובים חשופים לתרבויות חיידקי של צפיפות אופטית גדולה יותר. זכריים ונקביים זבובים אורגון R (OreR) לנקות את הזיהום aeruginosa פ באותו קצב (איור 3) ושפך מספר זהה של aeruginosa פ CFUs (איור 4A). כאשר נגוע entomophila פ אולם, זבובים OreR זכר ונקבה שונים במספר של המחסן חיידקים באופן משתנה לאורך זמן (איור 4B). זכרים ונקבות למות מ פ aeruginosa (איור 5A) ו entomophila פ (איור 5B) בקצב שונה. אנו רואים כי מוטציות Dcy (שחסרה המטריקס peritrophic מגן בתוך האפיתל הבטן), ומוטנטים תבלינים (שחסרה שביל תפקודית של מערכת החיסון IMD), מראים ירידה הישרדות בעקבות aeruginosa פ entomophila פ ו אוראלי זיהום (איור 5C).

Figure 1
איור 1: סקירה סכמטי של פרוטוקולים למדידת הישרדות ששפך, טען חיידקי פנימי בעקבות זיהום אוראלי melanogaster דרוזופילה. איור 3 הניסויים פוטנציאליים בעקבות זיהום אוראלי של melanogaster ד. למדוד את 'הישרדות' על-ידי העברת הזבובים יחיד בקבוקונים והקלטה על תוחלת החיים הנגוע שלהם. למדוד "שפיכת" על-ידי העברת הזבובים יחיד 1.5 mL צינורות microcentrifuge עם 50 µL של לואיס במדיום הכיפה. לאחר 24 שעות בצינור, להסיר את הזבוב מערבולת ברכבת התחתית עם µL 100 ל- 1 x PBS. הסר, צלחת פתרון זה על אגר מזין LB כדי לחשב את שפיכת חיידקי. למדוד את שפיכת בתוך הזבוב באותו longitudinally, על ידי העברת הזבובים צינורות טריים עם לואיס במדיום הכיפה לאחר 24 שעות ביממה, ואת שטיפת יופיצ הצינור עכשיו מזוהמים. ניתן למדוד 'עומס של זבוב פנימי' על-ידי לקיחת נגוע לטוס, משטח לחיטוי אותו, homogenizing אותו לפני סוף סוף ציפוי של homogenate על אגר מזין ליברות. זה יכול להתבצע לאחר ששפך לו היה נמדד כדי לחשב כמה 'עומס פנימי' ואת שפיכת לתאם. האיור לטוס בשימוש איור זה צוירה במקור על ידי B. Nuhanen36. המחברים ששינית אותו כדי ללוות את עקומת דוגמה קפלן-מאייר אשר נלקח מתוך ויקישיתוף37. כל האיורים אחרים הם המקוריים. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Figure 2
איור 2: זיהומיות במינון של חיידקים בעקבות זיהום אוראלי. (א) מנה זיהומיות של זכר ונקבה אורגון-R זבובים בעקבות חשיפה לתרבות aeruginosa פ (OD600 = 25) במשך 12 שעות. Mean ו SE חושבו 3 זכרים, 3 נקבות. (B) מנה זיהומיות של נקבות פראי-סוג outcrossed בעקבות חשיפה של ארבע תרבויות entomophila פ (OD600 = 100, 75, 50, ו-25) או לשלוט 5% סוכרוז פתרון עבור 24 שעות. הבדל סטטיסטי של (F3,76 = 18.567, p < 0.001) במינון זיהומיות בין הטיפולים חשיפה זה מסומן על ידי אותיות שונות מעל ברים. האמצעים היו המחושב מהזבובים 5 עבור ה OD600 = 0 במינון, ו- 18-20 עבור כל מנות אחרות. (ג) המינון זיהומיות של זכר ונקבה אורגון-R זבובים בעקבות חשיפה לתרבות entomophila פ (OD600 = 100) במשך 24 שעות ביממה. Mean ו SE חושבו מתוך 20 זכרים ונקבות 20. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Figure 3
