Summary
本稿ではエストロージェンの in vitroアッセイを行うひと子宮内膜間質細胞の分離文化の検証と最適化されたプロシージャ。さらに、この研究では、ひと子宮内膜間質細胞で Sirna を使用して特定の遺伝子の効率的にノックダウンする詳細な方法が提供します。
Abstract
分泌脱落膜に線維芽細胞のような外観からひと子宮内膜間質細胞 (HESC) の分化は、母親の子宮の子宮内に胚移植に必要な変換です。着床障害とそれに続く初期胚流産の根本的な原因として不適切なエストロージェンを設置します。したがって、エストロージェンの分子機構を理解することは成功した出生率向上に有利であります。人工エストロージェンの生体内研究は人間研究として動物モデル内での並進運動合併症に関連付けられている倫理的なジレンマのためしばしば制限しています。その結果、一次電池文化を通しての in vitroアッセイがホルモンを介してエストロージェンの変調を探るにしばしば用いられます。この研究は、悪名高くの分離と培養の培地にホルモンの補充によるその後の人工エストロージェンの詳しいプロトコルを提供します。さらに、この研究は、siRNA の脂質ベースの transfections を利用してノックダウンするうまく設計された方法興味の任意の遺伝子を提供します。このプロトコルにより、文化純度としてエストロージェンとの後の定量化の基礎となる分子機構を理解するための信頼性の高い方法としてこのモデルを活用する能力を最大化する製品の歩留まりの最適化decidualized 子宮内膜間質細胞因子を分泌します。
Introduction
生殖年齢の女性がホルモンによって調節される子宮内膜の増殖・分化・月経1 として知られているプロセスで妊娠の準備のためにその後放出の毎月のサイクルを受ける初潮の段階と月経閉止期の間 ,2。ひと子宮内膜のような物理的な変更が必要1子宮壁に適切な胚移植です。形態学的および生化学的適応を含む子宮内膜の変化は卵巣性ステロイド ホルモンのエストロゲンとプロゲステロン (P4) を介して月経サイクルを通して仲介される3,4,5。増殖 (または卵胞) フェーズの中で排卵エストロゲン レベルが高く、子宮内膜肥厚を開始します。次の排卵、分泌 (または黄体) 相は丸め、上皮のような脱落膜細胞線維芽細胞のような外観から子宮内膜間質細胞 (ESC) の形態学的変化を誘導する P4 濃度の大幅な上昇を促進します。エストロージェン4,6として知られているプロセス。注入の失敗とその後初期流産胚4,7,8根本原因として不適切なエストロージェンを設置します。したがって、エストロージェン分子機構の解明、診断と妊娠初期の損失の治療に有利であります。
現在、子宮内膜間質細胞のエストロージェンの根本的な影響を探検するいくつかの手法が利用されています。生体内で、マウス子宮機械的刺激 (すなわち、, 傷) を介してエストロージェンの人工的に誘導することができますまたは油ホルモン プライミング子宮9で注入。人間とは異なる、この合成の刺激は、胚盤胞の存在、齧歯動物の10、11エストロージェンの開始のために必要なステップの外観を提供することで子宮内腔の分化を促進します。したがって、並進合併症の動物モデルと人間の生体内で調査を囲む倫理的なジレンマに関連するのためエストロージェン ベース モデルはほとんどが正常に研究体外。
本研究では被験者は両方のローカル英語とスペイン語の新聞広告の配置によって募集しています。この研究に適した候補として識別される科目は、研究コーディネーター、潜在的なリスクの完全な情報開示の説明に会うため持って来られます。潜在的なリスクの完全な理解の確認後、被験者の同意は書面と口頭の両方の形態で得られます。被写体の同意には、(1) 今後の研究目的のための組織の瀉血 (2) 長期的なストレージを受けるし、(3) 収集した組織標本から初代培養の作成に同意する権限が含まれています。同意、次科目は、人種/民族および/または機密保持のための権利を許可された自己で完了するフォームを与えられています。その後の訪問は、サブジェクトの月経周期に基づく子宮内膜生検を達成する予定です。この研究に募ったボランティア 2012年国勢調査によって文書化されたセントルイス都市圏の民族、人種的な人口を反映し、妊娠中の女性、胎児、胚を含む任意の脆弱な人口の参加を伴わない18 歳未満の年齢、または他の弱者の子供。生検サンプル コレクションに参加するための資格要件は、(1) 歳の 18-45 年 (2) (3) を持たない現在の妊娠や避妊薬ホルモン/子宮内のデバイスの使用規則的な月経周期 (25-32 日) を持つが現在膣感染症や性感染症 (5) ない現在の抗生物質治療と (6) を持たない登録 (4) 前 30 日間ないこと現在の異常な Pap 汚れ。
この研究では、ひと子宮内膜間質細胞 (HESC) を培養し、人工的に誘導した体外ホルモン (エストラジ オール (E2)、酢酸メドロキシプロゲステロン (MPA)、および環状アデノシンのサプリメントからエストロージェンを受けることに一リン酸塩 (キャンプ)) 媒体に。このメソッドは、エストロージェンの程度は、ホルモン治療日数の合計数に基づいて変更されます。細胞骨格再配置に伴い、ホルモン補充は脱落膜細胞が分泌のような資質2,4を発生生化学的適応を誘発します。プロラクチン (PRL) とインスリン様成長因子結合蛋白質 1 (IGFBP1) などの認刻極印の遺伝子の表現を活用して、確認、HESC エストロージェン5,12,の程度を定量化すること13,14します。 重要なことは、遺伝子の特定の打撃を行うこのプロトコルの生存性も実証されています。
