Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove

Biology

Bakteriyel enfeksiyon ve atma Drosophila melanogaster içinde sözlü

doi: 10.3791/57676 Published: May 31, 2018

Summary

Bu iletişim kuralı sözlü olarak ortaya çıkarmak ve bakteriyel patojenler ile meyve sineği Drosophila melanogaster bulaştırmak ve bağırsak enfeksiyonu takip bulaşıcı bakteri döken sayısını ölçmek için yöntemler açıklanır. Daha fazla sinek hayatta kalma sözlü bakteriyel enfeksiyonu takip bağışıklık mutantlar etkisini açıklar.

Abstract

Meyve sineği Drosophila melanogaster enfeksiyon ve doğuştan gelen bağışıklık en gelişmiş modeli sistemlerinden biridir. Çoğu iş sistemik enfeksiyonlar üzerinde odaklanmıştır iken, gut immunocompetence sözlü olarak sinekler bulaştırmak için yöntemler gerektirir patojenlere mekanizmaları ilgi son bir artış olmuştur. Burada sözlü olarak bireysel sinekler bir fırsatçı bakteriyel patojen (Pseudomonas aeruginosa) ve D. melanogaster (Pseudomonas entomophila) doğal bir bakteriyel patojen ortaya çıkarmak için bir iletişim kuralı mevcut. Erkek ve dişi sinekler bu patojenler için ortaya çıkarmak için sağlam bir yöntem sağlamak amacıyla bu iletişim kuralı hedefidir. Biz hayatta kalma fenotipleri, mikrop yükler ve dökülme, bakteriyel gösteren temsilcisi sonuçları hangi heterojenite patojen iletim çalışmanın ilgilidir sağlar. Son olarak, biz bunu teyit (bağırsak epitel koruyucu peritrophic matrisinde eksik) Dcy mutantlar ve zevkle (fonksiyonel bağışıklık yetersizliği (IMD) yolu eksik) mutantlar, oral enfeksiyon bakteri artan duyarlılık göstermek. Bu iletişim kuralı, bu nedenle, bağırsak enfeksiyonu sonuçları ve bakteriyel iletim varyasyon bir çeşitli genetik ve çevresel kaynakları çalışma genişletilmiş enfeksiyonu ağız yolu kullanmanın sinekler bulaştırmak için sağlam bir yöntem açıklanır.

Introduction

Meyve sineği (sirke sineği olarak da bilinir) D. melanogaster, kapsamlı bir model organizma enfeksiyon ve patojenler1,2çeşitli karşı bağışıklık için kullanılmıştır. Bu eser enfeksiyon fizyolojik sonuçlarını temel anlayışlar teklif etti ve ayrıca konak immün yanıt parasitoid, bakteriyel, fungal ve viral enfeksiyonlara karşı temel moleküler yolları çözülüyor öncü oldu. Bu bilgi sadece doğuştan gelen bağışıklık yanıtı böcek ve diğer omurgasızlar anlamak yararlı değil, ama çünkü birçok bağışıklık mekanizmaları örümceklerle böcekler ve memeliler arasında korunmuş, Drosophila de keşif mahmuzlu vardır büyük bağışıklık mekanizmaları memelilerde, insanlar3dahil.

Çoğu çalışma Drosophila enfeksiyon ve Dokunulmazlık patojenler doğrudan böcek gövdesine iğneleyici veya enjeksiyon4,5,6tarafından teslim aşılama yöntemleri kullanarak sistemik enfeksiyonlar odaklanmıştır. Bu yöntemler içinde kontrollü bir bulaşıcı doz teslimini bırakmak açık ve sistemik enfeksiyonlar çalışmalarına büyük bir vücut tarafından desteklenen avantajdır. Ancak, birçok doğal olarak meydana gelen bakteriyel patojenler D. melanogaster , organik madde nerede gut immunocompetence konak savunma7,8', önemli bir rol oynamaktadır çürüyen besleme yoluyla iktisap 9 , 10 , 11 , 12 , 13 , 14 , 15. sistemik enfeksiyonlar istihdam deneyler bu savunma yan yol ve, bu nedenle, nasıl doğal patojenlere karşı savunma böcekler mount tamamen farklı bir resim sağlar. Bu çalışmanın amacı, ekoloji ve evrim enfeksiyon, hakkında tahminler test etmek doğal patojenler kullanımı ve yolları enfeksiyonunun önemli16,17nerede olduğunu özellikle uygundur. Son çalışmaları önemli ölçüde patojenler tarafından izlenen yolu hastalığı sonucu18,19etkilemesi vurgulanmış bulunmaktadır, farklı bağışıklık yolları20,21aydınlığa çıkartıyor, koruyucu etkisini belirlemek için Endosymbionts16miras ve hatta oyun ana savunma17gelişiminde önemli bir rol olabilir.

Sözlü yolları enfeksiyonu istihdam için bir başka neden bu varyasyon incelenmesi patojen iletimde bakteri dışkı atılımı oral enfeksiyon22,23, takip sırasında shedding ölçerek sağlanmıştır 24. hastalık iletim ana bilgisayar heterojenlik kaynaklarının anlama doğal nüfus25,26yılında zorlu, ancak iletim, patojen, altında kontrollü laboratuvar dökülme gibi bileşenleri ölçme koşulları yararlı alternatif yaklaşım27sağlamaktadır. Besleme sinekler bakteri ve ölçüm bakteriyel altında kontrollü deneysel koşullar genetik ve çevresel bağlamlarda çeşitli dökülme, iletim ana bilgisayarları arasında varyasyon kaynakları tanımlamak mümkündür.