איור 3: עומס פנימי aeruginosa פ בזבובים לאחר ההדבקה דרך הפה. זאת אומרת ± SE מטען חיידקי של זכר ונקבה אורגון-R זבובים בעקבות זיהום אוראלי עם פ aeruginosa (OD600 = 25) עד 168 שעות לאחר הפגיעה. Mean ו SE של כל נקודת זמן מחושבים מאנשים 3. עומס חיידקי פנימי של זבוב משתנה באופן משמעותי לאורך זמן (p < 0.001). אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Figure 4
איור 4: בקטריאלי ששפך בעקבות זיהום אוראלי. (א) פ aeruginosa לשפוך על ידי הזבובים באותו שימוש באיור 3, עד כדי 120 h לאחר הפגיעה. Mean ו SE חושבו 3 זכרים, 3 נקבות. (B) entomophila פ לשפוך על ידי זכר ונקבה אורגון-R זבובים בעקבות זיהום אוראלי עם entomophila פ (OD600 = 100) עד 120 שעות לאחר הפגיעה. Mean ו SE חושבו מתוך 34 זכרים ונקבות 38. Aeruginosa פ וגם entomophila פ, מספר CFUs הצריף על ידי זבוב משתנה באופן משמעותי לאורך זמן (p < 0.001). אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Figure 5
איור 5: הישרדות של הזבובים בעקבות זיהום חיידקי הפה. קפלן-מאייר (ק מ) עקומות הישרדות של אורגון-R (א) זכר ונקבה זבובים בעקבות זיהום אוראלי עם פ aeruginosa (OD600 = 25) או לשלוט 5% סוכרוז פתרון. עקומת הישרדות ק מחושב מתוך 4 בקבוקונים. של הזבובים 20 לכל קבוצה לטיפול. (B) OreR זכר ונקבה עפה אחרי זיהום אוראלי עם entomophila פ (OD600 = 100). עקומת הישרדות ק מחושב של זבובים שליטה יחידה 4 וזבובים נגוע 34 עבור זכרים ונקבות. (ג) מערכת החיסון מוטציות: Dcy (Drosocrystallin-peritrophic מטריקס מוטציה), Rel (התבלין-IMD מוטציה), חשופים entomophila פ (Pe), פ aeruginosa (Pa14) או פתרון שליטה 5% סוכרוז. כל הקבוצות נגוע למות באופן משמעותי יותר מהר מאשר הפקד זבובים (p < 0.001). אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Discussion

אנו מציגים פרוטוקול אמין אורלית שמאחורי הדבקת melanogaster ד עם פתוגנים חיידקיים. אנו מתמקדים aeruginosa פ ו פ entomophila, אבל פרוטוקול זה בקלות ניתן להתאים כדי לאפשר לזיהום חיידקי מינים אחרים, למשל, בסרישיה marcescens7. היבטים מרכזיים של פרוטוקול זה משתנה בין המינים חיידקי. בהתאם לכך, המינון זיהומיות היעילה ביותר המתאימים התקפה אלימה, המארח גנוטיפ הרגישות צריך כל להיות נחשב, אידיאלי נבדק במחקרים טייס. חשיפת זבובים לתרבויות חיידקי של מגוון של צפיפות אופטית ומדידת במינון זיהומיות והישרדות שלהם מהווה נקודת המתאימה בעת עבודה עם חיידקי של זנים חדשים או קווים לעוף.

פרוטוקול צעדים כגון לטוס רעב לפני האכלה, השעיית מחדש את חיידקי כדורי בפתרון 5% סוכרוז הם דבר שבשגרה, זיהום אוראלי, להגביר את המהימנות של זיהום חיידקי במהלך החשיפה7,8, 9 , 10. עם זאת, חשוב לציין כי במהלך החשיפה, זבובים בעצם חיים על משטח של התרבות חיידקי. בתהליך של הליכה על תרבות זו, חיידקים להיות נעוץ על פני השטח של הזבוב, במיוחד את הקוטיקולה או סביבו את הזיפים24. חיידקים epicuticular אלו, אינן משקפות את זיהום המעית מוצלח אבל עדיין יתגלה על ידי זבוב המגון ציפוי. כדי להפחית את האפשרות לקבלת תוצאות חיוביות שגויות, זה חיוני כדי משטח לחטא זבובים באמצעות טבילה אתנול 70% בעד 1דקות.