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Protocol
ワシントン大学セントルイス、産科から本研究のために収集するすべてのひと子宮内膜生検が可能し、婦人科制度審査委員会 (IRB) を使用して書面による同意フォームを承認します。
1. 準備
- 1 x ハンクのバランスの取れた塩ソリューション (HBSS) の 500 mL を準備するには、(さらには HBSS + 媒体として参照される) メディア含むボトルに 100 U/mL ペニシリンおよび 100 μ g/mL ストマイを追加します。
- ダルベッコ変更イーグル培地 500 mL を準備: 15 mM 4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic 酸 (HEPES) 1% 抗生物質抗真菌薬ソリューション (最終濃度を追加することによって、L-グルタミン, フェノールレッド栄養混合物 F-12 (DMEM/f12 キー)100 U/mL ペニシリン、100 μ g/mL ストレプトマイシン、0.25 μ g/mL、Fungizone) ボトル (さらに悪名高く分離媒体として参照されます) を含むメディアへ。
- 10% 胎仔ウシ血清 (FBS)、1 x Na2HCO3、および 1% を追加して 15 mM HEPES、L-グルタミン, フェノールレッド DMEM/F12 の 500 mL を準備ペニシリン (10,000 U/mL) とストレプトマイシン (10,000 μ g/mL) (ペン連鎖球菌) メディアに (さらにボトルを含むHESC メディアとして参照)。
- 2 %500 ml 減少血清媒体 HEPES、2.4 g/L 炭酸水素ナトリウム、L-グルタミンの炭除去牛胎児血清 (csFBS) および 1% ボトル (エストロージェン メディアとしてさらに参照) を含むメディアにペン連鎖球菌。
- F12 キー DMEM 無料/2% 炭を追加してボトル (変更メディアとしてさらに参照) を含むメディアでウシ胎児血清 (csFBS) を除去したフェノールレッドの 500 mL を準備します。
- 10 nM エストラジ オール (E2)、1 μ M 酢酸メドロキシプロゲステロン (MPA)、および 50 μ M 環状アデノシン一リン酸 (cAMP) 15 mL ポリプロピレン円錐管を準備し、体外の事前に準備されたエストロージェン メディアのよく因数あたり 2 mL を加えるエストロージェン試金 (EPC メディアとしてさらに参照)。
- 50 mL ポリプロピレン円錐管 (凍結メディアとしてさらに参照) でフリーズして 90 %fbs と 10% ジメチルスルホキシド (DMSO) とメディアの 50 mL を準備します。
- 重さのコラゲナーゼと DNase の 5 mg 25 mg 50 mL コニカル ポリプロピレン チューブ、-20 ° C でストアで
2. ひと子宮内膜生検買収
- HBSS で IRB 認可クリニックから月経周期の増殖期 (日 9 - 12 日) で収集されたひと子宮内膜生検サンプルを取得します。
- 1 ml prewarmed 37 ° C HBSS + 媒体の生検サンプルを洗ってそっと振って余分な血液を削除して粘液。
3. ひと子宮内膜間質細胞 (HESC) の分離
メモ: この分離手順は生物学的安全キャビネットの無菌環境で実行されます。
- 10 mL を含む 50 mL コニカル ポリプロピレン製遠心管に滅菌鉗子生検を転送新鮮な HBSS。
- 室温 90 500 x g で生検を遠心分離機 s。
- 細胞ペレット破裂が 90 2,000 x g で生検を再スピンかどうか s。
- 1 mL ピペットを使用してメディアを削除し、37 ° C の 10 mL で洗浄 prewarmed 90 500 × g で遠心分離によって続いて HESC 分離メディア s。
- 1 mL ピペットを使用してメディアを削除し、積極的に生検を取り除くため新鮮な HESC 分離メディアの 3 mL を追加します。
- 5 mL の HESC 分離培地を含むペトリ皿に生検をデカントします。
- 約 20 分間 #5 鉗子と細かい直線縫いのはさみを使用して可能な限り小さな作品としてに生検をミンチします。
- DNase を準備私は、悪名高く分離メディアの 10 mL をあらかじめ重量を量られた DNase に追加することによりコラゲナーゼ酵素コラゲナーゼ (2.5 mg/mL) と私 (0.5 mg/mL)。ピペットと混ぜます。
- ピペットは、新しい 50 mL の円錐ポリプロピレン管に 1 mL ピペットを使用して組織サンプルをカットしました。HESC 分離メディアの 7 mL で洗浄し、完全なサンプルを取得するポリプロピレン チューブを追加します。
- 2 分間遠心室温 800 x g でサンプルは、ピペットで上澄みを慎重に取り外します。
- ペレットに直接 10 mL のシリンジに接続されている私は、0.2 μ m のフィルターを通してコラゲナーゼの解決 DNase をフィルター処理します。
- 10 の渦のペレットを再懸濁します。
- 1.5 h の 37 ° C の水浴、10 のボルテックスでダイジェスト s 組織が消化されるまで、徹底的にすべての 10 分です。
- フィルター 40 μ m 携帯こし器を通ってサンプル 50 mL の円錐ポリプロピレン管上皮細胞およびティッシュの残骸を削除する上の積層。