Burada, biz sözlü olarak D. melanogaster bakteriyel patojenler ile hastalık için bir iletişim kuralı tanımlamak ve bakteriyel büyüme miktarının ve dökülme için bu (Şekil 1) izler. Biz bu protokol üzerinde iki Pseudomonas bakterileri tarif: zehirli bir fırsatçı patojen P. aeruginosa (PA14) suşu ve doğal patojen P. entomophilasinek daha az öldürücü bir tür. Psödomonadlar böcekler, nematod, bitkiler ve omurgalı, hastalık bir geniş ana bilgisayar aralığıyla ortak Ayagin Gram-negatif bakteriler ve çoğu ortamlarda4,6'. Drosophila P. aeruginosa ve P. entomophila tarafından enterik enfeksiyon patolojisi bağırsak epiteli12,13,14,-15sonuçları, 28. Biz bu iki bakteriyel patojenler üzerinde odaklanmak iken, yöntem tanımlamak burada prensip olarak küçük değişiklikler ile ilgi herhangi bir bakteriyel pathogen uygulanabilir. Sözlü pozlama, biz sonrası enfeksiyon hayatta kalma ölçmek ve bireysel sinek içinde mikrop yükü ölçmek ve birimleri (CFUs) oluşturan colony ifade ortamına uygun mikroplar döken. Çünkü bağırsak immunocompetence epitel bariyer ve humoral yanıt bir arada gelen sonuçlar, son olarak, aynı zamanda sinek satırları nerede bu savunma kesintiye yaşama ölçeriz. Özellikle, Drosocrystallin (Dcy) mutantlar daha önce gösterilmiştir sözlü bakteriyel enfeksiyon nedeniyle tükenmiş peritrophic matris29gut daha duyarlı olmak. Ayrıca hayatta kalma yolu ile IMD yolu30gram-negatif bakteri karşı antimikrobiyal peptidler üreten engellemiştir bir çeşni (Rel) mutant ölçüyoruz.

Protocol

1. korumak sinekler

  1. 23 mL plastik şişeleri taze yapılmış Lewis orta 7 mL içeren sinekli korumak (başvuru31; modifiye 1 L üç kez distile H2O, 6.1 g agar, 93.6 g kahverengi şeker, 68 g Mısır, 18.7 g Instant Maya, 15 mL Tegosept anti-mantar ajan) İnkübatörler içinde 25 ± 1 ° C s açık: koyu bir 12 h:12 ~ %60 nem ile döngüsü. Emici olmayan Pamuk yün ile şişeleri takın.
  2. Her 14 gün sonra 20-30 yetişkin yeni bir gıda şişe için anlık, Kuru Maya yumurta döşeme-gerçekleşmesi izin vermek 2-3 gün için yüzeye eklendi aktarabilirsiniz. Bu süre sonunda yumurta gıda yüzeyinde görünür olduğundan emin olun. Yetişkin sinekler kaldırın.
    Not: Bu tek nesil nüfus yaş eşlemeli şişeleri sinekler tutar.
  3. Yumurta geliştirmek için bırakın.
    Not: 25 ° c, Yetişkin sinekler eclose için pupa gün 11 başlatın ve 12-14 gün içinde devam.

2. deneysel sinekler hazırlayın

  1. Maya Yapıştır formaya (mix Kuru Maya ile ile (1 L Üçlü distile H2O, 30 g agar, 33 g sükroz, 330 mL elma suyu, 7 mL Tegosept anti-mantar ajan) 75 mL elma-agar plaka üzerinde üst nesil yumurta bir nüfus/embriyo koleksiyonu kafeste toplamak «««su) bir fıstık ezmesi gibi tutarlılık. Suya batırılmış Pamuk yün nem sağlamak için kafes ekleyin.
    Not: larva yetiştirme yoğunluk farklılıkları kaynaklanan efektleri semptomlarıdır önlemek için bu farklı şişeleri deneysel sinekli benzer yoğunlukları yetiştirilen önemlidir. Yukarıda adım etkileri semptomlarıdır önlemek için gerçekleştirilir.
  2. 12 h:12 h 25 ° C'de 24 h için kuluçkaya yumurta atarken oluştu kadar açık: koyu döngüsü. 24 saat sonra çok az yumurta varsa, daha uzun bir habituation süre sağlar. Elma-ağar kaplamalar değiştirin ve yumurta döşeme-daha fazla 24 h için gerçekleşmesi izin.
  3. Yumurta yüklü apple-ağar kaplamalar nüfus kafes al. Ağar'ın yüzeyindeki kalan Maya Yapıştır ve herhangi bir ölü sinekler çıkarmak.
  4. 1 fosfat tamponlu tuz çözeltisi (PBS) x 20 ml agar daldırın ve yavaşça ince fırça ile elma agar yumurtadan çıkarmak. PBS içinde askıya iken, 50 mL santrifüj tüpü yumurta transferi, yumurta altına lavabo diye 5 min için bırak.
    Not: Çoğu yumurta agar dış kenarındaki bulunur.
  5. Alt p1000 süzülmüş pipet ucu 4 mm kesim tarafından kaldırmak ve pipet ucu 1 mL 50 mL santrifüj tüpü alttan alınan çözeltisi, çizmek için kullanın. Bu 1.5 mL microcentrifuge tüp aktarmak ve yerleşmek izin vermek.
    Not: yumurta pipetting zaman ek serbest dalgıç nazik bir yayın daha verimli olur.
  6. Alt p20 süzülmüş pipet ucu 4 mm kesim tarafından kaldırın. Pipet istenen bir ses ayarına ve microcentrifuge tüp alttan çizin.
    Not: uygulama ile 5 µL hacmi yaklaşık 100 yumurta içerir.
  7. Toplanan yumurtalar yemek üzerine dağıtmak ve gerekli süreyi için geliştirmek için bırakın.