כאשר בוחנים את המחירים שפיכת חיידקי, זיהום אוראלי הוא חיוני. המספר של פתוגנים שלפונדקאי משחרר לתוך הסביבה הוא לרוב קשה למדוד, המטען הפנימי הוא נלקח לעיתים קרובות כמדד עבור חומרת הזיהום ולכן השידור26,27. מדידת עומס חיידקי לצד חיידקי ששפך מאפשר בחינת היחסים בין שני המרכיבים החשובים של חומרת והתפשטות מחלות38. מגבלה אחת של השיטה המובאת היא כי assaying עומס חיידקי פנימי של זבובים דורש דגימה הרסני. זה מקשה לחקור מגמות האורך של פתוגן צמיחה סיווג באותו בן אדם. עם זאת, זה אפשרי על מנת להתגבר על מגבלה זו על-ידי פגיעה דגימה גדודים של אנשים בשלבים שונים של זיהום, תחת ההנחה כי המטען חיידק הממוצע במדגם כל משקף הדינמיקה האורך פתוגן בתוך כל נתון בודדים. שפיכת חיידקי לא סובל אותן מגבלות, אנו מציעים דוגמאות איך שפיכת ניתן לכמת במדגם חתך הרוחב, או longitudinally כדי לחקור כיצד ששפך משתנה בתוך הפרט לאורך זמן.

תכונות המחשב המארח ופתוגן רבים במשותף לקבוע הנטייה של הפרט להעברת המחלה25,26,39. ואילו המשמעות של תכונות אלה סביר משתנה בין מערכות פתוגן-פונדקאי, ששפך הוא כנראה דטרמיננטה העיקריים של שידור בצואה אורלי. היכולת למדוד ששפך חיידקי פותח את ההזדמנות כדי לבדוק הנחה זו. שיש מאופיין פתוגן-פונדקאי dynamics בלוח הרצוי של קווי לעוף, ניסויים יכול בעל פה להדביק אנשים, והציבו אותם לצד המארחים נגוע, רגישים בתקופות זיהומיות שלהם. זבוב "נמענים" ואז יכול להיות לבדיקה פנימית לטעון חיידקי בנקודות זמן שונות כדרך ישירות מדידה שידור.

Acknowledgments

עבודה זו נתמכה על ידי פרס אסטרטגי מטרסט למרכז חסינות, זיהום של אבולוציה (הפניה גרנט http://ciie.bio.ed.ac.uk; מס 095831). PFV נתמך על ידי מלגת ברנקו וייס (https://brancoweissfellowship.org/) ואחווה של הקנצלר (בית הספר למדעי הביולוגיה, אוניברסיטת אדינבורו); JASJ נתמכה על ידי studentship NERC E3 DTP PhD.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Vials Sarstedt Ltd. 58.490 Polystyrene flat base tube 75mm x 23.5mm, 23ml
Agar Sigma-Aldrich A7002 Agar, ash 2.0-4.5%
Brown sugar Bidvest 66032 Light brown soft sugar
Maize Dove's Farm Organic maize flour
Fermipan yeast Bidvest 96360 Dry, instant yeast
Methyl-4-hydroxybenzoate Sigma-Aldrich H5501 >=99.0%, crystalline
Sucrose Sigma-Aldrich 84097 Sucrose BioUltra, for molecular biology, >=99.5% (HPLC)
Petri dishes Fisher Scientific UK Ltd. 15788517 X600 Petri Dish 90 X 16.2MM Sterile Triple Vent
Falcon tubes (50ml) Greiner Bio-one Inc 210261 Centrifuge tube, 50ml, skirted, bagged, sterile
Eppendorf tube (0.5ml) Sarstedt Ltd. 72.699 Sarstedt Micro Tube Conical Base Push Cap 0.5ml Standard Neutral
Eppendorf tube (1.5ml) Sarstedt Ltd. 72.690.001 Sarstedt Micro Tube Conical Base Push Cap 1.5ml Standard Neutral
Ethanol VWR International Ltd. 20821.33 ETHANOL ABSOLUTE ANALAR NP ACS/R.PE - Analytical Grade
2 L Conical Flask VWR International Ltd. 214-0038 Narrow neck, 2 L Erlenmeyer flask
Sterile filter paper Fisher Scientific UK Ltd. 1001-020 Plain circle and sheets; Particle Retention: greater than11um; Filtration speed: 150 herzberg; Air flow: 10.5s/100mL/in2; Medium porosity; Smooth surface; Grade 1; Type: circle; Dia: 20mm
Bijou sample container Fisher Scientific UK Ltd. 129A 7ml polystyrene sample container