注: 間質細胞は、50 mL のコニカル ポリプロピレン チューブです。 - 室温で 2.5 分の 800 の x g で 50 mL の円錐形ポリプロピレン チューブを遠心します。1 mL ピペットで上澄みを慎重に取り外します。
- HESC 分離メディアの 10 mL にペレットを再懸濁します。
- 室温で 2.5 分間 800 × g で遠心分離機します。、上清を吸引し、ミックスする HESC メディアとピペット前方および逆の 6 mL の細胞を再懸濁します。
- ゆっくりと層のレイヤーを混在させないよう注意されている、間質細胞からの残りの血液細胞を分離する再懸濁細胞密度勾配メディアの 3 mL。
- 室温で 30 分間 400 × g で 15 mL ポリプロピレン チューブを遠心します。
- 5 mL の新しい 50 mL ポリプロピレン チューブに上清を収集し、細胞を再懸濁しますに追加 5 mL HESC メディアを追加します。
- 室温、続いて上清の除去と 6 mL HESC メディアの追加で 2.5 分間 800 × g で遠心分離機します。渦 10 s およびピペッティングによるミックスのサンプルを転送、逆に 5 回。
- 細胞数 1.5 mL 遠心チューブに再浮遊細胞を分注 10 μ l 添加
- 0.4% トリパン ブルー染色因数を携帯し、ピペットとミックスするの 10 μ L を追加します。はろの 10 μ L を読み込み、診断を使用してセルをカウントします。
- 適切なフラスコ 15 mL HESC メディア総セル数に依存して細胞をプレートします。
- セルの総数は未満 100 万、悪名高くメディアの 6 mL で 25 cm フラスコ内のすべてのセルをプレートします。セルの合計数は以上 100 万、悪名高くメディアの 15 ml 75 cm 用フラスコ内のすべてのセルをプレートします。
- 適切な細胞接着を確保し悪名高くメディアにメディアを変更して 6 時間の最小値の 37 ° C で 5% CO2インキュベーターで培養します。
- 3-5 日、細胞を形成する単分子膜メッキ フラスコで 80-90% の confluency を達成するまでの期間の 37 ° C で 5% CO2インキュベーターで分離の HESC の文化.
- 2 日ごとに悪名高くメディアを変更します。
- 15 〜 20 分の 37 ° C の水浴中暖かい HESC メディア。
- フラスコからメディアを吸引し、フラスコに新鮮な HESC メディアを追加 (作業量: 8 mL か 16 mL 25 cm または 75 cm のフラスコあたりそれぞれ)。
- 80-90% の confluency が達成されるまで、37 ° C で 5% CO2インキュベーターにフラスコを配置します。
- 一度 HESC に 80-90% 合流、転送細胞 75 cm フラスコに 25 cm または 75 cm の 3 個のフラスコに 1 つ 75 cm 用フラスコからなります。
注: HESC できます冷凍し、今後のこの時点では、後での利用のため保存します。
4. 凍結・融解 HESCs
- 75 cm 用フラスコからメディアを吸引し、2 mL のトリプシン-EDTA を追加します。
- 細胞がフラスコから降りるまでは、37 ° C で 2-3 分間 5% CO2インキュベーターで孵化させなさい。
- 前方および逆引き HESC メディアのピペッティングで混ぜる 7 mL を追加します。
- 2.5 分の 800 × g で遠心し、上清を吸引します。
- 凍結管細胞、日付、および通路番号のラベルを付けます。
- 再凍結メディアの 5 mL の細胞ペレットを中断します。
- -80 ° C のフリーザーに各チューブと転送管に再懸濁の HESC の分注 1 mL。
- 24 時間以内に、チューブを液体窒素に転送します。
注: 当面で細胞を解凍する場合は、凍結細胞-80 ° C で 1 か月保存します。 - HESCs を解凍のためには、20 分間 HESC メディアを予熱します。
- 予熱した HESC メディアの 8 mL を 25 cm フラスコに追加します。
- 液体窒素タンクや-80 ° C から凍結チューブを取得し、細胞の解凍が 1-2 分の 37 ° C の水浴の管が水没します。
- HESC メディアで 25 cm のフラスコに解凍 HESC を転送し、37 ° C で一晩 5% CO2インキュベーターで孵化させなさい
- 次の日は HESC メディアを変更し、悪名高くコンフルエントになるし、75 cm フラスコ議定書 5 により下記の通りにセルを転送するまで 2-3 日を待ちます。
- 15 〜 20 分の 37 ° C の水浴中暖かい HESC メディア。
- フラスコからメディアを吸引し、フラスコに新鮮な HESC メディアを追加 (作業量: 8 mL か 16 mL 25 cm または 75 cm のフラスコあたりそれぞれ)。
- 80-90% の confluency が達成されるまで、37 ° C で 5% CO2インキュベーターにフラスコを配置します。
5. ひと子宮内膜間質細胞 (HESC) の養殖
メモ: この養殖手順は生物学的安全キャビネットの無菌環境で実行されます。
- 20-30 分間水浴の 37 ° C で予熱 HESC メディア。
- フラスコからメディアを吸引し、(1 mL フラスコ 25 cm または 75 cm のフラスコの 2 mL) 0.25% トリプシン エチレンジアミン四酢酸 (EDTA) を追加します。
- 細胞を取り除くまで 2 〜 3 分の 37 ° C で 5% CO2インキュベーターで孵化させなさい。
