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Biology

ओरल बैक्टीरियल इंफेक्शन और छप्पर में Drosophila melanogaster

doi: 10.3791/57676 Published: May 31, 2018

Summary

इस प्रोटोकॉल को मौखिक रूप से बेनकाब और बैक्टीरिया रोगजनकों के साथ फल फ्लाई Drosophila melanogasteआर संक्रमित करने के लिए तरीकों का वर्णन है, और संक्रामक बैक्टीरिया की संख्या को मापने के लिए पेट संक्रमण के बाद बहाया. हम आगे मक्खी पर प्रतिरक्षा म्यूटेंट के प्रभाव का वर्णन मौखिक जीवाणु संक्रमण के बाद अस्तित्व ।

Abstract

फल मक्खी Drosophila melanogaster संक्रमण और जन्मजात उन्मुक्ति का सबसे अच्छा विकसित मॉडल प्रणालियों में से एक है । जबकि अधिकांश काम प्रणालीगत संक्रमण पर ध्यान केंद्रित किया है, वहां आंत immunocompetence के तंत्र में ब्याज की हाल ही में वृद्धि हुई है रोगजनकों, जो मौखिक रूप से संक्रमित मक्खियों के लिए तरीकों की आवश्यकता है । यहां हम मौखिक रूप से एक अवसरवादी जीवाणु रोगज़नक़ (Pseudomonas aeruginosa) और डी. melanogaster (Pseudomonas entomophila) के एक प्राकृतिक जीवाणु रोगज़नक़ के लिए व्यक्तिगत मक्खियों बेनकाब करने के लिए एक प्रोटोकॉल पेश करते हैं । इस प्रोटोकॉल का लक्ष्य इन रोगजनकों के लिए पुरुष और मादा मक्खियों को बेनकाब करने के लिए एक मजबूत तरीका प्रदान करना है । हम प्रतिनिधि अस्तित्व phenotypes, सूक्ष्म जीव लोड दिखा परिणाम प्रदान करते हैं, और जीवाणु बहा, जो रोगज़नक़ संचरण में विविधता के अध्ययन के लिए प्रासंगिक है । अंत में, हम पुष्टि करते है कि Dcy म्यूटेंट (आंत उपकला में सुरक्षात्मक peritrophic मैट्रिक्स की कमी) और म्यूटेंट स्वाद (एक कार्यात्मक प्रतिरक्षा की कमी (आईएमडी) मार्ग की कमी), जीवाणु मौखिक संक्रमण के लिए वृद्धि की संवेदनशीलता दिखा. इस प्रोटोकॉल, इसलिए, संक्रमण के मौखिक मार्ग का उपयोग कर मक्खियों को संक्रमित करने के लिए एक मजबूत तरीका का वर्णन करता है, जो आंत संक्रमण परिणामों और जीवाणु संचरण में भिन्नता के एक किस्म आनुवंशिक और पर्यावरणीय स्रोतों के अध्ययन के लिए बढ़ाया जा सकता है.

Introduction

फल मक्खी (भी सिरका मक्खी के रूप में जाना जाता है), डी melanogaster, बड़े पैमाने पर रोगजनकों की एक किस्म के खिलाफ संक्रमण और प्रतिरक्षा के लिए एक मॉडल जीव के रूप में इस्तेमाल किया गया है1,2. इस काम के संक्रमण के शारीरिक परिणामों में मौलिक अंतर्दृष्टि की पेशकश की है और भी परजीवी, बैक्टीरियल, कवक, और वायरल संक्रमण के खिलाफ मेजबान प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया अंतर्निहित आणविक रास्ते जानने में अग्रणी था । यह ज्ञान केवल कीड़ों और अन्य अकशेरूकीय के सहज प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया को समझने के लिए उपयोगी नहीं है, लेकिन क्योंकि प्रतिरक्षा तंत्र के कई कीड़े और स्तनधारियों के बीच संरक्षित evolutionarily हैं, Drosophila भी खोज प्रेरित है स्तनधारियों में प्रमुख प्रतिरक्षा तंत्र की, मनुष्यों सहित3

Drosophila संक्रमण और उन्मुक्ति पर अधिकांश काम प्रणालीगत संक्रमण पर ध्यान केंद्रित किया है, टीका तरीकों का उपयोग करते हुए कि रोगजनकों के शरीर में सीधे चुभन या इंजेक्शन4,5,6द्वारा उद्धार । एक नियंत्रित संक्रामक खुराक के वितरण की अनुमति में इन तरीकों का लाभ स्पष्ट है और प्रणालीगत संक्रमण पर काम का एक बड़ा शरीर द्वारा समर्थित है । हालांकि, कई स्वाभाविक रूप से होने वाली बैक्टीरियल रोगज़नक़ों D. melanogaster के माध्यम से अधिग्रहीत कर रहे हैं पर खिला कार्बनिक बात है जहां आंत immunocompetence मेजबान रक्षा7में एक महत्वपूर्ण भूमिका निभाता है,8, 9 , 10 , 11 , 12 , 13 , 14 , 15. प्रयोगों है कि प्रणालीगत संक्रमण को रोजगार इन गढ़ बाईपास, और इसलिए, कैसे कीड़ों प्राकृतिक रोगजनकों के खिलाफ सुरक्षा माउंट के एक पूरी तरह अलग तस्वीर प्रदान करते हैं । यह विशेष रूप से प्रासंगिक है अगर काम का उद्देश्य पारिस्थितिकी और संक्रमण के विकास, जहां प्राकृतिक रोगजनकों और संक्रमण के मार्गों के उपयोग के बारे में भविष्यवाणी का परीक्षण करने के लिए महत्वपूर्ण है16,17। हाल ही में काम पर प्रकाश डाला गया है कैसे रोगजनकों द्वारा उठाए गए मार्ग काफी प्रभावित करता है रोग के परिणाम18,19, विशिष्ट प्रतिरक्षा रास्ते20,21, के सुरक्षात्मक प्रभाव निर्धारित कर सकते हैं । विरासत endosymbionts16, और भी मेजबान सुरक्षा17के विकास में एक महत्वपूर्ण भूमिका निभा सकता है ।