Pseudomonas isolation agar Sigma-Aldrich 17208 Contains agar 13.6 g/L, magnesium chloride 1.4 g/L, peptic digest of animal tissue 20g/L, potassium sulfate 10g/L, triclosan 0.025g/L
LB broth, Miller Fisher Scientific UK Ltd. BP1426 Contains 10g tryptone, 5g yeast extract, 10g sodium chloride per litre
Large Embryo Collection Cages Scientific Laboratory Supplies Ltd. 59-101 Flystuff- fits 100mm petri dish
TRI reagent solution Life Technologies AM9738
96-well microplate Scientific Laboratory Supplies Ltd. 353072 Falcon 96 Well Clear Flat Bottom TC-Treated Polystyrene Cell Culture Microplate with Lid Sterile
Pestle Fisher Scientific UK Ltd 12649595 Pestle, Presterilized; Axygen; Tissue grinder; Blue; Inert polypropylene construction; Fits 1.5 and 2.0mL centrifuge tubes; Individually wrapped; 100/Pk
Glycerol Scientific Laboratory Supplies Ltd. CHE2068 Glycerol A.R. 99.5% 2.5 L
Cotton wool- non absorbent Cowens Ltd ABL Non Absorbent Large quantity 20 bags x 500
Cotton wool- absorbent Cowens Ltd ABS BP small quantity 20 bags x 500
Vortex Fisherbrand Whirlimixer 75W 50-6-Hz 220-240V
Orbital incubator Gallenkamp INR-200-010V 220 V, 50 Hz, 5 A. Nominal temperature: 70ºC. Shaking frequency: 0...400 rpm.
Absorbance Microplate Reader Biotek Instruments Ltd ELx808™ Absorbance Microplate Reader
Gen 5 Microplate Reader and Imager Software Biotek Instruments Ltd For Absorbance Microplate Reader
Centrifuge Beckman Coulter 392304 Allegra X-12R Benchtop Centrifuge, refridgerated 50Hz 230V
Step One Plus Real Time qPCR System Thermofisher Scientific 4376600 Applied biosystems Step One Plus real time qPCR system
Step One Software 2.3 Thermofisher Scientific For Stepone and SteponePlus real time qPCR systems
R Statistical Software https://cran.r-project.org/
10 µL pipette tips Greiner Bio-one Inc 741015 Easlyload gilson-style. Graduated, clear, refill, 960 pcs
200 µL pipette tips Greiner Bio-one Inc 741065 Easlyload gilson-style. Graduated, clear, refill, 960 pcs
1000 µL pipette tips Greiner Bio-one Inc 741045 Easlyload gilson-style. Graduated, clear, refill, 960 pcs
20 µL filtered pipette tips Greiner Bio-one Inc 774288 Filter tip gilson-style. Clear, rack blue, single packed, R/Dnase free, 10 racks of 96pcs
200 µL filtered pipette tips Greiner Bio-one Inc 739288 Filter tip gilson-style. Clear, rack blue, single packed, R/Dnase free, 10 racks of 96pcs
1000 µL filtered pipette tips Greiner Bio-one Inc 740288 Filter tip gilson-style. Clear, rack blue, single packed, R/Dnase free, 10 racks of 60pcs

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Hoffmann, J. A. The immune response of Drosophila. Nature. 426, (6962), 33-38 (2003).
  2. Buchon, N., Silverman, N., Cherry, S. Immunity in Drosophila melanogaster - from microbial recognition to whole-organism physiology. Nat Rev Immunol. 14, (12), 796-810 (2014).
  3. Bergman, P., Seyedoleslami Esfahani, S., Engström, Y. Drosophila as a Model for Human Diseases-Focus on Innate Immunity in Barrier Epithelia. Curr Top Dev Biol. 121, 29-81 (2017).