- 残りのセルを除去するフラスコの壁に軽くたたきます。前方および逆引き HESC メディアのピペッティングで混ぜる 7 mL を追加します。
- 50 mL コニカル ポリプロピレン管、室温で 2.5 分間 800 × g で遠心分離に細胞の混合物をピペットで移しなさい。
- 上清を吸引し、再 HESC メディアで細胞ペレットを中断します。
- 15 mL フラスコ 25 cm または 75 cm のフラスコ (15 mL) 45 mL を加えます。
- 各 25 cm または 75 cm のフラスコにそれぞれ 5 mL、15 mL の細胞懸濁液を追加します。
- 3-5 日、細胞を形成する単分子膜メッキ フラスコで 80-90% の confluency を達成するまでの期間の 37 ° C で 5% CO2インキュベーターで分離の HESC の文化.
- 2 日ごとに悪名高くメディアを変更します。
- 15 〜 20 分の 37 ° C の水浴中暖かい HESC メディア。
- フラスコからメディアを吸引し、フラスコに新鮮な HESC メディアを追加 (作業量: 8 mL か 16 mL 25 cm または 75 cm のフラスコあたりそれぞれ)。
- 80-90% の confluency が達成されるまで、37 ° C で 5% CO2インキュベーターにフラスコを配置します。
6. 人間の子宮内膜間質細胞 (HESC) めっきと siRNA トランスフェクション
メモ: この導入手順は生物学的安全キャビネットの無菌環境で実行されます。
- 75 cm 用フラスコから悪名高くメディアを吸引し、0.25% トリプシン-EDTA 溶液 2 mL を追加します。
- 細胞を取り除くまで 2 〜 3 分の 37 ° C で 5% CO2インキュベーターで孵化させなさい。
- セルはフラスコから外れている場合、一度 HESC メディア 7 mL を加えると前方をピペットで穏やかに混合し、逆に 5 回。
- 50 mL コニカル ポリプロピレン管、室温で 2.5 分間 800 × g で遠心分離に細胞の混合物をピペットで移しなさい。上清を吸引し、再 HESC メディアの 10 mL の細胞ペレットを中断します。
注: 1 つ以上のフラスコから細胞をめっきする場合 HESC メディア ボリュームを増やします。 - 診断を使用してセルをカウントします。
- 1.5 mL 遠心チューブに再浮遊細胞を分注 10 μ l 添加
- 0.4% トリパン ブルー染色のセルに分注前方ピペッティングで混ぜるし、逆の 10 μ L を追加します。
- /6 ウェル プレートのウェル プレート 0.8 × 105セル。2 日後、セルは最適なトランスフェクションの 60-70% の合流をする必要があります。
- 各 siRNA トランスフェクション サンプルの siRNA トランスフェクション試薬 (60 nanomoles) を用いた複合体を準備します。
- 減少血清無料メディアの 150 μ L のトランスフェクション試薬の 5 μ L を希釈し、5 分間インキュベートします。
- 減らされた血清の無料メディアの 100 μ L の siRNA の 60 nanomoles を希釈し、5 分間インキュベートします。
- 5 分後希釈トランスフェクション試薬溶液と希薄 siRNA を組み合わせると前方ピペットで穏やかに混合し、逆に 5 回。
注: 複数の井戸の 1 つまたは複数の siRNA を株を準備 10 mL のマスター ミックス ポリスチレン管。 - SiRNA トランスフェクション試薬錯体室温で 5 分間インキュベートします。
- この潜伏中に各ウェルに変更メディアの 1 つの mL を追加します。
- 孵化の 5 分後にソリューションを収集も電池とメディアを含む siRNA トランスフェクション試薬複合体の 250 μ L を追加し 2 分間 500 x g でチューブを遠心します。
- 優しくロッキング ミックス、5 h の 5% CO2インキュベーターで 37 ° C でセルを孵化させなさい。
- 5 h 後 HESC メディアにメディアを変更します。
- 2 日間の in vitroエストロージェン アッセイのための準備のため 5% CO2インキュベーターで 37 ° C でセルを孵化させなさい。
7. エストロージェンの in Vitroアッセイ
メモ: この試金は生物学的安全キャビネットの無菌環境で実行されます。
- カムデンらで説明されているように体外エストロージェン治療を開始する前に EPC メディアを準備します。3 (1.6 参照)。
- HESC の transfected 行からステップ 6.16 培養後 48 時間からメディアを吸い出しなさい。
- 各ウェルに EPC メディア 2 mL を追加します。
注意してください: としてコントロール、EPC メディアでセルの 1 つのセットが放置のまま。代わりに、コントロールの井戸に悪名高くメディアの 2 mL を追加します。 - 37 ° C で 5% CO2インキュベーター内のセルは、6 日間インキュベートします。
- 48 時間ごと EPC メディアを変更します。
- 暖かいし、37 ° C の水浴中で 15-20 分 EPC メディアを準備します。
- 井戸からメディアを吸引し、新鮮な EPC のメディアを追加します。
- 37 ° C で 5% CO2インキュベーターにバック プレートを配置します。
- 48 時間ごと EPC メディアを変更します。
- 6 日後 (後述) として ELISA や qRT PCR を介して間質細胞エストロージェンの範囲を分析します。
8. (qRT PCR) の量的なリアルタイム PCR を用いた体外エストロージェンの検証