संक्रमण के मौखिक मार्गों को रोजगार के लिए एक और कारण यह है कि यह रोगज़नक़ संचरण में भिन्नता की जांच मौखिक संक्रमण के बाद मल उत्सर्जन के दौरान जीवाणु बहा को मापने के द्वारा की अनुमति देता है22,23, 24. रोग संचरण में मेजबान विविधता के सूत्रों को समझना प्राकृतिक आबादी25,26में चुनौतीपूर्ण है, लेकिन संचरण के घटकों को मापने, जैसे रोगज़नक़ बहा, नियंत्रित प्रयोगशाला के अंतर्गत शर्तों के एक उपयोगी वैकल्पिक दृष्टिकोण27प्रदान करता है । खिला मक्खियों बैक्टीरिया और मापने बैक्टीरियल और पर्यावरण संदर्भों की एक किस्म के तहत नियंत्रित प्रयोगात्मक स्थितियों में जीवाणु बहा द्वारा, यह मेजबान के बीच संचरण में भिंनता के स्रोतों की पहचान संभव है ।

यहां, हम एक प्रोटोकॉल का वर्णन मौखिक रूप से जीवाणु रोगजनकों के साथ D. melanogaster संक्रमण के लिए, और जीवाणु विकास और छप्पर कि इस प्रकार (चित्रा 1) को बढ़ाता है । हम दो Pseudomonas बैक्टीरिया पर इस प्रोटोकॉल का वर्णन: अवसरवादी रोगज़नक़ पी aeruginosa (PA14) के एक विषमय तनाव, और प्राकृतिक मक्खी रोगज़नक़ पी. विषमयके एक कम entomophila तनाव । Pseudomonads आम ग्राम हैं-एक व्यापक मेजबान रेंज के साथ नकारात्मक जीवाणु, कीड़े, सूत्रकृमि, पौधों, और रीढ़ को संक्रमित, और सबसे वातावरण में पाए जाते हैं4,6. p aeruginosa और p. entomophila द्वारा Drosophila का प्रवेशन संक्रमण आंतों epithelia12,13,14,15, 28. जब तक हम इन दो जीवाणु रोगजनकों पर ध्यान केंद्रित, तरीकों यहां वर्णित सिद्धांत में मामूली संशोधनों के साथ ब्याज की किसी भी जीवाणु रोगज़नक़ के लिए लागू किया जा सकता है । मौखिक जोखिम के बाद, हम उपाय के बाद संक्रमण अस्तित्व, और व्यक्तिगत मक्खियों और व्यवहार्य रोगाणुओं के भीतर सूक्ष्म जीव लोड उपाय पर्यावरण में बहाया, कॉलोनी बनाने इकाइयों (CFUs) में व्यक्त की । अंत में, क्योंकि उपकला बाधा और विनोदी प्रतिक्रियाओं का एक संयोजन से आंत immunocompetence परिणाम, हम भी मक्खी लाइनों जहां इन गढ़ बाधित कर रहे हैं के अस्तित्व को मापने. विशेष रूप से, Drosocrystallin (Dcy) म्यूटेंट पहले से अधिक मौखिक जीवाणु संक्रमण के लिए अतिसंवेदनशील29आंत में एक घट peritrophic मैट्रिक्स के कारण दिखाया गया है । हम यह भी एक स्वाद (रिलायंस एनर्जी) उत्परिवर्ती जो ग्राम के खिलाफ रोगाणुरोधी पेप्टाइड्स उत्पादन से बाधित है में अस्तित्व उपाय-आईएमडी मार्ग के माध्यम से नकारात्मक बैक्टीरिया30

Protocol

1. मक्खियों को बनाए रखें

  1. बनाए रखने के 23 मिलीलीटर प्लास्टिक शीशियों में हौसले से बनाया लुईस मध्यम के 7 मिलीलीटर युक्त (संदर्भ से संशोधित31; 1 एल ट्रिपल आसुत एच2ओ, ६.१ ग्राम आगर, ९३.६ ग्राम ब्राउन शुगर, ६८ ग्राम मक्का, १८.७ ग्राम तत्काल खमीर, 15 मिलीलीटर Tegosept विरोधी कवक एजेंट) में मशीन में 25 ± 1 ° c, एक 12 h:12 एच प्रकाश में: डार्क साइकिल ~ ६०% आर्द्रता के साथ । गैर शोषक कपास ऊन के साथ शीशियों प्लग ।
  2. हर 14 दिनों के बाद, एक नया भोजन की शीशी के लिए 20-30 वयस्कों के हस्तांतरण, तुरंत, शुष्क खमीर के साथ सतह में जोड़ा, 2 के लिए-3 दिनों के लिए अंडे की अनुमति के लिए हो बिछाने । इस समय अवधि के बाद, सुनिश्चित करें कि भोजन की सतह पर अंडे दिखाई दे रहे हैं । वयस्क मक्खियों को हटा दें ।
    नोट: यह शीशियों में एक पीढ़ी, उंर मिलान आबादी के रूप में मक्खियों रहता है ।
  3. अंडे को विकास के लिए छोड़ दें ।
    नोट: 25 डिग्री सेल्सियस पर, वयस्क मक्खियों को दिन 11 पर प्यूपा से eclose करने के लिए शुरू और दिन पर जारी 12 – 14 ।