  4. Apidianakis, Y., Rahme, L. G. Drosophila melanogaster as a model host for studying Pseudomonas aeruginosa infection. Nat Protoc. 4, (9), 1285-1294 (2009).
  5. Khalil, S., Jacobson, E., Chambers, M. C., Lazzaro, B. P. Systemic Bacterial Infection and Immune Defense Phenotypes in Drosophila Melanogaster. JoVE J Vis Exp. (99), e52613-e52613 (2015).
  6. Neyen, C., Bretscher, A. J., Binggeli, O., Lemaitre, B. Methods to study Drosophila immunity. Methods San Diego Calif. 68, (1), 116-128 (2014).
  7. Nehme, N. T., et al. A Model of Bacterial Intestinal Infections in Drosophila melanogaster. PLOS Pathog. 3, (11), e173 (2007).
  8. Bou Sleiman, M. S., Osman, D., Massouras, A., Hoffmann, A. A., Lemaitre, B., Deplancke, B. Genetic, molecular and physiological basis of variation in Drosophila gut immunocompetence. Nat Commun. 6, 7829 (2015).
  9. Buchon, N., Broderick, N. A., Lemaitre, B. Gut homeostasis in a microbial world: insights from Drosophila melanogaster. Nat Rev Microbiol. 11, (9), 615-626 (2013).
  10. Kuraishi, T., Hori, A., Kurata, S. Host-microbe interactions in the gut of Drosophila melanogaster. Front Physiol. 4, (2013).
  11. Ha, E. -M., Oh, C. -T., Bae, Y. S., Lee, W. -J. A Direct Role for Dual Oxidase in Drosophila Gut Immunity. Science. 310, (5749), 847-850 (2005).
  12. Limmer, S., et al. Pseudomonas aeruginosa RhlR is required to neutralize the cellular immune response in a Drosophila melanogaster oral infection model. Proc Natl Acad Sci U S A. 108, (42), 17378-17383 (2011).
  13. Apidianakis, Y., Pitsouli, C., Perrimon, N., Rahme, L. Synergy between bacterial infection and genetic predisposition in intestinal dysplasia. Proc Natl Acad Sci U S A. 106, (49), 20883-20888 (2009).
  14. Vodovar, N., et al. Drosophila host defense after oral infection by an entomopathogenic Pseudomonas species. Proc Natl Acad Sci U S A. 102, (32), 11414-11419 (2005).
  15. Chugani, S. A., Whiteley, M., Lee, K. M., D'Argenio, D., Manoil, C., Greenberg, E. P. QscR, a modulator of quorum-sensing signal synthesis and virulence in Pseudomonas aeruginosa. Proc Natl Acad Sci. 98, (5), 2752-2757 (2001).
  16. Gupta, V., Vasanthakrishnan, R. B., Siva-Jothy, J., Monteith, K. M., Brown, S. P., Vale, P. F. The route of infection determines Wolbachia antibacterial protection in Drosophila. Proc R Soc B. 284, (1856), 20170809 (2017).
  17. Martins, N. E., Faria, V. G., Teixeira, L., Magalhães, S., Sucena, É Host Adaptation Is Contingent upon the Infection Route Taken by Pathogens. PLoS Pathog. 9, (9), (2013).
  18. Chambers, M. C., Jacobson, E., Khalil, S., Lazzaro, B. P. Thorax Injury Lowers Resistance to Infection in Drosophila melanogaster. Infect Immun. 82, (10), 4380-4389 (2014).
  19. Gupta, V., Stewart, C., Rund, S. S., Monteith, K., Vale, P. F. Costs and benefits of sublethal Drosophila C virus infection. J Evol Biol. (2017).
  20. Ferreira, ÁG., Naylor, H., Esteves, S. S., Pais, I. S., Martins, N. E., Teixeira, L. The Toll-Dorsal Pathway Is Required for Resistance to Viral Oral Infection in Drosophila. PLoS Pathog. 10, (12), (2014).
  21. Buchon, N., Broderick, N. A., Poidevin, M., Pradervand, S., Lemaitre, B. Drosophila Intestinal Response to Bacterial Infection: Activation of Host Defense and Stem Cell Proliferation. Cell Host Microbe. 5, (2), 200-211 (2009).
