Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove

Biology

Mundtlige bakterieinfektion og kaste i Drosophila melanogaster

doi: 10.3791/57676 Published: May 31, 2018

Summary

Denne protokol beskriver metoder til mundtligt udsætte og inficere frugtflue Drosophila melanogaster med bakterielle patogener, og til at måle antallet af smitsomme bakterier skur efter tarm infektion. Vi yderligere at beskrive virkningen af immun mutanter på flyve overlevelse efter mundtlig bakteriel infektion.

Abstract

Bananfluen Drosophila melanogaster er en af de bedste udviklede modelsystemer af infektion og medfødt immunitet. Mens de fleste arbejde har fokuseret på systemiske infektioner, har der været en nylig stigning af interesse i mekanismerne i gut immunocompetence til patogener, som kræver metoder til mundtligt inficere fluer. Her præsenterer vi en protokol for at oralt udsætte enkelte fluer til en opportunistisk bakteriel patogen (Pseudomonas aeruginosa) og en naturlig bakteriel patogen af D. melanogaster (Pseudomonas entomophila). Målet med denne protokol er at give en robust metode til at afsløre mandlige og kvindelige fluer til disse patogener. Vi give repræsentative resultater viser overlevelse fænotyper, mikrobe belastninger og bakteriel udgydelse, som er relevante for undersøgelsen af heterogenitet i patogen transmission. Endelig vil vi bekræfte, at Dcy mutanter (mangler den beskyttende peritrophic matrix i tarm epitel) og Relish mutanter (mangler en funktionel immundefekt (IMD) pathway), vise øget følsomhed over for mundtlig bakterieinfektion. Denne protokol beskriver derfor en robust metode til at inficere fluer ved den mundtlige vej, infektion, som kan udvides til at omfatte undersøgelse af en række genetiske og miljømæssige kilder til variation i tarm infektion resultater og bakteriel overførsel.

Introduction

Bananfluen (også kendt som eddike flyve), D. melanogaster, har været flittigt brugt som en model organisme for infektion og immunitet mod en bred vifte af patogener1,2. Dette arbejde har tilbudt grundlæggende indsigt i de fysiologiske konsekvenser af infektion og var også banebrydende i optrævler de molekylære veje underliggende vært immunrespons mod snylter, bakterier, svampe og virale infektioner. Denne viden er ikke kun nyttig til at forstå det medfødte immunresponset af insekter og andre hvirvelløse dyr, men fordi mange af de immun mekanismer er evolutionært bevaret mellem insekter og pattedyr, Drosophila også har ansporet opdagelsen af større immun mekanismer i pattedyr, herunder mennesker3.

De fleste arbejde på Drosophila infektion og immunitet har fokuseret på systemiske infektioner, ved hjælp af podning metoder, der leverer patogener direkte ind i kroppen af insektet af prikkende eller injektion4,5,6. Fordelen ved disse metoder i muliggør levering af en kontrolleret infektiøse dosis er klar og understøttet af en omfattende arbejde på systemiske infektioner. Dog er mange naturligt forekommende bakterielle patogener af D. melanogaster erhvervet gennem fodring på rådnende organisk materiale hvor gut immunocompetence spiller en væsentlig rolle i vært forsvar7,8,, 9 , 10 , 11 , 12 , 13 , 14 , 15. eksperimenter, der beskæftiger systemiske infektioner omgå disse forsvarsværker, og derfor giver et helt andet billede af hvordan insekter montere forsvar mod naturlige patogener. Dette er især relevant, hvis formålet med arbejdet er at teste forudsigelser om økologi og udviklingen i infektion, hvor brugen af naturlige patogener og ruter for infektion er vigtigt16,17. Seneste arbejde har fremhævet, hvordan ruten taget af patogener væsentligt påvirker sygdommen resultatet18,19, fremkalder forskellige immun veje20,21, kan fastslå den beskyttende effekt af arvet endosymbionts16, og kan endda spille en vigtig rolle i udviklingen af vært forsvar17.

En anden grund til at ansætte mundtlig ruter af infektion er, at det giver undersøgelsen af variationen i patogen transmission ved måling af bakteriel udgydelse under fækal udskillelse efter oral infektion22,23, 24. forståelse kilder til vært heterogenitet i smitteoverførsel udfordrende i naturlige populationer25,26, men måling af komponenter af transmission, såsom patogen udgydelse, under kontrollerede laboratorium betingelser tilbyder en nyttig alternativ tilgang27. Ved fodring fluer bakterier og måle bakteriel udgydelse under en række af genetiske og miljømæssige sammenhænge i kontrolleret forsøgsbetingelser, er det muligt at identificere kilder til variation i lysgennemstrømningen blandt værter.

