Summary
Denne studien presenterer en validert og optimalisert prosedyre for isolasjon og kultur av menneskelige endometrial stromal celler å gjennomføre i vitro decidualization analysen. Videre, denne studien gir en detaljert metode for å effektivt knockdown et bestemt gen bruker siRNAs i menneskeceller endometrial stromal.
Abstract
Differensiering av menneskelige endometrial stromal celler (HESC) fra fibroblast utseende i sekretoriske decidua er en forandring nødvendig for implantasjon av embryoet i livmor lining av mors livmor. Feil decidualization har blitt etablert som en rotårsak for implantasjon svikt og påfølgende tidlig embryo spontanabort. Derfor er forstå molekylære mekanismer underliggende decidualization en fordel å forbedre frekvens vellykket fødsler. I vivo studier av kunstig decidualization er ofte begrenser på grunn etiske dilemmaer knyttet til menneskelige forskning, samt translasjonsforskning komplikasjoner i dyremodeller. Resultatet benyttes i vitro analyser gjennom grunnskolen cellekultur ofte til å utforske modulering av decidualization via hormoner. Denne studien gir en detaljert protokoll for isolering av HESC og påfølgende kunstig decidualization via kosttilskudd av hormoner til culturing medium. Videre, denne studien gir en velutformet metode til knockdown noen genet av interesse ved å benytte lipid-baserte siRNA transfections. Denne protokollen tillater optimalisering av kultur renhet samt produkt avkastning, og dermed maksimere muligheten til å utnytte denne modellen som en pålitelig metode for å forstå molekylære mekanismer underliggende decidualization og den påfølgende kvantifiseringen av utskilles agenter av decidualized endometrial stromal celler.
Introduction
Mellom stadier av menarke og menopause gjennomgå kvinner i reproduktiv alder månedlige sykluser av hormon-regulert endometrial spredning, differensiering og påfølgende blodsutgytelse i forberedelse til graviditet i en prosess som kalles menstruasjon1 ,2. Slike fysiske endringer av menneskelig endometrium er nødvendig for riktig embryoet implantasjon inn i livmor veggen1. Endringer av endometrium, inkludert både morfologiske og biokjemiske tilpasninger, er formidlet gjennom menstruasjonssyklusen via ovarian steroidhormoner østrogen og progesteron (P4)3,4,5. Innenfor den proliferativ (eller follikulær) fasen, preovulatory estrogen nivåer øker, starte endometrium jevning. Etter eggløsning fremmer sekretoriske (eller luteal) fasen en betydelig økning i P4 konsentrasjoner inducing morfologiske transformasjonen av endometrial stromal celler (ESC) fra fibroblast-lignende utseende til avrundet, epithelial-lignende decidual celler i en prosess kjent som decidualization4,6. Feil decidualization har blitt etablert som en rotårsak for implantasjon feil og påfølgende tidlig embryo spontanabort4,7,8. Derfor er forstå molekylære mekanismer underliggende decidualization fordelaktig for diagnostisering og behandling av tidlig graviditet.
For tiden benyttes flere metoder for å utforske underliggende virkningene av decidualization på endometrial stromal celler. I vivo, musen livmoren kan være kunstig indusert for decidualization via mekanisk stimulering (dvs., skrape) eller olje injeksjon i hormonally primet livmoren9. Forskjellig fra mennesker, fremmer dette syntetiske stimulering differensiering av livmor lumen ved å gi utseendet av blastocysten tilstedeværelse, et skritt som kreves for oppstart av decidualization i Red10,11. Følgelig, på grunn av translasjonsforskning komplikasjoner knyttet dyremodeller og etiske dilemmaer rundt i vivo studier i mennesker, er decidualization basert modeller mest vellykket studerte i vitro.