3. bakteri kültürü

  1. P. entomophila ve P. aeruginosa kültürler büyümeye, Luria-Bertani (LB) suyu 10 mL 30 ° C'de donmuş bir bakteri stokunun 100 µL ile aşılamak (P. entomophila) ve 37 ° C (P. aeruginosa), anılan sıraya göre. 150 devir / dakikada gecede sallamak. Bakteriyel kültür doygunluk faz ulaştığından emin olmak.
  2. Sinekler aşı için kullanılan bakteri veya üssel faz ve hızlı bir şekilde çoğaltmak, gecede kültür yeni bir alt kültür istenen bir birimin, ertesi sabah aşılamak sağlamak için. Ön inoculum alt kültür kültür toplam hacminin % 10 olduğundan emin olun.
    Not: Oral enfeksiyon yüksek gerektirir. Bu nedenle böylece yeterli aşılama kültür istenilen doz ve deneysel boyut için üretilen bakteriyel kültürünün önemli bir birim genişletme gereklidir. Ne kadar alt kültür denklem MsVs kullanarak gerekli bulaşıcı dozlarda üretmek için gerekli hesaplamak burada bir kültür gösterir M MıVı, = optik yoğunluk temsil 600 nm (OD600) değeri ve V ölçülen'ın onun birim. Alt simge mektupları kültür bir alt kültür (s) veya bir bulaşıcı doz (i) olarak kullanılan için başvurun.
  3. Öyle ki alt kültür'ın yüzey (en az) sadece şişeye'nın yamaç başlangıç yukarıda düşüyor bu alt kültür bir birim bir 2 L konik şişesi içinde büyümek. Bakterilerin büyümesini dublör gibi bu işareti yukarıda doldurmayın.
  4. Bu alt kültür bakterilerde OD her 30 dk ölçerek üstel büyüme aşamasında olduğundan emin olun.
    Not: Bu nerede alt kültür 0.6-0.8 arasında bir OD600 ulaşır 3-5 h sonra oluşur.
  5. Bu alt kültür eşit miktarda santrifüj tüpleri arasında 50 mL dökün ve alt kültür 2500 x g 4 ° C'de bakteri cips için 15 dakika, spin. Pelleted bir zamanlar çıkarın ve sonra tekrar yukarıdaki koşulların bakteri büyük çoğunluğu kaldırılmasını onaylamak için süpernatant spin.
    Not: Bu bir Pelet ihmal edilebilir boyutta (1 mm içinde yükseklik küçüktür) doğrular.
  6. Onları yeniden 5 mL alt kültür süpernatant alınması ve bu çözümler tek 50 mL tüp içinde yeniden birleştirme tarafından ayrı tüpler bakteriyel granül birleştirin. 2500 x g 4 ° C'de bakteri cips için 15 dk için konsantre bu kültür spin.
  7. Süpernatant kaldırmak ve son bakteri Pelet %5 sükroz su çözümde yeniden askıya alma. OD kontrol edin ve istenen bulaşıcı doz için ayarlayın (OD600 = P. entomophila8 ve OD600 için 100 = 25 P. aeruginosa16,28), granül % 5'yeniden askıya sükroz su çözüm gerekli birim.
    Not: % 5 sükroz su solüsyonu eklenmesi gereken miktarda adım 3.2.1 denklemi kullanılarak hesaplanabilir (MsVs MıVı=).

4. sözlü olarak sinekler bulaşmasını

  1. Oral enfeksiyon emin olmak için (1 L üç kez distile H2O, 20 g agar, 84 g kahverengi şeker, 7 mL Tegosept anti-mantar ajan) standart agar şişeleri için sinekler aktararak sinekler için 2-4 h bakteri maruz önce açlıktan.
  2. Sinekler aç iken enfeksiyon tüpleri hazırlayın. Pseudomonas enfeksiyon şişe standart şeker agar pipetting 500 µL tarafından 7 mL örnek tüp kapağı yapmak ve kurumaya bırakın. Kapak filtre kağıdı bir disk yerleştirin ve doğrudan filtre disk üzerine bakteriyel kültürünün 100 µL pipet. Denetim enfeksiyonlar için bakteri kültürü %5 sükroz su çözüm filtre kağıt üzerinde aynı hacmi ile değiştirin.
  3. Tek sinekler için örnek tüp eklenir ve 18-24 h için bırakılır.
  4. Oral enfeksiyon onaylayın, ilk yüzey sterilize-sinekler hemen bakteriyel maruz kaldıktan sonra 100 µL % 70 etanol için 20-30 s. yerleştirerek etanol kaldırmak ve 100 Ekle Üçlü µL 20-30 s için su kaldırmadan önce distile su. 1 x PBS 100 µL ekleyin ve anında lunaparkçı.
  5. Homogenate bir 96-şey plaka üst satır için aktarmak ve her şey 1 x PBS 90 µL ekleyin.
  6. Seri olarak bir CFU aralığı değerleri ayırmak için bu örnek oranında seyreltin. Homogenate 10 µL üst kuyuda alıp bu de ekleyin. Bu ikinci şey, 10 µL üçüncü için de, aktarma işlemi tekrarlayın vb., gerektiği kadar çok seri dilutions için.
    Not: Bu önemli yeni pipet keyif dilutions her kümesi için kullanılır.
  7. Bütün damlacıklar ayrı kalır emin olmak için 5 µL damlacıkları bir LB besin agar tabakta seri dilutions plaka.
  8. LB ağar kaplamalar gecede 30 ° C ve 37 ° C de P. entomophila ve P. aeruginosa, sırasıyla kuluçkaya ve görünür CFUs saymak.
    Not: Drosophila gut mikroplar ayrı anaerobik büyüme koşulları gerektirirken, Seçmeli Orta, Pseudomonas yalıtım Orta (PIM) Örneğin, sadece Pseudomonas CFUs dikkate alınır emin olmak için kullanılabilir.
  9. CFUs sayısını sinek başı nerede 10-60 CFUs açıkça görülebilir koloniler seri seyreltme mevcut sayısını sayarak hesaplayın. Sonra sinek başı bakteri sayısını hesaplamak için mevcut seyreltme faktörle çarpmak.
  10. İstatistiksel çözümleme gerçekleştirme. Gerektiğinde, bir normal dağılım için sinek başı CFUs dönüşümü. Günlük-dönüştürme tarafından bunu. Dönüşüm sonra Genelleştirilmiş Doğrusal modeller (GLMs)30,31,32 nasıl tedavi grupları (R33gibi yaygın olarak bulunan istatistiksel yazılım paketlerini kullanarak) sinek başı CFUs içinde farklı sınamak için kullanın.
    Not: Kalan sinek homogenate gen ekspresyonu kantitatif Ters transkripsiyon PCR (RT-qPCR) analizi ile ölçmek için kullanılabilir. Homogenate RNA izolasyon reaktif 50 µL içinde düzeltmek, RNA ayıklamak ve RT-qPCR tarafından belirli bir bağışıklık gen titreleri ölçmek ( Örneğin, bkz: Gupta ve Vale16 detaylı bir iletişim kuralı için). Belirli bir bağışıklık gen transkript ifade bir temizlik gen (Örneğin, rp49) transkript düzeyleri için normalleştirilmiş ve bir kat 2−ΔΔCt yöntemi31kullanarak denetim sinekler göre değiştikçe ifade, 32,33,34.