Her, vi beskriver en protokol for mundtligt inficerer D. melanogaster med bakterielle patogener, og til kvantificering af bakterievækst og udgyde som følger (figur 1). Vi beskriver denne protokol på to Pseudomonas -bakterier: en ondartet stamme af den opportunistisk patogen P. aeruginosa (PA14), og en mindre ondartet stamme af naturligt flyve patogen P. entomophila. Pseudomonads er fælles gram-negative bakterier med en bred værtsspektrum, inficere insekter, nematoder, planter og hvirveldyr, og som findes i de fleste miljøer4,6. Enterisk infektion i Drosophila af P. aeruginosa og P. entomophila resulterer i patologi til tarm epitheler12,13,14,15, 28. Mens vi fokus på disse to bakterielle patogener, kan de metoder, der beskrives her principielt anvendes på enhver bakteriel patogen interesse med mindre ændringer. Efter oral eksponering, vi måle efter infektionen overlevelse, og måle mikrobe belastning inden for enkelte fluer og levedygtige mikrober kaste ud i miljøet, udtrykt i kolonidannende enheder (CFUs). Endelig, da gut immunocompetence resultater fra en kombination af epitel barriere og humorale svar, vi også måle overlevelse flyve linjer hvor disse forsvarsværker er forstyrret. Specifikt, Drosocrystallin (Dcy) mutanter har tidligere vist sig at være mere modtagelige for mundtlige bakteriel infektion på grund af en forarmet peritrophic matrix i gut29. Vi måler også overlevelse i en Relish (Rel) mutant, der er forhindret i at producere antimikrobielle peptider mod Gram-negative bakterier via IMD pathway30.

Protocol

1. opretholde fluer

  1. Vedligeholde fluer i 23 mL plastik hætteglas indeholdende 7 mL af frisklavet Lewis medium (modificeret fra reference31; 1 L triple destilleret H2O, 6.1 g agar, 93.6 g brun farin, 68 g majs, 18,7 g instant gær, 15 mL Tegosept anti-svampe agent) i væksthuse på 25 ± 1 ° C, i en 12 h:12 cyklus h lys: mørke med ~ 60% fugtighed. Sæt hætteglas med ikke-absorberende Bomuld uld.
  2. Efter hver 14 dage, overføres 20 – 30 voksne til en ny mad hætteglas, med instant, tørre gær føjes til overflade, for 2-3 dage for at tillade æglægning at forekomme. Efter denne periode, sikre, at æggene er synlige på overfladen af maden. Fjerne voksne fluer.
    Bemærk: Dette holder fluer i hætteglassene som enkelt generation, alder-matchede populationer.
  3. Forlade æggene at udvikle.
    Bemærk: Ved 25 ° C, voksne fluer begynder at velsmagende fra pupper på dag 11 og fortsætte over dage 12-14.

2. klargør eksperimentelle fluer

  1. Indsamle æg af den overordnede generation i en befolkning/embryo samling bur på en 75 mL apple-agar plade (1 L tredobbelt destilleret H2O, 30 g agar, 33 g saccharose, 330 mL æblesaft, 7 mL Tegosept anti-svampe agent) med en gær pasta spredning (mix tørgær med vand til en jordnøddesmør-lignende konsistens). Tilføj vand-gennemblødt vat til bur til give fugt.
    Bemærk: For at undgå forstyrrende virkninger forårsaget af forskelle i larve opdræt tæthed, det er vigtigt, at eksperimentel fluer i forskellige hætteglas opdrættes i lignende tætheder. Ovenstående trin udføres for at undgå forstyrrende virkninger.
  2. Der inkuberes i 24 timer ved 25 ° C i et 12 h:12 h lys: mørke cyklus indtil æglægning opstod. Hvis der er for få æg efter 24 timer, give længere tilvænning. Erstat apple-agar plader og tillade æglægning at forekomme i en yderligere 24 timer.
  3. Tage æg-laden apple-agar plader fra befolkningen bur. Fjern de resterende gær pasta og eventuelle døde fluer fra den agar overfladen.
  4. Dykke agar i 20 mL af 1 x fosfatbufferet saltopløsning (PBS) og forsigtigt løsne æg fra apple-agar med en fin pensel. Mens suspenderet i PBS, overføre æggene til en 50 mL-centrifugerør og henstår i 5 min så æggene synker til bunds.
    Bemærk: De fleste æg er fundet på den ydre kant i agaren.
  5. Fjerne ved at skære bunden 4 mm af en p1000 filtrerede pipette tip og brug pipetten tip til at tegne 1 mL af opløsning, taget fra bunden af 50 mL-centrifugerør. Overføre dette til en 1,5 mL microcentrifuge tube og gør det muligt at løse.
    Bemærk: Når pipettering op æg, snap-releasing stemplet er mere effektiv end en blid overgang.
  6. Fjerne ved at skære bunden 4 mm af et p20 filtrerede pipette tip. Indstille pipetten til en ønskede lydstyrke og trække fra bunden af microcentrifuge rør.
    Bemærk: Med praksis, et volumen på 5 µL indeholder omtrent 100 æg.
  7. Undvære de indsamlede æg på mad og lade dem udvikle for den krævede tid.