I denne studien er fag rekruttert gjennom plasseringen av annonser i både engelsk og spansk lokalaviser. Emner som egnet kandidater til denne studien er brakt i å møte den koordinatoren, som en full avsløring av potensielle risikoer er omtalt. Idet en fullstendig forståelse av risiko involvert, er fag samtykke oppnådd i både skriftlig og muntlig former. Emnet samtykke inkluderer tillatelse (1) gjennomgå phlebotomy (2) langsiktig lagring av deres vev for fremtidige forskningsformål og (3) samtykke til etableringen av primære kulturer fra samlet vevsprøver. Etter samtykke får fag et skjema fylle ut som tillatt selv-identifikasjon av rase/etnisitet og/eller til høyre for taushetsplikt. Etterfølgende besøk er planlagt å oppnå endometrium biopsi basert på emnet menstrual syklus. Frivillige rekruttert til denne studien reflektere både etniske og rasemessige demografi av St. Louis hovedstadens som dokumentert av folketellingen i 2012 og involverer ikke deltakelse av alle sårbare befolkningen inkludert gravide, fostre, embryo, barn under 18 år, eller andre sårbare grupper. Kravene til deltagelse i samlingen biopsi prøven inkluderer (1) å være i alderen 18-45 år (2) å ha vanlig menstrual sykluser (25-32 dager) (3) har ingen gjeldende graviditet eller bruk av hormonelle/intrauterine enhet piller i 30 dager før registrering (4) ingen gjeldende vaginal infeksjon eller seksuelt overførbare sykdommer (5) har ingen aktuelle antibiotika behandlinger, og (6) har ingen gjeldende unormal Pap smear.
I denne studien er menneskelige endometrial stromal celler (HESC) kultivert og kunstig overtalt til å gjennomgå i vitro decidualization gjennom tilskudd av hormoner (østradiol (E2) medroxyprogesterone acetate (MPA) og syklisk adenosin monofosfat (cAMP)) til mediet. I denne metoden endres graden av decidualization basert på antall dager av hormonell behandling. I forbindelse med cellen cytoskjelett omorganisering induserer hormonelle kosttilskudd biokjemiske tilpasninger som decidual cellene oppleve sekretoriske-lignende egenskaper2,4. Uttrykket av hallmark gener som prolaktin (PRL) og insulin-lignende vekstfaktor bindende protein 1 (IGFBP1), kan brukes til å bekrefte og kvantifisere graden av HESC decidualization5,12, 13 , 14. viktigst, levedyktigheten til denne protokollen å gjennomføre genet bestemt knockdown er også demonstrert.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle menneskelige endometrium biopsier samlet denne studien var oppnådd fra Washington University i St. Louis, Institutt for obstetrikk og gynekologi ved hjelp av en institusjonell Review Board (IRB) godkjent skriftlig samtykke.
1. forberedelse
- Forberede 500 mL 1 x Hanks balansert Salt løsning (HBSS) ved å legge til 100 U/mL penicillin og 100 µg/mL streptomycin media inneholder flasken (videre referert til som HBSS + medium).
- Forberede 500 mL Dulbeccos endret Eagle Medium: næringsstoff blanding F-12 (DMEM/F12) med fenol rød, L-glutamin og 15 mM 4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic syre (HEPES) ved å legge til 1% antibiotika-antimycotic løsning (siste konsentrasjonen er 100 U/mL Penicillin og 100 µg/mL Streptomycin 0,25 µg/mL Fungizone) til mediet som inneholder flaske (videre referert til som HESC isolasjon Media).
- Forberede 500 mL DMEM/F12 med fenol rød, L-glutamin og 15 mM HEPES ved å legge 10% fosterets Bovine Serum (FBS), 1 x Na2HCO3og 1% Penicillin (10.000 U/mL) og Streptomycin (10.000 µg/mL) (penn Strep) til mediet som inneholder flaske (ytterligere referert til som HESC Media).
- Forberede 500 mL redusert Serum Medium med L-glutamin, 2,4 finans natriumbikarbonat og HEPES med 2% kull strippet fosterets Bovine Serum (csFBS) og 1% penn Strep til media som inneholder flaske (videre referert til som Decidualization Media).
- Forberede 500 mL fenol red gratis DMEM/F12 ved å legge til 2% trekull strippet fosterets bovin serum (csFBS) i media som inneholder flaske (videre referert til som endre Media).
- Forberede 10 nM østradiol (E2), 1 µM medroxyprogesterone acetate (MPA) og 50 µM syklisk adenosin monofosfat (cAMP) i en 15 mL polypropylen konisk tube, og legge til en 2 mL per godt aliquot av tidligere forberedt decidualization media in vitro decidualization analysen (videre referert til som EPC Media).