5. kayıt yaşayanlar enfeksiyon takip

  1. 4.2. adımda açıklandığı gibi sözlü olarak sinekler bulaştırmak.
  2. Enfekte aktarmak veya standart Lewis şişeleri ve koyu bir kuluçka 12 h:12 h 25 ° C'de tutmak içine onların anılan sıraya göre enfeksiyon tüpleri üzerinden kontrol sinekler döngüsü (veya koşulları istenilen). Onlar ölene uçar tutun.
  3. Ölü ya da diri sinekler her şişe her gün veya gerektiği gibi sık sık olarak saymak.
  4. Sinekler için yeni şişeleri getting şaşırıp kalmış içinde gıda sinekler önlemek için her 5 günde aktarın.
  5. Kaplan-Meier (KM) hayatta kalma eğrileri olarak bu veri mevcut veya ± SE orantılı hayatta kalma araziler demek. Analiz etmek için çeşitli faktörler ve/veya ilgili ilişkileri bir diğeriyle etkisini kullanın istatistik paketi (örneğin, paket R33"hayatta kalma") sağkalım Analizi Cox orantılı tehlikeler modeli35gibi çalıştırmak için.

6. ölçüm bakteri yükü

  1. İstenen saat noktada, tek bir virüslü sinek bir steril 1.5 mL microcentrifuge tüp aktarın.
  2. Yüzey 4.4 adımda anlatıldığı gibi sinekler sterilize et.
  3. Anında homojenize ve açıklanan adımları 4.5-4,10 protokolü kullanarak bakteriyel yük ölçmek.

7. ölçü bakteri dökülme

  1. Dahili yük dökülme ölçmek.
  2. Enfeksiyon sonra 1.5 mL microcentrifuge tüpler ~ 50 µL Lewis orta 24 h için içeren tek sinek aktarın.
  3. Dahili yük ölçümü için sinekler kaldırmak (bkz. Adım 6) ve 1 x PBS 100 µL tüplerini vortexing ağır için 3 tarafından yıkayın s.
  4. Bu yıkama CFUs LB besin agar 4.6-4,8 adımlarda açıklandığı gibi aynı iletişim kuralını kullanarak üzerine kaplama tarafından ölçmek.
  5. Enfeksiyon sonra 1.5 mL microcentrifuge tüpler ~ 50 µL Lewis orta 24 h için içeren tek sinek aktarın.
  6. Sinekler ~ 50 µL Lewis orta daha fazla 24 h yıkama için içeren yeni microcentrifuge Tüpler 1 x PBS 100 µL kirlenmiş tüplerini vortexing ağır için 3 tarafından transfer s.
  7. Bu yıkama CFUs tarafından açıklanan adımları 4.6-4,8 aynı iletişim kuralını kullanarak LB besin agar üzerine kaplama ölçmek.
  8. 7.2 ve 7.3 ve kayıt uçmak ölüm her aktarma, adımları yineleyin.

Representative Results

Burada, açıklayıcı deney sonuçlarından nerede D. melanogaster sözlü olarak P. aeruginosa veya P. entomophilaile enfekte oldu mevcut. Şekil 2 bir 12 saat veya 24 saat pozlama süre OD600 bakteri kültürleri aşağıdaki sinekler başarılı oral enfeksiyon gösterir 25 ile 100 = P. aeruginosa (Şekil 2A) ve P. entomophila (Şekil 2B için C), anılan sıraya göre. Şekil 2B P. entomophila, zaman sinekler fazla optik yoğunluk bakteri kültürleri maruz artış tarafından bakteri yükü olarak gösterilen daha yoğun bir kültür kullanmanın önemini göstermektedir. Erkek ve dişi Oregon R (örer) sinekler P. aeruginosa enfeksiyon aynı oranda (Şekil 3) temizleyin ve P. aeruginosa CFUs (Şekil 4A) aynı sayıda döken. P. entomophila ile ancak bulaştığında, erkek ve dişi örer sinekler (Şekil 4B) zaman içerisinde değişen bir şekilde bakteri döken cinsinden farklı. Kadın ve erkek P. aeruginosa (Şekil 5A) ve P. entomophila (Şekil 5B) farklı oranlarda ölür. Ayrıca (Bu bağırsak epitel koruyucu peritrophic matrisinde eksikliği) Dcy mutantlar ve (Bu bir işlevsel IMD bağışıklık yol eksikliği) Relish mutantlar azalmış hayatta kalma P. entomophila ve P. aeruginosa takip göstermek görmek oral enfeksiyon (Şekil 5C).