3. Bakteriers kultur

  1. For at vokse P. entomophila og P. aeruginosa kulturer, podes 10 mL Luria-Bertani (LB) bouillon med 100 µL af en frossen bakteriel bestand ved 30 ° C (P. entomophila) og 37 ° C (P. aeruginosa), henholdsvis. Ryste på 150 rpm natten over. Sikre at bakteriekulturen når fasen mætning.
  2. At sikre bakterier bruges til vaccination fluer er i fasen for eksponentiel og hurtigt gentage, podes overnight kultur ind i en ny subkultur af et ønsket volumen, den følgende morgen. Sikre, at den foreløbige inokulum 10% af den samlede subkultur kultur.
    Bemærk: Oral infektion kræver høj. Det er derfor nødvendigt at vokse en betydelig mængde af bakteriel kultur, således at nok podning kultur kan produceres til den ønskede dosis og eksperimenterende størrelse. Beregne hvor meget subkultur er nødvendig for at producere de nødvendige smitsomme doser ved hjælp af ligningen MsVs = M,jegVjeg, hvor M repræsenterer en kultur er ekstinktionen måles på 600 nm (OD600) værdi og V repræsenterer sin volumen. Sænket skrift bogstaver henviser til om kulturen anvendes som en subkultur (s) eller en smitsom dosis, (i).
  3. Vokse denne subkultur i en 2 L konisk kolbe i en volumen, sådan at den subkultur overflade falder (højst) lige over begyndelsen af kolbens skråning. Fyld ikke over denne mark da det vil hæmme væksten af bakterier.
  4. Sikre bakterier i denne subkultur er i den eksponentielle vækstfase ved måling af OD hvert 30 min.
    Bemærk: Dette sker efter 3-5 h, hvor subkultur når en OD600 mellem 0,6-0,8.
  5. Hæld lige store mængder af denne subkultur over 50 mL centrifugeglas og spin subkultur på 2.500 x g i 15 min. ved 4 ° C til pellet bakterier. Når pelleted, fjerne og derefter dreje supernatanten igen på ovennævnte betingelser at bekræfte fjernelsen af størstedelen af bakterier.
    Bemærk: En pellet af ubetydelig størrelse (mindre end 1 mm i højden) bekræfter dette.
  6. Kombinere de bakterielle pellets af de separate rør ved re suspendere dem i 5 mL af supernatanten subkultur og rekombinerer disse løsninger i en enkelt 50 mL tube. Spin denne koncentreret kultur på 2.500 x g i 15 min. ved 4 ° C til pellet bakterier.
  7. Fjern supernatanten og genopslæmmes endelige bakterier pellet i vand 5% rørsukkeropløsning. Kontrollere OD og justere til den ønskede infektiøse dosis (OD600 = 100 for P. entomophila8 og OD600 = 25 for P. aeruginosa16,28), ved at suspendere re pellets i 5% saccharose vand løsning til den nødvendige mængde.
    Bemærk: De 5% rørsukkeropløsning vand tilføjes kan beregnes ved hjælp af ligningen i trin 3.2.1 (MsVs = M,jegVjeg).

4. mundtligt inficerer fluer

  1. For at sikre oral infektion, sulte fluer for 2-4 timer før udsættelse for bakterier ved at overføre fluer til standard agar hætteglas (1 L triple destilleret H2O, 20 g agar, 84 g brun farin, 7 mL Tegosept anti-svampe agent).
  2. Forberede infektion hætteglas, mens fluer er at være sultet. Gøre en Pseudomonas infektion hætteglas af pipettering 500 µL af standard sukker agar til låget på en 7 mL prøveglas og lader det tørre. Læg en disk filtrerpapir i låget og afpipetteres 100 µL af bakteriekulturen direkte på filter disk. For kontrol infektioner, skal du erstatte bakteriekulturen med den samme mængde af 5% saccharose vand løsning på filtrerpapir.
  3. Tilføj enkelt fluer til prøveglas og henstår i 18 – 24 h.
  4. At bekræfte oral infektion, først overflade-sterilisere flyver straks efter bakteriel eksponering, ved at placere dem i 100 µL af 70% ethanol for 20-30 s. Fjern ethanol og tilsæt 100 µL af triple destilleret vand til 20 – 30 s før du fjerner vandet. Tilsæt 100 µL 1 x PBS og homogeniseres i farten.
  5. Overførsel af homogenatet til den øverste række af en 96-brønd plade og tilføje 90 µL 1 x PBS til hver brønd nedenfor.
  6. Seriefremstillede fortyndes denne prøve for at skelne mellem en vifte af CFU værdier. Tage 10 µL af homogenatet i den øverste godt og tilføje dette til langt under. Gentag dette trin med andet godt, overføre 10 µL til tredje godt, og så videre, for så mange serielle fortyndinger efter behov.
    Bemærk: Det er vigtigt, at nye pipette tips er brugt for hvert sæt af fortyndinger.
  7. Plade de serielle fortyndinger på en LB nutrient agar plade i 5 µL dråber, at sikre alle droplets forbliver diskret.
  8. Inkuber LB-Agar plader natten over ved 30 ° C og 37 ° C i P. entomophila og P. aeruginosa, henholdsvis og tælle synlige CFUs.
    Bemærk: Mens Drosophila gut mikrober kræver forskellige anaerobe vækstbetingelser, selektivt medie, for eksempel Pseudomonas Isolation Medium (PIM), kan anvendes til at sikre kun Pseudomonas CFUs tælles.
  9. Beregne antallet af CFUs per fly ved at tælle antallet af kolonier stede ved seriel fortynding hvor 10 – 60 CFUs er klart synlige. Derefter multipliceres med fortyndingsfaktoren stede til at beregne antallet af bakterier pr. fly.
  10. Udføre statistisk analyse. Eventuelt transform CFUs pr. fly til en normal fordeling. Gøre dette ved log-transformation. Når omdannet, bruge generaliserede lineære modeller (GLMs)30,31,32 til at teste, hvordan behandlingsgrupper afviger i CFUs per fly (ved hjælp af almindeligt tilgængelige statistiske softwarepakker såsom R33).
    Bemærk: Den resterende flyve homogenatet kan bruges til at måle genekspression gennem kvantitative reverse transkription PCR (RT-qPCR) analyse. Lave homogenatet i 50 µL af RNA isolering reagens, udtrække RNA og kvantificere bestemt immun gen titers af RT-qPCR (Se fx, Gupta og Vale16 for en detaljeret protokol). Udtryk for bestemt immun gen udskrifter skal normaliseres til udskrift niveauer af en husholdning gen (dvs, rp49) og udtrykt som en fold ændre i forhold til kontrol fluer ved hjælp af 2−ΔΔCt metode31, 32,33,34.