- Forberede 50 mL av frysing media med 90% FBS og 10% Dimethyl sulfoxide (DMSO) i 50 mL polypropylen konisk tube (videre referert til som fryser Media).
- Pre-veie 25 mg Collagenase og 5 mg DNase I en 50 mL konisk polypropylen rør og butikk på 20 ° C.
2. menneskets Endometrium biopsi oppkjøp
- Få menneskelige endometrium biopsi prøver samlet i proliferativ fase (dag 9 - dag 12) i menstruasjonssyklusen IRB godkjent klinikken i HBSS.
- Vask biopsi prøver med 1 mL av prewarmed 37 ° C HBSS + medium og forsiktig risting for å fjerne overflødig blod og slimete.
3. isolering av menneskelige Endometrial Stromal celler (HESC)
Merk: Denne isolasjon prosedyren utføres i et sterilt miljø under en biologiske sikkerhetskabinett kabinett.
- Overføre biopsy med sterilisert tang til en 50 mL konisk polypropylen sentrifuge rør som inneholder 10 mL frisk HBSS.
- Sentrifuge biopsi ved romtemperatur på 500 x g for 90 s.
- Hvis cellen pellet brudd, re-spinn biopsi 2000 x g for 90 s.
- Fjern mediene ved hjelp av en 1 mL Pipetter og vask med 10 mL av 37 ° C prewarmed HESC isolasjon Media etterfulgt av sentrifugering 500 x g for 90 s.
- Fjern mediene ved hjelp av en 1 mL Pipetter, og kraftig legge 3 mL frisk HESC isolasjon Media å dislodge biopsi.
- Dekanter biopsy i en Petriskål inneholder 5 mL av HESC isolasjon Media.
- Hakke biopsy inn som små biter som mulig bruker #5 tang og fine rett maske saks i ca 20 minutter.
- Forberede DNase jeg og Collagenase enzymer ved å legge 10 mL av HESC isolasjon Media pre veie DNase jeg (0,5 mg/mL) og Collagenase (2,5 mg/mL). Bland med pipetter.
- Pipetter kuttet vevsprøver ved hjelp av en 1 mL Pipetter i en ny 50 mL konisk polypropylen tube. Vask med 7 mL av HESC isolasjon Media og legge til polypropylen røret for å få det hele prøven.
- Sentrifuge prøven ved romtemperatur 800 x g for 2 min. Fjern nedbryting av pipette.
- Filtrere DNase jeg og Collagenase løsning gjennom 0,2 µm knyttet til 10 mL sprøyte direkte på pellets.
- Vortex for 10 å resuspend pellets.
- Digest i 37 ° C vannbad 1.5 h, vortexing for 10 s grundig hvert 10 min, til vev er fordøyd.
- Filtrere utvalget gjennom en 40 µm celle sil stablet over en 50 mL konisk polypropylen tube fjerne epitelceller og vev rusk.
Merk: Stromal celler er i 50 mL konisk polypropylen røret. - Sentrifuge 50 mL konisk polypropylen røret 800 x g for 2,5 min ved romtemperatur. Fjern nedbryting med en 1 mL pipette.
- Resuspend pellet i 10 mL HESC isolasjon medier.
- Sentrifuge 800 x g for 2,5 min ved romtemperatur. Sug opp nedbryting, og deretter resuspend celler i 6 mL av HESC Media og pipette revers å blande.
- Sakte lag på 3 mL tetthet gradert media til resuspended cellene skille ut resterende blod celler fra stromal celler, være forsiktig ikke for å blande lagene.
- Sentrifuge 15 mL polypropylen røret på 400 x g i 30 min ved romtemperatur.
- Samle 5 mL av nedbryting i en ny 50 mL polypropylen tube og legge til en ekstra 5 mL HESC Media å resuspend cellene.
- Sentrifuge 800 x g for 2,5 min i romtemperatur, etterfulgt av fjerning av nedbryting og tillegg av 6 mL HESC Media. Vortex utvalget for 10 s og blanding av pipettering vanlige og motsatte 5 ganger.
- Aliquot 10 µL av nytt suspendert celler slik 1,5 mL microcentrifuge for celletall.