2. प्रयोगात्मक मक्खियों तैयार

  1. एक ७५ मिलीलीटर सेब-आगर प्लेट पर एक जनसंख्या/भ्रूण संग्रह पिंजरे में जनक पीढ़ी के अंडे इकट्ठा (1 एल ट्रिपल आसुत एच2ओ, 30 ग्राम आगर, ३३ ग्राम सुक्रोज, ३३० मिलीलीटर सेब का रस, 7 मिलीलीटर Tegosept विरोधी कवक एजेंट) एक खमीर पेस्ट प्रसार के साथ (मिश्रण सूखी खमीर के साथ एक मूंगफली का मक्खन की तरह स्थिरता के लिए पानी) । पानी से लथपथ सूती ऊन को पिंजरे में डालकर नमी प्रदान करें ।
    नोट: लार्वा पालन घनत्व में मतभेद की वजह से पाया प्रभाव से बचने के लिए, यह महत्वपूर्ण है कि विभिन्न शीशियों में प्रयोगात्मक मक्खियों इसी तरह घनत्व में पीछे हैं. इसके बाद के संस्करण कदम से बचने के लिए प्रदर्शन किया है प्रभाव ।
  2. एक 12 h:12 एच प्रकाश में 25 डिग्री सेल्सियस पर 24 घंटे के लिए मशीन: अंडे बिछाने तक डार्क साइकिल हुई है । यदि 24 घंटे के बाद भी कुछ अंडे हैं, तो अब आदी होना अवधि प्रदान करें । सेब की जगह-आगर प्लेटें और अंडे बिछाने की अनुमति के लिए एक और 24 घंटे के लिए होते हैं ।
  3. आबादी के पिंजरे से अंडा लदी सेब-आगर प्लेट लें । शेष खमीर पेस्ट और आगर की सतह से किसी भी मृत मक्खियों निकालें ।
  4. 1x फॉस्फेट के 20 मिलीलीटर-खारा (पंजाब) में आगर जलमग्न और धीरे से अंडे एक ठीक तूलिका के साथ सेब-आगर उखाड़ फेंकना । जबकि पंजाब में निलंबित, एक ५० मिलीलीटर केंद्रापसारक ट्यूब के लिए अंडे हस्तांतरण और 5 मिनट के लिए छोड़ दो तो अंडे नीचे करने के लिए सिंक ।
    नोट: अधिकांश अंडे आगर के बाहरी छोर पर पाए जाते हैं ।
  5. एक p1000 फ़िल्टर पिपेट टिप के नीचे 4 मिमी काटने से निकालें और पिपेट टिप का उपयोग करने के समाधान के 1 मिलीलीटर आकर्षित, ५० मिलीलीटर केंद्रापसारक ट्यूब के नीचे से लिया । यह एक १.५ मिलीलीटर microcentrifuge ट्यूब करने के लिए स्थानांतरण और यह बसने के लिए अनुमति देते हैं ।
    नोट: जब अंडे pipetting, स्नैप-गोताख़ोर जारी एक सौंय रिलीज से अधिक कुशल है ।
  6. एक p20 फ़िल्टर्ड पिपेट टिप के नीचे 4 मिमी काटने से निकालें । एक वांछित मात्रा में पिपेट सेट और microcentrifuge ट्यूब के नीचे से आकर्षित ।
    नोट: अभ्यास के साथ, 5 µ l की मात्रा लगभग १०० अंडे होते हैं ।
  7. भोजन पर एकत्र अंडे बांटना और उन्हें समय की आवश्यकता राशि के लिए विकसित करने के लिए छोड़ दें ।

3. बैक्टीरियल कल्चर

  1. पी. entomophila और पी. aeruginosa संस्कृतियों, inoculate के 10 मिलीलीटर Luria-Bertani (पौंड) शोरबा 30 डिग्री सेल्सियस (पी. µ) और ३७ डिग्री सेल्सियस (पी. entomophila), क्रमशः में एक जमे हुए जीवाणु शेयर के १०० aeruginosa एल के साथ विकसित करने के लिए । १५० rpm पर रात भर शेक । सुनिश्चित करें कि बैक्टीरियल संस्कृति संतृप्ति चरण तक पहुंचता है ।
  2. inoculating मक्खियों के लिए इस्तेमाल बैक्टीरिया को सुनिश्चित करने के लिए घातीय चरण में है और तेजी से नकल, एक नया उपसंस्कृति में रातोंरात संस्कृति inoculate, एक वांछित मात्रा के, निंनलिखित सुबह । यह सुनिश्चित करें कि प्री-इनोक्युलम उपसंस्कृति संस्कृति की कुल मात्रा का 10% है ।
    नोट: मौखिक संक्रमण उच्च की आवश्यकता है । यह इसलिए है कि पर्याप्त टीका संस्कृति वांछित खुराक और प्रयोगात्मक आकार के लिए उत्पादन किया जा सकता है बैक्टीरियल संस्कृति का एक पर्याप्त मात्रा में विकसित करने के लिए आवश्यक है । गणना कितना उपसंस्कृति के लिए आवश्यक संक्रामक खुराक का उत्पादन की जरूरत है समीकरण एमएसवीएस = एममैंवीमैं, जहां M का प्रतिनिधित्व करता है एक संस्कृति ऑप्टिकल घनत्व ६०० एनएम में मापा (आयुध डिपो६००) मान और V का प्रतिनिधित्व करता है अपनी वॉल्यूम. उपलिपि पत्र कि संस्कृति एक उपसंस्कृति (ओं) या एक संक्रामक खुराक (आई) के रूप में प्रयोग किया जाता है के लिए देखें ।
  3. इस उपसंस्कृति को एक 2 एल शंकु कुप्पी में एक मात्रा में इस तरह बढ़ाएँ कि उपसंस्कृति की सतह गिर जाए (सबसे अधिक) बस कुप्पी की ढलान की शुरुआत के ऊपर । इस निशान के ऊपर मत भरें के रूप में यह बैक्टीरिया के विकास स्टंट होगा ।
  4. सुनिश्चित करें कि इस उपसंस्कृति में बैक्टीरिया हर 30 मिनट में आयुध डिपो को मापने से घातीय वृद्धि के चरण में हैं ।
    नोट: यह 3 – 5 घंटे के बाद होता है, जहां उपसंस्कृति 0.6 – 0.8 के बीच एक आयुध डिपो६०० तक पहुंच जाती है ।
  5. ५० मिलीलीटर केंद्रापसारक ट्यूबों भर में इस उपसंस्कृति के बराबर मात्रा डालो और 15 मिनट के लिए २,५०० एक्स जी में उपसंस्कृति स्पिन 4 डिग्री सेल्सियस पर जीवाणु गोली । एक बार गोली निकाल, और फिर ऊपर की शर्तों पर फिर से supernatant स्पिन बैक्टीरिया के विशाल बहुमत को हटाने की पुष्टि करने के लिए ।
    नोट: नगण्य आकार की एक गोली (ऊंचाई में 1 मिमी से छोटे) यह पुष्टि करता है ।
  6. फिर से अलग ट्यूबों के जीवाणु छर्रों गठबंधन उन्हें उपसंस्कृति supernatant के 5 मिलीलीटर में सस्पैंड और एक एकल ५० मिलीलीटर ट्यूब में इन समाधानों को पुन: संयोजित. 15 मिनट के लिए २,५०० x g पर इस केंद्रित संस्कृति 4 डिग्री सेल्सियस पर स्पिन करने के लिए जीवाणु गोली ।
  7. supernatant निकालें और 5% सुक्रोज पानी समाधान में अंतिम बैक्टीरिया गोली पुनः निलंबित । आयुध डिपो की जांच करें और वांछित संक्रामक खुराक (आयुध डिपो६०० = १०० पी के लिए समायोजित करने के लिए । entomophila8 और आयुध डिपो६०० = P. aeruginosa16,28) के लिए 25, 5% में फिर से छर्रों सस्पैंड द्वारा सुक्रोज आवश्यक मात्रा में पानी का समाधान ।
    नोट: जोड़ा जा करने के लिए 5% सुक्रोज जल समाधान की राशि कदम 3.2.1 में समीकरण (एमएसवीएस = एमआईवीमैं) का उपयोग कर गणना की जा सकती है ।