5. optagelse efterladte efter infektion

  1. Inficere fluer mundtligt som beskrevet i trin 4.2.
  2. Overføre den inficerede eller kontrol fluer fra deres respektive infektion hætteglas til standard Lewis hætteglas og holde i en inkubator ved 25 ° C i et 12 h:12 h lys-mørke cyklus (eller ønsket betingelser). Holde fluer, indtil de er døde.
  3. Tæl antallet af levende eller døde fluer i hvert hætteglas hver dag eller så ofte som nødvendigt.
  4. Overføre fluer til nye hætteglas hver 5 dage for at undgå fluer at sidde fast i maden.
  5. Præsentere disse data som Kaplan-Meier (KM) overlevelse kurver eller gennemsnit ± SE proportional overlevelse parceller. For at analysere effekten af flere faktorer og/eller deres respektive interaktioner med hinanden bruge en statistisk pakke (for eksempel pakken "overlevelse" i R33) til at køre en overlevelses analyse såsom Cox Proportional farer model35.

6. måling af bakteriemængde

  1. På det ønskede tidspunkt, skal du overføre en enkelt inficeret flyve til en sterile 1,5 mL microcentrifuge tube.
  2. Overfladen sterilisere fluer som beskrevet i trin 4.4.
  3. Homogeniseres flue og kvantificere bakteriemængde ved hjælp af den protokol, der er beskrevet i trin 4.5 – 4.10.

7. foranstaltning bakteriel Shedding

  1. Måle kaste sammen med den interne belastning.
  2. Efter infektion, skal du overføre enkelt fluer til 1,5 mL microcentrifuge rør indeholdende ~ 50 µL af Lewis medie i 24 timer.
  3. Fjerne fluer til intern belastning måling (Se trin 6) og vaske rør med 100 µL 1 x PBS af vortexing stærkt for 3 s.
  4. Måle CFUs i denne vask af plating på LB nutrient agar ved hjælp af den samme protokol, som beskrevet i trin 4.6-4.8.
  5. Efter infektion, skal du overføre enkelt fluer til 1,5 mL microcentrifuge rør indeholdende ~ 50 µL af Lewis medie i 24 timer.
  6. Overføre fluer til nyt microcentrifuge-rør indeholdende ~ 50 µL af Lewis medium for en yderligere 24 h. vask de forurenede rør med 100 µL 1 x PBS ved vortexing stærkt for 3 s.
  7. Måle CFUs i denne vask af plating på LB nutrient agar ved hjælp af samme protokollen beskrevet i trin 4.6-4.8.
  8. Gentag trin 7.2 og 7.3 og optage flyve dødelighed på hver overførsel.

Representative Results

Vi præsenterer her, illustrative resultater fra eksperimenter hvor D. melanogaster var mundtligt inficeret med P. aeruginosa eller P. entomophila. Figur 2 viser vellykket oral infektion af fluer efter en 12-timers eller 24-timers eksponeringstid for bakteriel kulturer OD600 = 25 og 100 for P. aeruginosa (figur 2A) og P. entomophila (figur 2B C), henholdsvis. Figur 2B illustrerer betydningen af at anvende en mere koncentreret kultur af P. entomophila, vist af stigningen i bakteriemængde når fluer er udsat for bakteriel kulturer af større ekstinktionen. Mandlige og kvindelige Oregon Rasmussen (ører) fluer klare P. aeruginosa infektion i samme tempo (figur 3) og kaste det samme antal P. aeruginosa CFUs (figur 4A). Når inficeret med P. entomophila dog, mandlige og kvindelige ører fluer adskiller sig i antallet af bakterier stald, på en måde, der ændrer sig over tid (figur 4B). Hanner og hunner dør af P. aeruginosa (figur 5A) og P. entomophila (figur 5B) til forskellige priser. Vi ser også, at Dcy mutanter, (som mangler den beskyttende peritrophic matrix i tarm epitel) og Relish mutanter (som mangler en funktionel IMD immun pathway), viser nedsat overlevelse efter P. entomophila og P. aeruginosa oral infektion (figur 5 c).

Figure 1
Figur 1: Skematisk oversigt over protokoller til måling af overlevelse, kaste og interne bakteriemængde efter oral infektion i Drosophila melanogaster. En illustration af 3 mulige eksperimenter efter oral infektion af D. melanogaster. Måle 'overlevelse' ved at overføre enkelt fluer til hætteglas og optage deres inficerede levetid. Måle 'kaste' ved at overføre enkelt fluer til 1,5 mL microcentrifuge rør med 50 µL af Lewis medium i fælles landbrugspolitik. Efter 24 timer i røret, fjerne fly og vortex tube med 100 µL 1 x PBS. Fjerne og plade denne løsning på LB nutrient agar til at beregne den bakterielle udgyde. Måle kaste i den samme flyve på langs, ved at overføre fluer til frisk rør med Lewis medium i fælles landbrugspolitik efter 24 timer, og vask og plating nu forurenede røret. En flue 'intern belastning» kan måles ved at tage en inficeret flyve, overflade sterilisation det, og homogenisering det før endelig plating homogenatet på LB nutrient agar. Dette kan udføres efter afgivelse er blevet målt til at beregne hvordan 'intern belastning' og kaste korrelat. De flyve illustration anvendes i denne figur var oprindelig tegnet af B. Nuhanen36. Forfatterne har ændret det til at ledsage den eksempel Kaplan-Meier-kurve, som er taget fra Wikimedia Commons37. Alle andre illustrationer er originale. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 2
Figur 2: infektiøse dosis af bakterier efter oral infektion. (A) infektiøse dosis af mandlige og kvindelige Oregon-R flyver efter udsættelse for en P. aeruginosa kultur (OD600 = 25) for 12 timer. Middelværdi og SE blev beregnet fra 3 hanner og 3 tæver. (B) infektiøse dosis af outcrossed vildtype hunnerne efter udsættelse for en af fire P. entomophila kulturer (OD600 = 100, 75, 50 og 25) eller kontrollere 5% rørsukkeropløsning i 24 timer. Den statistiske forskel af (F3,76 = 18.567, p < 0,001) i den infektiøse dosis mellem eksponering behandlinger er angivet med forskellige bogstaver over barer. Midlerne var beregnet ud fra 5 fluer for OD600 = 0 dosis, og 18-20 for alle andre doser. (C) den infektiøse dosis af mandlige og kvindelige Oregon-R flyver efter udsættelse for P. entomophila kultur (OD600 = 100) i 24 timer. Middelværdi og SE blev beregnet fra 20 mænd og 20 kvinder. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 3
Figur 3: Indre P. aeruginosa belastning i fluer efter oral infektion. Gennemsnit ± SE bakteriemængde på mandlige og kvindelige Oregon-R flyver efter oral infektion med P. aeruginosa (OD600 = 25) op til 168 h efter infektionen. Middelværdi og SE for hvert tidspunkt beregnes ud fra 3 personer. En flue interne bakteriemængde væsentligt ændrer sig over tid (p < 0,001). Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 4
Figur 4: bakteriel kaste efter oral infektion. (A) P. aeruginosa kaste af de samme fluer bruges i figur 3, op til 120 h efter infektionen. Middelværdi og SE blev beregnet fra 3 hanner og 3 tæver. (B) P. entomophila kaste af mandlige og kvindelige Oregon-R flyver efter oral infektion med P. entomophila (OD600 = 100) op til 120 h efter infektionen. Middelværdi og SE blev beregnet fra 34 mænd og 38 kvinder. For både P. aeruginosa og P. entomophila, antallet af CFUs skur af en flue betydeligt ændres over tid (p < 0,001). Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 5
Figur 5: overlevelse af fluer efter mundtlig bakterieinfektion. Kaplan-Meier (KM) overlevelse kurver af (A) Oregon-R mandlige og kvindelige flyver efter oral infektion med P. aeruginosa (OD600 = 25) eller kontrollere 5% rørsukkeropløsning. KM overlevelse kurven blev beregnet ud fra 4 hætteglas med 20 fluer per behandling gruppe. (B) ører mandlige og kvindelige flyver efter oral infektion med P. entomophila (OD600 = 100). KM overlevelse kurven blev beregnet ud fra 4 enkelt kontrol fluer og 34 inficerede fluer for både hanner og hunner. (C) immun mutanter: Dcy (Drosocrystallin-peritrophic matrix mutant) og Rel (Relish-IMD mutant), udsat for P. entomophila (Pe), P. aeruginosa (Pa14) eller en kontrol 5% rørsukkeropløsning. Alle inficerede grupper die betydeligt hurtigere end kontrollen flyver (p < 0,001). Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Discussion

Vi præsenterer en protokol til at pålideligt mundtligt inficere D. melanogaster med bakterielle patogener. Vi fokuserer på P. aeruginosa og P. entomophila, men denne protokol kan nemt tilpasses aktiverer infektion af andre bakteriearter, fx, Serratia marcescens7. Vigtige aspekter af denne protokol vil variere mellem bakteriearter. Derfor, den mest effektive infektiøse dosis, tilsvarende virulens og vært genotype modtagelighed bør alle betragtes og ideelt testet i pilotundersøgelserne. Udsætte fluer til bakteriel kulturer af en vifte af optiske tætheder og måle deres infektiøse dosis og overlevelse er et passende udgangspunkt, når du arbejder med nye bakteriearter eller flyve linjer.

Protokollen skridt såsom flyve sult inden fodring og re suspendere bakteriel pellets i 5% rørsukkeropløsning er hverdagskost i oral infektion og øge pålideligheden af bakteriel infektion under eksponering7,8, 9 , 10. det er imidlertid vigtigt at bemærke, at under eksponeringen, fluer hovedsagelig live på en overflade af bakteriekulturen. Ved at gå på denne kultur, vil bakterier blive indgivet på den flue overflade, især på hårstrået eller omkring børster24. Disse epicuticular bakterier, afspejler ikke en vellykket enterisk infektion men ville stadig blive opdaget af flyve homogenisering og plating. For at mindske risikoen for falske positiver, er det vigtigt at overfladen sterilisere fluer gennem fordybelse i 70% ethanol i op til 1 minut.

