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Developmental Biology

आइसोलेशन इन विट्रो Decidualization के लिए मानव एंडोमेट्रियल Stromal कोशिकाओं का

Published: September 1, 2018 doi: 10.3791/57684
Automatic Translation
*1, *1, 1, 1
1Department of Obstetrics and Gynecology, Center for Reproductive Health Sciences, Washington University School of Medicine
* These authors contributed equally

Summary

इस अध्ययन के एक सत्यापित और अलगाव और मानव एंडोमेट्रियल stromal कोशिकाओं की संस्कृति के लिए प्रक्रिया को इन विट्रो decidualization परख में आचरण प्रस्तुत करता है । इसके अलावा, यह अध्ययन कुशलतापूर्वक मानव एंडोमेट्रियल stromal कोशिकाओं में siRNAs का उपयोग कर एक विशिष्ट जीन पछाड़ना करने के लिए एक विस्तृत विधि प्रदान करता है ।

Abstract

fibroblast से मानव एंडोमेट्रियल stromal कोशिकाओं (HESC) के भेदभाव स्रावी decidua में उपस्थिति की तरह मातृ गर्भ के गर्भाशय अस्तर में भ्रूण आरोपण के लिए आवश्यक परिवर्तन है । अनुचित decidualization आरोपण विफलता और बाद में जल्दी भ्रूण गर्भपात के लिए एक मूल कारण के रूप में स्थापित किया गया है । इसलिए, decidualization अंतर्निहित आणविक तंत्र को समझना सफल जन्मों की दर में सुधार करने के लिए लाभप्रद है । vivo आधारित अध्ययनों में कृत्रिम decidualization के अक्सर मानव अनुसंधान के साथ जुड़े नैतिक दुविधाओं के कारण सीमित कर रहे हैं, साथ ही पशु मॉडलों के भीतर अनुवाद जटिलताओं. एक परिणाम के रूप में , इन विट्रो परख प्राथमिक सेल संस्कृति के माध्यम से अक्सर हार्मोन के माध्यम से decidualization के मॉडुलन का पता लगाने के लिए उपयोग किया जाता है । यह अध्ययन HESC के अलगाव और बाद में कृत्रिम decidualization हार्मोन की पूरकता के माध्यम से संवर्धन माध्यम के लिए एक विस्तृत प्रोटोकॉल प्रदान करता है । इसके अलावा, यह अध्ययन लिपिड आधारित सिरना transfections का उपयोग करके ब्याज की किसी भी जीन पछाड़ना करने के लिए एक अच्छी तरह से डिजाइन विधि प्रदान करता है । इस प्रोटोकॉल संस्कृति पवित्रता के अनुकूलन के रूप में के रूप में अच्छी तरह से उत्पाद उपज परमिट, जिससे एक विश्वसनीय विधि के रूप में इस मॉडल का उपयोग करने आणविक decidualization अंतर्निहित तंत्र को समझने की क्षमता अधिकतम, और बाद के ठहराव decidualized एंडोमेट्रियल stromal कोशिकाओं द्वारा गुप्त एजेंटों ।

Introduction

मिनार्चे और रजोनिवृत्ति के चरणों के बीच, प्रजनन आयु की महिलाओं को मासिक धर्म के रूप में जाना जाता है एक प्रक्रिया में गर्भावस्था के लिए तैयारी में हार्मोन विनियमित एंडोमेट्रियल प्रसार, भेदभाव, और बाद में बहा से गुजरना ,2. मानव अंतर्गर्भाशयकला के इस तरह के भौतिक संशोधन गर्भाशय की दीवार1में उचित भ्रूण आरोपण के लिए आवश्यक हैं । अंतर्गर्भाशयकला के परिवर्तन, दोनों रूपात्मक और जैव रासायनिक रूपांतरों सहित, डिम्बग्रंथि स्टेरॉयड हार्मोन एस्ट्रोजन और प्रोजेस्टेरोन (पी 4)3,4,5के माध्यम से मासिक धर्म चक्र भर में मध्यस्थता कर रहे हैं. प्रफलन (या तोंसिल्लितिस) चरण के भीतर, preovulatory एस्ट्रोजन का स्तर बढ़ाने के लिए, अंतर्गर्भाशयकला और अधिक मोटा होना आरंभ । निम्नलिखित ovulation, स्रावी (या लुटियल) चरण पी 4 सांद्रता में एक महत्वपूर्ण वृद्धि को बढ़ावा देता है, एंडोमेट्रियल stromal कोशिकाओं के रूपात्मक परिवर्तन उत्प्रेरण (ESC) से fibroblast की तरह उपस्थिति गोल करने के लिए, उपकला की तरह decidual कोशिकाओं decidualization4,6के रूप में जाना एक प्रक्रिया में । अनुचित decidualization आरोपण विफलता और बाद में जल्दी भ्रूण गर्भपात4,7,8के लिए एक मूल कारण के रूप में स्थापित किया गया है । इसलिए, आणविक decidualization अंतर्निहित तंत्र को समझने के निदान और जल्दी गर्भावस्था के नुकसान के उपचार के लिए लाभप्रद है ।

वर्तमान में, कई तरीकों एंडोमेट्रियल stromal कोशिकाओं पर decidualization के अंतर्निहित प्रभावों का पता लगाने के लिए उपयोग किया जाता है । vivo में, माउस गर्भाशय कृत्रिम रूप से यांत्रिक उत्तेजना के माध्यम से decidualization के लिए प्रेरित किया जा सकता है (यानी,, scratching) या एक हार्मोनल में एक प्रधान गर्भाशय में तेल इंजेक्शन9. मनुष्यों से अलग, इस सिंथेटिक उत्तेजना ब्लास्टोसिस्ट उपस्थिति, एक कदम है कि कुतर10,11में decidualization की दीक्षा के लिए आवश्यक है की उपस्थिति प्रदान करके गर्भाशय लुमेन के भेदभाव को बढ़ावा देता है । तदनुसार, अनुवाद के कारण पशु मॉडल के साथ जुड़े जटिलताओं और मानव में vivo आधारित अध्ययन में आसपास के नैतिक दुविधाओं, decidualization आधारित मॉडल सबसे सफलतापूर्वक इन विट्रो में अध्ययन कर रहे हैं ।

