Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

Muntlig bakteriell infeksjon og Shedding i Drosophila melanogaster

Published: May 31, 2018 doi: 10.3791/57676
Automatic Translation
1, 1, 2, 1, 1,3
1Institute of Evolutionary Biology, School of Biological Sciences, University of Edinburgh, 2IGDR - CNRS UMR 6290, 3Centre for Immunity, Infection and Evolution, University of Edinburgh

Summary

Denne protokollen beskriver metoder muntlig avsløre og infisere frukt fly Drosophila melanogaster med bakteriell patogener og måle antall smittsomme bakterier skur etter gut infeksjon. Videre beskriver vi effekten av immun mutanter på fly overlevelse etter muntlig bakteriell infeksjon.

Abstract

Frukt fly Drosophila melanogaster er en av de best utviklede modell systemene av infeksjon og medfødt immunitet. Mens de fleste har fokusert på systemisk infeksjoner, har det vært en nylig økning av interesse i mekanismer for gut immunkompetanse til patogener, som krever metoder å infisere muntlig fluer. Her presenterer vi en protokoll for å muntlig avsløre personlige flyr til en opportunistisk bakteriell patogen (Pseudomonas aeruginosa) og en naturlig bakteriell patogen av D. melanogaster (Pseudomonas entomophila). Målet med denne protokollen er en robust metode for å avsløre mannlige og kvinnelige flyr til disse patogener. Vi gir representant resultater viser overlevelse fenotyper, mikrobe laster og bakteriell shedding, som er relevante for studier av heterogenitet i patogen overføring. Til slutt, vi bekrefte at Dcy mutanter (mangler beskyttende peritrophic matrix i tarmen epitel) og nyte mutanter (mangler en funksjonell immunforsvarsvikt (IMD) sti), Vis økt mottakelighet for bakteriell muntlig infeksjon. Denne protokollen, derfor beskriver en robust metode å infisere fluer med oral ruten infeksjon, hvilke kan utbygget å studere en rekke genetiske og miljømessige kilder til variasjon i tarmen infeksjon resultater og bakteriell overføring.

Introduction

Frukt fly (også kjent som eddik fly), D. melanogaster, har vært mye brukt som en modell organisme for infeksjon og immunitet mot en rekke patogener1,2. Dette arbeidet har tilbudt grunnleggende innsikt i fysiologiske konsekvensene av infeksjon og var også banebrytende i unraveling molekylær veier underliggende vert immunrespons mot parasitoider, bakteriell, fungal og viral infeksjoner. Denne kunnskapen er ikke bare nyttig for å forstå medfødte immunforsvaret av insekter og andre virvelløse dyr, men fordi mange av immun mekanismene er evolutionarily bevart mellom insekter og pattedyr, Drosophila ansporet også funnet av store immun mekanismer i pattedyr, inkludert mennesker3.

Mest arbeid med Drosophila infeksjon og immunitet har fokusert på systemisk infeksjoner, bruke inoculation leverer patogener direkte inn i kroppen av insekter ved pricking eller injeksjon4,5,6. Fordelen med disse metodene i å tillate levering av en kontrollert smittsomme dose er klar og støttet av en stor mengde arbeid på systemisk infeksjoner. Men er mange naturlig forekommende bakteriell patogener av D. melanogaster ervervet gjennom fôring på råtnende organisk materiale der gut immunkompetanse spiller en viktig rolle i vert forsvar7,8, 9 , 10 , 11 , 12 , 13 , 14 , 15. eksperimenter som bruker systemisk infeksjoner omgå disse forsvar, og derfor gir et helt annet bilde av hvordan insekter montere forsvar mot naturlig patogener. Dette gjelder spesielt hvis målet av arbeidet er å teste spådommer om økologi og evolusjon av infeksjon, der bruk av naturlige patogener og ruter infeksjon er viktig16,17. Siste arbeid har understreket hvordan ruten tatt av patogener betydelig påvirker sykdommen utfallet18,19, utløser distinkte immun veier20,21, kan bestemme beskyttende effekten av arvet endosymbionts16, og kan også spille en viktig rolle i utviklingen av vert forsvar17.

En annen grunn å ansette muntlig ruter infeksjon er at det tillater etterforskningen av variasjonen i patogen overføring ved å måle bakteriell shedding under fecal utskillelse etter oral smitte22,23, 24. forstå kildene til verten heterogene i smitteoverføring utfordrende i naturlige populasjoner25,26, men måle komponentene i overføring, som patogen shedding, under kontrollerte laboratorium betingelser tilbyr en nyttig alternativ tilnærming27. Fôring fluer bakterier og måle bakteriell shedding under en rekke genetiske og miljømessige sammenhenger i kontrollerte eksperimentelle forhold, er det mulig å identifisere kildene til variasjon i overføring blant verter.