- Legge til 10 µL av 0,4% Trypan blå flekker celle aliquot og bland med pipetter. Last 10 µL av aliquot og telle celler ved hjelp av en hemocytometer.
- Plate cellene i en passende kolbe avhengig av totale celletall i 15 mL HESC medier.
- Hvis antall celler er mindre enn 1 million, plate alle celler i 25 cm kolbe med 6 mL av HESC Media. Hvis antall celler er mer enn 1 million, plate alle celler i 75 cm kolbe med 15 mL HESC Media.
- Kultur cellene i en 5% CO2 inkubator på 37 ° C i minst 6 h å sikre riktig celleadhesjon og endre media HESC Media.
- Kultur i isolerte HESC i en 5% CO2 inkubator på 37 ° C for en periode på 3-5 dager til cellene danner en monolayer å oppnå 80-90% confluency i en forkrommet kolbe.
- Endre HESC Media annenhver dag.
- Varm HESC Media i et vannbad 37 ° C i 15-20 min.
- Sug opp medier fra flasken og legge til frisk HESC Media kolbe (volum: 8 mL eller 16 mL per 25 cm eller 75 cm kolbe henholdsvis).
- Plasser kolbe tilbake i 5% CO2 inkubator på 37 ° C til 80-90% confluency er oppnådd.
- Når HESC blir 80-90% confluent, overføre celler fra 25 cm til 75 cm kolbe eller en 75 cm kolbe til tre 75 cm flasker.
Merk: HESC kan frosset og lagres for senere bruk på dette tidspunktet for fremtidige eksperimentering.
4. frysing og tining HESCs
- Sug opp medier fra 75 cm kolbe og legge 2 mL trypsin-EDTA.
- Inkuber i en 5% CO2 inkubator for 2-3 minutter på 37 ° C til cellene dislodge fra flasken.
- Legge til 7 mL av HESC Media og bland godt av pipettering revers.
- Sentrifuge 800 x g for 2,5 min og Sug opp nedbryting.
- Etiketten frysing rør med cellen linje, dato og passasje tall.
- Nytt avbryte celle pellet 5 mL av frysing media.
- Aliquot 1 mL av nytt suspendert HESC til hver rør og overføre rør-80 ° C fryser.
- Overføre rør til flytende nitrogen innen 24 timer.
Merk: Hvis å tine celler i umiddelbar fremtid, lagre frosne celler i-80 ° C i en måned. - For tining HESCs Forvarm HESC Media for 20 min.
- Legge til 8 mL forvarmet HESC Media 25 cm kolbe.
- Hente frysing røret fra flytende nitrogen tanken eller-80 ° C og senke røret i 37 ° C vannbad for 1-2 min å tine cellene.
- Overføre tinte HESC til en 25 cm kolbe med HESC Media og ruge i en 5% CO2 inkubator overnatting på 37 ° C.
- Neste dag, endre HESC Media og vente 2-3 dager før HESC blir confluent og overføre celler til 75 cm kolbe som beskrevet nedenfor i protokollen 5.
- Varm HESC Media i et vannbad 37 ° C i 15-20 min.
- Sug opp medier fra flasken og legge til frisk HESC Media kolbe (volum: 8 mL eller 16 mL per 25 cm eller 75 cm kolbe henholdsvis).
- Plasser kolbe tilbake i 5% CO2 inkubator på 37 ° C til 80-90% confluency er oppnådd.
5. menneskelige Endometrial Stromal Cell (HESC) dyrking
Merk: Denne Culturing prosedyren utføres i et sterilt miljø under en biologiske sikkerhetskabinett kabinett.
- Forvarm HESC Media på 37 ° C i et vannbad i 20-30 min.
- Sug opp medier fra flasken og Legg til 0,25% Trypsin ethylenediaminetetraacetic syre (EDTA) (1 mL for 25 cm kolbe eller 2 mL til 75 cm kolbe).
- Inkuber i en 5% CO2 inkubator på 37 ° C for 2-3 minutter til cellene dislodge.
- Forsiktig Tapp kolbe veggene for å fjerne gjenværende cellene. Legge til 7 mL av HESC Media og bland godt av pipettering revers.