इस अध्ययन में, विषयों दोनों स्थानीय अंग्रेजी और स्पेनिश अखबारों में विज्ञापनों के स्थान के माध्यम से भर्ती कर रहे हैं । इस अध्ययन के लिए उपयुक्त उंमीदवारों के रूप में पहचाने गए विषयों को अनुसंधान समंवयक के साथ मिलने के लिए लाया जाता है, जिसमें संभावित जोखिमों का पूर्ण प्रकटीकरण चर्चा में होता है । संभावित जोखिम शामिल की एक पूरी समझ की पुष्टि पर, विषयों की सहमति दोनों लिखित और मौखिक रूपों में प्राप्त होता है । विषय सहमति के लिए अनुमति शामिल है (1) phlebotomy से गुजरना (2) भावी अनुसंधान प्रयोजनों के लिए अपने ऊतकों की लंबी अवधि के भंडारण और (3) एकत्र ऊतक नमूनों से प्राथमिक संस्कृतियों के निर्माण के लिए सहमत हैं । सहमति के बाद, विषयों को पूरा करने के लिए एक फार्म दिया जाता है जिसमें स्वयं की अनुमति की दौड़ की पहचान/जातीयता और/ एक बाद की यात्रा के लिए अंतर्गर्भाशयकला है विषय मासिक धर्म चक्र के आधार पर बायोप्सी प्राप्त करने के लिए निर्धारित है । स्वयंसेवकों इस अध्ययन के लिए भर्ती दोनों जातीय और नस्लीय जनसांख्यिकी के रूप में अनुसूचित जनजाति लुई महानगरीय क्षेत्र के २०१२ जनगणना द्वारा प्रलेखित और गर्भवती महिलाओं, भ्रूण, भ्रूण सहित किसी भी कमजोर आबादी की भागीदारी को शामिल नहीं किया है, 18 वर्ष से कम आयु के बच्चे, या अंय संवेदनशील समूह । बायोप्सी नमूना संग्रह में भाग लेने के लिए पात्रता आवश्यकताओं में शामिल हैं (1) 18-45 वर्ष की आयु के बीच किया जा रहा (2) नियमित माहवारी चक्र होने (25-32 दिन) (3) कोई वर्तमान गर्भावस्था या हार्मोनल/अंतर्गर्भाशयी डिवाइस गर्भ निरोधक का उपयोग कर 30 दिनों के लिए नामांकन से पहले (4) कोई वर्तमान योनि संक्रमण या यौन संचारित रोगों (5) कोई वर्तमान एंटीबायोटिक उपचार होने, और (6) कोई वर्तमान असामांय पीएपी धब्बा होने ।

इस अध्ययन के भीतर, मानव एंडोमेट्रियल stromal कोशिकाओं (HESC) और संस्कृति और कृत्रिम रूप से हार्मोन की पूरकता के माध्यम से decidualization इन विट्रो में से गुजरना करने के लिए प्रेरित कर रहे हैं (एस्ट्राडियोल (E2), medroxyprogesterone एसीटेट (MPA), और चक्रीय adenosine मोनोफोस्फेट (cAMP)) को यम से । इस विधि में, decidualization की डिग्री हार्मोनल उपचार के दिनों की कुल संख्या के आधार पर बदल दिया है । cytoskeletal पुनर्व्यवस्था के साथ संयोजन के रूप में, हार्मोन अनुपूरण जैव रासायनिक रूपांतरों जो decidual कोशिकाओं स्रावी तरह के गुणों का अनुभव2,4लाती है । पहचान जीन की अभिव्यक्ति, जैसे प्रोलैक्टिन (PRL) और इंसुलिन जैसे विकास कारक बंधन प्रोटीन 1 (IGFBP1), की पुष्टि करने के लिए उपयोग किया जा सकता है और HESC decidualization5,12की डिग्री यों तो 13 , 14. महत्वपूर्ण बात, इस प्रोटोकॉल की व्यवहार्यता जीन विशिष्ट पछाड़ना आचरण भी प्रदर्शन किया है ।

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Protocol

इस अध्ययन के लिए एकत्र किए गए सभी मानव अंतर्गर्भाशयकला बायोप्सी को वॉशिंगटन विश्वविद्यालय के सेंट लुइस, प्रसूति एवं स्त्रीरोग विज्ञान विभाग में एक संस्थागत समीक्षा बोर्ड (आईआरबी) के लिखित सहमति प्रपत्र के उपयोग से प्राप्त किया गया था ।

1. तैयारी

  1. (आगे HBSS + माध्यम के रूप में संदर्भित) १०० U/एमएल पेनिसिलिन और १०० µ g/ml streptomycin जोड़कर 1x हांक के संतुलित नमक समाधान (HBSS) की ५०० मिलीलीटर तैयार करें ।
  2. Dulbecco के संशोधित ईगल मध्यम के ५०० मिलीलीटर तैयार करें: पोषक तत्व मिश्रण एफ 12 (DMEM/F12) के साथ phenol लाल, एल-glutamine, और 15 मिमी 4-(2-hydroxyethyl) -1-piperazineethanesulfonic एसिड (HEPES) 1% जोड़कर एंटीबायोटिक-antimycotic समाधान (अंतिम एकाग्रता है १०० U/एमएल पेनिसिलिन, १०० µ g/ml Streptomycin, और ०.२५ µ g/ml Fungizone) (आगे HESC आइसोलेशन मीडिया के रूप में संदर्भित) बोतल युक्त मीडिया के लिए ।
  3. phenol लाल के साथ DMEM/F12 के ५०० मिलीलीटर तैयार करें, एल-glutamine, और 15 मिमी HEPES जोड़कर 10% भ्रूण गोजातीय सीरम (FBS), 1x Na2HCO3, और 1% पेनिसिलिन (१०,००० U/एमएल) और Streptomycin (१०,००० µ g/एमएल) (पेन Strep) बोतल युक्त मीडिया को (आगे HESC मीडिया के रूप में संदर्भित) ।
  4. एल-Glutamine, २.४ g/l सोडियम बिकारबोनिट, और HEPES के साथ 2% चारकोल छीन भ्रूण गोजातीय सीरम (csFBS) और बोतल युक्त मीडिया के लिए 1% पेन Strep (आगे Decidualization मीडिया के रूप में संदर्भित) के साथ कम सीरम मध्यम के ५०० मिलीलीटर तैयार करें ।
  5. 2% जोड़ने के द्वारा Phenol लाल नि: शुल्क DMEM/F12 की ५०० मिलीलीटर तैयार चारकोल बोतल युक्त मीडिया में भ्रूण गोजातीय सीरम (csFBS) छीन (आगे परिवर्तन मीडिया के रूप में संदर्भित) ।
  6. तैयार 10 एनएम एस्ट्राडियोल (E2), 1 µ एम medroxyprogesterone एसीटेट (MPA), और ५० µ एम चक्रीय adenosine मोनोफोस्फेट (शिविर) एक 15 मिलीलीटर में शंकु ट्यूब, और एक 2 मिलीलीटर में जोड़ने के लिए पहले से तैयार aliquot मीडिया के decidualization के प्रति इन विट्रो decidualization परख (आगे ईपीसी मीडिया के रूप में संदर्भित) ।
  7. ९०% FBS और 10% Dimethyl sulfoxide (DMSO) ५० मिलीलीटर में शंकु ट्यूब (आगे ठंड मीडिया के रूप में संदर्भित) के साथ ठंड मीडिया के ५० मिलीलीटर तैयार करें ।
  8. पूर्व वजन 25 Collagenase के मिलीग्राम और 5 DNase के मिलीग्राम मैं एक ५० मिलीलीटर में शंकु के के रूप में ट्यूब और स्टोर-20 डिग्री सेल्सियस ।

2. मानव अंतर्गर्भाशयकला बायोप्सी अधिग्रहण

  1. HBSS में आईआरबी अनुमोदित क्लिनिक से मासिक धर्म चक्र के प्रफलन चरण (दिन 9 दिन 12) में एकत्र मानव अंतर्गर्भाशयकला बायोप्सी नमूने प्राप्त करें ।
  2. गर्म ३७ ° c HBSS + मध्यम और धीरे से अतिरिक्त रक्त और श्लेष्म को दूर करने के लिए हिला के 1 मिलीलीटर के साथ बायोप्सी के नमूने धो लें ।