Her beskriver vi en protokoll for muntlig infisere D. melanogaster med bakteriell patogener, og for kvantifisere bakteriell vekst og shedding som følger (figur 1). Vi beskriver denne protokollen på to Pseudomonas bakterier: en kraftig forstuing av opportunistiske patogene P. aeruginosa (PA14), og en mindre kraftig belastning av naturlige fly patogen P. entomophila. Pseudomonads er vanlige gram-negative bakterier med en bred vert rekkevidde, infiserer insekter, nematoder, planter og virveldyr, og finnes i de fleste miljøer4,6. Innstigning infeksjon i Drosophila P. aeruginosa og P. entomophila resulterer i patologi intestinal epithelia12,13,14,15, 28. Mens vi fokuserer på disse to bakteriell patogener, kan metodene som er beskrevet her i prinsippet brukes på alle bakteriell patogen rundt med mindre modifikasjoner. Etter muntlig eksponering, vi måle etter infeksjon overlevelse og måle mikrobe belastningen i individuelle fluer og levedyktig mikrober kaste inn i miljøet, uttrykt i kolonien danner enheter (CFUs). Til slutt, fordi gut immunkompetanse skyldes en kombinasjon av epitelial barriere og humorale svar, vi også måle overlevelse av fly linjer hvor disse forsvar er avbrutt. Spesielt Drosocrystallin (Dcy) mutanter har tidligere vist seg å være mer utsatt for muntlig bakteriell infeksjon skyldes en utarmet peritrophic matrise i tarmen29. Vi måler også overleve i en velsmak (Rel) mutant som er forhindret fra å produsere antimikrobielle peptider mot Gram-negative bakterier via IMD veien30.

Protocol

1. vedlikeholde fluer

  1. Opprettholde fluer i 23 mL plast ampuller som inneholder 7 mL av nystekte Lewis medium (endret fra referanse31; 1 L triple destillert H2O, 6.1 g agar, 93.6 g brunt sukker, 68 g mais, 18,7 g instant gjær, 15 mL Tegosept anti-sopp middel) i inkubatorer på 25 ± 1 ° C, i en 12 h:12 syklus h lys: mørke med ~ 60% fukt. Koble hetteglass med ikke-absorberende vatt.
  2. Etter hver 14, overføre 20-30 voksne til en ny mat medisinglass, med øyeblikkelig, tørr gjær lagt til overflaten, for 2-3 dager for at egg-legging oppstår. Etter denne perioden, kan du sikre at eggene er synlige på overflaten av maten. Fjerne voksen fluer.
    Merk: Dette holder fluer i hetteglass som enkelt generasjon, alder-matchet populasjoner.
  3. La egg å utvikle.
    Merk: Ved 25 ° C, voksen fluer begynner å dra fra pupae på dag 11 og videre over dager 12 – 14.

2. Forbered eksperimentelle fluer

  1. Samle egg av foreldre generasjon i befolkningen/embryoet samling bur på en 75 mL apple-agar plate (1 L triple destillert H2O, 30 g agar, 33 g sukrose, 330 mL eplejuice, 7 mL Tegosept anti-sopp middel) med gjær lim spredning (blanding tørr gjær med vann til en peanøttsmør konsistens). Legge til vann-gjennomvåt vatt byrået å gi fuktighet.
    Merk: For å unngå confounding effekter forårsaket av forskjeller i larver oppdrett tetthet, er det viktig at eksperimentelle fluer i forskjellige hetteglass er oppdratt i lignende tettheter. Trinnet ovenfor utføres for å unngå confounding effekter.
  2. Inkuber 24 h ved 25 ° C i en 12 h:12 h lys: mørke syklus til egg-legging oppstod. Hvis det er for få egg etter 24 h, gir lengre habituering. Erstatte apple-agar plater og la egg-legging oppstår en ytterligere 24 h.
  3. Ta egg-laden apple-agar plater fra befolkningen buret. Fjerne gjenværende gjær lim og noen døde flyr fra den agar overflate.
  4. Senk agar i 20 mL 1 x fosfat-bufret saltvann (PBS) og ta forsiktig løs egg fra apple-agar med en fin pensel. Mens suspendert i PBS, overføre eggene til en 50 mL sentrifuge rør og la stå i 5 min så eggene synke å bunnen.
    Merk: De fleste egg finnes på ytterkanten av agar.
  5. Fjerne ved å kutte bunnen 4 mm fra et p1000 filtrerte pipette tips og bruke pipette spissen for å trekke 1 mL løsning, tatt fra bunnen av 50 mL sentrifuge røret. Overføre dette til en 1,5 mL microcentrifuge rør og tillater det å bosette seg.
    Merk: Når pipettering opp egg, snapin-slippe stempelet er mer effektiv enn en mild utgivelse.
  6. Fjerne ved å kutte bunnen 4 mm fra et p20 filtrerte pipette tips. Sette pipette en ønsket volum og trekke fra bunnen av microcentrifuge røret.
    Merk: Med praksis et volum på 5 µL inneholder omtrent 100 egg.
  7. Dispensere samlet egg på mat og la dem å utvikle for den nødvendige mengden av tid.