Figure 1
Resim 1: Hayatta kalma, dökülme ve iç bakteri yükü Drosophila melanogasterağız enfeksiyonu takip ölçmek için protokolleri şematik bakış. D. melanogasterağız enfeksiyonu takip 3 potansiyel deneyler görülmektedir. 'Yaşam' tek sinek şişeleri için aktarmak ve onların virüslü ömrü kayıt ölçmek. 'Tek sinek 1.5 mL microcentrifuge tüpler 50 µL Lewis orta Cap ile aktararak akıtan' ölçmek. Tüp içinde 24 saat sonra sinek ve girdap tüp 100 µL 1 x PBS ile kaldırın. Kaldırmak ve bu çözüm LB besin agar bakteri dökülme hesaplamak için üzerinde plakası. Aynı sinek boyuna, 24 saat sonra kap ortamda Lewis ile taze tüpler sinekler aktarılması ve yıkama ve şimdi kirlenmiş boru kaplama dökülme ölçmek. Bir sinek 's 'dahili yük' bir virüslü sinek, yüzey bu sterilize alarak ve sonunda homogenate LB besin agar üzerinde kaplama önce homojenizasyon ölçülebilir. Sonra dökülme hesaplamak için ölçülen bu yapılabilir nasıl 'dahili yük' ve dökülme ilişkili. Bu şekilde kullanılan sinek illüstrasyon aslında B. Nuhanen36tarafından çizilmiştir. Yazarlar bu Wikimedia Commons37alınan örnek Kaplan-Meier eğrisi eşlik edecek değiştirdiniz. Tüm diğer resimler orijinal. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Figure 2
Şekil 2: bulaşıcı doz oral enfeksiyon takip bakteri. (A) erkek ve dişi Oregon-R bulaşıcı doz uçar P. aeruginosa kültür maruz takiben (OD600 = 25) 12 h için. Ortalama ve SE 3 kadın ve 3 erkek hesaplanır. (B) bulaşıcı bir dört P. entomophila kültürlerin maruz takip outcrossed vahşi tipi kadın doz (OD600 = 100, 75, 50 ve 25) veya % 5 sükroz çözüm 24 h için kontrol. İstatistiksel farkı (F3,76 18.567, p = < 0.001) maruz kalma tedaviler arasında bulaşıcı doz barlar yukarıda farklı harfler tarafından gösterilir. Anlamına gelir 5 sinekler OD600 üzerinden hesaplanan = 0 doz ve 18-20 diğer dozlarda için. (C) erkek ve dişi Oregon-R bulaşıcı doz P. entomophila kültür maruz takiben uçar (OD600 = 100) 24 h için. Ortalama ve SE 20 ve 20 erkek hesaplanır. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Figure 3
Şekil 3: İç P. aeruginosa yük oral enfeksiyon sonra sinek içinde. Erkek ve dişi Oregon-R ortalama ± SE bakteriyel yük uçar P. aeruginosa ile oral enfeksiyon takip (OD600 = 25) 168 h sonrası enfeksiyon e kadar. Ortalama ve SE her zaman noktasının 3 bireyler hesaplanır. Bir sinek 's iç bakteri yükü önemli ölçüde zaman içerisinde değişen (p < 0.001). Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Figure 4
Şekil 4: oral enfeksiyon sonrasında dökülme bakteriyel. (A) P. aeruginosa döken Şekil 3, en fazla 120 h sonrası enfeksiyon için kullanılan aynı sinekler tarafından. Ortalama ve SE 3 kadın ve 3 erkek hesaplanır. (B) P. entomophila erkek ve dişi Oregon-R tarafından döken uçar P. entomophila ağız mantar enfeksiyonu takip (OD600 = 100) en çok 120 h sonrası enfeksiyon. Ortalama ve SE 34 ve 38 erkek hesaplanır. P. aeruginosa ve P. entomophilaiçin bir sinek barakanın CFUs sayısını önemli ölçüde zaman içinde değiştirir (p < 0.001). Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Figure 5
Şekil 5: oral enfeksiyon bakteri takip sinekler yaşama. Kaplan-Meier (KM) hayatta kalma eğrileri (A) Oregon-R erkek ve dişi sinekler P. aeruginosa ile oral enfeksiyon takip (OD600 = 25) veya % 5 sükroz çözüm kontrol. KM sağkalım eğrisi tedavi grubu başına 20 Sineklerin Tanrısı 4 tüpleri üzerinden hesaplanır. (B) P. entomophila ile oral enfeksiyon sonra örer erkek ve dişi sinekler (OD600 = 100). KM sağkalım eğrisi 4 tek kontrol sinekler ve kadın ve erkek için 34 virüslü sinekler üzerinden hesaplanır. (C) bağışıklık mutantlar: Dcy (Drosocrystallin-peritrophic matris mutant) ve Rel (Relish IMD mutant), maruz P. entomophila (Pe), P. aeruginosa (Pa14) veya kontrol % 5 sükroz çözümü için. Tüm enfekte grupları önemli ölçüde denetim sinekler daha hızlı ölmek (p < 0.001). Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Discussion

Biz güvenilir bir şekilde sözlü olarak D. melanogaster bakteriyel patojenler ile hastalık için bir iletişim kuralı mevcut. Biz P. aeruginosa ve P. entomophilaodaklanmak, ama bu protokolü kolayca diğer bakteriyel türler Örneğin, Serratia marcescens7. enfeksiyonu etkinleştirmek için adapte edilebilir Bu iletişim kuralının temel yönlerini bakteriyel türler arasında değişir. Buna göre en verimli bulaşıcı doz, karşılık gelen virülans ve ana genotip duyarlılık tüm kabul ve ideal olarak test pilot çalışmalar. Optik yoğunlukları çeşitli bakteri kültürleri uçmaktadır teşhir ve onların bulaşıcı doz ve hayatta kalma ölçme yeni bakteriyel türler veya sinek hatları ile çalışırken uygun bir başlangıç noktası olabilir.