4. मौखिक रूप से संक्रमित मक्खियों

  1. मौखिक संक्रमण सुनिश्चित करने के लिए, मानक आगर शीशियों (1 एल ट्रिपल आसुत एच2ओ, 20 ग्राम आगर, ८४ ग्राम ब्राउन शुगर, 7 एमएल Tegosept विरोधी कवक एजेंट) को मक्खियों स्थानांतरित द्वारा बैक्टीरिया के लिए जोखिम से पहले 2-4 ज के लिए मक्खियों को भूखा ।
  2. मक्खियों भूखे जा रहे हैं, जबकि संक्रमण शीशियों तैयार करते हैं । एक 7 मिलीलीटर नमूना ट्यूब के ढक्कन में मानक चीनी आगर के pipetting ५०० µ एल द्वारा एक Pseudomonas संक्रमण शीशी बनाओ और यह शुष्क करने के लिए छोड़ दें । ढक्कन में फिल्टर पेपर की एक डिस्क प्लेस और बैक्टीरियल संस्कृति के पिपेट १०० µ एल सीधे फिल्टर डिस्क पर । नियंत्रण संक्रमण के लिए, एक ही मात्रा के साथ बैक्टीरियल संस्कृति की जगह 5% सुक्रोज पानी समाधान फिल्टर कागज पर.
  3. नमूना ट्यूब के लिए एक मक्खियों जोड़ें और 18 के लिए छोड़-24 एच ।
  4. मौखिक संक्रमण की पुष्टि करने के लिए, पहली सतह-जीवाणु जोखिम के तुरंत बाद मक्खियों निष्फल, उंहें १०० µ एल में 20 के लिए ७०% इथेनॉल के रखने से-30 एस । इथेनॉल निकालें और 20 के लिए ट्रिपल आसुत जल के १०० µ एल जोड़ें-पानी निकालने से पहले 30 एस । 1x पंजाबस के १०० µ एल जोड़ें और मक्खी homogenize ।
  5. एक ९६-अच्छी तरह से प्लेट की शीर्ष पंक्ति में homogenate स्थानांतरण और हर अच्छी तरह से नीचे करने के लिए 1x पंजाबियों के ९० µ एल जोड़ें ।
  6. प्रश्नपत्र को CFU मानों की श्रेणी में अंतर करने के लिए इस नमूने को पतला करें । ऊपर से अच्छी तरह से homogenate के 10 µ एल ले और अच्छी तरह से नीचे करने के लिए इस जोड़ें । दोहराएं इस कदम के साथ दूसरी अच्छी तरह से, 10 µ एल स्थानांतरित तीसरी अच्छी तरह से, और इतने पर, के लिए के रूप में कई धारावाहिक कमजोर पड़ने के रूप में की आवश्यकता है ।
    नोट: यह महत्वपूर्ण है कि नए पिपेट युक्तियों के कमजोर पड़ने के प्रत्येक सेट के लिए उपयोग किया जाता है ।
  7. प्लेट एक पौंड पोषक तत्व आगर प्लेट पर 5 µ एल बूंदों में धारावाहिक कमजोर पड़ने, सभी बूंदों असतत रहना सुनिश्चित करने के लिए ।
  8. पौंड आगर 30 डिग्री सेल्सियस और ३७ डिग्री सेल्सियस पर रातोंरात पी. entomophila और पी aeruginosa, क्रमशः और गिनती दिखाई CFUs के लिए प्लेटें ।
    नोट: Drosophila आंत रोगाणुओं अलग anaerobic वृद्धि की स्थिति की आवश्यकता होती है, जबकि चुनिंदा माध्यम, उदाहरण के लिए Pseudomonas आइसोलेशन माध्यम (PIM), यकीन है कि केवल Pseudomonas CFUs गिना रहे हैं बनाने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है.
  9. सीरियल कमजोर पड़ने पर वर्तमान में मौजूद कालोनियों की संख्या की गणना करके प्रति फ्लाई CFUs की संख्या का परिकलन करें जहाँ १०-६० CFUs स्पष्ट रूप से दिखाई दे रहे हैं. तो मक्खी प्रति बैक्टीरिया की संख्या की गणना करने के लिए वर्तमान कमजोर पड़ने फैक्टर से गुणा ।
  10. सांख्यिकीय विश्लेषण करें । जहां आवश्यक हो, एक सामांय वितरण के लिए मक्खी प्रति CFUs बदलना । इस लॉग-रूपांतरण के द्वारा । एक बार बदल गया, सामान्यीकृत रैखिक मॉडल (GLMs) का उपयोग करें30,31,३२ परीक्षण के लिए कैसे उपचार समूहों (जैसे आर३३के रूप में आमतौर पर उपलब्ध सांख्यिकीय सॉफ्टवेयर संकुल का उपयोग कर) मक्खी प्रति CFUs में अलग ।
    नोट: शेष मक्खी homogenate मात्रात्मक रिवर्स प्रतिलेखन पीसीआर (आरटी-qPCR) विश्लेषण के माध्यम से जीन अभिव्यक्ति को मापने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है । homogenate को ठीक ५० µ में आरएनए अलगाव रिएजेंट के एल, निकालने आरएनए, और आरटी द्वारा विशिष्ट प्रतिरक्षा जीन titers यों-qPCR (देखें जैसे, गुप्ता और16 एक विस्तृत प्रोटोकॉल के लिए घाटी). विशिष्ट प्रतिरक्षा जीन टेप की अभिव्यक्ति एक गृह व्यवस्था जीन की प्रतिलिपि स्तर को सामान्यीकृत किया जाना चाहिए (यानी, rp49) और एक गुना नियंत्रण के सापेक्ष परिवर्तन के रूप में व्यक्त 2− ΔΔCt विधि31का उपयोग कर मक्खियों, ३२,३३,३४.