3. bakteriell kultur

  1. For å vokse P. entomophila og P. aeruginosa kulturer, vaksinere 10 mL av Luria-Bertani (LB) buljong med 100 µL av en frossen bakteriell lager på 30 ° C (P. entomophila) og 37 ° C (P. aeruginosa), henholdsvis. Rist på 150 rpm over natten. Kontroller at bakteriell kultur når metning fasen.
  2. Sikre bakterier brukes til å vaksinere fluene er i eksponentiell fase og raskt replikere, vaksinere overnatting kulturen i nye subkultur, et ønsket volum, neste morgen. Kontroller at den pre inoculum er 10% av det totale volumet av subkultur kultur.
    Merk: Oral smitte krever høy. Derfor er det nødvendig å vokse en betydelig volum av bakteriell kultur slik at nok inoculation kultur kan produseres for den ønskede dose og eksperimentelle. Beregne hvor mye subkultur er nødvendig for å produsere den nødvendige smittsomme doser med ligningen MsVs = MjegVjeg, der M representerer en kultur er optisk densitet målt på 600 nm (OD600) verdi og V representerer sin volum. Senket bokstaver se om kulturen brukes som en subkultur (s) eller en smittsomme dose (i).
  3. Vokse dette subkultur i en 2 L konisk kolbe i et volum slik at den subkulturen overflaten faller (maks) like over begynnelsen av kolbes skråningen. Ikke fyll over dette merket som det vil stunt veksten av bakterier.
  4. Sikre bakterier i dette subkultur er i eksponensiell vekstfase ved å måle OD enhver 30 min.
    Merk: Dette skjer etter 3-5 h, hvor subkultur når en OD600 mellom 0.6-0,8.
  5. Hell like volum av dette subkultur over 50 mL sentrifuge rør og spinne subkultur 2500 x g i 15 min på 4 ° C pellets bakterier. Når pelleted, fjerne, og deretter spinne nedbryting igjen på de ovennevnte forholdene å bekrefte fjerningen av majoriteten av bakterier.
    Merk: Pellets ubetydelig størrelse (mindre enn 1 mm i høyden) bekrefter dette.
  6. Kombinere bakteriell pellets av separate rørene ved å henge dem i 5 mL av subkultur supernatant og recombining disse løsningene i en enkelt 50 mL tube. Spinne konsentrert kultur 2500 x g i 15 min på 4 ° C pellets bakterier.
  7. Fjern nedbryting og re avbryte den endelige bakterier pellet 5% sukrose vann løsning. Sjekk OD og Juster til ønsket smittsomme dose (OD600 = 100 for P. entomophila8 og OD600 = 25 for P. aeruginosa16,28), ved å stenge re pellets i 5% sukrose vann løsningen på et bestemt volum.
    Merk: Mengden 5% sukrose vann løsning legges kan beregnes ved hjelp av formelen i trinn 3.2.1 (MsVs = MjegVjeg).

4. muntlig infisere fluer

  1. For å sikre oral smitte, sulte fluene for 2-4 h før eksponering for bakterier ved å overføre fluene til standard agar ampuller (1 L triple destillert H2O, 20 g agar, 84 g brunt sukker, 7 mL Tegosept anti-sopp middel).
  2. Forberede infeksjon ampuller mens fluer er blir sultet. Gjøre Pseudomonas infeksjon ampuller av pipettering 500 µL av standard sukker agar i lokket på en 7 mL eksempel rør og la det tørke. Plasser platen med filter papir i lokket og Pipetter 100 µL av bakteriell kultur direkte på filteret platen. For kontroll infeksjoner, erstatte bakteriell kultur med samme volum 5% sukrose vann løsning på filter papir.
  3. Legg enkelt flyr til eksempel røret og la i 18-24 h.
  4. Bekrefte oral smitte, først overflaten-sterilisere fluene umiddelbart etter bakteriell eksponering, ved å plassere dem i 100 µL av 70% etanol for 20-30 s. fjerne etanol og legge til 100 µL av triple destillert vann for 20-30 s før vannet. Legg 100 µL av 1 x PBS og homogenize fly.
  5. Overføre til homogenate til den øverste raden i en 96-brønns plate, og Legg til 90 µL av 1 x PBS hver godt under.
  6. Serielt fortynne eksempelfilen for å skille et utvalg av CFU verdier. Ta 10 µL av homogenate topp brønnen og legge dette til godt under. Gjenta dette trinnet med andre Vel, overføring 10 µL til tredje Vel, og så videre, for så mange føljetong fortynninger som kreves.
    Merk: Det viktig at ny pipette-spisser brukes for hvert sett med fortynninger.
  7. Plate de serielle fortynninger på en LB næringsstoffer agar plate i 5 µL dråper, sikre alle dråper forblir atskilt.
  8. Inkuber LB Agar platene overnatting på 30 ° C og 37 ° C for P. entomophila og P. aeruginosa, henholdsvis og telle synlig CFUs.
    Merk: Mens Drosophila gut mikrober krever forskjellige anaerob vekst forhold, selektiv medium, for eksempel Pseudomonas isolasjon Medium (PIM), kan brukes å sikre at bare Pseudomonas CFUs telles.
  9. Beregne antall CFUs per fly ved å telle antall kolonier i seriell fortynning hvor 10-60 CFUs er synlig. Deretter multiplisere med fortynningsfaktoren for å beregne hvor mange bakterier per fly.
  10. Utføre statistisk analyse. Der det er nødvendig, transformere CFUs per fly til en normalfordeling. Gjør dette ved Logg-transformasjon. Når forvandlet, bruke generaliserte lineære modeller (GLMs)30,31,32 å teste hvordan behandlingsgrupper variere i CFUs fly (med vanlig statistisk programvarepakkene som R33).
    Merk: Den gjenværende fly homogenate kan brukes for å måle genuttrykk gjennom kvantitative omvendt transkripsjon PCR (RT-qPCR) analyse. Fastsette homogenate i 50 µL av RNA isolasjon reagensen ekstra RNA og kvantifisere spesifikk immun genet titers av RT-qPCR (se f.eksGupta og Vale16 for en detaljert protokoll). Uttrykk for spesifikk immun genet transkripsjoner bør normalisert transkripsjon nivåer med et housekeeping (dvs., rp49) og uttrykt som en fold endres i forhold til kontrollen fluer med 2−ΔΔCt metoden31, 32,33,34.