注: qRT PCR が Kommaganiら10で前述したように完了しました。
- 市販の RNA 分離キットからプロトコルを利用した HESC からの総 RNA を分離します。
- RNA 量と純度 (260/A280) ガルシア ・ エリアスら15で述べるように、NanoDrop または同様の手法を使って分析します。
- 1 μ g 市販の逆転写キット プロトコルを通じて総 RNA からの cDNA を合成します。
- 市販 qRT PCR キット プロトコルで説明されているように、qRT PCR の反作用を実行します。
- 市販リアルタイム PCR マスター ミックスを使用して反応を行い、特定遺伝子プローブと内部システム コントロール (18 s、 PRL、およびIGFBP1)。
9. ELISA を用いた体外エストロージェンの検証
- 市販のプロラクチン ELISA キットを利用した培養メディアから分泌されたプロラクチンのレベルを定量化します。
10. ファロイジン染色を用いた体外エストロージェンの検証。
- 12 ウェル プレートの各ウェルに滅菌 coverslips を挿入します。
- 6.1 6.5 の手順を繰り返します。
- /12 ウェル プレートのウェル プレート 0.8 × 105セル。
- 37 ° C で 5% CO2インキュベーター内のセルは、2 日間インキュベートします。
- メディアを吸い出しなさい。
- 7.3 7.4 の手順を繰り返します。
- リン酸緩衝生理食塩水 (PBS) 30 分間室温で 4% パラホルムアルデヒド (PFA) のセルを修正します。
- 固定の解決を吸引し、5 分の 1 mL の PBS で 3 回洗います。
- 固定セル透磁率を高めるために PBS で 5 分の 0.1% 非イオン性界面活性剤ポリエチレング リコール tert-オクチル フェニル エーテルを追加します。
- 3 回各 5 分の 1 mL の PBS で洗浄します。
- Coverslip あたりファロイジン溶液 100 μ L を追加し、90 分間室温でインキュベートします。
- 1 単位 5 μ L でファロイジン原液を使用して PBS で 1: 100 希釈を準備します。
- 3 回各 5 分の 1 mL の PBS で洗浄します。
- メディアを含んでいる 4', 6-Diamidino-2-Phenylindole マウント (DAPI) スライドをマウントします。
- 共焦点顕微鏡を用いた細胞を観察します。
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Representative Results
HESC 文化エストロージェン
次の分離、ひと子宮内膜間質細胞は 80-90% の confluency による単分子膜形成に培養し、体外エストロージェンの 10 nM E2、1 μ M MPA、50 μ M のキャンプと治療による (EPC)。エストロージェン体外に関連付けられている形態学的変化は、図 1 aに, 可視化されました。エストロージェンに HESCs は細長い、線維芽細胞から丸みを帯びた類上皮細胞の細胞骨格語順換えを経る。したがって、ファロイジン染色を HESC エストロージェン中細胞骨格の再構成を確認に行った。ファロイジンはアクチン フィラメントの染色を活用した高選択的環ペプチドにより体外エストロージェン (図 1 b) と一貫性のある骨格転位を可視化します。
記事 EPC 治療の 6 日は、 PRLおよびIGFBP1の mRNA のレベルはエストロージェン (図 2 a) の程度を確認するため qRT PCR によって評価されました。PRLおよびIGFBP1のレベルが制御車と扱われる HESC に比べて有意に増加 (p < 0.001)。エストロージェンに伴う生化学的変化も培養培地 (図 2 b) から分泌された prl の定量化を通して評価しました。トラン スクリプト レベルで一貫性のある、prl 非常が高値であった EPC 培養コントロールと比較して悪名高く (p < 0.001)。
SRC 2候補遺伝子 (図 3) として使用 HESCs エストロージェンの細胞・分子の変化に関する特定の遺伝子廃止の影響が評価されました。次のコントロールまたはSRC 2 siRNA トランスフェクションの 48 時間は、悪名高くは EPC メディアで 6 日間で培養しました。コントロール siRNA トランスフェクション HESC を示した細胞および分子変更適切なエストロージェン、石畳の形態変化とエストロージェン マーカー PRLおよびIGFBP1の高められたトラン スクリプト レベルを含め一貫しました。SRC 2 siRNA ノックダウンで期待どおりに悪名高く残ったコントロール siRNA と比較すると外観は線維芽は悪名高く (図 3 a) を導入しました。この携帯電話の変更と一致して、 PRLおよびIGFBP1トラン スクリプトSRC 2 siRNA で有意に減少したレベル transfected 悪名高く、 SRC 2ノックダウン エストロージェン プログラミングで脱線を示す (** *p < 0.001)。SRC 2転写レベルが有意に減少したSRC 2で siRNA トランスフェクション HESC に比べて提案手法を用いた効率的な遺伝子サイレンシングを示す、siRNA を制御する (* * *p < 0.001) (図 3 b)。