5. रिकॉर्डिंग उत्तरजीवी संक्रमण निम्नलिखित

  1. ४.२ चरण में वर्णित के रूप में संक्रमित मक्खी मौखिक रूप से ।
  2. स्थानांतरण संक्रमित या नियंत्रण मानक लुईस शीशियों में उनके संबंधित संक्रमण शीशियों से मक्खियों और एक मशीन में 25 डिग्री सेल्सियस में एक 12 h:12 एच प्रकाश अंधेरे चक्र में रखने के लिए (या वांछित शर्तों). मक्खियों रखें जब तक वे मर चुके हैं ।
  3. प्रत्येक शीशी में जीवित या मृत मक्खियों की संख्या हर दिन, या के रूप में अक्सर की आवश्यकता के रूप में गिनती ।
  4. खाने में फंस रही मक्खियों से बचने के लिए हर 5 दिन में मक्खियों को नई शीशियों में ट्रांसफर करें ।
  5. कापलान के रूप में इन आंकड़ों वर्तमान-Meier (किमी) अस्तित्व घटता है या ± एसई आनुपातिक अस्तित्व के भूखंडों मतलब है । के लिए कई कारकों और/या उनके संबंधित बातचीत के प्रभाव का विश्लेषण एक दूसरे के साथ एक सांख्यिकीय पैकेज का उपयोग करें (उदाहरण के लिए, पैकेज "आर३३में अस्तित्व") ऐसे कॉक्स आनुपातिक खतरों मॉडल के रूप में एक अस्तित्व विश्लेषण चलाने के लिए३५

6. मापने बैक्टीरियल लोड

  1. वांछित समय बिंदु पर, एक बाँझ १.५ मिलीलीटर microcentrifuge ट्यूब करने के लिए एक संक्रमित मक्खी हस्तांतरण ।
  2. सतह ४.४ चरण में वर्णित के रूप में मक्खियों निष्फल ।
  3. Homogenize मक्खी और जीवाणु लोड मात्रा 4.5-4.10 चरणों में वर्णित प्रोटोकॉल का उपयोग कर ।

7. उपाय बैक्टीरियल छप्पर

  1. आंतरिक भार के साथ बहा उपाय ।
  2. संक्रमण के बाद, स्थानांतरण एकल मक्खियों के लिए १.५ मिलीलीटर microcentrifuge ट्यूब से युक्त ~ ५० µ के लिए लुईस मध्यम के एल 24 एच ।
  3. आंतरिक लोड माप के लिए मक्खियों निकालें (6 कदम देखें) और 3 एस के लिए भारी भंवर से 1x पंजाबियों के १०० µ एल के साथ ट्यूबों धो लो ।
  4. इस धोने में CFUs को मापने के रूप में एक ही प्रोटोकॉल का उपयोग कर £ पोषक आगर पर चढ़ाना चरणों में वर्णित 4.6 – 4.8 ।
  5. संक्रमण के बाद, स्थानांतरण एकल मक्खियों के लिए १.५ मिलीलीटर microcentrifuge ट्यूब से युक्त ~ ५० µ के लिए लुईस मध्यम के एल 24 एच ।
  6. स्थानांतरित करने के लिए नई microcentrifuge ट्यूबों से युक्त ~ ५० µ एल लुईस मध्यम के लिए एक और 24 घंटे के लिए भारी भंवर द्वारा १०० 1x के µ एल के साथ दूषित ट्यूबों धो 3 एस ।
  7. इस धोने में CFUs पर चढ़ाना द्वारा पौंड पोषक तत्व आगर चरणों में वर्णित एक ही प्रोटोकॉल का उपयोग करके मापने 4.6 – 4.8.
  8. दोहराएँ चरण ७.२ और ७.३ और हर स्थानांतरण पर रिकॉर्ड मक्खी मृत्यु दर.

Representative Results

यहां, हम प्रयोगों से उदाहरणात्मक परिणाम प्रस्तुत करते हैं जहां D. melanogaster p. aeruginosa या p. entomophilaसे मौखिक रूप से संक्रमित था । चित्रा 2 ६०० = 25 और १०० p. aeruginosa (चित्रा 2a) और पी. entomophila के लिए एक 12 एच या 24 के जीवाणु संस्कृतियों के लिए एच जोखिम अवधि के बाद मक्खियों के सफल मौखिक संक्रमण को दर्शाता है (आंकड़ा बी 2 , ग) क्रमशः । चित्रा बी पी entomophila के एक और अधिक केंद्रित संस्कृति का उपयोग कर के महत्व को दिखाता है, जीवाणु लोड में वृद्धि के द्वारा दिखाया गया है जब मक्खियों को अधिक से अधिक ऑप्टिकल घनत्व के जीवाणु संस्कृतियों को उजागर कर रहे हैं । पुरुष और महिला ओरेगन आर (ओरर) एक ही दर (चित्रा 3) में स्पष्ट पी. aeruginosa संक्रमण मक्खियों और पी. aeruginosa CFUs (चित्रा 4a) के एक ही नंबर शेड । जब पी entomophila से संक्रमित हालांकि, पुरुष और मादा ओरर मक्खियों बैक्टीरिया की संख्या में अलग शेड, एक तरह से है कि समय के साथ परिवर्तन (चित्रा 4B) । नर और मादा पी aeruginosa (चित्रा 5) और entomophila (चित्रा 5B) से अलग दरों पर मर जाते हैं । हम यह भी देखते है कि Dcy म्यूटेंट (जो आंत उपकला में सुरक्षात्मक peritrophic मैट्रिक्स कमी) और म्यूटेंट स्वाद (जो एक कार्यात्मक आईएमडी प्रतिरक्षा मार्ग की कमी), शो कम अस्तित्व के बाद पी entomophila और पी aeruginosa ओरल इंफेक्शन (फिगर 5C).