3. मानव एंडोमेट्रियल Stromal कोशिकाओं का अलगाव (HESC)

नोट: यह आइसोलेशन प्रक्रिया एक जैविक सुरक्षा कैबिनेट के तहत एक बाँझ वातावरण में किया जाता है ।

  1. एक ५० मिलीलीटर शंकु के रूप में निष्फल संदंश के साथ बायोप्सी हस्तांतरण केंद्रापसारक ट्यूब 10 मिलीलीटर ताजा HBSS युक्त ।
  2. ९० एस के लिए ५०० x g पर कमरे के तापमान पर बायोप्सी केंद्रापसारक ।
    1. यदि सेल गोली टूटना, फिर से ९० एस के लिए २,००० x g पर बायोप्सी स्पिन ।
  3. एक 1 मिलीलीटर प्लास्टिक का उपयोग कर मीडिया को निकालें और ३७ ° c के 10 मिलीलीटर के साथ धो गरम HESC अलगाव ५०० एक्स जी पर केंद्रापसारक द्वारा पीछा मीडिया ९० एस के लिए ।
  4. एक 1 मिलीलीटर प्लास्टिक का उपयोग कर मीडिया को निकालें, और तेजी से ताजा HESC अलगाव मीडिया के 3 एमएल जोड़ने के लिए बायोप्सी बेदखल ।
  5. एक पेट्री HESC अलगाव मीडिया के 5 मिलीलीटर युक्त पकवान में बायोप्सी नहीं कर सकते ।
  6. लगभग 20 मिनट के लिए #5 संदंश और ठीक सीधे सिलाई कैंची का उपयोग संभव के रूप में छोटे टुकड़े के रूप में बायोप्सी कीमा ।
  7. DNase मैं और Collagenase एंजाइमों HESC अलगाव मीडिया के 10 मिलीलीटर पूर्व वजन DNase मैं (०.५ मिलीग्राम/एमएल) और Collagenase (२.५ मिलीग्राम/एमएल) को जोड़कर तैयार करें । प्लास्टिक के साथ मिलाएं ।
  8. पिपेट कट ऊतक नमूने एक नया ५० मिलीलीटर शंकु के ट्यूब में एक 1 मिलीलीटर प्लास्टिक का उपयोग कर । HESC अलगाव मीडिया के 7 मिलीलीटर के साथ धोने और पूर्ण नमूना प्राप्त करने के लिए
  9. 2 मिनट के लिए ८०० x g पर कमरे के तापमान पर नमूना केंद्रापसारक धीरे पिपेट द्वारा supernatant निकालें ।
  10. DNase मैं और Collagenase समाधान ०.२ µm फिल्टर के माध्यम से 10 मिलीलीटर गोली पर सीधे सिरिंज से जुड़ी फ़िल्टर ।
  11. 10 एस के लिए भंवर गोली resuspend करने के लिए ।
  12. १.५ एच के लिए ३७ ° c जल स्नान में डाइजेस्ट, 10 एस अच्छी तरह से हर 10 मिनट के लिए भंवर, जब तक ऊतक पच जाता है ।
  13. उपकला कोशिकाओं और ऊतक मलबे को दूर करने के लिए एक ५० मिलीलीटर शंकु के ट्यूब पर खड़ी एक ४० µm सेल छलनी के माध्यम से नमूना फ़िल्टर ।
    नोट: Stromal कोशिकाओं ५० मिलीलीटर शंकु के ट्यूब में हैं ।
  14. कमरे के तापमान पर २.५ मिनट के लिए ८०० x g में ५० मिलीलीटर शंकु के ट्यूब के केंद्रापसारक । धीरे से एक 1 मिलीलीटर पिपेट के साथ supernatant निकालें ।
  15. HESC अलगाव मीडिया के 10 मिलीलीटर में गोली resuspend ।
  16. कमरे के तापमान पर २.५ मिनट के लिए ८०० x g पर केंद्रापसारक । महाप्राण supernatant, और फिर HESC मीडिया और पिपेट आगे और मिश्रण करने के लिए रिवर्स की 6 मिलीलीटर में कोशिकाओं resuspend ।
  17. धीरे से resuspend कोशिकाओं को घनत्व ढाल मीडिया के 3 मिलीलीटर पर परत stromal कोशिकाओं से शेष रक्त कोशिकाओं को अलग करने के लिए, परतों मिश्रण करने के लिए सावधान नहीं किया जा रहा ।
  18. ४०० x g पर कमरे के तापमान पर 30 मिनट के लिए 15 एमएल के ट्यूब के केंद्रापसारक ।
  19. एक नया ५० एमएल के ट्यूब में supernatant के 5 मिलीलीटर ले लीजिए और कोशिकाओं को resuspend करने के लिए एक अतिरिक्त 5 मिलीलीटर HESC मीडिया जोड़ें ।
  20. ८०० पर २.५ मिनट के लिए एक्स जी पर केंद्रापसारक कमरे के तापमान, supernatant और 6 मिलीलीटर HESC मीडिया के अलावा हटाने के द्वारा पीछा किया । भंवर 10 एस के लिए नमूने और आगे pipetting और रिवर्स द्वारा 5 बार मिश्रण ।
  21. Aliquot सेल गिनती के लिए १.५ मिलीलीटर microcentrifuge ट्यूब के लिए पुनः निलंबित कोशिकाओं के 10 µ एल ।
  22. सेल aliquot करने के लिए ०.४% Trypan नीले दाग के 10 µ एल जोड़ें और प्लास्टिक के साथ मिश्रण । aliquot के 10 µ एल लोड और एक hemocytometer का उपयोग कर कोशिकाओं की गणना ।
  23. प्लेट एक उचित कुप्पी में कुल सेल गणना पर निर्भर में कोशिकाओं 15 एमएल HESC मीडिया ।
    1. यदि कक्षों की कुल संख्या १,०००,००० से कम है, तो HESC मीडिया के 6 मिलीलीटर के साथ 25-सेमी कुप्पी में सभी कक्षों को प्लेट करें । यदि कक्षों की कुल संख्या १,०००,००० से अधिक है, तो HESC मीडिया के 15 मिलीलीटर के साथ ७५-सेमी कुप्पी में सभी कक्षों को प्लेट करें ।
  24. संस्कृति ३७ डिग्री सेल्सियस पर एक 5% सह2 मशीन में 6 एच की एक ंयूनतम के लिए कोशिकाओं को उचित सेल आसंजन सुनिश्चित करने और मीडिया HESC मीडिया बदलने के लिए ।
  25. संस्कृति एक 5% CO2 मशीन में ३७ डिग्री सेल्सियस में अलग HESC 3-5 दिनों की अवधि के लिए जब तक कोशिकाओं को एक monolayer प्राप्त ८०-९०% एक मढ़वाया कुप्पी में प्रवाह ।
  26. हर दो दिन में HESC मीडिया बदलें ।
    1. एक ३७ ° c जल स्नान में गर्म HESC मीडिया 15-20 मिनट के लिए ।
    2. महाप्राण मीडिया कुप्पी से और कुप्पी (कार्य मात्रा: 8 मिलीलीटर या 16 मिलीलीटर प्रति 25-सेमी या ७५-सेमी कुप्पी क्रमशः) करने के लिए ताजा HESC मीडिया जोड़ें ।
    3. जगह कुप्पी वापस 5% सह2 मशीन में ३७ ° c में 80-90% तक प्रवाह प्राप्त किया है जब तक ।
  27. एक बार HESC बन ८०-९०% धाराप्रवाह, स्थानांतरण कोशिकाओं से 25-सेमी से ७५-सेमी कुप्पी या १ ७५-सेमी कुप्पी से ३ ७५-सेमी कुप्पी तक ।
    नोट: HESC जमे हुए और भविष्य के प्रयोग के लिए इस समय में बाद में उपयोग के लिए संग्रहीत किया जा सकता है ।