5. opptak Survivorship etter infeksjon

  1. Infisere fluer muntlig som beskrevet i trinn 4.2.
  2. Overfør den infiserte eller kontroll flyr fra sine respektive infeksjon ampuller i standard Lewis ampuller og holde i en inkubator ved 25 ° C i en 12 h:12 h lys og mørke syklus (eller ønsket forhold). Oppbevare flies før de er døde.
  3. Telle antall levende eller døde fluer i hvert hetteglass hver dag eller så ofte som nødvendig.
  4. Overføre fluene til nye flasker hver 5 dager for å unngå fluene bli sittende fast i maten.
  5. Presentere disse dataene som Kaplan-Meier KM overlevelse kurver eller gjennomsnittlig ± SE proporsjonal overlevelse tomter. For å analysere effekten av flere faktorer og/eller deres respektive interaksjon med hverandre bruker en statistikkpakke (for eksempel pakken "overlevelse" R33) å kjøre en overlevelse analyse som Cox proporsjonal farer modell35.

6. måle bakterielle belastningen

  1. Det ønsket tid punktet, overføre en enkelt infiserte fly til en bakteriefri 1.5 mL microcentrifuge tube.
  2. Overflaten sterilisere fluene som beskrevet i trinn 4.4.
  3. Homogenize fly og kvantifisere bakterielle belastningen ved hjelp av protokollen som er beskrevet i trinnene 4.5-4.10.

7. måle Bakteriell Shedding

  1. Måle blodsutgytelse sammen med interne belastningen.
  2. Etter infeksjon, overføre enkelt flyr til 1,5 mL microcentrifuge rør som inneholder ~ 50 µL av Lewis medium for 24 timer.
  3. Fjerne fluene for interne laste måling (se trinn 6) og vaske rør med 100 µL av 1 x PBS av vortexing tungt for 3 s.
  4. Måle CFUs i denne vask av plating på LB næringsstoffer agar bruker den samme protokollen som beskrevet i trinnene 4.6-4.8.
  5. Etter infeksjon, overføre enkelt flyr til 1,5 mL microcentrifuge rør som inneholder ~ 50 µL av Lewis medium for 24 timer.
  6. Overføre fluene til nye microcentrifuge rør som inneholder ~ 50 µL av Lewis medium for en ytterligere 24 h. vask forurenset rør med 100 µL av 1 x PBS ved vortexing tungt for 3 s.
  7. Måle CFUs i denne vask av plating på LB næringsstoffer agar bruke samme protokoll beskrevet i trinnene 4.6-4.8.
  8. Gjenta trinn 7,2 og 7.3 og registrere fly dødelighet ved hver overføring.

Representative Results

Her presenterer vi illustrerende resultatene fra eksperimentene der D. melanogaster var muntlig infisert med P. aeruginosa eller P. entomophila. Figur 2 viser den muntlige infeksjonen fluer etter en periode med 12 h eller 24 h-eksponering til bakteriekulturer OD600 = 25 og 100 for P. aeruginosa (figur 2A) og P. entomophila (figur 2B C), henholdsvis. Figur 2B illustrerer viktigheten av å bruke en mer konsentrert kultur av P. entomophila, vist ved økningen i bakterielle belastningen når fluene er utsatt for bakteriekulturer av større optisk tetthet. Mannlige og kvinnelige Oregon R (OreR) fluer fjerne P. aeruginosa infeksjon i samme takt (Figur 3) og kaste det samme antallet P. aeruginosa CFUs (figur 4A). Når infisert med P. entomophila men, forskjellig mannlige og kvinnelige OreR fluer antall bakterier skur, på en måte som endringer over tid (figur 4B). Menn og kvinner dør av P. aeruginosa (figur 5A) og P. entomophila (figur 5B) til ulike priser. Vi ser også at Dcy mutanter (som mangler beskyttende peritrophic matrix i tarmen epitel) og nyte mutanter (som mangler en funksjonell IMD immun sti), viser redusert overlevelse etter P. entomophila og P. aeruginosa oral smitte (figur 5C).