Figure 1
चित्रा 1: जीवन रक्षा, छप्पर, और आंतरिक बैक्टीरियल लोड को मापने के लिए प्रोटोकॉल का योजनाबद्ध सिंहावलोकन Drosophila melanogasterमें मौखिक संक्रमण के बाद. D. melanogasterके ओरल संक्रमण के बाद 3 संभावित प्रयोगों का चित्रण । शीशियों और उनके संक्रमित उम्र रिकॉर्डिंग करने के लिए एकल मक्खियों स्थानांतरित करके ' अस्तित्व ' को मापने. १.५ मिलीलीटर microcentrifuge ट्यूबों के लिए एक मक्खियों को स्थानांतरित करके ' उपाय बहा ' टोपी में लुईस मध्यम के ५० µ एल के साथ । ट्यूब में 24 घंटे के बाद, मक्खी हटाने और 1x पंजाब के १०० µ एल के साथ ट्यूब भंवर । निकालें और प्लेट पौंड पोषक पर इस समाधान के जीवाणु छप्पर की गणना करने के लिए आगर । एक ही मक्खी longitudinally में छप्पर को मापने, 24 घंटे के बाद टोपी में लुईस माध्यम के साथ ताजा ट्यूबों के लिए मक्खियों को स्थानांतरित करके, और धोने और अब दूषित ट्यूब चढ़ाना । एक मक्खी ' आंतरिक लोड ' एक संक्रमित मक्खी, सतह यह निष्फल लेने के द्वारा मापा जा सकता है, और यह अंत में पौंड पोषक तत्व आगर पर homogenate चढ़ाना इससे पहले अनुमन्य । यह बहा के बाद किया जा सकता है की गणना कैसे ' आंतरिक ' लोड और बहा सहसंबंधी बनाना मापा गया है । मक्खी इस आंकड़े में प्रयुक्त चित्रण मूल रूप से Nuhanen३६द्वारा तैयार किया गया था । लेखकों ने इसे उदाहरण कापलान-Meier वक्र के साथ संशोधित किया है जो विकिमीडिया कॉमन्स३७से लिया गया है । अंय सभी चित्र मूल हैं । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 2
चित्रा 2: मौखिक संक्रमण के बाद बैक्टीरिया की संक्रामक खुराक. (क) नर और मादा ओरेगन-आर की संक्रामक खुराक एक P. aeruginosa संस्कृति (आयुध डिपो६०० = 25) के लिए 12 एच के लिए जोखिम के बाद मक्खियों मतलब और एसई 3 पुरुषों और 3 महिलाओं से गणना की गई । (ख) एक चार पी. entomophila संस्कृतियों (आयुध डिपो६०० = १००, ७५, ५०, और 25) या नियंत्रण के लिए 5% सुक्रोज समाधान के लिए जोखिम के बाद पार जंगली प्रकार महिलाओं की संक्रामक खुराक 24 एच । के सांख्यिकीय अंतर (F3, 76 = १८.५६७, p < 0.001) जोखिम उपचार के बीच संक्रामक खुराक में सलाखों के ऊपर अलग अक्षरों से चिह्नित है । मतलब 5 मक्खियों से आयुध डिपो के लिए गणना की गई६०० = 0 खुराक, और अंय सभी खुराकों के लिए 18-20 । (ग) पुरुष और महिला ओरेगन-आर की संक्रामक खुराक P. entomophila संस्कृति (आयुध डिपो६०० = १००) के लिए 24 एच के लिए जोखिम के बाद मक्खियों । मतलब और एसई 20 पुरुषों और 20 महिलाओं से गणना की गई । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 3
चित्रा 3: आंतरिक पी. aeruginosa मौखिक संक्रमण के बाद मक्खियों में लोड । पुरुष और महिला ओरेगन-आर के जीवाणु लोड मतलब ± P aeruginosa (आयुध डिपो६०० = 25) के साथ मौखिक संक्रमण के बाद १६८ एच के लिए संक्रमण के बाद मक्खियों । मतलब है और हर समय बिंदु के एसई 3 व्यक्तियों से गणना कर रहे हैं । एक मक्खी के आंतरिक बैक्टीरियल लोड समय के साथ काफी बदलता है (p < 0.001) । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 4
चित्रा 4: मौखिक संक्रमण के बाद जीवाणु बहा । (A) P. aeruginosa द्वारा बहाए गए चित्रा 3, १२० ज के बाद संक्रमण में प्रयुक्त मक्खियों । मतलब और एसई 3 पुरुषों और 3 महिलाओं से गणना की गई । (ख) पी. entomophila पुरुष और महिला ओरेगन-R द्वारा शेड p entomophila (आयुध डिपो६०० = १००) के साथ मौखिक संक्रमण के बाद १२० एच के लिए संक्रमण के बाद मक्खियों । मतलब और एसई ३४ पुरुषों और ३८ महिलाओं से गणना की गई । p. aeruginosa और p. entomophilaदोनों के लिए, एक मक्खी द्वारा शेड CFUs की संख्या समय के साथ काफी परिवर्तन (P < 0.001) । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 5
चित्रा 5: जीवाणु मौखिक संक्रमण के बाद मक्खियों का अस्तित्व । कापलान-Meier (किमी) के जीवन रक्षा curves (क) ओरेगन-R पुरुष और महिला पी aeruginosa (आयुध डिपो६०० = 25) या नियंत्रण 5% सुक्रोज समाधान के साथ मौखिक संक्रमण के बाद मक्खियों । किमी उत्तरजीविता वक्र उपचार समूह के अनुसार 20 मक्खियों की 4 शीशियों से गणना की गई थी । (ख) ओरर नर और मादा मक्खियों के साथ मौखिक संक्रमण के बाद P entomophila (OD६०० = १००). किमी जीवन रक्षा वक्र 4 एकल नियंत्रण मक्खियों और दोनों पुरुषों और महिलाओं के लिए ३४ संक्रमित मक्खियों से गणना की गई थी । (ग) प्रतिरक्षा म्यूटेंट: Dcy (Drosocrystallin-peritrophic मैट्रिक्स उत्परिवर्ती) और रिलायंस एनर्जी (स्वाद-आईएमडी उत्परिवर्ती), पी. entomophila (पीई), पी. aeruginosa (Pa14), या एक नियंत्रण 5% सुक्रोज हल करने के लिए उजागर । सभी संक्रमित समूह नियंत्रण मक्खियों (p < 0.001) की तुलना में काफी तेज़ी से मरते हैं । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Discussion