図 1: 子宮内膜間質細胞中の携帯電話の変更体外エストロージェン.HESCs は分離され、車両や E2、MPA とキャンプ (EPC) のいずれかを含んでいる媒体で 6 日間培養します。A) 細胞像は類上皮細胞から線維芽細胞の形態変化を示します。B) ファロイジン染色体外エストロージェン、青地は核 (DAPI) に関連付けられている (緑) の細胞骨格の変化を示す HESC の画像です。赤い矢印は、decidualized のセルを表します。黒の矢印は、線維芽細胞を示しています。スケール バー: 100 μ m.この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 2: 子宮内膜間質細胞の間の分子変更体外エストロージェン.A) 総 RNA HSECs 車両または E2、MPA とキャンプ (EPC) のいずれかを含んでいる媒体で 6 日間培養から分離され、 PRLとIGFBP1転写レベルを検出する qRT PCR 分析を受けます。B) 培養液に分泌される PRL のレベルは、HESC EPC にどちらかの車で 6 日間培養からベース ELISA アッセイを使用して測定されました。p < 0.05 * * p < 0.01 * * * p < 0.001。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 3: ひと子宮内膜間質細胞におけるSRC 2ノックダウンに影響を与える体外エストロージェン.SiRNA の A) 形態変化 transfected HESC EPC メディアと文化の 6 日間を次 (トップ パネル: 時コントロール siRNA ポイント 0 日目と日 6、底面: 時のSRC 2 siRNA ポイント 0 日目と 6 日)。B) トラン スクリプト レベルのSRC 2、 PRL0 の日と日 EPC 6 IGFBP1は、コントロールまたはSRC 2 siRNA をトランスフェクトした HESC を扱われます。黒い矢印は、decidualized のセルを表します。白の矢印は、線維芽細胞を示しています。スケール バー: 200 μ m. * * * p < 0.001。 この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
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Discussion
女性の月経周期は、それによって分泌細胞が上皮のようにラウンド、3、8に ESC のエストロージェンを誘導中黄体期のプロゲステロンのレベルの上昇によって特徴付けられます。エストロージェンの開始は、依存する生物です。ヒトでは、エストロージェンは、自発的にプロゲステロン濃度の上昇マウス胚盤胞の存在10,11を必要とするのに対し。エストロージェンでこの矛盾を例証するひと培養細胞の細胞分化の研究の橋渡しの利点。ホルモン4,6,10を介してエストロージェンの変調を探索する一次電池文化による試験管内アッセイがしばしば用いられます。ただし、このメソッドの制限事項は、サイクルの段階と妊娠の歴史に大きな変化なし人間組織の大規模なサンプル サイズの obtainability の時に発生します。それにもかかわらず、制限が十分に十分なサンプルを保証する事前研究と月経周期の増殖期 (日 9 - 12 日) のスケジューリングの生検を計画することによって最小限に抑える措置ができます。
本研究では HESC を培養し、最初 Brosensらで説明した手法を人工的に decidualized16どのホルモン E2、P4、およびキャンプは、6 日間の潜伏期間中培養培地に補われます。通常、代替方法12、14プライミング セル拡張 14 日潜伏期間にわたって E2 および MPA の添加による人工エストロージェンの文化します。養殖メディア キャンプの補充は相乗的ながら同時にキャンプの応答の要素のプロモーター領域 (すなわちを含む遺伝子の発現を増加させる短縮時間枠で ESC のエストロージェンを増幅します。PRLおよびIGFBP1)12,13。このメソッドは、Kommaganiらで説明されているプロトコルに基づいて10分離の最適化と HESC 文化を許可します。細胞培養の純度とストローマ細胞上皮細胞を分離する 40 μ m セル ストレーナーを用いて最適化を行った。さらに、Ficoll Paque プラス試薬は確実にサンプルからの血液細胞の除去時に純粋な間質細胞の実行可能な高収率分離に適用されました。追加遠心分離ステップ (30 分 400 g x) はセル人口からの血液細胞の完全な除去を確実に含まれている次の Ficoll 追加。最後に、悪名高く生存率と収量がエストロージェンの 95% の confluency まで細胞を培養に最適化されました。完全に、これらの追加手順は実行可能な高収率は HESC の純粋培養を確保しました。
ファロイジン骨格転位や特徴の遺伝子の発現を観察する染色、ELISA、qRT PCR を利用したエストロージェンの程度を評価しました。QRT PCR エストロージェン マーカー PRLおよびIGFBP1の転写レベルが評価されました。HESC のエストロージェン、 PRLおよびIGFBP1のレベル引き上げ時間依存的前研究6から定め。Prl 分泌の時間依存の増加は、ELISA で悪名高く培養メディアを調べることによって確認されました。さらに、ファロイジンと核マーカー 4', 6-Diamidino-2-Phenylindole (DAPI)17を介してアクチン フィラメントの costaining を通じて脱落膜細胞間質細胞の形態学的変化を視覚化できます。一緒に、これらの実験結果は、E2、MPA、キャンプ ・補充を介して HESC を培養の有効性を確認しました。