Figure 1
Figur 1: Skjematisk oversikt over protokoller for å måle overlevelse, shedding og interne bakterielle belastningen etter muntlig infeksjon i Drosophila melanogaster. En illustrasjon av 3 potensielle eksperimenter etter muntlig infeksjon av D. melanogaster. Måle "overlevelse" overføre enkelt flyr til ampuller og opptak levetiden infisert. Måle shedding ved å overføre enkelt flyr til 1,5 mL microcentrifuge rør med 50 µL av Lewis medium i cap. Etter 24 timer i røret, fjerne fly og vortex tube med 100 µL av 1 x PBS. Fjerne og tallerkenen denne løsningen på LB næringsstoffer agar beregne bakteriell blodsutgytelse. Måle blodsutgytelse i samme fly langs, overføre flyr til frisk rør med Lewis medium i cap etter 24 h, vask og plating nå forurensede røret. Et fly "intern Last" kan måles ved å ta en infisert fly, overflaten sterilisering det, og homogenisere det før endelig plating homogenate på LB næringsstoffer agar. Dette kan utføres etter shedding har blitt målt beregner hvor de 'interne Last' og shedding relatere. Illustrasjonen fly som brukes i dette tallet ble opprinnelig tegnet av B. Nuhanen36. Forfatterne har endret for å følge eksemplet Kaplan-Meier kurven som er Hentet fra Wikimedia Commons37. Alle andre illustrasjoner er originale. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 2
Figur 2: smittsomme dose av bakterier etter oral smitte. (A) smittsomme dose av mannlige og kvinnelige Oregon-R flyr etter eksponering for en P. aeruginosa kultur (OD600 = 25) 12 h. Midlere og SE ble beregnet fra 3 menn og 3 kvinner. (B) smittsomme dose outcrossed vill-type kvinner etter eksponering for en av fire P. entomophila kulturer (OD600 = 100, 75, 50 og 25) eller kontrollere 5% sukrose løsning for 24 timer. Den statistiske forskjellen (F3,76 = 18.567, p < 0,001) i smittsomme dosen mellom eksponering behandlinger er merket med ulike bokstaver over barer. Midlene ble beregnet fra 5 fluer for OD600 = 0 dose og 18-20 for alle andre doser. (C) smittsomme dosen av mannlige og kvinnelige Oregon-R flyr etter eksponering for P. entomophila kultur (OD600 = 100) for 24 timer. Midlere og SE ble beregnet fra 20 menn og 20 kvinner. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 3
Figur 3: Intern P. aeruginosa belastning i fluer etter oral smitte. Gjennomsnittlig ± SE bakterielle belastningen av mannlige og kvinnelige Oregon-R flyr etter muntlig infeksjon med P. aeruginosa (OD600 = 25) opp til 168 h etter infeksjon. Midlere og SE på hvert punkt beregnes fra 3 personer. En flue interne bakterielle belastningen betraktelig endringer over tid (p < 0,001). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 4
Figur 4: bakteriell blodsutgytelse etter oral smitte. (A) P. aeruginosa kaste av samme fluene brukes i Figur 3, opp til 120 timer etter infeksjon. Midlere og SE ble beregnet fra 3 menn og 3 kvinner. (B) P. entomophila kaste av mannlig og kvinnelig Oregon-R flyr etter muntlig infeksjon med P. entomophila (OD600 = 100) opptil 120 timer etter infeksjon. Midlere og SE ble beregnet fra 34 menn og 38 kvinner. For både P. aeruginosa og P. entomophila, antall CFUs skur av et fly betydelig endringer over tid (p < 0,001). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 5
Figur 5: Survival av fluer etter bakteriell infeksjon i muntlige. Kaplan-Meier KM overlevelse kurver av (A) Oregon-R mannlige og kvinnelige flyr etter muntlig infeksjon med P. aeruginosa (OD600 = 25) eller kontrollere 5% sucrose løsning. KM overlevelse kurven beregnet fra 4 ampuller 20 fluer per behandlingsgruppe. (B) OreR mannlige og kvinnelige flyr etter oral smitte med P. entomophila (OD600 = 100). KM overlevelse kurven beregnet fra 4 enkelt kontroll fluer og 34 infiserte fluer for både menn og kvinner. (C) immun mutanter: Dcy (Drosocrystallin-peritrophic matrise mutant) og Rel (velsmak-IMD mutant), utsatt for P. entomophila (Pe), P. aeruginosa (Pa14) eller en kontrolløsning for 5% sukrose. Alle infiserte grupper dø betydelig raskere enn kontrollen flyr (p < 0,001). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Discussion

Vi presenterer en protokoll for pålitelig muntlig infisere D. melanogaster med bakteriell patogener. Vi fokuserer på P. aeruginosa og P. entomophila, men denne protokollen kan enkelt tilpasses til å aktivere infeksjon av andre bakterielle arter, f.eks Serratia marcescens7. Nøkkelen aspektene ved denne protokollen vil variere mellom bakterie-art. Følgelig, den mest effektive smittsomme dose, tilsvarende virulens og vert genotype mottakelighet skal alle anses for og ideelt testet i pilotstudier. Utsette flyr til bakteriekulturer av en rekke optiske tettheter og måle deres smittsomme dose og overlevelse er et egnet utgangspunkt når du arbeider med nye bakterie-art eller fly linjer.

Protokollen trinnene som fly sult før fôring og å suspendere bakteriell pellets i 5% sucrose løsning er vanlig i oral smitte og øke påliteligheten av bakteriell infeksjon under eksponering7,8, 9 , 10. det er imidlertid viktig å merke seg at under eksponering, fluer i hovedsak bor på en overflate av bakteriell kultur. I ferd med å gå på denne kulturen, vil bakterier bli lodged på fly's overflaten, spesielt på cuticle eller rundt bust24. Disse epicuticular bakterier, reflekterer ikke en enteric infeksjonen men ville fremdeles bli oppdaget av fly homogenisering og plating. For å redusere faren for falske positiver, er det viktig å overflaten sterilisere flyr gjennom nedsenking i 70% etanol for opptil 1 min.