हम मज़बूती से मौखिक रूप से जीवाणु रोगजनकों के साथ D. melanogaster को संक्रमित करने के लिए एक प्रोटोकॉल पेश करते हैं । हम पी. aeruginosa और पी. entomophilaपर ध्यान केंद्रित है, लेकिन इस प्रोटोकॉल को आसानी से अंय जीवाणु प्रजातियों के संक्रमण को सक्षम करने के लिए अनुकूलित किया जा सकता है, जैसे, Serratia marcescens7 इस प्रोटोकॉल के मुख्य पहलुओं बैक्टीरियल प्रजातियों के बीच भिंन होगा । तदनुसार, सबसे कुशल संक्रामक खुराक, इसी डाह, और मेजबान जीनोटाइप संवेदनशीलता सभी पर विचार किया जाना चाहिए और आदर्श पायलट अध्ययन में जांच की । ऑप्टिकल घनत्व की एक सीमा के जीवाणु संस्कृतियों को उजागर मक्खियों और उनके संक्रामक खुराक और अस्तित्व को मापने के नए जीवाणु प्रजातियों के साथ काम कर रहे हैं या लाइनों मक्खी जब एक उचित प्रारंभिक बिंदु है ।

प्रोटोकॉल जैसे मक्खी भुखमरी से पहले खिलाने और 5% सुक्रोज समाधान में बैक्टीरियल छर्रों फिर से सस्पैंड के रूप में कदम मौखिक संक्रमण में आम है और जोखिम के दौरान जीवाणु संक्रमण की विश्वसनीयता में वृद्धि7,8, 9 , 10. हालांकि, यह ध्यान दें कि जोखिम के दौरान महत्वपूर्ण है, मूलतः जीवाणु संस्कृति की सतह पर जीना मक्खियों । इस संस्कृति पर चलने की प्रक्रिया में, बैक्टीरिया मक्खी की सतह पर दर्ज हो जाएगा, विशेष रूप से छल्ली पर या bristles24के आसपास । ये epicuticular बैक्टीरिया, एक सफल प्रवेश संक्रमण को प्रतिबिंबित नहीं करते लेकिन अभी भी मक्खी homogenization और चढ़ाना द्वारा पता लगाया जाएगा । झूठी सकारात्मक के लिए क्षमता को कम करने के लिए, यह करने के लिए 1 मिनट के लिए ७०% इथेनॉल में विसर्जन के माध्यम से मक्खी निष्फल सतह आवश्यक है ।

जब बैक्टीरिया बहा दरों पर विचार, मौखिक संक्रमण आवश्यक है । पर्यावरण में एक मेजबान विज्ञप्ति रोगजनकों की संख्या अक्सर मापने के लिए मुश्किल है और आंतरिक लोड अक्सर संक्रमण की गंभीरता के लिए एक प्रॉक्सी के रूप में लिया जाता है और इसलिए26संचरण,27। बैक्टीरियल छप्पर के साथ बैक्टीरियल लोड मापने रोग गंभीरता और प्रसार के इन दो महत्वपूर्ण घटकों के बीच संबंधों की एक परीक्षा३८की अनुमति देता है । प्रस्तुत विधि की एक सीमा है कि मक्खियों के आंतरिक जीवाणु लोड परख विनाशकारी नमूना की आवश्यकता है । यह एक ही व्यक्ति के भीतर रोगज़नक़ विकास और निकासी की अनुदैर्ध्य प्रवृत्तियों की जांच करने के लिए मुश्किल बना देता है । हालांकि, यह संक्रमण के विभिंन चरणों में व्यक्तियों के विनाशकारी नमूना साथियों द्वारा इस सीमा पर काबू पाने के लिए संभव है, इस धारणा के तहत कि प्रत्येक पलटने में औसत सूक्ष्म जीव लोड अनुदैर्ध्य रोगजनक गतिशीलता के भीतर किसी भी दिया दर्शाता है व्यक्तिगत. बैक्टीरियल छप्पर एक ही सीमाओं से ग्रस्त नहीं है, और हम कैसे छप्पर एक पार में quantified जा सकता है के उदाहरण प्रदान करते हैं, अनुभागीय नमूना, या longitudinally कैसे एक व्यक्ति के भीतर समय में परिवर्तन बहा की जांच करने के लिए ।

कई मेजबान और रोगज़नक़ लक्षण संयुक्त रूप से एक व्यक्ति की प्रवृत्ति को25,26,३९संचारित रोग का निर्धारण । जबकि इन लक्षणों की संभावना की महत्ता मेजबान के बीच बदलता है-रोगज़नक़ प्रणालियों, छप्पर की संभावना मल के एक प्रमुख निर्धारक-मौखिक संचरण है । बैक्टीरियल छप्पर को मापने की क्षमता इस धारणा का परीक्षण करने का अवसर खोलती है. उड़ान लाइनों के एक वांछित पैनल में विशेषता मेजबान-रोगज़नक़ गतिशीलता होने, experimenters मौखिक रूप से व्यक्तियों को संक्रमित कर सकता है, और उन्हें अपने संक्रामक समय के दौरान संक्रमित, अतिसंवेदनशील मेजबान के साथ जगह है । इन ' प्राप्तकर्ता ' मक्खियों तो सीधे संचरण को मापने का एक तरीका के रूप में विभिंन समय बिंदुओं पर आंतरिक बैक्टीरियल लोड के लिए परख सकता है ।