4. फ्रीज और गल HESCs

  1. महाप्राण मीडिया से ७५-सेमी कुप्पी और trypsin-EDTA के 2 मिलीलीटर जोड़ें ।
  2. ३७ ° c पर 2-3 मिनट के लिए एक 5% CO2 मशीन में मशीन जब तक कोशिकाओं कुप्पी से बेदखल करना ।
  3. HESC मीडिया के 7 मिलीलीटर जोड़ें और pipetting आगे और रिवर्स द्वारा अच्छी तरह से मिश्रण ।
  4. २.५ मिनट के लिए ८०० x g पर केंद्रापसारक और महाप्राण supernatant ।
  5. लेबल सेल लाइन, तिथि, और बीतने संख्या के साथ ठंड ट्यूबों ।
  6. फिर से फ्रीज मीडिया के 5 मिलीलीटर में सेल गोली निलंबित ।
  7. Aliquot के 1 मिलीलीटर पुनः निलंबित HESC के प्रत्येक ट्यूब और स्थानांतरण ट्यूबों को-८० ° c फ्रीजर ।
  8. स्थानांतरण ट्यूबों 24 घंटे के भीतर तरल नाइट्रोजन के लिए ।
    नोट: यदि तुरंत भविष्य में गल कोशिकाओं की योजना बना, एक महीने के लिए-८० डिग्री सेल्सियस में जमे हुए कोशिकाओं की दुकान ।
  9. गल के लिए HESCs कचौरी HESC मीडिया 20 min.
  10. 25 सेमी कुप्पी के लिए कचौरी HESC मीडिया के 8 मिलीलीटर जोड़ें ।
  11. तरल नाइट्रोजन टैंक या-८० डिग्री सेल्सियस से ठंड ट्यूब पुनः प्राप्त करने और ३७ डिग्री सेल्सियस पानी स्नान के लिए 1-2 मिनट गल कोशिकाओं में ट्यूब जलमग्न ।
  12. HESC मीडिया और एक 5% CO2 मशीन में ३७ डिग्री सेल्सियस पर रात में मशीन के साथ एक 25 सेमी कुप्पी के लिए HESC गल हस्तांतरण ।
  13. अगले दिन, HESC मीडिया बदलने के लिए और 2-3 दिनों के लिए रुको जब तक HESC धाराप्रवाह हो और ७५-सेमी कुप्पी के रूप में 5 प्रोटोकॉल में नीचे विस्तृत के रूप में कोशिकाओं को स्थानांतरित ।
    1. एक ३७ ° c जल स्नान में गर्म HESC मीडिया 15-20 मिनट के लिए ।
    2. महाप्राण मीडिया कुप्पी से और कुप्पी (कार्य मात्रा: 8 मिलीलीटर या 16 मिलीलीटर प्रति 25-सेमी या ७५-सेमी कुप्पी क्रमशः) करने के लिए ताजा HESC मीडिया जोड़ें ।
    3. जगह कुप्पी वापस 5% सह2 मशीन में ३७ ° c में 80-90% तक प्रवाह प्राप्त किया है जब तक ।

5. ह्यूमन एंडोमेट्रियल Stromal सेल (HESC) संवर्धन

नोट: यह संवर्धन प्रक्रिया एक जैविक सुरक्षा कैबिनेट के तहत एक बाँझ वातावरण में किया जाता है ।

  1. 20-30 मिनट के लिए एक जल स्नान में 37 ° c पर पूर्व हीट HESC मीडिया ।
  2. महाप्राण मीडिया कुप्पी से और जोड़ें ०.२५% Trypsin ethylenediaminetetraacetic एसिड (EDTA) (के लिए 1 मिलीलीटर 25-सेमी कुप्पी या 2 मिलीलीटर के लिए ७५-सेमी कुप्पी).
  3. 2-3 मिनट के लिए ३७ ° c में एक 5% CO2 मशीन में मशीन जब तक कोशिकाओं को उखाड़ फेंक ।
  4. धीरे शेष कोशिकाओं को बेदखल करने के लिए कुप्पी दीवारों नल । HESC मीडिया के 7 मिलीलीटर जोड़ें और pipetting आगे और रिवर्स द्वारा अच्छी तरह से मिश्रण ।
  5. कक्ष के तापमान पर २.५ मिनट के लिए ८०० x g में ५० मिलीलीटर शंकु के ट्यूब और केंद्रापसारक में सेल मिश्रण प्लास्टिक ।
  6. महाप्राण supernatant और पुनः निलंबित HESC मीडिया में सेल गोली ।
    1. ७५ के लिए 25 सेमी कुप्पी या 45mL के लिए 15 मिलीलीटर जोड़ें-सेमी कुप्पी (15 मिलीलीटर प्रत्येक) ।
  7. प्रत्येक 25 सेमी या ७५ सेमी कुप्पी क्रमशः 5 मिलीलीटर या 15 मिलीलीटर सेल निलंबन जोड़ें ।
  8. संस्कृति एक 5% CO2 मशीन में ३७ डिग्री सेल्सियस में अलग HESC 3-5 दिनों की अवधि के लिए जब तक कोशिकाओं को एक monolayer प्राप्त ८०-९०% एक मढ़वाया कुप्पी में प्रवाह ।
  9. हर दो दिन में HESC मीडिया बदलें ।
    1. एक ३७ ° c जल स्नान में गर्म HESC मीडिया 15-20 मिनट के लिए ।
    2. महाप्राण मीडिया कुप्पी से और कुप्पी (कार्य मात्रा: 8 मिलीलीटर या 16 मिलीलीटर प्रति 25-सेमी या ७५-सेमी कुप्पी क्रमशः) करने के लिए ताजा HESC मीडिया जोड़ें ।
    3. जगह कुप्पी वापस 5% सह2 मशीन में ३७ ° c में 80-90% तक प्रवाह प्राप्त किया है जब तक ।

6. ह्यूमन एंडोमेट्रियल Stromal सेल (HESC) चढ़ाना और सिरना अभिकर्मक

नोट: यह अभिकर्मक प्रक्रिया एक जैविक सुरक्षा कैबिनेट के तहत एक बाँझ वातावरण में किया जाता है ।

  1. महाप्राण HESC मीडिया से ७५-सेमी कुप्पी और ०.२५% trypsin-EDTA समाधान के 2 मिलीलीटर जोड़ें ।
  2. 2-3 मिनट के लिए ३७ ° c में 5% CO2 मशीन में गर्मी जब तक कोशिकाओं को हटाना ।
  3. एक बार कोशिकाओं कुप्पी से बेदखल कर रहे हैं, HESC मीडिया के 7 मिलीलीटर जोड़ने और धीरे आगे pipetting और रिवर्स 5 बार से मिश्रण ।
  4. कक्ष के तापमान पर २.५ मिनट के लिए ८०० x g में ५० मिलीलीटर शंकु के ट्यूब और केंद्रापसारक में सेल मिश्रण प्लास्टिक । महाप्राण supernatant और पुनः निलंबित HESC मीडिया के 10 मिलीलीटर में सेल गोली ।
    नोट: यदि एक से अधिक कुप्पी से कोशिकाओं को चढ़ाना, बस HESC मीडिया मात्रा में वृद्धि.
  5. किसी Hemocytometer का उपयोग करके कक्ष गिनना ।
    1. Aliquot १.५ मिलीलीटर microcentrifuge ट्यूब में पुनः निलंबित कोशिकाओं के 10 µ एल.
    2. सेल aliquot करने के लिए ०.४% Trypan नीले दाग के 10 µ एल जोड़ें और आगे और रिवर्स pipetting द्वारा मिश्रण ।
  6. प्लेट ०.८ x 105 अच्छी तरह से 6-अच्छी प्लेटों में प्रति कोशिकाओं । दो दिनों के बाद, कोशिकाओं को इष्टतम अभिकर्मक के लिए 60-70% धाराप्रवाह होना चाहिए ।
  7. प्रत्येक सिरना अभिकर्मक नमूना के लिए, अभिकर्मक एजेंट सिरना (६० nanomoles) का उपयोग कर परिसरों तैयार करते हैं ।
  8. कम सीरम नि: शुल्क मीडिया और 5 मिनट के लिए मशीन के १५० µ एल में अभिकर्मक रिएजेंट के 5 µ एल पतला ।
  9. कम सीरम मुक्त मीडिया के १०० µ एल में सिरना के ६० nanomoles पतला और 5 मिनट के लिए मशीन ।
  10. 5 मिनट के बाद, पतला अभिकर्मक एजेंट समाधान के साथ पतला सिरना गठबंधन और pipetting आगे और रिवर्स द्वारा धीरे मिश्रण 5 बार ।
    नोट: यदि transfecting एकाधिक कुओं में एक या एक से अधिक सिरना, 10 मिलीलीटर polystyrene ट्यूबों में मास्टर मिश्रण तैयार करते हैं ।
  11. गर्मी कमरे के तापमान पर 5 मिनट के लिए सिरना-अभिकर्मक एजेंट परिसरों ।
  12. इस मशीन के दौरान, एक अच्छी तरह से बदलने के लिए मीडिया के 1 मिलीलीटर जोड़ें ।
  13. मशीन के 5 मिनट के बाद, समाधान इकट्ठा करने और प्रत्येक अच्छी तरह से युक्त कोशिकाओं और मीडिया के लिए सिरना-अभिकर्मक रिएजेंट परिसरों के २५० µ एल जोड़ने के लिए 2 मिनट के लिए ५०० x g पर ट्यूबों केंद्रापसारक ।
  14. धीरे से मिश्रण और 5 घंटे के लिए एक 5% CO2 मशीन में 37 ° c में कोशिकाओं को गर्मी से मिलाएं ।
  15. 5 ज के बाद, मीडिया को HESC मीडिया में बदलें ।
  16. ३७ ° c में एक 5% कं2 मशीन में 2 दिनों के लिए तैयारी में एक इन विट्रो decidualization परख के लिए कोशिकाओं में मशीन ।

7. इन विट्रो Decidualization परख

नोट: यह परख एक जैविक सुरक्षा कैबिनेट के तहत एक बाँझ वातावरण में किया जाता है ।

  1. Camden एट अल के रूप में वर्णित इन विट्रो decidualization उपचार की शुरुआत करने से पहले ईपीसी मीडिया तैयार करें । 3 (१.६ देखें) ।
  2. महाप्राण के पद से मीडिया को ४८ घंटे की transfected लाइन HESC की मशीन से कदम ६.१६ ।
  3. एक अच्छी तरह से ईपीसी मीडिया के 2 मिलीलीटर जोड़ें ।
    नोट: एक नियंत्रण के रूप में, ईपीसी मीडिया के साथ अनुपचारित कोशिकाओं का एक सेट छोड़ दें । इसके बजाय, नियंत्रण कुओं के लिए HESC मीडिया के 2 मिलीलीटर जोड़ें ।
  4. 6 दिनों के लिए ३७ ° c में 5% CO2 मशीन में कोशिकाओं की मशीन ।
    1. ईपीसी मीडिया हर ४८ घंटे में बदलें ।
      1. गर्म और 15-20 मिनट के लिए एक ३७ ° c जल स्नान में ईपीसी मीडिया तैयार करते हैं ।
      2. महाप्राण मीडिया से अच्छी तरह से और ताजा ईपीसी मीडिया जोड़ें ।
      3. थाली ३७ डिग्री सेल्सियस पर 5% सह2 मशीन में वापस प्लेस ।
  5. छठे दिन के बाद, एलिसा और qRT-पीसीआर के माध्यम से stromal सेल decidualization की सीमा का विश्लेषण (जैसा कि नीचे वर्णित) ।

8. इन विट्रो Decidualization उपयोग मात्रात्मक रीयल टाइम पीसीआर (qRT-पीसीआर) के सत्यापन

नोट: qRT-पीसीआर पहले Kommagani एट अल10में वर्णित के रूप में पूरा हो गया है ।

  1. एक व्यावसायिक रूप से उपलब्ध आरएनए अलगाव किट से प्रोटोकॉल का उपयोग HESC से कुल आरएनए को अलग.
    1. गार्सिया-एलियास एट अल15में वर्णित के रूप में एक NanoDrop या इसी तरह की पद्धति का उपयोग कर आरएनए मात्रा और शुद्धता (एक२६०/२८०) का विश्लेषण करें ।
  2. एक व्यावसायिक रूप से उपलब्ध रिवर्स प्रतिलेखन किट प्रोटोकॉल के माध्यम से कुल आरएनए के 1 µ जी से संश्लेषित सीडीएनए.
  3. व्यावसायिक रूप से उपलब्ध qRT-पीसीआर किट प्रोटोकॉल में वर्णित qRT-पीसीआर प्रतिक्रिया चलाएं ।
    1. आंतरिक प्रणाली नियंत्रण (18s, PRL, और IGFBP1) के साथ साथ एक व्यावसायिक रूप से उपलब्ध वास्तविक समय पीसीआर मास्टर मिश्रण और जीन विशिष्ट जांच का उपयोग कर प्रतिक्रिया करते हैं ।

9. इन विट्रो Decidualization उपयोग एलिसा का सत्यापन

  1. ऊतक संस्कृति एक व्यावसायिक रूप से उपलब्ध प्रोलैक्टिन एलिसा किट का उपयोग मीडिया से गुप्त प्रोलैक्टिन स्तर यों तो ।

10. इन विट्रो Decidualization उपयोग Phalloidin धुंधला के सत्यापन ।

  1. एक अच्छी तरह से 12 प्लेट के प्रत्येक कुआं में बाँझ coverslips डालें ।
  2. दोहराएँ चरण ६.१-६.५.
  3. प्लेट ०.८ x 10 अच्छी तरह से एक थाली के प्रति अच्छी तरह से5 कोशिकाओं ।
  4. 2 दिनों के लिए ३७ ° c में 5% CO2 मशीन में कोशिकाओं की मशीन ।
  5. मीडिया को महाप्राण ।
  6. दोहराएँ चरण ७.३-७.४.
  7. 30 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर फॉस्फेट बफर खारा (पंजाब) में 4% paraformaldehyde (पीएफए) में कोशिकाओं को ठीक करें ।
  8. निर्धारण समाधान महाप्राण और 5 मिनट प्रत्येक के लिए पंजाब के 1 मिलीलीटर के साथ 3 बार धो लें ।
  9. जोड़ें ०.१% गैर ईओण surfactant पॉलीथीन ग्लाइकोल tert-octyl फिनाइल आकाश में 5 मिनट के लिए तय कोशिकाओं को पारगम्यता बढ़ाने के लिए ।
  10. 5 मिनट प्रत्येक के लिए पंजाब के 1 मिलीलीटर के साथ 3 बार धो लें ।
  11. coverslip प्रति phalloidin समाधान के १०० µ एल जोड़ें और ९० मिनट के लिए कमरे के तापमान पर मशीन ।
    1. 1 यूनिट प्रति 5 µ में एक phalloidin शेयर समाधान का उपयोग करने से पंजाब में 1:100 कमजोर पड़ने की तैयारी करें l
  12. 5 मिनट प्रत्येक के लिए पंजाब के 1 मिलीलीटर के साथ 3 बार धो लें ।
  13. माउंट 4 ', 6-Diamidino-2-Phenylindole (DAPI) युक्त माध्यम बढ़ते माध्यम के साथ स्लाइड ।
  14. एक फोकल माइक्रोस्कोप का उपयोग कोशिकाओं का निरीक्षण ।

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Representative Results

HESC संस्कृति में Decidualization

अलगाव के बाद, मानव एंडोमेट्रियल stromal कोशिकाओं 80-90% प्रवाह के साथ एक monolayer गठन के लिए प्रेरित किया गया और इन विट्रो decidualization के साथ इलाज द्वारा 10 एनएम E2, 1 µ m MPA, और ५० µ एम शिविर (ईपीसी) के साथ । इन विट्रो decidualization में साथ जुड़े रूपात्मक शिफ्ट्स चित्रा 1aमें visualized थे । decidualization पर, HESCs लंबी, fibroblastic कोशिकाओं से cytoskeletal पुनर्व्यवस्था से गुजरना epithelioid कोशिकाओं गोल । इस प्रकार, phalloidin धुंधला HESC decidualization के दौरान cytoskeletal पुनर्गठन की पुष्टि करने के लिए प्रदर्शन किया गया था । Phalloidin एक उच्च चयनात्मक bicyclic पेप्टाइड जो actin रेशा के लिए दाग के लिए उपयोग किया जाता है, इस प्रकार cytoskeletal के साथ संगत rearrangement visualizing इन विट्रो decidualization (आंकड़ा 1b).

पोस्ट ईपीसी उपचार के छह दिनों में, PRL और IGFBP1 mRNA स्तर decidualization (चित्रा 2a) की डिग्री की पुष्टि करने के लिए qRT-पीसीआर के माध्यम से मूल्यांकन किया गया । नियंत्रण वाहन (पी < 0.001) से इलाज HESC की तुलना में PRL और IGFBP1 का स्तर काफी बढ़ गया । decidualization से जुड़े जैव रासायनिक परिवर्तनों का भी संवर्धन माध्यम (चित्रा बी) से स्रावित PRL स्तरों के ठहराव के माध्यम से मूल्यांकन किया गया. प्रतिलिपि स्तर के अनुरूप, PRL स्तर अत्यधिक नियंत्रण (पी < 0.001) की तुलना में ईपीसी कल्चरल HESC में ऊंचा किया गया ।

सेलुलर और HESCs decidualization के आणविक परिवर्तन पर विशिष्ट जीन abrogation के प्रभाव के उंमीदवार जीन (चित्रा 3) के रूप में SRC-2 का उपयोग कर मूल्यांकन किया गया । नियंत्रण या SRC-2 सिरना के साथ अभिकर्मक के ४८ घंटे के बाद, HESC में ईपीसी मीडिया में 6 दिनों के लिए संस्कृति थे । नियंत्रण सिरना transfected HESC सेलुलर और आणविक परिवर्तन का प्रदर्शन उचित decidualization के साथ संगत, एक cobblestone रूपात्मक परिवर्तन और decidualization मार्करों PRL और IGFBP1के प्रतिलिपि स्तर में वृद्धि सहित । के रूप में की उंमीद है, SRC-2 सिरना पछाड़ना के साथ, HESC उपस्थिति में fibroblastic के रूप में नियंत्रण सिरना transfected HESC (3ए) की तुलना में बनी रही । इस सेलुलर परिवर्तन के अनुरूप, PRL और IGFBP1 प्रतिलेखन स्तर काफी src-2 सिरना transfected HESC के भीतर कमी आई थी, decidualization के साथ programing में एक पटरी का संकेत -2 पछाड़ना (* * *p < ०.००१) । src-2 प्रतिलिपि स्तर में काफी कम थे src-2 सिरना transfected HESC जब नियंत्रण सिरना की तुलना में, हमारे विधि के साथ एक कुशल जीन मुंह बंद करने का संकेत (* * *p < ०.००१) (चित्र 3 बी) ।

Figure 1
चित्रा 1 : सेलुलर परिवर्तन के दौरान मानव एंडोमेट्रियल stromal कोशिकाओं इन विट्रो में decidualization । HESCs अलग थे और या तो वाहन या E2, MPA और शिविर (ईपीसी) युक्त मीडिया में छह दिनों के लिए संस्कृति । A) fibroblastic से epithelioid कोशिकाओं में सेलुलर आकृति विज्ञान में परिवर्तन illustrating सेल छवियों. ख) Phalloidin HESC के दाग छवियों (हरे रंग में) cytoskeletal परिवर्तन illustrating के साथ जुड़े इन विट्रो decidualization, जहां नीले नाभिक का प्रतिनिधित्व करता है (DAPI) । लाल तीर decidualized कक्षों का प्रतिनिधित्व करता है । काला तीर fibroblastic कक्षों को दिखाता है । स्केल बार: १०० µm । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 2
चित्रा 2 : मानव एंडोमेट्रियल stromal कोशिकाओं में आणविक परिवर्तन के दौरान इन विट्रो में decidualization । एक) कुल आरएनए HSECs से अलग किया गया मीडिया में छह दिनों के लिए या तो वाहन या E2, MPA और शिविर (ईपीसी) युक्त और qRT-पीसीआर विश्लेषण करने के लिए PRL और IGFBP1 प्रतिलिपि स्तर का पता लगाने के लिए अधीन । ख) संस्कृति मीडिया में स्रावित PRL के स्तर पर या तो ईपीसी के लिए वाहन में छह दिनों के लिए HESC संस्कृति से एक एलिसा आधारित परख का उपयोग कर मापा गया । * p < ०.०५, * * p < ०.०१, * * * p < ०.००१ । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 3
चित्रा 3 : पछाड़ना के SRC-2 में मानव एंडोमेट्रियल stromal कोशिकाओं को प्रभावित करता है इन विट्रो में decidualization । क) सिरना transfected HESC में रूपात्मक परिवर्तन ईपीसी मीडिया के साथ संस्कृति के 6 दिनों के बाद (शीर्ष पैनलों: समय अंक दिन में नियंत्रण सिरना 0 और दिन 6, नीचे पैनलों: SRC-2 सिरना समय अंक दिन में 0 और दिन 6) । ख) SRC का प्रतिलिपि स्तर -2, PRL, और IGFBP1 दिन पर 0 और ईपीसी के 6 दिन इलाज HESC नियंत्रण या SRC-2 सिरना के साथ transfected । काला तीर decidualized कक्षों का प्रतिनिधित्व करता है । सफ़ेद तीर fibroblastic कक्षों को दिखाता है । स्केल बार: २०० µm. * * * p < ०.००१ ।  कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

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Discussion

मादा प्रजनन मासिक धर्म चक्र लुटियल चरण भर में प्रोजेस्टेरोन के स्तर में वृद्धि की विशेषता है, जिससे दौर में ESC के decidualization उत्प्रेरण, उपकला की तरह स्रावी कोशिकाओं3,8. decidualization की दीक्षा प्रजाति निर्भर है । मनुष्यों में, decidualization प्रोजेस्टेरोन एकाग्रता की वृद्धि पर अनायास होता है, जबकि चूहों ब्लास्टोसिस्ट उपस्थिति की आवश्यकता होती है10,11. decidualization में यह विसंगति मानव कोशिका लाइनों में सेलुलर विभेद का अध्ययन करने के शोधों के लाभों को मिसाल है । इन विट्रो परख प्राथमिक सेल संस्कृति के माध्यम से अक्सर4,6,10हार्मोन के माध्यम से decidualization के मॉडुलन का पता लगाने के लिए उपयोग किया जाता है । हालांकि, इस विधि की सीमाएं चक्र चरण और गर्भावस्था के इतिहास में महत्वपूर्ण बदलाव के बिना मानव ऊतक का एक बड़ा नमूना आकार की प्राप्यता पर हो सकता है । फिर भी, उपायों को सुनिश्चित करने के लिए किया जा सकता है सीमाओं के अध्ययन की योजना बना द्वारा अब तक काफी अग्रिम में पर्याप्त नमूनों की गारंटी और समयबद्धन बायोप्सी प्रफलन चरण में (दिन 9 दिन 12) मासिक धर्म चक्र के ।

इस अध्ययन में, HESC संस्कृति और कृत्रिम रूप से एक उपंयास विधि के माध्यम से decidualized पहले Brosens एट अल में वर्णित हैं । 16 में जो हार्मोन E2, पी 4, और शिविर एक 6 दिन की गर्मी की अवधि के दौरान संवर्धन माध्यम के लिए पूरक हैं । आमतौर पर, वैकल्पिक तरीकों12,14 एक विस्तारित 14 दिन की गर्मी की अवधि में E2 और MPA के अलावा के माध्यम से कृत्रिम decidualization के लिए सेल संस्कृतियों प्रधान । संवर्धन मीडिया synergistically के लिए शिविर की अनुपूरण एक छोटा समय सीमा में ESC के decidualization प्रवर्धक जबकि एक साथ शिविर उत्तरदायी तत्व प्रवर्तक क्षेत्रों से युक्त जीन की अभिव्यक्ति को विनियमित (यानी, PRL व IGFBP1)12,13. इस विधि, Kommagani एट अल में वर्णित प्रोटोकॉल पर आधारित है । 10, अलगाव और HESC के संस्कृति के अनुकूलन परमिट । सेल संस्कृति पवित्रता stromal और उपकला कोशिका लाइनों को अलग करने के लिए एक ४० µm सेल छलनी का उपयोग करके अनुकूलित किया गया था । इसके अलावा, Ficoll-Paque प्लस रिएजेंट नमूने से रक्त कोशिकाओं को हटाने पर शुद्ध stromal कोशिकाओं के एक व्यवहार्य, उच्च उपज अलगाव सुनिश्चित करने के लिए लागू किया गया था । एक अतिरिक्त केंद्रापसारक कदम (30 मिनट के लिए ४०० x g) सेल जनसंख्या से रक्त कोशिकाओं का पूरा उन्मूलन सुनिश्चित करने के लिए Ficoll इसके अलावा निंनलिखित शामिल किया गया था । अंत में, HESC व्यवहार्यता और उपज संवर्धन कोशिकाओं पर अनुकूलित किया गया जब तक ९५ decidualization के लिए% प्रवाह । कुल मिलाकर, इन अतिरिक्त कदम व्यवहार्य, उच्च उपज HESC की शुद्ध संस्कृति को सुनिश्चित किया ।

decidualization की डिग्री qRT-पीसीआर, एलिसा, और phalloidin cytoskeletal पुनर्व्यवस्था और पहचान जीन के ऊपर का पालन करने के लिए धुंधला का उपयोग का आकलन किया गया था । qRT-पीसीआर में, decidualization मार्करों PRL और IGFBP1 के प्रतिलिपि स्तर का मूल्यांकन किया गया । HESC, PRL और IGFBP1 स्तर के decidualization पर एक समय पर निर्भर फैशन में वृद्धि हुई, के रूप में पिछले6अनुसंधान से स्थापित । गुप्त PRL स्तरों के समय-निर्भर वृद्धि को भी एलिसा द्वारा HESC टिशू कल्चर मीडिया की जांच करके पुष्टि की गई । इसके अलावा, decidual कोशिकाओं में stromal कोशिकाओं के रूपात्मक परिवर्तन actin और परमाणु मार्कर 4 ', 6-phalloidin-2-Diamidino (Phenylindole)17के माध्यम से DAPI रेशा के costaining के माध्यम से visualized किया जा सकता है । साथ में, इन प्रयोगात्मक परिणामों E2, MPA, और शिविर की पूरकता के माध्यम से संवर्धन HESC की प्रभावशीलता की पुष्टि की ।

इस प्रोटोकॉल की क्षमता जीन विशिष्ट पछाड़ना अध्ययन करने के लिए भी SRC के खिलाफ सिरना -2का उपयोग मूल्यांकन किया गया । आकृति विज्ञान, SRC-2 transfected HESC बनी fibroblastic, जबकि HESC सिरना कोशिकाओं में नियंत्रण decidualized epithelioid के साथ इलाज किया । SRC-2 पछाड़ना दक्षता प्रतिलिपि स्तर के माध्यम से मूल्यांकन किया गया था और काफी कम हो गया था, हमारे प्रोटोकॉल के साथ विशिष्ट जीन की एक सफल मुंह बंद करने का संकेत है । इस प्रकार, हमारे प्रोटोकॉल एंडोमेट्रियल decidualization में विशिष्ट जीन (ओं) की भूमिका delineating में एक ब्याज के साथ जांचकर्ताओं के लिए एक उपयोगी संसाधन हो सकता है ।

जबकि decidualization के अंतर्निहित आणविक तंत्र को समझने में प्रगति कर दिया गया है, एक महत्वपूर्ण ज्ञान गैप अभी भी विशेष पर मौजूद है । अनुचित decidualization आरोपण विफलता और बाद में जल्दी भ्रूण गर्भपात4,6,7,10के लिए एक मूल कारण के रूप में स्थापित किया गया है । इसलिए, और epigenetic कारकों और आणविक रास्ते के लक्षण वर्णन के बारे में अंवेषण गर्भावस्था विफलता के निदान और उपचार के लिए आवश्यक है ।

अंत में, इस अध्ययन में प्रस्तुत प्रोटोकॉल एक कुशल विधि को अलग और संस्कृति मानव एंडोमेट्रियल stromal कोशिकाओं के एक शुद्ध और व्यवहार्य लाइन स्थापित करता है । हार्मोन E2, MPA, और संवर्धन मीडिया के लिए शिविर का सप्लीमेंट द्वारा, कृत्रिम decidualization qRT-पीसीआर, एलिसा, और Phalloidin धुंधला द्वारा की पुष्टि के रूप में प्रेरित किया जा सकता है । इसके अलावा, हमारे प्रोटोकॉल विस्तृत सिरना और लिपिड आधारित transfections का उपयोग कर ब्याज की एक विशिष्ट जीन के कुशल पछाड़ना के लिए आवश्यक कदम रूपरेखा । कुल मिलाकर, इस विधि अंतर्निहित सेलुलर और आणविक तंत्र (एस) HESC decidualization के साथ जुड़े अध्ययन करने की क्षमता प्रस्तुत करता है ।

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Disclosures

यह काम स्वास्थ्य के राष्ट्रीय संस्थानों (NIH)/National बाल स्वास्थ्य और मानव विकास के संस्थान (niched) अनुदान (R00 HD080742) और वाशिंगटन विश्वविद्यालय के स्कूल ऑफ मेडिसिन स्टार्ट-अप निधियों से धन द्वारा समर्थित है आर. पी. हम एंडोमेट्रियल बायोप्सी नमूने प्रदान करने के लिए वाशिंगटन विश्वविद्यालय फर्टिलिटी क्लिनिक का शुक्रिया अदा करना चाहूंगा ।

Acknowledgments

लेखकों का खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Opti-MEM I (1X) Reduced Serum Medium Gibco 31985-070 For decidualization media
DMEM / F12 (1:1) (1X) Gibco 11330-032
Trypan Blue Stain (0.4%) Gibco 15250-061 For cell count
PureLink RNA Mini Kit Invitrogen 12183018A For RNA Isolation/Purification
TaqMan 2X Universal PCR Master Mix Applied Biosystems 4304437
High Capacity cDNA Reverse Transcription Kit Applied Biosystems 4374967
Eukaryotic 18S rRNA Endogenous Control Life Technologies 4319413E For qPCR internal control
TaqMan Gene Expression Assay Prolactin Probe Applied Biosystems 4331182 For qPCR internal control
TaqMan Gene Expression Assay IGFBP1 Probe Applied Biosystems 4331182 For qPCR internal control
Phalloidin-iFluor 488 Reagent - CytoPainter Abcam ab176753
Human Prolactin ELISA Kit Invitrogen EHIAPRL
16% Paraformaldehyde Alfa Aesar 30525-89-4 Fixative
Lipofectamine RNAiMAX Invitrogen 13778150 Transfection Reagent
ProLong Gold antifade reagent with DAPI Invitrogen P36935 For mounting
0.25% Trypsin-EDTA (1X) Gibco 25200-056
Penicillin Streptomycin Gibco 15140-122
Charcoal Stripped Fetal Bovine Serum Sigma F6765-500ML
Sodium Bicarbonate (7.5%) Gibco 25080-094
Ficoll-Paque PLUS Reagent Fisher Scientific 45001749
Collagenase from Clostridium histolyticum Sigma C0130-1G
Deoxyribonuclease I from bovine pancreas Sigma DN25-100MG
Medroxyprogesterone 17-acetate Sigma M1629-1G For EPC Media
Estradiol Sigma E1024-1G For EPC Media
cAMP Sigma A6885-100MG For EPC Media
Fine straight stitch scissors Fine Science Tools 15396-00
TaqMan Gene Expression Assay NCOA2 Probe Applied Biosystems 4351372
Fetal Bovine Serum, heat inactivated Gibco 10-082-147
Antibiotic-antimycotic Thermo Scientific 15240062
Hank’s Balanced Salt Solution  Corning 21-021-cv
50 mL conical polypropylene Falcon tube Corning 352098
Dumont #5/45 Forceps Fine Science Tools 11251-35
100 x 15 mm Glass Petri dish VWR 75845-546
40 micron cell strainer Midsci 229481
Isotemp 215 Water bath Fisher Scientific FS-215
LSE Centrifuge  Corning 6755
Human NCOA2 siRNA  Dharmacon L-020159-00 Gene specific qPCR probe
Steri-cycle i160 CO2 Incubator  Thermo Scientific 51030301
NanoDrop 2000 Thermo Scientific ND-2000 For RNA quantification
Phosphate Buffered Saline  Fisher Scientific 50146771
75 cm Canted Neck Cell Culture flask Corning 430641U
6 well Non-Pyrogenic Cell Culture Plate Corning 3506
Pipet Controller Ultra Corning 4099
Photoshop Adobe 19.0.1.334
25 cm Canted Neck Cell Culture flask Corning 7200876
Triton X-100 Sigma X100-1L
15 mL conical polypropylene Falcon tube Corning 352099
10 mL Syringe BD 302995
1300 Series A2 Biological Safety Hood Thermo Scientific 1377
accuspin Micro17 centrifuge Fisher Scientific 13100675
7500 Fast real time PCR system Applied Biosystems 3052632
EVOS FL Immunofluorescence Microscope Life Technologies 01414-155G-291
Leica Inverted Light Microscope Leica DMi1
Illrustrator Adobe 22.0.1.253
Excel Spreadsheets Microsoft 2016
Deckglaser 18 mm cover glasses NeuVitro GG-18
Reichert Bright-Line Hemacytometer Sigma Z359629-1EA
2-mercaptoethanol Fisher Bioreagents BP176-100 For RNA lysis buffer
1.2mL External Threaded Polypropylene Cryogenic Vial Corning 430658 For freezing HESC cells 
Dimethyl Sulfoxide (DMSO) Sigma D2650-100mL For freezing media

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References

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Michalski, S. A., Chadchan, S. B., Jungheim, E. S., Kommagani, R. Isolation of Human Endometrial Stromal Cells for In Vitro Decidualization. J. Vis. Exp. (139), e57684, doi:10.3791/57684 (2018).

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