- Pipetter celle blandingen i en 50 mL konisk polypropylen rør og sentrifuge 800 x g for 2,5 min ved romtemperatur.
- Sug opp nedbryting og å suspendere celle pellet i HESC medier.
- Legge til 15 mL for 25 cm kolbe eller 45mL til 75 cm kolbe (15 mL hver).
- Legge til 5 mL eller 15 mL celle suspensjon i hver 25 cm eller 75 cm kolbe henholdsvis.
- Kultur i isolerte HESC i en 5% CO2 inkubator på 37 ° C for en periode på 3-5 dager til cellene danner en monolayer å oppnå 80-90% confluency i en forkrommet kolbe.
- Endre HESC Media annenhver dag.
- Varm HESC Media i et vannbad 37 ° C i 15-20 min.
- Sug opp medier fra flasken og legge til frisk HESC Media kolbe (volum: 8 mL eller 16 mL per 25 cm eller 75 cm kolbe henholdsvis).
- Plasser kolbe tilbake i 5% CO2 inkubator på 37 ° C til 80-90% confluency er oppnådd.
6. menneskelige Endometrial Stromal Cell (HESC) Plating og siRNA Transfection
Merk: Denne hva prosedyren utføres i et sterilt miljø under en biologiske sikkerhetskabinett kabinett.
- Sug opp HESC Media fra 75 cm kolbe og legge 2 mL 0,25% trypsin-EDTA løsning.
- Inkuber i 5% CO2 inkubator på 37 ° C for 2-3 minutter til cellene dislodge.
- Når celler er forskyves fra flasken, legge til 7 mL av HESC Media og bland forsiktig av pipettering fremover og reversere 5 ganger.
- Pipetter celle blandingen i en 50 mL konisk polypropylen rør og sentrifuge 800 x g for 2,5 min ved romtemperatur. Sug opp nedbryting og re avbryte celle pellet 10 mL av HESC Media.
Merk: Hvis plating celler fra mer enn én kolbe, bare øke HESC Media volumet. - Telle celler ved hjelp av en Hemocytometer.
- Aliquot 10 µL av nytt suspendert celler i en 1,5 mL microcentrifuge tube.
- Legge til 10 µL av 0,4% Trypan blå flekker til cellen aliquot og blande av pipettering frem og omvendt.
- Plate 0.8 x 105 celler per brønn i 6-og plater. Etter to dager skal cellene 60-70% confluent for optimal transfection.
- For hver siRNA transfection prøve, forberede komplekser bruker siRNA (60 nanomoles) til transfection reagens.
- Fortynne 5 µL av transfection reagensen i 150 µL av redusert serum gratis media og ruge i 5 min.
- Fortynne 60 nanomoles av siRNA i 100 µL av redusert serum gratis media og ruge i 5 min.
- Etter 5 minutter, kombinere utvannet siRNA med fortynnet transfection reagens løsning og bland forsiktig av pipettering frem og reversere 5 ganger.
Merk: Hvis transfecting en eller flere siRNA i flere brønner, klargjør master blandingen i 10 mL polystyren rør. - Inkuber siRNA-hva reagens komplekser for 5 min ved romtemperatur.
- Under denne inkubasjonstiden, kan du legge til 1 mL av endre Media i hver brønn.
- Etter 5 min med inkubering, sentrifuge rør på 500 x g i 2 minutter å samle løsning og legge til 250 µL av siRNA-hva reagens komplekser hver også inneholder celler og media.
- Bland av forsiktig rocking og ruge cellene på 37° C i en 5% CO2 inkubator for 5 h.
- Etter 5 h, endre media HESC Media.
- Inkuber cellene på 37 ° C i en 5% CO2 inkubator for 2 dager i forberedelse til i vitro decidualization analysen.
7. in Vitro Decidualization analysen
Merk: Denne analysen utføres i et sterilt miljø under en biologiske sikkerhetskabinett kabinett.
- Forberede EPC media før starter i vitro decidualization behandling som beskrevet i Camden et al. 3 (se 1.6).
- Sug opp media fra post-48-timers transfekterte linje av HESC ruges fra trinn 6.16.
- Legg 2 mL EPC Media i hver brønn.