Acknowledgments

यह काम केंद्र के लिए प्रतिरक्षा, संक्रमण और विकास के लिए वेलकम ट्रस्ट से एक रणनीतिक पुरस्कार द्वारा समर्थित किया गया था (http://ciie.bio.ed.ac.uk; अनुदान संदर्भ no. ०९५८३१) । PFV एक Branco Weiss फैलोशिप (https://brancoweissfellowship.org/) और एक चांसलर फैलोशिप (जैव विज्ञान के स्कूल, एडिनबर्ग के विश्वविद्यालय) द्वारा समर्थित किया गया था; JASJ एक NERC E3 डीटीपी पीएचडी की छात्रा द्वारा समर्थित किया गया था ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Vials Sarstedt Ltd. 58.490 Polystyrene flat base tube 75mm x 23.5mm, 23ml
Agar Sigma-Aldrich A7002 Agar, ash 2.0-4.5%
Brown sugar Bidvest 66032 Light brown soft sugar
Maize Dove's Farm Organic maize flour
Fermipan yeast Bidvest 96360 Dry, instant yeast
Methyl-4-hydroxybenzoate Sigma-Aldrich H5501 >=99.0%, crystalline
Sucrose Sigma-Aldrich 84097 Sucrose BioUltra, for molecular biology, >=99.5% (HPLC)
Petri dishes Fisher Scientific UK Ltd. 15788517 X600 Petri Dish 90 X 16.2MM Sterile Triple Vent
Falcon tubes (50ml) Greiner Bio-one Inc 210261 Centrifuge tube, 50ml, skirted, bagged, sterile
Eppendorf tube (0.5ml) Sarstedt Ltd. 72.699 Sarstedt Micro Tube Conical Base Push Cap 0.5ml Standard Neutral
Eppendorf tube (1.5ml) Sarstedt Ltd. 72.690.001 Sarstedt Micro Tube Conical Base Push Cap 1.5ml Standard Neutral
Ethanol VWR International Ltd. 20821.33 ETHANOL ABSOLUTE ANALAR NP ACS/R.PE - Analytical Grade
2 L Conical Flask VWR International Ltd. 214-0038 Narrow neck, 2 L Erlenmeyer flask
Sterile filter paper Fisher Scientific UK Ltd. 1001-020 Plain circle and sheets; Particle Retention: greater than11um; Filtration speed: 150 herzberg; Air flow: 10.5s/100mL/in2; Medium porosity; Smooth surface; Grade 1; Type: circle; Dia: 20mm
Bijou sample container Fisher Scientific UK Ltd. 129A 7ml polystyrene sample container
Pseudomonas isolation agar Sigma-Aldrich 17208 Contains agar 13.6 g/L, magnesium chloride 1.4 g/L, peptic digest of animal tissue 20g/L, potassium sulfate 10g/L, triclosan 0.025g/L
LB broth, Miller Fisher Scientific UK Ltd. BP1426 Contains 10g tryptone, 5g yeast extract, 10g sodium chloride per litre
Large Embryo Collection Cages Scientific Laboratory Supplies Ltd. 59-101 Flystuff- fits 100mm petri dish
TRI reagent solution Life Technologies AM9738
96-well microplate Scientific Laboratory Supplies Ltd. 353072 Falcon 96 Well Clear Flat Bottom TC-Treated Polystyrene Cell Culture Microplate with Lid Sterile
Pestle Fisher Scientific UK Ltd 12649595 Pestle, Presterilized; Axygen; Tissue grinder; Blue; Inert polypropylene construction; Fits 1.5 and 2.0mL centrifuge tubes; Individually wrapped; 100/Pk
Glycerol Scientific Laboratory Supplies Ltd. CHE2068 Glycerol A.R. 99.5% 2.5 L
Cotton wool- non absorbent Cowens Ltd ABL Non Absorbent Large quantity 20 bags x 500
Cotton wool- absorbent Cowens Ltd ABS BP small quantity 20 bags x 500
Vortex Fisherbrand Whirlimixer 75W 50-6-Hz 220-240V
Orbital incubator Gallenkamp INR-200-010V 220 V, 50 Hz, 5 A. Nominal temperature: 70ºC. Shaking frequency: 0...400 rpm.
Absorbance Microplate Reader Biotek Instruments Ltd ELx808™ Absorbance Microplate Reader
Gen 5 Microplate Reader and Imager Software Biotek Instruments Ltd For Absorbance Microplate Reader
Centrifuge Beckman Coulter 392304 Allegra X-12R Benchtop Centrifuge, refridgerated 50Hz 230V
Step One Plus Real Time qPCR System Thermofisher Scientific 4376600 Applied biosystems Step One Plus real time qPCR system
Step One Software 2.3 Thermofisher Scientific For Stepone and SteponePlus real time qPCR systems
R Statistical Software https://cran.r-project.org/
10 µL pipette tips Greiner Bio-one Inc 741015 Easlyload gilson-style. Graduated, clear, refill, 960 pcs
200 µL pipette tips Greiner Bio-one Inc 741065 Easlyload gilson-style. Graduated, clear, refill, 960 pcs
1000 µL pipette tips Greiner Bio-one Inc 741045 Easlyload gilson-style. Graduated, clear, refill, 960 pcs
20 µL filtered pipette tips Greiner Bio-one Inc 774288 Filter tip gilson-style. Clear, rack blue, single packed, R/Dnase free, 10 racks of 96pcs
200 µL filtered pipette tips Greiner Bio-one Inc 739288 Filter tip gilson-style. Clear, rack blue, single packed, R/Dnase free, 10 racks of 96pcs
1000 µL filtered pipette tips Greiner Bio-one Inc 740288 Filter tip gilson-style. Clear, rack blue, single packed, R/Dnase free, 10 racks of 60pcs

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References

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ओरल बैक्टीरियल इंफेक्शन और छप्पर में <em>Drosophila melanogaster</em>
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Siva-Jothy, J. A., Prakash, A., Vasanthakrishnan, R. B., Monteith, K. M., Vale, P. F. Oral Bacterial Infection and Shedding in Drosophila melanogaster. J. Vis. Exp. (135), e57676, doi:10.3791/57676 (2018).More

Siva-Jothy, J. A., Prakash, A., Vasanthakrishnan, R. B., Monteith, K. M., Vale, P. F. Oral Bacterial Infection and Shedding in Drosophila melanogaster. J. Vis. Exp. (135), e57676, doi:10.3791/57676 (2018).

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