Når bakteriell shedding priser, er oral smitte viktig. Antall patogener en rekke utgivelser i miljøet er ofte vanskelig å måle interne belastningen er ofte tatt som en proxy for alvorlighetsgraden av infeksjonen og derfor overføring26,27. Måle bakterielle belastningen sammen med bakteriell shedding kan en undersøkelse av forholdet mellom disse to viktige komponenter sykdom alvorlighetsgrad og spre38. En begrensning av metoden presentert er det assaying interne bakterielle belastningen av fluer behøver destruktiv prøvetaking. Dette gjør det vanskelig å undersøke langsgående trender av patogen veksten og klarering i samme individ. Det er imidlertid mulig å overkomme denne begrensningen av destructively prøvetaking kohorter av enkeltpersoner på ulike stadier av infeksjon, under forutsetning av at gjennomsnittlig mikrobe belastningen i hver kohort gjenspeiler langsgående patogen dynamikken i enhver individuelle. Bakteriell shedding ikke lider samme begrensninger, og vi tilbyr eksempler på hvordan shedding kan kvantifiseres i en cross-sectional prøve eller langs undersøke hvordan shedding endringer i en person over tid.

Mange vert og patogen trekk avgjøre i fellesskap et individs tilbøyelighet til å overføre sykdom25,26,39. Mens betydningen av disse trekkene sannsynlig varierer mellom verten-patogen systemer, er shedding trolig en viktig determinant av fecal-muntlige overføring. Muligheten til å måle bakteriell shedding åpner muligheten til å teste denne antakelsen. Har preget vert-patogen dynamikk i et ønsket panel av fly linjer, kan forskere muntlig infisere individer, og plassere dem sammen med infisert, utsatt verter i deres smittsomme perioder. Disse 'mottaker' fluene kan deretter assayed for interne bakterielle belastningen på ulike tidspunkt som en måte å måle direkte overføring.

Acknowledgments

Dette arbeidet ble støttet av en strategisk award fra the Wellcome Trust til sentrum for immunitet, infeksjon og utvikling (http://ciie.bio.ed.ac.uk; grant referanse nr. 095831). PFV ble støttet av et Branco Weiss fellesskap (https://brancoweissfellowship.org/) og en kansler fellesskap (School of Biological Sciences, University of Edinburgh); JASJ ble støttet av en NERC E3 DTP PhD studentship.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Vials Sarstedt Ltd. 58.490 Polystyrene flat base tube 75mm x 23.5mm, 23ml
Agar Sigma-Aldrich A7002 Agar, ash 2.0-4.5%
Brown sugar Bidvest 66032 Light brown soft sugar
Maize Dove's Farm Organic maize flour
Fermipan yeast Bidvest 96360 Dry, instant yeast
Methyl-4-hydroxybenzoate Sigma-Aldrich H5501 >=99.0%, crystalline
Sucrose Sigma-Aldrich 84097 Sucrose BioUltra, for molecular biology, >=99.5% (HPLC)
Petri dishes Fisher Scientific UK Ltd. 15788517 X600 Petri Dish 90 X 16.2MM Sterile Triple Vent
Falcon tubes (50ml) Greiner Bio-one Inc 210261 Centrifuge tube, 50ml, skirted, bagged, sterile
Eppendorf tube (0.5ml) Sarstedt Ltd. 72.699 Sarstedt Micro Tube Conical Base Push Cap 0.5ml Standard Neutral
Eppendorf tube (1.5ml) Sarstedt Ltd. 72.690.001 Sarstedt Micro Tube Conical Base Push Cap 1.5ml Standard Neutral
Ethanol VWR International Ltd. 20821.33 ETHANOL ABSOLUTE ANALAR NP ACS/R.PE - Analytical Grade
2 L Conical Flask VWR International Ltd. 214-0038 Narrow neck, 2 L Erlenmeyer flask
Sterile filter paper Fisher Scientific UK Ltd. 1001-020 Plain circle and sheets; Particle Retention: greater than11um; Filtration speed: 150 herzberg; Air flow: 10.5s/100mL/in2; Medium porosity; Smooth surface; Grade 1; Type: circle; Dia: 20mm
Bijou sample container Fisher Scientific UK Ltd. 129A 7ml polystyrene sample container
Pseudomonas isolation agar Sigma-Aldrich 17208 Contains agar 13.6 g/L, magnesium chloride 1.4 g/L, peptic digest of animal tissue 20g/L, potassium sulfate 10g/L, triclosan 0.025g/L
LB broth, Miller Fisher Scientific UK Ltd. BP1426 Contains 10g tryptone, 5g yeast extract, 10g sodium chloride per litre
Large Embryo Collection Cages Scientific Laboratory Supplies Ltd. 59-101 Flystuff- fits 100mm petri dish
TRI reagent solution Life Technologies AM9738
96-well microplate Scientific Laboratory Supplies Ltd. 353072 Falcon 96 Well Clear Flat Bottom TC-Treated Polystyrene Cell Culture Microplate with Lid Sterile
Pestle Fisher Scientific UK Ltd 12649595 Pestle, Presterilized; Axygen; Tissue grinder; Blue; Inert polypropylene construction; Fits 1.5 and 2.0mL centrifuge tubes; Individually wrapped; 100/Pk
Glycerol Scientific Laboratory Supplies Ltd. CHE2068 Glycerol A.R. 99.5% 2.5 L
Cotton wool- non absorbent Cowens Ltd ABL Non Absorbent Large quantity 20 bags x 500
Cotton wool- absorbent Cowens Ltd ABS BP small quantity 20 bags x 500
Vortex Fisherbrand Whirlimixer 75W 50-6-Hz 220-240V
Orbital incubator Gallenkamp INR-200-010V 220 V, 50 Hz, 5 A. Nominal temperature: 70ºC. Shaking frequency: 0...400 rpm.
Absorbance Microplate Reader Biotek Instruments Ltd ELx808™ Absorbance Microplate Reader
Gen 5 Microplate Reader and Imager Software Biotek Instruments Ltd For Absorbance Microplate Reader
Centrifuge Beckman Coulter 392304 Allegra X-12R Benchtop Centrifuge, refridgerated 50Hz 230V
Step One Plus Real Time qPCR System Thermofisher Scientific 4376600 Applied biosystems Step One Plus real time qPCR system
Step One Software 2.3 Thermofisher Scientific For Stepone and SteponePlus real time qPCR systems
R Statistical Software https://cran.r-project.org/
10 µL pipette tips Greiner Bio-one Inc 741015 Easlyload gilson-style. Graduated, clear, refill, 960 pcs
200 µL pipette tips Greiner Bio-one Inc 741065 Easlyload gilson-style. Graduated, clear, refill, 960 pcs
1000 µL pipette tips Greiner Bio-one Inc 741045 Easlyload gilson-style. Graduated, clear, refill, 960 pcs
20 µL filtered pipette tips Greiner Bio-one Inc 774288 Filter tip gilson-style. Clear, rack blue, single packed, R/Dnase free, 10 racks of 96pcs
200 µL filtered pipette tips Greiner Bio-one Inc 739288 Filter tip gilson-style. Clear, rack blue, single packed, R/Dnase free, 10 racks of 96pcs
1000 µL filtered pipette tips Greiner Bio-one Inc 740288 Filter tip gilson-style. Clear, rack blue, single packed, R/Dnase free, 10 racks of 60pcs