Merk: som en kontroll, la ett sett med celler ubehandlet EPC Media. I stedet legge til 2 mL HESC Media kontroll brønnene. - Inkuber cellene i 5% CO2 inkubator på 37 ° C for 6 dager.
- Endre EPC Media hvert døgn.
- Varm og forberede EPC medier i et vannbad 37 ° C for 15-20 min.
- Sug opp medier fra brønnen og legge frisk EPC Media.
- Plass platen tilbake til 5% CO2 inkubator på 37 ° C.
- Endre EPC Media hvert døgn.
- Etter den sjette dagen, analysere omfanget av stromal cell decidualization via ELISA og qRT PCR (som beskrevet nedenfor).
8. validering av I Vitro Decidualization utnytte kvantitative sanntid PCR (qRT-PCR)
Merk: qRT PCR fullføres som tidligere beskrevet i Kommagani et al10.
- Isolere den totale RNA fra HESC bruker protokollen fra et kommersielt tilgjengelig RNA isolering kit.
- Analysere RNA kvantitet og renhet (en260/A280) bruker en NanoDrop eller lignende metodikk som beskrevet i Garcia-Elias et al15.
- Syntetisere cDNA fra 1 µg av totale gjennom en kommersielt tilgjengelig omvendt transkripsjon kit protokoll.
- Kjøre en qRT PCR reaksjon som beskrevet i en kommersielt tilgjengelig qRT PCR kit protokoll.
- Utfør reaksjonen ved hjelp av en kommersielt tilgjengelig Real-Time PCR Master Mix og gene bestemt sonder sammen med interne kontroller (18s PRLog IGFBP1).
9. validering av I Vitro Decidualization utnytte ELISA
- Kvantifisere secreted Prolactin nivåer fra vev kultur media utnytte en kommersielt tilgjengelig prolaktin ELISA kit.
10. validering av I Vitro Decidualization utnytte Phalloidin flekker.
- Sett inn sterilt coverslips i hver brønn av en 12 godt plate.
- Gjenta 6.1-6.5.
- Plate 0.8 x 105 celler per brønn av en 12 godt plate.
- Inkuber cellene i 5% CO2 inkubator på 37 ° C i 2 dager.
- Sug opp media.
- Gjenta 7.3-7.4.
- Fix cellene i 4% paraformaldehyde (PFA) i fosfat bufret saltvann (PBS) i romtemperatur i 30 min.
- Sug opp fiksering løsningen og vaskes 3 ganger med 1 mL av PBS i 5 min.
- Legge til 0,1% ikke-ioniske surfactant polyetylenglykol tert-octyl fenyl Eter i PBS i 5 min faste cellene å øke permeabilitet.
- Vask 3 ganger med 1 mL av PBS i 5 min.
- Legg 100 µL phalloidin løsning per dekkglassvæske og ruge ved romtemperatur for 90 min.
- Forberede 1: 100 fortynning i PBS bruke en phalloidin lager løsning i 1 enhet per 5 µL.
- Vask 3 ganger med 1 mL av PBS i 5 min.
- Montere lysbildene med montering medium som inneholder 4', 6-Diamidino-2-Phenylindole (DAPI).
- Observere cellene utnytte AC confocal mikroskop.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Decidualization i HESC kultur
Etter isolasjon, endometrial stromal menneskeceller ble kultivert å en monolayer med 80-90% confluency og indusert for i vitro decidualization ved å behandle med 10 nM E2, 1 µM MPA og 50 µM leiren (EPC). Morfologiske Skift knyttet i vitro decidualization var visualisert i figur 1A. På decidualization gjennom HESCs cellen cytoskjelett omorganisering fra avlange, fibroblastic celler avrundet epithelioid celler. Dermed ble phalloidin flekker utført for å bekrefte cellen cytoskjelett omorganiseringen under HESC decidualization. Phalloidin er et svært selektive bisyklisk peptid som benyttes stain for utgangen filamenter, visualisere og dermed den cellen cytoskjelett omorganisering samsvar med i vitro decidualization (figur 1B).
Etter seks dagers innlegget EPC behandlinger, ble PRL og IGFBP1 mRNA nivåer vurdert via qRT PCR å bekrefte graden av decidualization (figur 2A). PRL og IGFBP1 var betydelig økt sammenlignet med HESC behandlet med kontroll kjøretøy (p < 0,001). Biokjemiske filendringer tilknyttet decidualization ble også vurdert gjennom kvantifiseringen utskilles PRL nivåer fra culturing mediet (figur 2B). Samsvar med transkripsjon nivåer, PRL nivåene var svært opphøyd i EPC kultivert HESC sammenlignet med kontrollen (p < 0,001).
Effekten av bestemte genet forverring på mobilnettet og molekylære forandringene av HESCs decidualization ble vurdert bruker SRC-2 som kandidat genet (Figur 3). Etter 48 timer av hva med SRC-2 siRNA- eller HESC ble kultivert i 6 dager i EPC medier. Kontroll siRNA transfekterte HESC vist cellulære og molekylære endringer samsvar med riktig decidualization, inkludert en brosteinsbelagt morfologiske endring og økt transkripsjon nivåer for decidualization PRL og IGFBP1. Som forventet, med SRC-2 siRNA knockdown, HESC var fibroblastic i utseendet i forhold til kontrollen siRNA transfekterte HESC (figur 3A). I samsvar med endringen mobilnettet, PRL og IGFBP1 utskrift nivåer ble betydelig redusert i SRC-2 siRNA transfekterte HESC, som indikerer en avsporing i decidualization programing med SRC-2 knockdown (* **p < 0,001). SRC-2 transkripsjon nivåer ble betydelig redusert i SRC-2 siRNA transfekterte HESC sammenlignet for å kontrollere siRNA, som indikerer en effektiv genet stanse med vår metode (***p < 0,001) (figur 3B).
Figur 1 : Cellular endringer av menneskelige endometrial stromal celler under i vitro decidualization. HESCs ble isolert og kultivert i seks dager i media som inneholder enten kjøretøy eller E2, MPA og cAMP (EPC). A) cellen bilder illustrerer endringene i mobilnettet morfologi fra fibroblastic til epithelioid celler. B) Phalloidin farget bilder av HESC illustrerer cellen cytoskjelett endringene (i grønt) tilknyttet i vitro decidualization, der blå representerer kjernen (DAPI). Den røde pilen representerer decidualized celler. Den svarte pilen viser fibroblastic celler. Skala bar: 100 µm. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2 : Molekylære endringer i menneskelige endometrial stromal celler under i vitro decidualization. A) total RNA ble isolert fra HSECs kultivert seks dager mediet som inneholder enten kjøretøy eller E2, MPA og cAMP (EPC) og utsatt for qRT PCR analyse PRL og IGFBP1 transkripsjon nivåer. B) nivåer av PRL utskilles i kultur-media ble målt med ELISA basert analysen fra HESC kultivert i seks dager i enten kjøretøy i EPC. p < 0,05, ** p < 0,01, *** p < 0,001. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3 : Knockdown SRC-2 i menneskeceller endometrial stromal påvirker i vitro decidualization. A) morfologiske endringer i siRNA transfekterte HESC etter 6 dager kultur med EPC media (topp paneler: kontroll siRNA gangen poeng dag 0 og dag 6, nedre paneler: SRC-2 siRNA gangen poeng dag 0 og dag 6). B) transkripsjon nivåer av SRC-2, PRLog IGFBP1 på dag 0 og dag 6 av EPC behandlet HESC transfekterte med eller SRC-2 siRNA. Den svarte pilen representerer decidualized celler. Den hvite pil viser fibroblastic celler. Skala bar: 200 µm. *** p < 0,001. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Kvinnelige reproduktive menstruasjonssyklusen er preget av en økning i progesteronnivåer gjennom luteal fase, og dermed indusere decidualization av ESC i runde, epithelial-lignende sekretoriske celler3,8. Initiering av decidualization er avhengig. Hos mennesker oppstår decidualization spontant på fremveksten av progesteron konsentrasjon, mens mus kreve blastocysten tilstedeværelse10,11. Denne inkonsekvensen i decidualization eksemplifiserer translasjonsforskning fordelene av å studere differensiering i humane cellelinjer. In vitro analyser gjennom grunnskolen cellekultur benyttes ofte til å utforske modulering av decidualization via hormoner4,6,10. Begrensninger av denne metoden kan imidlertid oppstå ved obtainability av en stor utvalgsstørrelsen av menneskelig vev uten betydelige variasjoner i syklus fase og graviditet. Likevel kan måler tatt å sikre begrensninger er minimert ved å planlegge studien langt nok på forhånd garantere rikelig prøver og planlegging biopsier i proliferativ fase (dag 9 - dag 12) i menstruasjonssyklusen.