Når man overvejer bakteriel shedding satser, er oral infektion afgørende. Antallet af patogener en vært udslip i miljøet er ofte vanskeligt at måle og den interne belastning er ofte taget som en proxy for sværhedsgraden af infektion og derfor transmission26,27. Måling bakteriemængde sammen med bakteriel udgydelse giver mulighed for en undersøgelse af forholdet mellem disse to vigtige komponenter i sygdom sværhedsgraden og opslag38. En begrænsning af metoden præsenteret er, at aflæst den interne bakteriemængde på fluer kræver destruktiv prøvetagning. Dette gør det vanskeligt at undersøge langsgående tendenser af patogenet vækst og clearance inden for samme individ. Det er dog muligt at overvinde denne begrænsning af destruktivt prøveudtagning kohorter af personer på forskellige stadier af infektion, under forudsætning af, at den gennemsnitlige mikrobe belastning i hver kohorte afspejler den langsgående patogen dynamik inden for et givet enkelte. Bakteriel udgydelse ikke lider af de samme begrænsninger, og vi giver eksempler på hvordan udgydelse kan kvantificeres i en tværsnitsstikprøven, eller på langs til at undersøge, hvordan udgydelse ændringer inden for individ over tid.

Mange vært og patogen træk afgøre i fællesskab en persons tilbøjelighed til at overføre sygdommen25,26,39. Mens betydningen af disse træk sandsynligvis varierer mellem vært-patogen systemer, er udgyde sandsynligvis en vigtig faktor for fækal-oral transmission. Evnen til at måle bakteriel udgydelse åbner mulighed for at teste denne antagelse. Har karakteriseret vært-patogen dynamics i en ønskede panel af flyve linjer, kunne eksperimentatorer mundtligt inficere individer og placere dem ved siden af ikke-inficerede, modtagelige værter i deres smitsomme perioder. Disse 'modtagende' fluer kunne derefter analyseres for interne bakteriemængde på forskellige tidspunkter som en måde at måle direkte transmission.

Acknowledgments

Dette arbejde blev støttet af en strategisk award fra Wellcome Trust for centret for immunitet, infektion og Evolution (http://ciie.bio.ed.ac.uk; grant reference nr. 095831). PFV blev støttet af en Branco Weiss fellowship (https://brancoweissfellowship.org/) og en kansler Fellowship (School of Biological Sciences, University of Edinburgh); JASJ blev støttet af en NERC E3 DTP PhD studentship.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Vials Sarstedt Ltd. 58.490 Polystyrene flat base tube 75mm x 23.5mm, 23ml
Agar Sigma-Aldrich A7002 Agar, ash 2.0-4.5%
Brown sugar Bidvest 66032 Light brown soft sugar
Maize Dove's Farm Organic maize flour
Fermipan yeast Bidvest 96360 Dry, instant yeast
Methyl-4-hydroxybenzoate Sigma-Aldrich H5501 >=99.0%, crystalline
Sucrose Sigma-Aldrich 84097 Sucrose BioUltra, for molecular biology, >=99.5% (HPLC)
Petri dishes Fisher Scientific UK Ltd. 15788517 X600 Petri Dish 90 X 16.2MM Sterile Triple Vent
Falcon tubes (50ml) Greiner Bio-one Inc 210261 Centrifuge tube, 50ml, skirted, bagged, sterile
Eppendorf tube (0.5ml) Sarstedt Ltd. 72.699 Sarstedt Micro Tube Conical Base Push Cap 0.5ml Standard Neutral
Eppendorf tube (1.5ml) Sarstedt Ltd. 72.690.001 Sarstedt Micro Tube Conical Base Push Cap 1.5ml Standard Neutral
Ethanol VWR International Ltd. 20821.33 ETHANOL ABSOLUTE ANALAR NP ACS/R.PE - Analytical Grade
2 L Conical Flask VWR International Ltd. 214-0038 Narrow neck, 2 L Erlenmeyer flask
Sterile filter paper Fisher Scientific UK Ltd. 1001-020 Plain circle and sheets; Particle Retention: greater than11um; Filtration speed: 150 herzberg; Air flow: 10.5s/100mL/in2; Medium porosity; Smooth surface; Grade 1; Type: circle; Dia: 20mm
Bijou sample container Fisher Scientific UK Ltd. 129A 7ml polystyrene sample container
Pseudomonas isolation agar Sigma-Aldrich 17208 Contains agar 13.6 g/L, magnesium chloride 1.4 g/L, peptic digest of animal tissue 20g/L, potassium sulfate 10g/L, triclosan 0.025g/L
LB broth, Miller Fisher Scientific UK Ltd. BP1426 Contains 10g tryptone, 5g yeast extract, 10g sodium chloride per litre
Large Embryo Collection Cages Scientific Laboratory Supplies Ltd. 59-101 Flystuff- fits 100mm petri dish
TRI reagent solution Life Technologies AM9738
96-well microplate Scientific Laboratory Supplies Ltd. 353072 Falcon 96 Well Clear Flat Bottom TC-Treated Polystyrene Cell Culture Microplate with Lid Sterile
Pestle Fisher Scientific UK Ltd 12649595 Pestle, Presterilized; Axygen; Tissue grinder; Blue; Inert polypropylene construction; Fits 1.5 and 2.0mL centrifuge tubes; Individually wrapped; 100/Pk
Glycerol Scientific Laboratory Supplies Ltd. CHE2068 Glycerol A.R. 99.5% 2.5 L
Cotton wool- non absorbent Cowens Ltd ABL Non Absorbent Large quantity 20 bags x 500
Cotton wool- absorbent Cowens Ltd ABS BP small quantity 20 bags x 500
Vortex Fisherbrand Whirlimixer 75W 50-6-Hz 220-240V
Orbital incubator Gallenkamp INR-200-010V 220 V, 50 Hz, 5 A. Nominal temperature: 70ºC. Shaking frequency: 0...400 rpm.
Absorbance Microplate Reader Biotek Instruments Ltd ELx808™ Absorbance Microplate Reader
Gen 5 Microplate Reader and Imager Software Biotek Instruments Ltd For Absorbance Microplate Reader
Centrifuge Beckman Coulter 392304 Allegra X-12R Benchtop Centrifuge, refridgerated 50Hz 230V
Step One Plus Real Time qPCR System Thermofisher Scientific 4376600 Applied biosystems Step One Plus real time qPCR system
Step One Software 2.3 Thermofisher Scientific For Stepone and SteponePlus real time qPCR systems
R Statistical Software https://cran.r-project.org/
10 µL pipette tips Greiner Bio-one Inc 741015 Easlyload gilson-style. Graduated, clear, refill, 960 pcs
200 µL pipette tips Greiner Bio-one Inc 741065 Easlyload gilson-style. Graduated, clear, refill, 960 pcs
1000 µL pipette tips Greiner Bio-one Inc 741045 Easlyload gilson-style. Graduated, clear, refill, 960 pcs
20 µL filtered pipette tips Greiner Bio-one Inc 774288 Filter tip gilson-style. Clear, rack blue, single packed, R/Dnase free, 10 racks of 96pcs
200 µL filtered pipette tips Greiner Bio-one Inc 739288 Filter tip gilson-style. Clear, rack blue, single packed, R/Dnase free, 10 racks of 96pcs
1000 µL filtered pipette tips Greiner Bio-one Inc 740288 Filter tip gilson-style. Clear, rack blue, single packed, R/Dnase free, 10 racks of 60pcs