  22. Wayland, M. T., et al. Spotting the differences: Probing host/microbiota interactions with a dedicated software tool for the analysis of faecal outputs in Drosophila. J Insect Physiol. 69, 126-135 (2014).
  23. Hori, A., Kurata, S., Kuraishi, T. Unexpected role of the IMD pathway in Drosophila gut defense against Staphylococcus aureus. Biochem Biophys Res Commun. 495, (1), 395-400 (2018).
  24. Ren, C., Webster, P., Finkel, S. E., Tower, J. Increased Internal and External Bacterial Load during Drosophila Aging without Life-Span Trade-Off. Cell Metab. 6, (2), 144-152 (2007).
  25. Ezenwa, V. O., et al. Host behaviour-parasite feedback: an essential link between animal behaviour and disease ecology. Proc R Soc B. 283, (1828), 20153078 (2016).
  26. McCallum, H., et al. Breaking beta: deconstructing the parasite transmission function. Phil Trans R Soc B. 372, (1719), 20160084 (2017).
  27. Vale, P. F., Choisy, M., Little, T. J. Host nutrition alters the variance in parasite transmission potential. Biol Lett. 9, (2), 20121145 (2013).
  28. Mulcahy, H., Sibley, C. D., Surette, M. G., Lewenza, S. Drosophila melanogaster as an Animal Model for the Study of Pseudomonas aeruginosa Biofilm Infections In Vivo. PLoS Pathog. 7, (10), e1002299 (2011).
  29. Kuraishi, T., Binggeli, O., Opota, O., Buchon, N., Lemaitre, B. Genetic evidence for a protective role of the peritrophic matrix against intestinal bacterial infection in Drosophila melanogaster. Proc Natl Acad Sci. 108, (38), 15966-15971 (2011).
  30. Myllymäki, H., Valanne, S., Rämet, M. The Drosophila Imd Signaling Pathway. J Immunol. 192, (8), 3455-3462 (2014).
  31. Lewis, E. A new standard food medium. Cold Spring Harb Protoc. 2014, (9), pdb.rec081414 (2014).
  32. Bolker, B. M., et al. Generalized linear mixed models: a practical guide for ecology and evolution. Trends Ecol Evol. 24, (3), 127-135 (2009).
  33. R Core Team. R: A Language and Environment for Statistical Computing. R Foundation for Statistical Computing. Vienna, Austria. (2015).
  34. Schmittgen, T. D., Livak, K. J. Analyzing real-time PCR data by the comparative CT method. Nat Protoc. 3, (6), 1101-1108 (2008).
  35. Kalbfleisch, J. D., Prentice, R. L. The Statistical Analysis of Failure Time Data. 2nd Edition, Wiley-Blackwell. Hoboken, N.J. (2002).
  36. Nuhanen, B. Drosophila melanogaster, drawing.SVG. Available from: https://commons.wikimedia.org/wiki/File:Drosophila-drawing.svg (2007).
  37. Accountalive. Example of a survival curve estimated by Kaplan-Meier method including 95% confidence limits. Available from: https://commons.wikimedia.org/wiki/File:Kaplan-Meier-sample-plot.svg (2011).
  38. Susi, H., Vale, P. F., Laine, A. -L. Host Genotype and Coinfection Modify the Relationship of within and between Host Transmission. Am Nat. 186, (2), 252-263 (2015).
  39. Fellous, S., Duncan, A. B., Quillery, E., Vale, P. F., Kaltz, O. Genetic influence on disease spread following arrival of infected carriers. Ecol Lett. 15, (3), 186-192 (2012).
זיהום חיידקי הפה ו Shedding ב <em>דרוזופילה melanogaster</em>
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Siva-Jothy, J. A., Prakash, A., Vasanthakrishnan, R. B., Monteith, K. M., Vale, P. F. Oral Bacterial Infection and Shedding in Drosophila melanogaster. J. Vis. Exp. (135), e57676, doi:10.3791/57676 (2018).More

Siva-Jothy, J. A., Prakash, A., Vasanthakrishnan, R. B., Monteith, K. M., Vale, P. F. Oral Bacterial Infection and Shedding in Drosophila melanogaster. J. Vis. Exp. (135), e57676, doi:10.3791/57676 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
simple hit counter