SRC 2に対する siRNA を用いた遺伝子特定の打撃を研究するこの議定書の機能も検討しました。形態学的に、 SRC 2は HESC 治療コントロール siRNA 類上皮細胞に decidualized 一方線維芽、残った HESC を transfected しました。SRC 2ノックダウン効率転写レベルで評価され、有意に減少した、我々 のプロトコルに特定の遺伝子を黙らせる成功を示します。したがって、我々 のプロトコルは、子宮内膜エストロージェン特定遺伝子の役割の輪郭を描くに関心を持つ研究者のための有用なリソースをすることができます。
エストロージェンの基礎となる分子メカニズムの理解の進歩がなされている間重要な知識のギャップはまだ具体的に存在します。着床障害とその後初期胚流産4,6,7,の10の根本的な原因として不適切なエストロージェンを設置します。したがって、後成の要因との分子経路の評価についてさらに調査は診断と妊娠障害の治療のため必要です。
結論として、本研究で提示されたプロトコルは、分離し、培養ひと子宮内膜間質細胞の純粋な実行可能な行の効率的な手法を確立します。ELISA、qRT PCR によって確認された培養メディアをキャンプ、MPA、ホルモン E2 を補完、人工エストロージェンを誘起することとファロイジン染色します。さらに、我々 のプロトコルは siRNA と脂質ベースの transfections を使用して興味の特定の遺伝子の効率的なノックダウンに必要な詳細な手順を説明します。全体では、このメソッドは HESC エストロージェンに関連付けられている基になる細胞・分子機構を研究する能力を示します。
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Disclosures
この仕事はから国民衛生の健康 (NIH) の資金でサポートされている/児童保健および人間の開発 (NICHD) 助成金 (R00 HD080742) ワシントン州大学医科大学院スタートアップ研究資金 R.K.子宮内膜生検サンプルを提供するため、ワシントン大学の不妊クリニックに感謝したいと思います。
Acknowledgments
著者が明らかに何もありません。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Opti-MEM I (1X) Reduced Serum Medium | Gibco | 31985-070 | For decidualization media |
| DMEM / F12 (1:1) (1X) | Gibco | 11330-032 | |
| Trypan Blue Stain (0.4%) | Gibco | 15250-061 | For cell count |
| PureLink RNA Mini Kit | Invitrogen | 12183018A | For RNA Isolation/Purification |
| TaqMan 2X Universal PCR Master Mix | Applied Biosystems | 4304437 | |
| High Capacity cDNA Reverse Transcription Kit | Applied Biosystems | 4374967 | |
| Eukaryotic 18S rRNA Endogenous Control | Life Technologies | 4319413E | For qPCR internal control |
| TaqMan Gene Expression Assay Prolactin Probe | Applied Biosystems | 4331182 | For qPCR internal control |
| TaqMan Gene Expression Assay IGFBP1 Probe | Applied Biosystems | 4331182 | For qPCR internal control |
| Phalloidin-iFluor 488 Reagent - CytoPainter | Abcam | ab176753 | |
| Human Prolactin ELISA Kit | Invitrogen | EHIAPRL | |
| 16% Paraformaldehyde | Alfa Aesar | 30525-89-4 | Fixative |
| Lipofectamine RNAiMAX | Invitrogen | 13778150 | Transfection Reagent |
| ProLong Gold antifade reagent with DAPI | Invitrogen | P36935 | For mounting |
| 0.25% Trypsin-EDTA (1X) | Gibco | 25200-056 | |
| Penicillin Streptomycin | Gibco | 15140-122 | |
| Charcoal Stripped Fetal Bovine Serum | Sigma | F6765-500ML | |
| Sodium Bicarbonate (7.5%) | Gibco | 25080-094 | |
| Ficoll-Paque PLUS Reagent | Fisher Scientific | 45001749 | |
| Collagenase from Clostridium histolyticum | Sigma | C0130-1G | |