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Hoffmann, J. A. The immune response of Drosophila. Nature. 426, (6962), 33-38 (2003).
  2. Buchon, N., Silverman, N., Cherry, S. Immunity in Drosophila melanogaster - from microbial recognition to whole-organism physiology. Nat Rev Immunol. 14, (12), 796-810 (2014).
  3. Bergman, P., Seyedoleslami Esfahani, S., Engström, Y. Drosophila as a Model for Human Diseases-Focus on Innate Immunity in Barrier Epithelia. Curr Top Dev Biol. 121, 29-81 (2017).
  4. Apidianakis, Y., Rahme, L. G. Drosophila melanogaster as a model host for studying Pseudomonas aeruginosa infection. Nat Protoc. 4, (9), 1285-1294 (2009).
  5. Khalil, S., Jacobson, E., Chambers, M. C., Lazzaro, B. P. Systemic Bacterial Infection and Immune Defense Phenotypes in Drosophila Melanogaster. JoVE J Vis Exp. (99), e52613-e52613 (2015).
  6. Neyen, C., Bretscher, A. J., Binggeli, O., Lemaitre, B. Methods to study Drosophila immunity. Methods San Diego Calif. 68, (1), 116-128 (2014).
  7. Nehme, N. T., et al. A Model of Bacterial Intestinal Infections in Drosophila melanogaster. PLOS Pathog. 3, (11), e173 (2007).
  8. Bou Sleiman, M. S., Osman, D., Massouras, A., Hoffmann, A. A., Lemaitre, B., Deplancke, B. Genetic, molecular and physiological basis of variation in Drosophila gut immunocompetence. Nat Commun. 6, 7829 (2015).
  9. Buchon, N., Broderick, N. A., Lemaitre, B. Gut homeostasis in a microbial world: insights from Drosophila melanogaster. Nat Rev Microbiol. 11, (9), 615-626 (2013).
  10. Kuraishi, T., Hori, A., Kurata, S. Host-microbe interactions in the gut of Drosophila melanogaster. Front Physiol. 4, (2013).
  11. Ha, E. -M., Oh, C. -T., Bae, Y. S., Lee, W. -J. A Direct Role for Dual Oxidase in Drosophila Gut Immunity. Science. 310, (5749), 847-850 (2005).
  12. Limmer, S., et al. Pseudomonas aeruginosa RhlR is required to neutralize the cellular immune response in a Drosophila melanogaster oral infection model. Proc Natl Acad Sci U S A. 108, (42), 17378-17383 (2011).
  13. Apidianakis, Y., Pitsouli, C., Perrimon, N., Rahme, L. Synergy between bacterial infection and genetic predisposition in intestinal dysplasia. Proc Natl Acad Sci U S A. 106, (49), 20883-20888 (2009).
  14. Vodovar, N., et al. Drosophila host defense after oral infection by an entomopathogenic Pseudomonas species. Proc Natl Acad Sci U S A. 102, (32), 11414-11419 (2005).
  15. Chugani, S. A., Whiteley, M., Lee, K. M., D'Argenio, D., Manoil, C., Greenberg, E. P. QscR, a modulator of quorum-sensing signal synthesis and virulence in Pseudomonas aeruginosa. Proc Natl Acad Sci. 98, (5), 2752-2757 (2001).
  16. Gupta, V., Vasanthakrishnan, R. B., Siva-Jothy, J., Monteith, K. M., Brown, S. P., Vale, P. F. The route of infection determines Wolbachia antibacterial protection in Drosophila. Proc R Soc B. 284, (1856), 20170809 (2017).
  17. Martins, N. E., Faria, V. G., Teixeira, L., Magalhães, S., Sucena, É Host Adaptation Is Contingent upon the Infection Route Taken by Pathogens. PLoS Pathog. 9, (9), (2013).
  18. Chambers, M. C., Jacobson, E., Khalil, S., Lazzaro, B. P. Thorax Injury Lowers Resistance to Infection in Drosophila melanogaster. Infect Immun. 82, (10), 4380-4389 (2014).
  19. Gupta, V., Stewart, C., Rund, S. S., Monteith, K., Vale, P. F. Costs and benefits of sublethal Drosophila C virus infection. J Evol Biol. (2017).
  20. Ferreira, ÁG., Naylor, H., Esteves, S. S., Pais, I. S., Martins, N. E., Teixeira, L. The Toll-Dorsal Pathway Is Required for Resistance to Viral Oral Infection in Drosophila. PLoS Pathog. 10, (12), (2014).
  21. Buchon, N., Broderick, N. A., Poidevin, M., Pradervand, S., Lemaitre, B. Drosophila Intestinal Response to Bacterial Infection: Activation of Host Defense and Stem Cell Proliferation. Cell Host Microbe. 5, (2), 200-211 (2009).