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Hoffmann, J. A. The immune response of Drosophila. Nature. 426 (6962), 33-38 (2003).
  2. Buchon, N., Silverman, N., Cherry, S. Immunity in Drosophila melanogaster - from microbial recognition to whole-organism physiology. Nat Rev Immunol. 14 (12), 796-810 (2014).
  3. Bergman, P., Seyedoleslami Esfahani, S., Engström, Y. Drosophila as a Model for Human Diseases-Focus on Innate Immunity in Barrier Epithelia. Curr Top Dev Biol. 121, 29-81 (2017).
  4. Apidianakis, Y., Rahme, L. G. Drosophila melanogaster as a model host for studying Pseudomonas aeruginosa infection. Nat Protoc. 4 (9), 1285-1294 (2009).
  5. Khalil, S., Jacobson, E., Chambers, M. C., Lazzaro, B. P. Systemic Bacterial Infection and Immune Defense Phenotypes in Drosophila Melanogaster. JoVE J Vis Exp. (99), e52613-e52613 (2015).
  6. Neyen, C., Bretscher, A. J., Binggeli, O., Lemaitre, B. Methods to study Drosophila immunity. Methods San Diego Calif. 68 (1), 116-128 (2014).
  7. Nehme, N. T., et al. A Model of Bacterial Intestinal Infections in Drosophila melanogaster. PLOS Pathog. 3 (11), e173 (2007).
  8. Bou Sleiman, M. S., Osman, D., Massouras, A., Hoffmann, A. A., Lemaitre, B., Deplancke, B. Genetic, molecular and physiological basis of variation in Drosophila gut immunocompetence. Nat Commun. 6, 7829 (2015).
  9. Buchon, N., Broderick, N. A., Lemaitre, B. Gut homeostasis in a microbial world: insights from Drosophila melanogaster. Nat Rev Microbiol. 11 (9), 615-626 (2013).
  10. Kuraishi, T., Hori, A., Kurata, S. Host-microbe interactions in the gut of Drosophila melanogaster. Front Physiol. 4, (2013).
  11. Ha, E. -M., Oh, C. -T., Bae, Y. S., Lee, W. -J. A Direct Role for Dual Oxidase in Drosophila Gut Immunity. Science. 310 (5749), 847-850 (2005).
  12. Limmer, S., et al. Pseudomonas aeruginosa RhlR is required to neutralize the cellular immune response in a Drosophila melanogaster oral infection model. Proc Natl Acad Sci U S A. 108 (42), 17378-17383 (2011).
  13. Apidianakis, Y., Pitsouli, C., Perrimon, N., Rahme, L. Synergy between bacterial infection and genetic predisposition in intestinal dysplasia. Proc Natl Acad Sci U S A. 106 (49), 20883-20888 (2009).
  14. Vodovar, N., et al. Drosophila host defense after oral infection by an entomopathogenic Pseudomonas species. Proc Natl Acad Sci U S A. 102 (32), 11414-11419 (2005).
  15. Chugani, S. A., Whiteley, M., Lee, K. M., D'Argenio, D., Manoil, C., Greenberg, E. P. QscR, a modulator of quorum-sensing signal synthesis and virulence in Pseudomonas aeruginosa. Proc Natl Acad Sci. 98 (5), 2752-2757 (2001).
  16. Gupta, V., Vasanthakrishnan, R. B., Siva-Jothy, J., Monteith, K. M., Brown, S. P., Vale, P. F. The route of infection determines Wolbachia antibacterial protection in Drosophila. Proc R Soc B. 284 (1856), 20170809 (2017).
  17. Martins, N. E., Faria, V. G., Teixeira, L., Magalhães, S., Sucena, É Host Adaptation Is Contingent upon the Infection Route Taken by Pathogens. PLoS Pathog. 9 (9), (2013).
  18. Chambers, M. C., Jacobson, E., Khalil, S., Lazzaro, B. P. Thorax Injury Lowers Resistance to Infection in Drosophila melanogaster. Infect Immun. 82 (10), 4380-4389 (2014).
  19. Gupta, V., Stewart, C., Rund, S. S., Monteith, K., Vale, P. F. Costs and benefits of sublethal Drosophila C virus infection. J Evol Biol. , (2017).
  20. Ferreira, ÁG., Naylor, H., Esteves, S. S., Pais, I. S., Martins, N. E., Teixeira, L. The Toll-Dorsal Pathway Is Required for Resistance to Viral Oral Infection in Drosophila. PLoS Pathog. 10 (12), (2014).