| Deoxyribonuclease I from bovine pancreas | Sigma | DN25-100MG | |
| Medroxyprogesterone 17-acetate | Sigma | M1629-1G | For EPC Media |
| Estradiol | Sigma | E1024-1G | For EPC Media |
| cAMP | Sigma | A6885-100MG | For EPC Media |
| Fine straight stitch scissors | Fine Science Tools | 15396-00 | |
| TaqMan Gene Expression Assay NCOA2 Probe | Applied Biosystems | 4351372 | |
| Fetal Bovine Serum, heat inactivated | Gibco | 10-082-147 | |
| Antibiotic-antimycotic | Thermo Scientific | 15240062 | |
| Hank’s Balanced Salt Solution | Corning | 21-021-cv | |
| 50 mL conical polypropylene Falcon tube | Corning | 352098 | |
| Dumont #5/45 Forceps | Fine Science Tools | 11251-35 | |
| 100 x 15 mm Glass Petri dish | VWR | 75845-546 | |
| 40 micron cell strainer | Midsci | 229481 | |
| Isotemp 215 Water bath | Fisher Scientific | FS-215 | |
| LSE Centrifuge | Corning | 6755 | |
| Human NCOA2 siRNA | Dharmacon | L-020159-00 | Gene specific qPCR probe |
| Steri-cycle i160 CO2 Incubator | Thermo Scientific | 51030301 | |
| NanoDrop 2000 | Thermo Scientific | ND-2000 | For RNA quantification |
| Phosphate Buffered Saline | Fisher Scientific | 50146771 | |
| 75 cm Canted Neck Cell Culture flask | Corning | 430641U | |
| 6 well Non-Pyrogenic Cell Culture Plate | Corning | 3506 | |
| Pipet Controller Ultra | Corning | 4099 | |
| Photoshop | Adobe | 19.0.1.334 | |
| 25 cm Canted Neck Cell Culture flask | Corning | 7200876 | |
| Triton X-100 | Sigma | X100-1L | |
| 15 mL conical polypropylene Falcon tube | Corning | 352099 | |
| 10 mL Syringe | BD | 302995 | |
| 1300 Series A2 Biological Safety Hood | Thermo Scientific | 1377 | |
| accuspin Micro17 centrifuge | Fisher Scientific | 13100675 | |
| 7500 Fast real time PCR system | Applied Biosystems | 3052632 | |
| EVOS FL Immunofluorescence Microscope | Life Technologies | 01414-155G-291 | |
| Leica Inverted Light Microscope | Leica | DMi1 | |
| Illrustrator | Adobe | 22.0.1.253 | |
| Excel Spreadsheets | Microsoft | 2016 | |
| Deckglaser 18 mm cover glasses | NeuVitro | GG-18 | |
| Reichert Bright-Line Hemacytometer | Sigma | Z359629-1EA | |
| 2-mercaptoethanol | Fisher Bioreagents | BP176-100 | For RNA lysis buffer |
| 1.2mL External Threaded Polypropylene Cryogenic Vial | Corning | 430658 | For freezing HESC cells |
| Dimethyl Sulfoxide (DMSO) | Sigma | D2650-100mL | For freezing media |
References
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