  22. Wayland, M. T., et al. Spotting the differences: Probing host/microbiota interactions with a dedicated software tool for the analysis of faecal outputs in Drosophila. J Insect Physiol. 69, 126-135 (2014).
  23. Hori, A., Kurata, S., Kuraishi, T. Unexpected role of the IMD pathway in Drosophila gut defense against Staphylococcus aureus. Biochem Biophys Res Commun. 495, (1), 395-400 (2018).
  24. Ren, C., Webster, P., Finkel, S. E., Tower, J. Increased Internal and External Bacterial Load during Drosophila Aging without Life-Span Trade-Off. Cell Metab. 6, (2), 144-152 (2007).
  25. Ezenwa, V. O., et al. Host behaviour-parasite feedback: an essential link between animal behaviour and disease ecology. Proc R Soc B. 283, (1828), 20153078 (2016).
  26. McCallum, H., et al. Breaking beta: deconstructing the parasite transmission function. Phil Trans R Soc B. 372, (1719), 20160084 (2017).
  27. Vale, P. F., Choisy, M., Little, T. J. Host nutrition alters the variance in parasite transmission potential. Biol Lett. 9, (2), 20121145 (2013).
  28. Mulcahy, H., Sibley, C. D., Surette, M. G., Lewenza, S. Drosophila melanogaster as an Animal Model for the Study of Pseudomonas aeruginosa Biofilm Infections In Vivo. PLoS Pathog. 7, (10), e1002299 (2011).
  29. Kuraishi, T., Binggeli, O., Opota, O., Buchon, N., Lemaitre, B. Genetic evidence for a protective role of the peritrophic matrix against intestinal bacterial infection in Drosophila melanogaster. Proc Natl Acad Sci. 108, (38), 15966-15971 (2011).
  30. Myllymäki, H., Valanne, S., Rämet, M. The Drosophila Imd Signaling Pathway. J Immunol. 192, (8), 3455-3462 (2014).
  31. Lewis, E. A new standard food medium. Cold Spring Harb Protoc. 2014, (9), pdb.rec081414 (2014).
  32. Bolker, B. M., et al. Generalized linear mixed models: a practical guide for ecology and evolution. Trends Ecol Evol. 24, (3), 127-135 (2009).
  33. R Core Team. R: A Language and Environment for Statistical Computing. R Foundation for Statistical Computing. Vienna, Austria. (2015).
  34. Schmittgen, T. D., Livak, K. J. Analyzing real-time PCR data by the comparative CT method. Nat Protoc. 3, (6), 1101-1108 (2008).
  35. Kalbfleisch, J. D., Prentice, R. L. The Statistical Analysis of Failure Time Data. 2nd Edition, Wiley-Blackwell. Hoboken, N.J. (2002).
  36. Nuhanen, B. Drosophila melanogaster, drawing.SVG. Available from: https://commons.wikimedia.org/wiki/File:Drosophila-drawing.svg (2007).
  37. Accountalive. Example of a survival curve estimated by Kaplan-Meier method including 95% confidence limits. Available from: https://commons.wikimedia.org/wiki/File:Kaplan-Meier-sample-plot.svg (2011).
  38. Susi, H., Vale, P. F., Laine, A. -L. Host Genotype and Coinfection Modify the Relationship of within and between Host Transmission. Am Nat. 186, (2), 252-263 (2015).
  39. Fellous, S., Duncan, A. B., Quillery, E., Vale, P. F., Kaltz, O. Genetic influence on disease spread following arrival of infected carriers. Ecol Lett. 15, (3), 186-192 (2012).
Mundtlige bakterieinfektion og kaste i <em>Drosophila melanogaster</em>
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Siva-Jothy, J. A., Prakash, A., Vasanthakrishnan, R. B., Monteith, K. M., Vale, P. F. Oral Bacterial Infection and Shedding in Drosophila melanogaster. J. Vis. Exp. (135), e57676, doi:10.3791/57676 (2018).More

Siva-Jothy, J. A., Prakash, A., Vasanthakrishnan, R. B., Monteith, K. M., Vale, P. F. Oral Bacterial Infection and Shedding in Drosophila melanogaster. J. Vis. Exp. (135), e57676, doi:10.3791/57676 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
simple hit counter