  21. Buchon, N., Broderick, N. A., Poidevin, M., Pradervand, S., Lemaitre, B. Drosophila Intestinal Response to Bacterial Infection: Activation of Host Defense and Stem Cell Proliferation. Cell Host Microbe. 5 (2), 200-211 (2009).
  22. Wayland, M. T., et al. Spotting the differences: Probing host/microbiota interactions with a dedicated software tool for the analysis of faecal outputs in Drosophila. J Insect Physiol. 69, 126-135 (2014).
  23. Hori, A., Kurata, S., Kuraishi, T. Unexpected role of the IMD pathway in Drosophila gut defense against Staphylococcus aureus. Biochem Biophys Res Commun. 495 (1), 395-400 (2018).
  24. Ren, C., Webster, P., Finkel, S. E., Tower, J. Increased Internal and External Bacterial Load during Drosophila Aging without Life-Span Trade-Off. Cell Metab. 6 (2), 144-152 (2007).
  25. Ezenwa, V. O., et al. Host behaviour-parasite feedback: an essential link between animal behaviour and disease ecology. Proc R Soc B. 283 (1828), 20153078 (2016).
  26. McCallum, H., et al. Breaking beta: deconstructing the parasite transmission function. Phil Trans R Soc B. 372 (1719), 20160084 (2017).
  27. Vale, P. F., Choisy, M., Little, T. J. Host nutrition alters the variance in parasite transmission potential. Biol Lett. 9 (2), 20121145 (2013).
  28. Mulcahy, H., Sibley, C. D., Surette, M. G., Lewenza, S. Drosophila melanogaster as an Animal Model for the Study of Pseudomonas aeruginosa Biofilm Infections In Vivo. PLoS Pathog. 7 (10), e1002299 (2011).
  29. Kuraishi, T., Binggeli, O., Opota, O., Buchon, N., Lemaitre, B. Genetic evidence for a protective role of the peritrophic matrix against intestinal bacterial infection in Drosophila melanogaster. Proc Natl Acad Sci. 108 (38), 15966-15971 (2011).
  30. Myllymäki, H., Valanne, S., Rämet, M. The Drosophila Imd Signaling Pathway. J Immunol. 192 (8), 3455-3462 (2014).
  31. Lewis, E. A new standard food medium. Cold Spring Harb Protoc. 2014 (9), pdb.rec081414 (2014).
  32. Bolker, B. M., et al. Generalized linear mixed models: a practical guide for ecology and evolution. Trends Ecol Evol. 24 (3), 127-135 (2009).
  33. R Core Team. R: A Language and Environment for Statistical Computing. , R Foundation for Statistical Computing. Vienna, Austria. (2015).
  34. Schmittgen, T. D., Livak, K. J. Analyzing real-time PCR data by the comparative CT method. Nat Protoc. 3 (6), 1101-1108 (2008).
  35. Kalbfleisch, J. D., Prentice, R. L. The Statistical Analysis of Failure Time Data. , 2nd Edition, Wiley-Blackwell. Hoboken, N.J. (2002).
  36. Nuhanen, B. Drosophila melanogaster, drawing.SVG. , Available from: https://commons.wikimedia.org/wiki/File:Drosophila-drawing.svg (2007).
  37. Accountalive. Example of a survival curve estimated by Kaplan-Meier method including 95% confidence limits. , Available from: https://commons.wikimedia.org/wiki/File:Kaplan-Meier-sample-plot.svg (2011).
  38. Susi, H., Vale, P. F., Laine, A. -L. Host Genotype and Coinfection Modify the Relationship of within and between Host Transmission. Am Nat. 186 (2), 252-263 (2015).
  39. Fellous, S., Duncan, A. B., Quillery, E., Vale, P. F., Kaltz, O. Genetic influence on disease spread following arrival of infected carriers. Ecol Lett. 15 (3), 186-192 (2012).

Tags

Biologi problemet 135 infeksjon immunitet Drosophila oral smitte bakteriell shedding Relish Dcy
Muntlig bakteriell infeksjon og Shedding i <em>Drosophila melanogaster</em>
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Siva-Jothy, J. A., Prakash, A.,… More

Siva-Jothy, J. A., Prakash, A., Vasanthakrishnan, R. B., Monteith, K. M., Vale, P. F. Oral Bacterial Infection and Shedding in Drosophila melanogaster. J. Vis. Exp. (135), e57676, doi:10.3791/57676 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter