Summary
Deze studie geeft een gevalideerde en geoptimaliseerde procedure voor de isolatie en de cultuur van menselijke baarmoederslijmvlies stromale cellen uit te voeren in vitro decidualization assay. Verder biedt deze studie een gedetailleerde methode om efficiënt vechtpartij een specifiek gen siRNAs, waarbij in menselijk baarmoederslijmvlies stromale cellen.
Abstract
De differentiatie van menselijke baarmoederslijmvlies stromale cellen (HESC) van de fibroblast-achtige verschijning in secretoire decidua is een transformatie die nodig is voor de innesteling van het embryo in het baarmoederslijmvlies van de moeders schoot. Onjuiste decidualization is opgezet als een oorzaak voor implantatie falen en de daaropvolgende vroege embryo miskraam. Daarom is het voordeel aan de verbetering van het tarief van succesvolle geboorten inzicht in de moleculaire mechanismen die ten grondslag liggen aan de decidualization. In vivo gebaseerd studies van kunstmatige decidualization beperken vaak als gevolg van ethische dilemma's gekoppeld aan menselijk onderzoek, evenals translationeel complicaties in diermodellen. Dientengevolge, worden in vitro testen door middel van primaire celculturen vaak gebruikt om de modulering van de decidualization verkennen via hormonen. Deze studie biedt een gedetailleerd protocol voor de isolatie van HESC en latere kunstmatige decidualization via de suppletie van hormonen aan het kweken medium. Verder, deze studie biedt een goed ontworpen methode om knockdown elk gen van belang met behulp van siRNA lipide-gebaseerde transfections. Dit protocol staat de optimalisatie van cultuur zuiverheid, alsmede product rendement, waardoor het maximaliseren van de mogelijkheid om gebruik te maken van dit model als een betrouwbare methode om te begrijpen van de moleculaire mechanismen die ten grondslag liggen aan de decidualization, en de daaropvolgende kwantificering van secreted agenten door decidualized baarmoederslijmvlies stromale cellen.
Introduction
Tussen de fasen van menarche en menopauze ondergaan vrouwen in de reproductieve leeftijd maandelijkse cycli van hormoon-gereglementeerde endometrium-proliferatie, differentiatie en latere vergieten in voorbereiding op de zwangerschap in een proces dat bekend staat als de menstruatie1 ,2. Dergelijke fysieke wijzigingen van het menselijke endometrium zijn nodig voor de goede embryo-implantatie in de baarmoederwand1. Wijzigingen van het endometrium, met inbegrip van zowel morfologische en biochemische aanpassingen, zijn gedurende de menstruele cyclus via ovariële steroïde hormonen oestrogeen en progesteron (P4) gemedieerde3,4,5. Preovulatory oestrogeen niveaus binnen de proliferatieve (of folliculaire) fase, verhoging, initiëren verdikking van het baarmoederslijmvlies. Na de ovulatie promoot de secretoire (of luteale) fase een aanzienlijke stijging van de P4 concentraties, de morfologische transformatie van baarmoederslijmvlies stromale cellen (ESC) inducerende uit fibroblast-achtige verschijning afgerond, epitheliale-achtige decidual cellen in een proces dat bekend staat als decidualization4,6. Onjuiste decidualization is opgezet als een oorzaak voor implantatie mislukking en daaropvolgende vroege embryo miskraam4,7,8. Inzicht in de moleculaire mechanismen die ten grondslag liggen aan de decidualization is dus voordelig voor de diagnose en de behandeling van vroege zwangerschap verlies.
Op dit moment worden verschillende methoden gebruikt voor het verkennen van de onderliggende effecten van decidualization op baarmoederslijmvlies stromale cellen. In vivo, de muis baarmoeder kan worden kunstmatig opgewekt voor decidualization via mechanische stimulatie (dat wil zeggen,krabben) of injectie in een hormonaal primer baarmoeder-9olie. Onderscheiden van mensen, deze synthetische stimulatie bevordert de differentiatie van de uteriene lumen door het verstrekken van het uiterlijk van de blastocyst aanwezigheid, een stap die nodig is voor de opening van decidualization in knaagdieren10,11. Dienovereenkomstig, als gevolg van de translationeel complicaties geassocieerd met diermodellen en de ethische dilemma's rond in vivo gebaseerd studies bij de mens, op basis decidualization modellen zijn met het meeste succes studeerde in vitro.
In deze studie, worden onderwerpen aangeworven door middel van de plaatsing van advertenties in zowel lokale kranten voor Engels en Spaans. Onderwerpen geïdentificeerd als geschikte kandidaten voor deze studie komen om te voldoen aan de coördinator van het onderzoek, waarin een volledige openbaarmaking van potentiële risico's worden besproken. Na bevestiging wordt door voor een compleet begrip van de potentiële risico's wordt onderwerpen toestemming bereikt in zowel de schriftelijke en de mondelinge vormen. Onderwerp toestemming heeft betrekking op (1) ondergaan phlebotomy (2) langdurige opslag van hun weefsels voor toekomstige onderzoeksdoeleinden en (3) akkoord gaan met de totstandbrenging van primaire culturen uit verzamelde weefsel monsters. Na toestemming, onderwerpen krijgen een formulier in te vullen in welke toegestane zelf-identificatie van ras/etniciteit en/of het recht van de geheimhoudingsplicht. Een volgend bezoek is gepland voor het bereiken van het endometrium biopsie op basis van de menstruele cyclus van het onderwerp. Vrijwilligers gerekruteerd om deze studie beide etnische en raciale demographics van de St. Louis Metropolitana weerspiegelen, zoals gedocumenteerd door de volkstelling van 2012 en de deelname van alle kwetsbare bevolking zoals zwangere vrouwen, foetussen, embryo's, geen kinderen jonger dan 18 jaar van leeftijd, of andere kwetsbare groepen. Vereisten voor deelname aan de biopsie sample collectie opnemen (1) zijn tussen de leeftijden van 18-45 jaar (2) met regelmatige menstruatiecyclus (25-32 dagen) (3) hebben geen huidige zwangerschap of gebruik van hormonale/uteriene apparaat anticonceptiva Gelet geen huidige abnormale uitstrijkpreparaten voor 30 dagen vóór de inschrijving (4) hebben geen huidige vaginale infectie of seksueel overdraagbare aandoeningen (5) Gelet geen huidige antibiotica, en (6).
Binnen deze studie, zijn menselijke baarmoederslijmvlies stromale cellen (HESC) gekweekt en kunstmatig geïnduceerde ondergaan in vitro decidualization via de suppletie van hormonen (estradiol (E2), medroxyprogesteron acetaat (MPA) en cyclisch adenosine monofosfaat (cAMP)) aan het medium. Bij deze methode wordt wordt de mate van decidualization gewijzigd op basis van het totale aantal dagen van hormonale behandeling. In combinatie met cytoskeletal omlegging induceert hormonale suppletie biochemische aanpassingen waarin de decidual cellen secretoire-achtige kwaliteiten2,4 ervaren. De expressie van genen van hallmark, zoals prolactine (PRL) en insuline-achtige groeifactor bindende eiwit 1 (IGFBP1), kan worden gebruikt om te bevestigen en kwantificeren van de mate van HESC decidualization5,12, 13 , 14. bovenal de levensvatbaarheid van dit protocol uit te voeren specifieke knockdown gen wordt ook aangetoond.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle menselijke endometrium biopsieën verzameld voor deze studie werden bereikt aan de Washington University in St. Louis, afdeling Obstetrie en Gynaecologie met behulp van een institutionele Review Board (IRB) goedgekeurde schriftelijke toestemmingsformulier.
1. voorbereiding
- 500 mL 1 x Henks evenwichtig zout oplossing (HBSS) voor te bereiden door 100 U/mL penicilline en 100 µg/mL streptomycine toe te voegen aan de media met fles (verder HBSS + medium genoemd).
- Bereiden van 500 mL Dulbecco van bewerkt Eagle Medium: nutriënt mengsel F-12 (DMEM/F12) met fenol rood, L-glutamine en 15 mM 4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic zuur (HEPES) door toevoeging van de antibiotica-antimycotic 1%-oplossing (de eindconcentratie is 100 U/mL penicilline, 100 µg/mL streptomycine, 0,25 µg/mL Fungizone) tot de media met fles (verder HESC isolatie Media genoemd).
- 500 mL DMEM/F12 met fenol rood, L-glutamine en 15 mM HEPES bereiden door toevoeging van 10% foetale boviene Serum (FBS), 1 x Na2HCO3en 1% penicilline (10.000 U/mL) en streptomycine (10.000 µg/mL) (Pen Strep) tot de media (verdere bevattende fles genoemd HESC Media).
- Bereiden van 500 mL met 2% verminderd Serum Medium met L-Glutamine, 2,4 g/L natriumbicarbonaat en HEPES houtskool ontdaan foetale runderserum (csFBS) en 1% Strep Pen aan de media met fles (verder Decidualization Media genoemd).
- 500 mL van fenol red gratis DMEM/F12 door toevoeging van 2% houtskool ontdaan foetale runderserum (csFBS) in de media met fles (verdere verandering Media genoemd) voor te bereiden.
- Bereiden van 10 nM estradiol (E2), 1 µM medroxyprogesteron acetaat (MPA) en cyclisch adenosinemonofosfaat (cAMP) van 50 µM in een polypropyleen conische tube van 15 mL en voeg een 2 ml per goed hoeveelheid eerder bereid decidualization media voor in vitro decidualization assay (verdere EPC Media genoemd).
- 50 mL van het bevriezen van media met 90% FBS en 10% dimethylsulfoxide (DMSO) in polypropyleen conische tube 50 mL (verder bevriezen Media genoemd) voor te bereiden.
- Vooraf Weeg 25 mg Collagenase en 5 mg DNase ik in een conische polypropyleen tube van 50 mL en winkel bij-20 ° C.
2. menselijke Endometrium biopsie overname
- Menselijke endometrium biopsie monsters verzameld in de proliferatieve fase (dag 9 - dag 12) van de menstruatiecyclus van de IRB goedgekeurd kliniek in HBSS verkrijgen.
- Wassen van de biopsie monsters met 1 mL voorverwarmde 37 ° C HBSS + medium en zachtjes schudden als u wilt verwijderen van de overtollige bloed en slijm.
3. isolatie van menselijke baarmoederslijmvlies stromale cellen (HESC)
Opmerking: Deze procedure isolatie is uitgevoerd in een steriele omgeving onder een biologische veiligheidskast.
- Pipetteer van de biopsie met gesteriliseerde pincet in een 50 mL conische polypropyleen centrifugebuis met 10 mL verse HBSS.
- Centrifugeer de biopsie bij kamertemperatuur bij 500 x g gedurende 90 s.
- Als de cel pellet breuken, opnieuw draaien de biopsie bij 2.000 x g gedurende 90 s.
- Verwijder het medium met behulp van een pipet 1 mL en wassen met 10 mL van 37 ° C voorverwarmde HESC isolatie Media gevolgd door centrifugatie bij 500 x g gedurende 90 s.
- Verwijder het medium met behulp van een pipet 1 mL, en krachtig Voeg 3 mL verse HESC isolatie Media te verjagen van de biopsie.
- De biopsie decanteren in een petrischaal met 5 mL HESC isolatie Media.
- Mince de biopsie in als kleine stukjes mogelijk met behulp van #5 pincet en fijne rechte steek schaar voor ongeveer 20 minuten.
- Bereiden DNase ik en Collagenase enzymen door het toevoegen van 10 mL van de HESC isolatie Media aan vooraf gewogen DNase ik (0,5 mg/mL) en Collagenase (2,5 mg/mL). Meng met de pipet.
- Pipetteer gesneden weefselsteekproeven met behulp van een pipet 1 mL in een nieuwe 50 mL conische polypropyleen buis. Wassen met HESC isolatie Media 7 mL en voeg toe aan de polypropyleen buis te verwerven van de totale steekproef.
- Centrifugeer het monster bij kamertemperatuur 800 x g gedurende 2 min. zachtjes Verwijder het supernatant Pipetteer.
- Filter de DNase ik en Collagenase oplossing door 0,2 µm filter op 10 mL spuit direct op pellet aangesloten.
- Vortex voor 10 s tot resuspendeer de pellet.
- Digest in het waterbad 37 ° C gedurende 1,5 uur, vortexing voor 10 s grondig elke 10 min, totdat het weefsel wordt verteerd.
- Filtreer het monster door een 40 µm cel zeef gestapeld over een conische polypropyleen tube 50 mL om de epitheliale cellen en weefsel puin te verwijderen.
Opmerking: Stromale cellen zijn in de conische polypropyleen tube van 50 mL. - Centrifugeer de conische polypropyleen tube 50 mL bij 800 x g gedurende 2,5 min bij kamertemperatuur. De bovendrijvende vloeistof met een 1 mL pipet zachtjes te verwijderen.
- Resuspendeer de pellet in 10 mL HESC isolatie Media.
- Centrifugeer bij 800 x g gedurende 2,5 minuten bij kamertemperatuur. Gecombineerd het supernatant en resuspendeer vervolgens cellen in 6 mL HESC Media en Pipetteer forward en reverse te mengen.
- Langzaam laag op 3 mL van de kleurovergang media dichtheid aan de geresuspendeerde cellen te scheiden van de overige cellen van het bloed uit de stromale cellen, dat evenwel niet tot het mengen van de lagen.
- Centrifugeer het polypropyleen tube van 15 mL bij 400 x g gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur.
- Verzamelen van 5 mL van het supernatans dat in een nieuwe polypropyleen tube van 50 mL en voeg een extra 5 mL HESC Media resuspendeer de cellen.
- Centrifugeer bij 800 x g gedurende 2,5 minuten bij kamertemperatuur, gevolgd door verwijdering van het supernatant en toevoeging van 6 mL HESC Media. Vortex het monster voor 10 s en meng door pipetteren forward en reverse 5 keer.
- Aliquot 10 µL van opnieuw zwevende cellen tot een 1,5 mL microcentrifuge koker voor cellen.
- Voeg 10 µL van 0,4% Trypan blauwe vlek naar cel aliquot en meng met de pipet. 10 µL van het afgepipetteerde deel laden en met behulp van een hemocytometer cellen tellen.
- Plaat van de cellen in een passende kolf afhankelijk van cel totaal tellen in 15 mL HESC Media.
- Als het totale aantal cellen minder dan 1 miljoen is, plaat met alle cellen in de maatkolf van 25 cm met 6 mL van HESC Media. Als het totale aantal cellen meer dan 1 miljoen is, plaat met alle cellen in de kolf van 75 cm met 15 mL HESC Media.
- Cultuur van de cellen in een 5% CO2 incubator bij 37 ° C gedurende ten minste 6 h te verzekeren van de juiste cel adhesie en de media te HESC Media veranderen.
- Cultuur van de geïsoleerde HESC in een 5% CO2 incubator bij 37 ° C gedurende een periode van 3-5 dagen totdat de cellen vormen een enkelgelaagde 80-90% in een maatkolf van vergulde confluentie bereiken.
- HESC Media elke twee dagen wijzigen.
- Warme HESC Media in een waterbad 37 ° C gedurende 15-20 minuten.
- Media uit de kolf gecombineerd en verse HESC Media Voeg aan de maatkolf (werkende volume: 8 mL of 16 mL per kolf van 25 cm of 75 cm respectievelijk).
- Plaats de kolf terug in de 5% CO2 incubator bij 37 ° C tot 80-90% confluentie is bereikt.
- Zodra HESC 80-90% heuvels, overbrengen in cellen van 25-cm tot 75 cm kolf of uit één 75 cm kolf drie kolven van 75 cm.
Opmerking: HESC kunnen worden bevroren en opgeslagen voor later gebruik op dit moment voor toekomstige experimenten.
4. bevriezen en ontdooien van HESCs
- Media uit de kolf 75 cm gecombineerd en voeg toe 2 mL trypsine-EDTA.
- Incubeer in een 5% CO2 incubator gedurende 2-3 minuten bij 37 ° C, totdat de cellen uit de kolf verjagen.
- Voeg 7 mL HESC Media en meng goed door pipetteren forward en reverse.
- Centrifugeer bij 800 x g gedurende 2,5 min en het supernatant gecombineerd.
- Label bevriezing buizen met cellijn, datum en nummer van de passage.
- Resuspendeer de pellet cel in 5 mL van de bevriezing van de media.
- Aliquot 1 mL van het opnieuw gesuspendeerde HESC elke buis en overdracht buizen naar-80 ° C vriezer.
- Buizen overbrengen in vloeibare stikstof binnen 24 uur.
Opmerking: Als plan te ontdooien van cellen in de nabije toekomst, opslag bevroren cellen in-80 ° C voor een maand. - Verwarm de HESC Media voor 20 min voor het ontdooien van de HESCs.
- Voeg 8 mL voorverwarmde HESC Media in de maatkolf van 25 cm.
- De bevriezing buis worden opgehaald uit de vloeibare stikstof tank of -80 ° C en het onderdompelen van de buis in het waterbad 37 ° C gedurende 1-2 minuten te ontdooien van de cellen.
- Ontdooide HESC overbrengen in een maatkolf van 25 cm met HESC Media en broeden in een 5% CO2 incubator's nachts bij 37 ° C.
- Volgende dag, het wijzigen van de HESC Media en wacht 2-3 dagen tot HESC worden confluente en breng deze cellen over 75 cm maatkolf zoals hieronder in Protocol 5.
- Warme HESC Media in een waterbad 37 ° C gedurende 15-20 minuten.
- Media uit de kolf gecombineerd en verse HESC Media Voeg aan de maatkolf (werkende volume: 8 mL of 16 mL per kolf van 25 cm of 75 cm respectievelijk).
- Plaats de kolf terug in de 5% CO2 incubator bij 37 ° C tot 80-90% confluentie is bereikt.
5. menselijke baarmoederslijmvlies stromale cel (HESC) kweken
Opmerking: Deze procedure Culturing is uitgevoerd in een steriele omgeving onder een biologische veiligheidskast.
- Verwarm HESC Media bij 37 ° C in een waterbad voor 20-30 min.
- Media uit de kolf gecombineerd en Voeg 0,25% trypsine ethyleendiamminetetra azijnzuuroplossing (NA2EDTA) (1 mL maatkolf van 25 cm of 2 mL voor maatkolf van 75 cm).
- Incubeer in een 5% CO2 incubator bij 37 ° C gedurende 2-3 minuten totdat de cellen verjagen.
- Tik zachtjes op de wanden van de kolf te verjagen van de resterende cellen. Voeg 7 mL HESC Media en meng goed door pipetteren forward en reverse.
- Pipetteer het mengsel van de cel in een conische polypropyleen tube van 50 mL en centrifugeer bij 800 x g gedurende 2,5 min bij kamertemperatuur.
- Gecombineerd het supernatant en resuspendeer de pellet cel in HESC Media.
- Voeg toe 15 mL voor 25 cm kolf of 45mL voor 75 cm kolf (elke 15 mL).
- Voeg 5 mL of 15 mL celsuspensie respectievelijk toe aan elke kolf van 25 cm of 75 cm.
- Cultuur van de geïsoleerde HESC in een 5% CO2 incubator bij 37 ° C gedurende een periode van 3-5 dagen totdat de cellen vormen een enkelgelaagde 80-90% in een maatkolf van vergulde confluentie bereiken.
- HESC Media elke twee dagen wijzigen.
- Warme HESC Media in een waterbad 37 ° C gedurende 15-20 minuten.
- Media uit de kolf gecombineerd en verse HESC Media Voeg aan de maatkolf (werkende volume: 8 mL of 16 mL per kolf van 25 cm of 75 cm respectievelijk).
- Plaats de kolf terug in de 5% CO2 incubator bij 37 ° C tot 80-90% confluentie is bereikt.
6. menselijke baarmoederslijmvlies stromale cel (HESC) beplating en siRNA transfectie
Opmerking: Deze procedure transfectie is uitgevoerd in een steriele omgeving onder een biologische veiligheidskast.
- Gecombineerd HESC Media uit de kolf van 75 cm en voeg 2 mL trypsine-EDTA-oplossing van 0,25%.
- Incubeer in 5% CO2 incubator bij 37 ° C gedurende 2-3 minuten totdat de cellen verjagen.
- Zodra cellen zijn verdreven uit de kolf, voeg 7 mL HESC Media en meng zachtjes door pipetteren forward en reverse 5 keer.
- Pipetteer het mengsel van de cel in een conische polypropyleen tube van 50 mL en centrifugeer bij 800 x g gedurende 2,5 min bij kamertemperatuur. Gecombineerd het supernatant en resuspendeer de pellet cel in 10 mL van HESC Media.
Opmerking: Als plating cellen uit meer dan één kolf, gewoon verhogen het volume van de HESC Media. - Cellen tellen met behulp van een Hemocytometer.
- Aliquot 10 µL van opnieuw zwevende cellen in een buis 1,5 mL microcentrifuge.
- Voeg 10 µL van 0,4% Trypan blauwe vlek naar cel aliquoot en meng door pipetteren vooruit en omkeren.
- Plaat 0,8 x 105 cellen per putje in 6-Wells-platen. Na twee dagen moet cellen 60-70% heuvels voor optimale transfectie.
- Voor elk monster siRNA transfectie, complexen met behulp van siRNA (60 nanomoles) naar transfectiereagens te bereiden.
- Verdun 5 µL van transfectiereagens in 150 µL van verminderde serum vrije media en incubeer gedurende 5 min.
- Verdun 60 nanomoles van siRNA in 100 µL van verminderde serum vrije media en incubeer gedurende 5 min.
- Na 5 minuten, verdunde siRNA combineren met verdunde transfectie reagens oplossing en meng zachtjes door pipetteren vooruit en 5 keer omkeren.
Opmerking: Als het transfecting van een of meer siRNA in meerdere wells, bereiden master mix 10 ml polystyreen buizen. - SiRNA transfectie reagens complexen gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur incuberen.
- Tijdens deze incubatie, voeg 1 mL verandering Media aan elk putje.
- Na 5 min van incubatie, centrifugeren buizen bij 500 x g gedurende 2 min voor het verzamelen van de oplossing en de 250 µL van siRNA transfectie reagens complexen toevoegen aan elk putje met cellen en media.
- Meng door zachtjes te schommelen en Incubeer de cellen bij 37° C in een 5% CO2 incubator voor 5 h.
- Na 5 uur, door de media te omzetten in HESC Media.
- Incubeer de cellen bij 37 ° C in een 5% CO2 incubator voor 2 days in voorbereiding voor een decidualization in vitro assay.
7. in Vitro Decidualization Assay
Opmerking: Deze test is uitgevoerd in een steriele omgeving onder een biologische veiligheidskast.
- De EPC media alvorens aan te vangen van de in vitro decidualization behandeling, zoals beschreven in Camden et al. bereiden 3 (zie 1.6).
- De media van het post-48 uur transfected lijn van HESC uitgebroed uit stap 6.16 gecombineerd.
- Voeg toe 2 mL EPC Media in elk putje.
Opmerking: als een besturingselement, laat één set cellen onbehandeld met EPC Media. In plaats daarvan, voeg toe 2 mL HESC Media aan de controleputjes. - Incubeer de cellen in de 5% CO2 incubator bij 37 ° C gedurende 6 dagen.
- Wijzig de EPC Media elke 48 uur.
- Warm en bereiden van EPC Media in een waterbad 37 ° C gedurende 15-20 minuten.
- Media uit de put gecombineerd en verse EPC Media toe te voegen.
- Plaats de plaat terug in de 5% CO2 incubator bij 37 ° C.
- Wijzig de EPC Media elke 48 uur.
- Na de zesde dag, door de omvang van stromale cel decidualization via ELISA en qRT-PCR te analyseren (zoals hieronder beschreven).
8. validering van In Vitro Decidualization met behulp van kwantitatieve real-time PCR (qRT-PCR)
Opmerking: qRT-PCR is voltooid zoals eerder beschreven in Kommagani et al.10.
- Isoleren totaal RNA van HESC met behulp van het protocol uit een commercieel beschikbare RNA isolatie kit.
- Het analyseren van de RNA-hoeveelheid en zuiverheid (een260/A280) met een NanoDrop of soortgelijke methodologie zoals beschreven in Garcia-Elias et al.15.
- Synthetiseren cDNA van 1 µg totaal RNA via een verkrijgbare omgekeerde transcriptie kit protocol.
- Voer een qRT-PCR-reactie zoals beschreven in een commercieel beschikbare qRT-PCR kit protocol.
- Het uitvoeren van de reactie met behulp van een commercieel beschikbare Real-Time PCR Master Mix en gene specifieke sondes samen met interne systeem controles (18s PRLen IGFBP1).
9. bevestiging van In Vitro Decidualization met behulp van ELISA
- Kwantificeren van de secreted prolactine niveaus van de voedingsbodems van weefsel met behulp van een commercieel beschikbare prolactine ELISA-kit.
10. validering van In Vitro Decidualization met behulp van Phalloidin kleuring.
- Steriele coverslips invoegen in ieder putje van een 12 goed plaat.
- Herhaal stap 6.1-6.5.
- Plaat 0,8 x 105 cellen per putje van een 12 goed plaat.
- Incubeer de cellen in de 5% CO2 incubator bij 37 ° C gedurende 2 dagen.
- De media gecombineerd.
- Herhaal stap 7.3-7.4.
- Corrigeer de cellen in 4% paraformaldehyde (PFA) in fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS) bij kamertemperatuur gedurende 30 minuten.
- De fixatie oplossing gecombineerd en was 3 keer met 1 mL PBS voor elke 5 min.
- 0,1% niet-ionogene oppervlakteactieve stof polyethyleenglycol tert-octyl fenyl ether in PBS gedurende 5 minuten aan de vaste cellen toevoegen aan het vergroten van de permeabiliteit.
- Was 3 keer met 1 mL PBS voor elke 5 min.
- Voeg 100 µL van phalloidin oplossing per dekglaasje aan en uit te broeden bij kamertemperatuur gedurende 90 minuten.
- Maak 1:100 verdunning in PBS met het gebruik van een stamoplossing van phalloidin in 1 eenheid per 5 µL.
- Was 3 keer met 1 mL PBS voor elke 5 min.
- Monteer de dia's met montage medium dat 4', 6-Diamidino-2-Phenylindole (DAPI).
- Observeer de cellen met behulp van een confocal microscoop.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Decidualization in HESC cultuur
Na isolatie, menselijke baarmoederslijmvlies stromale cellen werden gekweekt tot de vorming van een enkelgelaagde met 80-90% confluentie en geïnduceerde voor in vitro decidualization door de behandeling met 10 nM E2, 1 µM MPA en 50 µM cAMP (EPC). Morfologische verschuivingen in vitro decidualization gekoppeld zijn gevisualiseerd in figuur 1A. Op decidualization ondergaan HESCs cytoskeletal omlegging van langwerpige, fibroblastic cellen naar afgeronde epithelioid cellen. Dus werd phalloidin kleuring uitgevoerd om te bevestigen de cytoskeletal reorganisatie tijdens HESC decidualization. Phalloidin is een zeer selectieve bicyclische peptide die wordt gebruikt om vlek voor door samensmelting van filamenten actine, waardoor het visualiseren van de cytoskeletal-omlegging consistent met in vitro decidualization (figuur 1B).
Op de Zesdaagse van post EPC behandelingen, werden PRL en IGFBP1 mRNA niveaus beoordeeld via qRT-PCR te bevestigen de mate van decidualization (figuur 2A). Parti réformateur Libéral en IGFBP1 niveaus werden aanzienlijk verhoogd ten opzichte van de HESC behandeld met controle voertuig (p < 0,001). Biochemische veranderingen geassocieerd met decidualization werden ook beoordeeld via de kwantificering van secreted PRL niveaus van het kweken medium (figuur 2B). In overeenstemming met transcript niveaus, PRL niveaus waren zeer verhoogde in de EPC gekweekte HESC in vergelijking met het besturingselement (p < 0,001).
Het effect van de specifiek gen intrekking op de cellulaire en moleculaire veranderingen van de HESCs decidualization werden beoordeeld met behulp van SRC-2 als kandidaat-gen (Figuur 3). Na 48 uur met het besturingselement of de SRC-2 siRNA transfectie, HESC werden gekweekt 6 dagen in de media van de EPC. Controle siRNA transfected HESC aangetoond cellulaire en moleculaire veranderingen overeenstemming met juiste decidualization, met inbegrip van een geplaveide morfologische verandering en verhoogde transcript niveaus van decidualization markers PRL en IGFBP1. Zoals verwacht, met SRC-2 siRNA knockdown, transfected HESC bleef fibroblastic in verschijning in vergelijking met de controle siRNA HESC (figuur 3A). In overeenstemming met deze cellulaire wijziging, PRL en IGFBP1 transcript niveaus werden aanzienlijk verlaagd binnen SRC-2 siRNA transfected HESC, met vermelding van een ontsporing in decidualization programing met SRC-2 knockdown (* **p < 0,001). SRC-2 transcript niveaus werden aanzienlijk verlaagd in SRC-2 siRNA transfected HESC vergeleken om te bepalen van siRNA, die aangeeft dat een efficiënte gene monddood maken met onze methode (***p < 0.001) (figuur 3B).
Figuur 1 : Cellulaire veranderingen van menselijke baarmoederslijmvlies stromale cellen tijdens in vitro decidualization. HESCs waren geïsoleerd en gekweekt gedurende zes dagen in de media met voertuig of E2, MPA en cAMP (EPC). A) cel beelden ter illustratie van de veranderingen in de morfologie van de cellulaire van fibroblastic naar epithelioid cellen. B) Phalloidin gekleurd beelden van HESC ter illustratie van de cytoskeletal wijzigingen (in groen) in vitro decidualization, waar blauw de kern (DAPI vertegenwoordigt) is gekoppeld. De rode pijl geeft decidualized cellen. De zwarte pijl toont fibroblastic cellen. Schaal bar: 100 µm. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 2 : Moleculaire veranderingen in menselijke baarmoederslijmvlies stromale cellen tijdens in vitro decidualization. A) totaal RNA werd geïsoleerd uit HSECs gekweekt voor zes dagen in de media met voertuig of E2, MPA en cAMP (EPC) en onderworpen aan qRT-PCR analyse om PRL en IGFBP1 transcript niveaus te detecteren. B) werden PRL uitgescheiden in de kweekmedia gemeten met behulp van een analyse ELISA op basis van HESC gekweekt voor zes dagen in beide voertuig aan EPC. p < 0,05, ** p < 0,01, *** p < 0,001. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 3 : Knockdown voor SRC-2 in menselijke baarmoederslijmvlies stromale cellen van invloed op in vitro decidualization. A) morfologische veranderingen in siRNA transfected HESC na 6 dagen van cultuur met EPC media (top panelen: controle siRNA tijde punten dag 0 en dag 6, onderste panelen: SRC-2 siRNA tijde punten dag 0 en dag 6). B) transcript niveaus van SRC-2, PRLen IGFBP1 op dag 0 en dag 6 van EPC behandeld HESC transfected met controle of SRC-2 siRNA. De zwarte pijl voorstelt decidualized cellen. De witte pijl toont fibroblastic cellen. Schaal bar: 200 µm. *** p < 0,001. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
De vrouwelijke reproductieve menstruele cyclus wordt gekenmerkt door een stijging van progesteron niveaus gedurende de luteale fase inducerende waardoor de decidualization van ESC in ronde, epitheliale-achtige secretoire cellen3,8. De opening van decidualization is afhankelijke soorten. Bij de mens, decidualization doet zich spontaan op de opkomst van progesteron concentratie, overwegende dat muizen10,11van de aanwezigheid van de blastocyst noodzakelijk. Deze inconsistentie in decidualization illustreert de translationeel voordelen bestuderen van celdifferentiatie in menselijke cellijnen. In-vitrotests door middel van primaire celculturen worden vaak gebruikt om de modulering van de decidualization verkennen via hormonen4,6,10. Beperkingen van deze methode kunnen echter optreden op de obtainability van de grootte van een grote steekproef van menselijk weefsel zonder aanzienlijke verschillen in de cyclus fase en zwangerschap geschiedenis. Niettemin, maatregelen kunnen worden genomen om ervoor te zorgen dat beperkingen zijn geminimaliseerd door de studie ver genoeg op voorhand te garanderen van voldoende monsters en planning biopsieën in de proliferatieve fase (dag 9 - dag 12) van de menstruele cyclus te plannen.
In deze studie HESC zijn gekweekt en kunstmatig door een nieuwe methode voor het eerst beschreven in Brosens et al. decidualized 16 in welke hormonen E2, P4 en kamp worden aangevuld tot het kweken medium gedurende een periode van 6 dagen incubatie. Doorgaans alternatieve methoden12,14 primer cel culturen voor kunstmatige decidualization door toevoeging van E2 en MPA over een uitgebreide 14 dagen incubatieperiode. De suppletie van kamp tot de kweken media versterkt synergetisch de decidualization van ESC in een verkorte tijdsbestek terwijl gelijktijdig de expressie van genen met cAMP responsief element promotor regio's (dat wil zeggen, upregulating Parti réformateur Libéral en IGFBP1)12,13. Deze methode, gebaseerd op het protocol beschreven in Kommagani et al. 10, staat de optimalisatie van de isolatie en de cultuur van HESC. Cel cultuur zuiverheid is geoptimaliseerd door het gebruik van een 40 µm cel zeef om te scheiden stromale en epitheliale cellijnen. Densiteitgradiënt-Paque PLUS reagens werd verder toegepast om ervoor te zorgen een levensvatbare, hoog rendement isolatie van pure stromale cellen na de verwijdering van de cellen van het bloed uit het monster. Een stap extra centrifugeren (400 x g gedurende 30 minuten) was opgenomen volgende densiteitgradiënt toevoeging om de volledige uitbanning van bloedcellen uit de celpopulatie. Tot slot werden HESC levensvatbaarheid en rendement geoptimaliseerd op het kweken van cellen tot 95% confluentie voor decidualization. Over het geheel genomen gewaarborgd deze extra stappen het reincultuur van levensvatbare, hoge opbrengst HESC.
De mate van decidualization werd beoordeeld met behulp van qRT-PCR, ELISA, en phalloidin om de cytoskeletal-omlegging en opregulatie van hallmark genen te observeren kleuring. In qRT-PCR, werden het transcript niveaus van decidualization markers PRL en IGFBP1 beoordeeld. Op decidualization van HESC, PRL en IGFBP1 niveaus steeg in een tijd-afhankelijke manier, zoals vastgesteld van eerdere onderzoek6. De toename van de tijd-afhankelijke van secreted PRL niveaus werd ook bevestigd door onderzoek van de HESC weefselkweek media via ELISA. Bovendien, morfologische veranderingen van stromale cellen in decidual cellen kunnen worden gevisualiseerd door middel van de costaining van actine-filamenten via phalloidin en nucleaire marker 4', 6-Diamidino-2-Phenylindole (DAPI)17. Deze experimentele resultaten bevestigd samen, de doeltreffendheid van het kweken van HESC via de suppletie van E2, MPA en kamp.
De mogelijkheden van dit protocol te bestuderen van specifieke knockdown gene evalueerden ook met behulp van siRNA tegen SRC-2. Morfologisch, transfected SRC-2 HESC bleef fibroblastic, terwijl HESC behandeld met controle siRNA decidualized in epithelioid cellen. SRC-2 vechtpartij efficiëntie werd beoordeeld door het transcript niveau en sterk was gedaald, die aangeeft dat een succesvolle monddood maken van specifiek gen met ons protocol. Ons protocol kunnen dus een nuttige bron voor onderzoekers met een interesse in de rol van specifieke gene(s) in baarmoederslijmvlies decidualization uitgezet.
Hoewel vooruitgang in het begrip van de moleculaire mechanismen van decidualization hebben geboekt, kloof een noemenswaardige kennis nog steeds op de specifieke kenmerken. Onjuiste decidualization is opgezet als een oorzaak voor implantatie mislukking en daaropvolgende vroege embryo miskraam4,6,7,10. Daarom is verdere exploratie met betrekking tot de epigenetische factoren en de karakterisering van moleculaire pathways noodzakelijk voor de diagnose en behandeling van falen van de zwangerschap.
Kortom, wordt het protocol gepresenteerd in deze studie een efficiënte methode om te isoleren en een zuivere en levensvatbare lijn van menselijke baarmoederslijmvlies stromale cellen cultuur. Aanvulling vormt op hormonen E2, MPA en kamp tot de kweken media, kunstmatige decidualization kan worden opgewekt, zoals bevestigd door qRT-PCR, ELISA, en Phalloidin vlekken. Verder schetst ons protocol gedetailleerde stappen die nodig zijn voor de efficiënte knockdown van een specifiek gen van belang met behulp van siRNA en lipide-gebaseerde transfections. Over het geheel genomen is deze methode presenteert de mogelijkheid te bestuderen van de onderliggende cellulaire en moleculaire mechanism(s) HESC decidualization is gekoppeld.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Dit werk wordt ondersteund door de financiering van National Institutes of Health (NIH) / National Institute of Child Health en menselijke ontwikkeling (NICHD) grant (R00 HD080742) en Washington University School of Medicine start-up fondsen aan R.K. We zouden graag bedanken de Washington University vruchtbaarheid kliniek voor het verstrekken van de monsters van het endometrium biopsie.
Acknowledgments
De auteurs hebben niets te onthullen.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Opti-MEM I (1X) Reduced Serum Medium | Gibco | 31985-070 | For decidualization media |
| DMEM / F12 (1:1) (1X) | Gibco | 11330-032 | |
| Trypan Blue Stain (0.4%) | Gibco | 15250-061 | For cell count |
| PureLink RNA Mini Kit | Invitrogen | 12183018A | For RNA Isolation/Purification |
| TaqMan 2X Universal PCR Master Mix | Applied Biosystems | 4304437 | |
| High Capacity cDNA Reverse Transcription Kit | Applied Biosystems | 4374967 | |
| Eukaryotic 18S rRNA Endogenous Control | Life Technologies | 4319413E | For qPCR internal control |
| TaqMan Gene Expression Assay Prolactin Probe | Applied Biosystems | 4331182 | For qPCR internal control |
| TaqMan Gene Expression Assay IGFBP1 Probe | Applied Biosystems | 4331182 | For qPCR internal control |
| Phalloidin-iFluor 488 Reagent - CytoPainter | Abcam | ab176753 | |
| Human Prolactin ELISA Kit | Invitrogen | EHIAPRL | |
| 16% Paraformaldehyde | Alfa Aesar | 30525-89-4 | Fixative |
| Lipofectamine RNAiMAX | Invitrogen | 13778150 | Transfection Reagent |
| ProLong Gold antifade reagent with DAPI | Invitrogen | P36935 | For mounting |
| 0.25% Trypsin-EDTA (1X) | Gibco | 25200-056 | |
| Penicillin Streptomycin | Gibco | 15140-122 | |
| Charcoal Stripped Fetal Bovine Serum | Sigma | F6765-500ML | |
| Sodium Bicarbonate (7.5%) | Gibco | 25080-094 | |
| Ficoll-Paque PLUS Reagent | Fisher Scientific | 45001749 | |
| Collagenase from Clostridium histolyticum | Sigma | C0130-1G | |
| Deoxyribonuclease I from bovine pancreas | Sigma | DN25-100MG | |
| Medroxyprogesterone 17-acetate | Sigma | M1629-1G | For EPC Media |
| Estradiol | Sigma | E1024-1G | For EPC Media |
| cAMP | Sigma | A6885-100MG | For EPC Media |
| Fine straight stitch scissors | Fine Science Tools | 15396-00 | |
| TaqMan Gene Expression Assay NCOA2 Probe | Applied Biosystems | 4351372 | |
| Fetal Bovine Serum, heat inactivated | Gibco | 10-082-147 | |
| Antibiotic-antimycotic | Thermo Scientific | 15240062 | |
| Hank’s Balanced Salt Solution | Corning | 21-021-cv | |
| 50 mL conical polypropylene Falcon tube | Corning | 352098 | |
| Dumont #5/45 Forceps | Fine Science Tools | 11251-35 | |
| 100 x 15 mm Glass Petri dish | VWR | 75845-546 | |
| 40 micron cell strainer | Midsci | 229481 | |
| Isotemp 215 Water bath | Fisher Scientific | FS-215 | |
| LSE Centrifuge | Corning | 6755 | |
| Human NCOA2 siRNA | Dharmacon | L-020159-00 | Gene specific qPCR probe |
| Steri-cycle i160 CO2 Incubator | Thermo Scientific | 51030301 | |
| NanoDrop 2000 | Thermo Scientific | ND-2000 | For RNA quantification |
| Phosphate Buffered Saline | Fisher Scientific | 50146771 | |
| 75 cm Canted Neck Cell Culture flask | Corning | 430641U | |
| 6 well Non-Pyrogenic Cell Culture Plate | Corning | 3506 | |
| Pipet Controller Ultra | Corning | 4099 | |
| Photoshop | Adobe | 19.0.1.334 | |
| 25 cm Canted Neck Cell Culture flask | Corning | 7200876 | |
| Triton X-100 | Sigma | X100-1L | |
| 15 mL conical polypropylene Falcon tube | Corning | 352099 | |
| 10 mL Syringe | BD | 302995 | |
| 1300 Series A2 Biological Safety Hood | Thermo Scientific | 1377 | |
| accuspin Micro17 centrifuge | Fisher Scientific | 13100675 | |
| 7500 Fast real time PCR system | Applied Biosystems | 3052632 | |
| EVOS FL Immunofluorescence Microscope | Life Technologies | 01414-155G-291 | |
| Leica Inverted Light Microscope | Leica | DMi1 | |
| Illrustrator | Adobe | 22.0.1.253 | |
| Excel Spreadsheets | Microsoft | 2016 | |
| Deckglaser 18 mm cover glasses | NeuVitro | GG-18 | |
| Reichert Bright-Line Hemacytometer | Sigma | Z359629-1EA | |
| 2-mercaptoethanol | Fisher Bioreagents | BP176-100 | For RNA lysis buffer |
| 1.2mL External Threaded Polypropylene Cryogenic Vial | Corning | 430658 | For freezing HESC cells |
| Dimethyl Sulfoxide (DMSO) | Sigma | D2650-100mL | For freezing media |
References
- Maruyama, T., Yoshimura, Y. Molecular and cellular mechanisms for differentiation and regeneration of the uterine endometrium. Endocrine Journal. 55, 795-810 (2008).
- Yu, J., et al. Endometrial Stromal Decidualization Responds Reversibly to Hormone Stimulation and Withdrawal. Endocrinology. 157, 2432-2446 (2016).
- Ahn, J. I., et al. cAMP-Response Element-Binding 3-Like Protein 1 (CREB3L1) is Required for Decidualization and its Expression is Decreased in Women with Endometriosis. Current Molecular Medicine. 16, 276-287 (2016).
- Gellersen, B., Brosens, J. J. Cyclic decidualization of the human endometrium in reproductive health and failure. Endocrine Reviews. 35, 851-905 (2014).
- Telgmann, R., Gellersen, B. Marker genes of decidualization: activation of the decidual prolactin gene. Human Reproduction Update. 4, 472-479 (1998).
- Camden, A. J., et al. Growth regulation by estrogen in breast cancer 1 (GREB1) is a novel progesterone-responsive gene required for human endometrial stromal decidualization. Molecular Human Reproduction. 23, 646-653 (2017).
- Kommagani, R., et al. The Promyelocytic Leukemia Zinc Finger Transcription Factor Is Critical for Human Endometrial Stromal Cell Decidualization. PLoS Genetics. 12, e1005937 (2016).
- Large, M. J., DeMayo, F. J. The regulation of embryo implantation and endometrial decidualization by progesterone receptor signaling. Molecular and Cellular Endocrinology. 358, 155-165 (2012).
- Zhang, X. H., et al. The mesenchymal-epithelial transition during in vitro decidualization. Reproductive Sciences. 20, 354-360 (2013).
- Kommagani, R., et al. Acceleration of the glycolytic flux by steroid receptor coactivator-2 is essential for endometrial decidualization. PLoS Genetics. 9, e1003900 (2013).
- Ramathal, C. Y., Bagchi, I. C., Taylor, R. N., Bagchi, M. K. Endometrial decidualization: of mice and men. Seminars in Reproductive Medicine. 28, 17-26 (2010).
- Tamura, I., et al. Novel Function of a Transcription Factor WT1 in Regulating Decidualization in Human Endometrial Stromal Cells and Its Molecular Mechanism. Endocrinology. 158, 3696-3707 (2017).
- Vinketova, K., Mourdjeva, M., Oreshkova, T. Human Decidual Stromal Cells as a Component of the Implantation Niche and a Modulator of Maternal Immunity. Journal of Pregnancy. , 8689436 (2016).
- Wu, D., et al. Chronic endometritis modifies decidualization in human endometrial stromal cells. Reproductive Biology and Endocrinology. 15, 16 (2017).
- Garcia-Elias, A., et al. Defining quantification methods and optimizing protocols for microarray hybridization of circulating microRNAs. Scientific Reports. 7, 7725 (2017).
- Brosens, J. J., et al. Human endometrial fibroblasts immortalized by simian virus 40 large T antigen differentiate in response to a decidualization stimulus. Endocrinology. 137, 2225-2231 (1996).
- Koukouritaki, S. B., Margioris, A. N., Gravanis, A., Hartig, R., Stournaras, C. Dexamethasone induces rapid actin assembly in human endometrial cells without affecting its synthesis. Journal of Cellular Biochemistry. 65, 492-500 (1997).