İletişim kuralı adımları gibi açlık besleme önce sinek ve yeniden askıya bakteriyel granül %5 sükroz çözümde oral enfeksiyon sıradan ve pozlama7,8, sırasında bakteriyel enfeksiyon güvenilirliğini artırmak 9 , 10. ancak, pozlama sırasında sinekler aslında bakteri kültürü bir yüzey üzerinde yaşamak unutmamak önemlidir. Bu kültür üzerinde yürüme sürecinde, bakteri sinek 's yüzeyi, özellikle manikür veya çevresinde kıllar24teslim olmak. Epicuticular bu bakteri, başarılı bir enterik enfeksiyon yansıtmıyor ama hala sinek homojenizasyon ve kaplama tarafından algılanan. Yanlış pozitif olasılığını azaltmak için o yüzeye esastır sinekler % 70 etanol için 1 dakikaya kadar daldırma yoluyla sterilize.

Oral enfeksiyon bakteri dökülme oranları dikkate alınarak, esastır. Bir ana bilgisayar ortamına bültenleri patojenler sayısı genellikle ölçmek zordur ve dahili yük kez enfeksiyon ve bu nedenle iletim26,27şiddeti için bir proxy olarak kabul edilir. Bakteri dökülme yanında ölçüm bakteri yükü incelenmesi hastalığın şiddeti ve yaymak38bu iki önemli bileşenleri arasında ilişki sağlar. Yöntemi sunulan bir sınırlama sinekler iç bakteri yükünü raporlaması yıkıcı örnekleme gerektirmesidir. Bu zor uzunlamasına eğilimleri patojen büyüme ve izni aynı birey içinde araştırmak yapar. Ancak, ortalama mikrop yükü her kohort boyuna patojen dynamics verilen herhangi içinde yansıtır varsayımı altında enfeksiyon farklı aşamalarında bireylerin destructively örnekleme kohortlardan tarafından bu sınırlamayı aşmak mümkündür bireysel. Bakteri dökülme aynı kısıtlamalarla acı değil ve biz nasıl dökülme kesitsel bir örnek veya boyuna nasıl dökülme içinde tek bir zaman içerisinde değişen araştırmak için sayısal örnekleri sunuyoruz.

Birçok ev sahibi ve patojen özelliği ortaklaşa hastalık25,26,39iletimi için bireyin eğilimi belirlemek. Bu özellikler büyük olasılıkla önemi ana bilgisayar-patojen sistemleri arasında değişir, dökülme büyük olasılıkla önemli bir belirleyici fekal-oral iletim iken. Bakteri dökülme ölçmek için yetenek bu varsayımı test etme olanağı açar. Ana bilgisayar-patojen dynamics sinek satırlarının istenen bir panel ile karakterize, Denemecileri sözlü olarak bireyler bulaştırmak ve bulaşmamış, duyarlı ev sahibi bulaşıcı kendi dönemlerinde koyun. 'Alıcı' Bu sinekler sonra doğrudan iletim ölçmenin bir yolu olarak çeşitli zaman noktalarda iç bakteriyel yük denetlesinler.

Acknowledgments

Dokunulmazlık, enfeksiyon ve evrim (http://ciie.bio.ed.ac.uk; Hibe Başvuru no. 095831) için bu iş merkezi için Wellcome Trust stratejik bir ödülü tarafından desteklenmiştir. PFV Branco Weiss arkadaş grubu (https://brancoweissfellowship.org/) ve bir Başkan'ın bursu (Biyolojik Bilimler, University of Edinburgh) tarafından desteklenmiştir JASJ NERC E3 DTP doktora öğrencilik tarafından desteklenmiştir.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Vials Sarstedt Ltd. 58.490 Polystyrene flat base tube 75mm x 23.5mm, 23ml
Agar Sigma-Aldrich A7002 Agar, ash 2.0-4.5%
Brown sugar Bidvest 66032 Light brown soft sugar
Maize Dove's Farm Organic maize flour
Fermipan yeast Bidvest 96360 Dry, instant yeast
Methyl-4-hydroxybenzoate Sigma-Aldrich H5501 >=99.0%, crystalline
Sucrose Sigma-Aldrich 84097 Sucrose BioUltra, for molecular biology, >=99.5% (HPLC)
Petri dishes Fisher Scientific UK Ltd. 15788517 X600 Petri Dish 90 X 16.2MM Sterile Triple Vent
Falcon tubes (50ml) Greiner Bio-one Inc 210261 Centrifuge tube, 50ml, skirted, bagged, sterile
Eppendorf tube (0.5ml) Sarstedt Ltd. 72.699 Sarstedt Micro Tube Conical Base Push Cap 0.5ml Standard Neutral
Eppendorf tube (1.5ml) Sarstedt Ltd. 72.690.001 Sarstedt Micro Tube Conical Base Push Cap 1.5ml Standard Neutral
Ethanol VWR International Ltd. 20821.33 ETHANOL ABSOLUTE ANALAR NP ACS/R.PE - Analytical Grade
2 L Conical Flask VWR International Ltd. 214-0038 Narrow neck, 2 L Erlenmeyer flask
Sterile filter paper Fisher Scientific UK Ltd. 1001-020 Plain circle and sheets; Particle Retention: greater than11um; Filtration speed: 150 herzberg; Air flow: 10.5s/100mL/in2; Medium porosity; Smooth surface; Grade 1; Type: circle; Dia: 20mm
Bijou sample container Fisher Scientific UK Ltd. 129A 7ml polystyrene sample container
Pseudomonas isolation agar Sigma-Aldrich 17208 Contains agar 13.6 g/L, magnesium chloride 1.4 g/L, peptic digest of animal tissue 20g/L, potassium sulfate 10g/L, triclosan 0.025g/L
LB broth, Miller Fisher Scientific UK Ltd. BP1426 Contains 10g tryptone, 5g yeast extract, 10g sodium chloride per litre
Large Embryo Collection Cages Scientific Laboratory Supplies Ltd. 59-101 Flystuff- fits 100mm petri dish
TRI reagent solution Life Technologies AM9738
96-well microplate Scientific Laboratory Supplies Ltd. 353072 Falcon 96 Well Clear Flat Bottom TC-Treated Polystyrene Cell Culture Microplate with Lid Sterile
Pestle Fisher Scientific UK Ltd 12649595 Pestle, Presterilized; Axygen; Tissue grinder; Blue; Inert polypropylene construction; Fits 1.5 and 2.0mL centrifuge tubes; Individually wrapped; 100/Pk
Glycerol Scientific Laboratory Supplies Ltd. CHE2068 Glycerol A.R. 99.5% 2.5 L
Cotton wool- non absorbent Cowens Ltd ABL Non Absorbent Large quantity 20 bags x 500
Cotton wool- absorbent Cowens Ltd ABS BP small quantity 20 bags x 500
Vortex Fisherbrand Whirlimixer 75W 50-6-Hz 220-240V
Orbital incubator Gallenkamp INR-200-010V 220 V, 50 Hz, 5 A. Nominal temperature: 70ºC. Shaking frequency: 0...400 rpm.
Absorbance Microplate Reader Biotek Instruments Ltd ELx808™ Absorbance Microplate Reader
Gen 5 Microplate Reader and Imager Software Biotek Instruments Ltd For Absorbance Microplate Reader
Centrifuge Beckman Coulter 392304 Allegra X-12R Benchtop Centrifuge, refridgerated 50Hz 230V
Step One Plus Real Time qPCR System Thermofisher Scientific 4376600 Applied biosystems Step One Plus real time qPCR system
Step One Software 2.3 Thermofisher Scientific For Stepone and SteponePlus real time qPCR systems
R Statistical Software https://cran.r-project.org/
10 µL pipette tips Greiner Bio-one Inc 741015 Easlyload gilson-style. Graduated, clear, refill, 960 pcs
200 µL pipette tips Greiner Bio-one Inc 741065 Easlyload gilson-style. Graduated, clear, refill, 960 pcs
1000 µL pipette tips Greiner Bio-one Inc 741045 Easlyload gilson-style. Graduated, clear, refill, 960 pcs
20 µL filtered pipette tips Greiner Bio-one Inc 774288 Filter tip gilson-style. Clear, rack blue, single packed, R/Dnase free, 10 racks of 96pcs
200 µL filtered pipette tips Greiner Bio-one Inc 739288 Filter tip gilson-style. Clear, rack blue, single packed, R/Dnase free, 10 racks of 96pcs
1000 µL filtered pipette tips Greiner Bio-one Inc 740288 Filter tip gilson-style. Clear, rack blue, single packed, R/Dnase free, 10 racks of 60pcs

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Hoffmann, J. A. The immune response of Drosophila. Nature. 426, (6962), 33-38 (2003).
  2. Buchon, N., Silverman, N., Cherry, S. Immunity in Drosophila melanogaster - from microbial recognition to whole-organism physiology. Nat Rev Immunol. 14, (12), 796-810 (2014).
  3. Bergman, P., Seyedoleslami Esfahani, S., Engström, Y. Drosophila as a Model for Human Diseases-Focus on Innate Immunity in Barrier Epithelia. Curr Top Dev Biol. 121, 29-81 (2017).
  4. Apidianakis, Y., Rahme, L. G. Drosophila melanogaster as a model host for studying Pseudomonas aeruginosa infection. Nat Protoc. 4, (9), 1285-1294 (2009).
  5. Khalil, S., Jacobson, E., Chambers, M. C., Lazzaro, B. P. Systemic Bacterial Infection and Immune Defense Phenotypes in Drosophila Melanogaster. JoVE J Vis Exp. (99), e52613-e52613 (2015).
  6. Neyen, C., Bretscher, A. J., Binggeli, O., Lemaitre, B. Methods to study Drosophila immunity. Methods San Diego Calif. 68, (1), 116-128 (2014).
  7. Nehme, N. T., et al. A Model of Bacterial Intestinal Infections in Drosophila melanogaster. PLOS Pathog. 3, (11), e173 (2007).
  8. Bou Sleiman, M. S., Osman, D., Massouras, A., Hoffmann, A. A., Lemaitre, B., Deplancke, B. Genetic, molecular and physiological basis of variation in Drosophila gut immunocompetence. Nat Commun. 6, 7829 (2015).
  9. Buchon, N., Broderick, N. A., Lemaitre, B. Gut homeostasis in a microbial world: insights from Drosophila melanogaster. Nat Rev Microbiol. 11, (9), 615-626 (2013).
  10. Kuraishi, T., Hori, A., Kurata, S. Host-microbe interactions in the gut of Drosophila melanogaster. Front Physiol. 4, (2013).
  11. Ha, E. -M., Oh, C. -T., Bae, Y. S., Lee, W. -J. A Direct Role for Dual Oxidase in Drosophila Gut Immunity. Science. 310, (5749), 847-850 (2005).
  12. Limmer, S., et al. Pseudomonas aeruginosa RhlR is required to neutralize the cellular immune response in a Drosophila melanogaster oral infection model. Proc Natl Acad Sci U S A. 108, (42), 17378-17383 (2011).
  13. Apidianakis, Y., Pitsouli, C., Perrimon, N., Rahme, L. Synergy between bacterial infection and genetic predisposition in intestinal dysplasia. Proc Natl Acad Sci U S A. 106, (49), 20883-20888 (2009).
  14. Vodovar, N., et al. Drosophila host defense after oral infection by an entomopathogenic Pseudomonas species. Proc Natl Acad Sci U S A. 102, (32), 11414-11419 (2005).
  15. Chugani, S. A., Whiteley, M., Lee, K. M., D'Argenio, D., Manoil, C., Greenberg, E. P. QscR, a modulator of quorum-sensing signal synthesis and virulence in Pseudomonas aeruginosa. Proc Natl Acad Sci. 98, (5), 2752-2757 (2001).
  16. Gupta, V., Vasanthakrishnan, R. B., Siva-Jothy, J., Monteith, K. M., Brown, S. P., Vale, P. F. The route of infection determines Wolbachia antibacterial protection in Drosophila. Proc R Soc B. 284, (1856), 20170809 (2017).
  17. Martins, N. E., Faria, V. G., Teixeira, L., Magalhães, S., Sucena, É Host Adaptation Is Contingent upon the Infection Route Taken by Pathogens. PLoS Pathog. 9, (9), (2013).
  18. Chambers, M. C., Jacobson, E., Khalil, S., Lazzaro, B. P. Thorax Injury Lowers Resistance to Infection in Drosophila melanogaster. Infect Immun. 82, (10), 4380-4389 (2014).
  19. Gupta, V., Stewart, C., Rund, S. S., Monteith, K., Vale, P. F. Costs and benefits of sublethal Drosophila C virus infection. J Evol Biol. (2017).
  20. Ferreira, ÁG., Naylor, H., Esteves, S. S., Pais, I. S., Martins, N. E., Teixeira, L. The Toll-Dorsal Pathway Is Required for Resistance to Viral Oral Infection in Drosophila. PLoS Pathog. 10, (12), (2014).
  21. Buchon, N., Broderick, N. A., Poidevin, M., Pradervand, S., Lemaitre, B. Drosophila Intestinal Response to Bacterial Infection: Activation of Host Defense and Stem Cell Proliferation. Cell Host Microbe. 5, (2), 200-211 (2009).
  22. Wayland, M. T., et al. Spotting the differences: Probing host/microbiota interactions with a dedicated software tool for the analysis of faecal outputs in Drosophila. J Insect Physiol. 69, 126-135 (2014).
  23. Hori, A., Kurata, S., Kuraishi, T. Unexpected role of the IMD pathway in Drosophila gut defense against Staphylococcus aureus. Biochem Biophys Res Commun. 495, (1), 395-400 (2018).
  24. Ren, C., Webster, P., Finkel, S. E., Tower, J. Increased Internal and External Bacterial Load during Drosophila Aging without Life-Span Trade-Off. Cell Metab. 6, (2), 144-152 (2007).
  25. Ezenwa, V. O., et al. Host behaviour-parasite feedback: an essential link between animal behaviour and disease ecology. Proc R Soc B. 283, (1828), 20153078 (2016).
  26. McCallum, H., et al. Breaking beta: deconstructing the parasite transmission function. Phil Trans R Soc B. 372, (1719), 20160084 (2017).
  27. Vale, P. F., Choisy, M., Little, T. J. Host nutrition alters the variance in parasite transmission potential. Biol Lett. 9, (2), 20121145 (2013).
  28. Mulcahy, H., Sibley, C. D., Surette, M. G., Lewenza, S. Drosophila melanogaster as an Animal Model for the Study of Pseudomonas aeruginosa Biofilm Infections In Vivo. PLoS Pathog. 7, (10), e1002299 (2011).
  29. Kuraishi, T., Binggeli, O., Opota, O., Buchon, N., Lemaitre, B. Genetic evidence for a protective role of the peritrophic matrix against intestinal bacterial infection in Drosophila melanogaster. Proc Natl Acad Sci. 108, (38), 15966-15971 (2011).
  30. Myllymäki, H., Valanne, S., Rämet, M. The Drosophila Imd Signaling Pathway. J Immunol. 192, (8), 3455-3462 (2014).
  31. Lewis, E. A new standard food medium. Cold Spring Harb Protoc. 2014, (9), pdb.rec081414 (2014).
  32. Bolker, B. M., et al. Generalized linear mixed models: a practical guide for ecology and evolution. Trends Ecol Evol. 24, (3), 127-135 (2009).
  33. R Core Team. R: A Language and Environment for Statistical Computing. R Foundation for Statistical Computing. Vienna, Austria. (2015).
  34. Schmittgen, T. D., Livak, K. J. Analyzing real-time PCR data by the comparative CT method. Nat Protoc. 3, (6), 1101-1108 (2008).
  35. Kalbfleisch, J. D., Prentice, R. L. The Statistical Analysis of Failure Time Data. 2nd Edition, Wiley-Blackwell. Hoboken, N.J. (2002).
  36. Nuhanen, B. Drosophila melanogaster, drawing.SVG. Available from: https://commons.wikimedia.org/wiki/File:Drosophila-drawing.svg (2007).
  37. Accountalive. Example of a survival curve estimated by Kaplan-Meier method including 95% confidence limits. Available from: https://commons.wikimedia.org/wiki/File:Kaplan-Meier-sample-plot.svg (2011).
  38. Susi, H., Vale, P. F., Laine, A. -L. Host Genotype and Coinfection Modify the Relationship of within and between Host Transmission. Am Nat. 186, (2), 252-263 (2015).
  39. Fellous, S., Duncan, A. B., Quillery, E., Vale, P. F., Kaltz, O. Genetic influence on disease spread following arrival of infected carriers. Ecol Lett. 15, (3), 186-192 (2012).
Bakteriyel enfeksiyon ve atma <em>Drosophila melanogaster</em> içinde sözlü
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Siva-Jothy, J. A., Prakash, A., Vasanthakrishnan, R. B., Monteith, K. M., Vale, P. F. Oral Bacterial Infection and Shedding in Drosophila melanogaster. J. Vis. Exp. (135), e57676, doi:10.3791/57676 (2018).More

Siva-Jothy, J. A., Prakash, A., Vasanthakrishnan, R. B., Monteith, K. M., Vale, P. F. Oral Bacterial Infection and Shedding in Drosophila melanogaster. J. Vis. Exp. (135), e57676, doi:10.3791/57676 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
simple hit counter