I denne studien, HESC er kultivert og kunstig decidualized gjennom en roman metode beskrives i Brosens et al. 16 i hvilke hormoner E2, P4, og leiren er supplert til culturing medium i en 6 dagers inkubasjonstid. Vanligvis alternative metoder12:14 primet celle kulturer for kunstig decidualization gjennom tillegg av E2 og MPA over en utvidet 14 dagers inkubasjonstid. Kosttilskudd Camp til culturing media forsterker synergi decidualization av ESC i et kortere tidsrom mens samtidig upregulating uttrykket av gener som inneholder leiren forståelsesfull elementet formidler områder (dvs. PRL og IGFBP1)12,13. Denne metoden, basert på protokollen beskrevet i Kommagani et al. 10, tillater optimalisering av isolasjon og kultur HESC. Celle kultur renhet ble optimalisert ved å benytte en 40 µm celle sil for å skille stromal og epithelial linjer. Videre, Ficoll-Paque pluss reagens ble brukt for å sikre en levedyktig, høy avkastning isolering av ren stromal celler ved fjerning av blod celler fra eksempeldiagrammene. En ekstra sentrifugering trinn (400 x g i 30 min) var inkludert følgende Ficoll tillegg til sikre fullstendig fjerning av blod celler fra celle befolkningen. Endelig var HESC levedyktighet og avkastning optimalisert ved dyrking celler til 95% confluency for decidualization. Sammen sikrer disse trinnene ren kultur levedyktig, høy avkastning HESC.
Graden av decidualization ble vurdert qRT PCR, ELISA, og phalloidin flekker for å observere cellen cytoskjelett omorganisering og oppregulering av hallmark gener. I qRT PCR, ble karakterutskriften nivåer for decidualization PRL og IGFBP1 vurdert. Ved decidualization av HESC økt PRL og IGFBP1 i en tidsavhengige mote, som etablerte tidligere forskning6. Tidsavhengige økningen av utskilles PRL bekrefter også undersøke HESC vev kultur media via ELISA. Videre kan morfologiske endringer av stromal celler i decidual celler bli visualisert gjennom costaining av utgangen filamenter via phalloidin og kjernefysiske markør 4', 6-Diamidino-2-Phenylindole (DAPI)17. Sammen bekreftet disse eksperimentelle resultater effektiviteten av dyrking HESC gjennom kosttilskudd E2, MPA og cAMP.
Evnen til denne protokollen å studere genet bestemt knockdown ble også vurdert utnytte siRNA mot SRC-2. Morphologically, SRC-2 transfekterte HESC var fibroblastic, mens HESC behandlet med kontroll siRNA decidualized i epithelioid celler. SRC-2 knockdown effektivitet ble vurdert gjennom hvilket transkripsjon og ble betydelig redusert, som indikerer en vellykket stanse bestemte genet med våre protokollen. Dermed kan våre protokollen være en nyttig ressurs for etterforskere med interesse skildre rollen til bestemte gene(s) i endometrial decidualization.
Mens fremskritt i forstå de underliggende molekylære mekanismene av decidualization har gjort, finnes fortsatt et betydelige kunnskaper gap på informasjon. Feil decidualization har blitt etablert som en rotårsak for implantasjon feil og påfølgende tidlig embryo spontanabort4,6,7,10. Derfor, videre undersøkelse om epigenetic faktorer og karakterisering av molekylære er nødvendig for diagnostisering og behandling av graviditet svikt.
Avslutningsvis etablerer protokollen presenteres denne studien effektiv metode for å isolere og kultur en ren og levedyktig linje av endometrial stromal menneskeceller. Ved supplere hormoner E2, MPA, og cAMP til culturing media, kunstig decidualization kan bli indusert som bekreftes av qRT PCR, ELISA, og Phalloidin flekker. Videre skisserer våre protokollen detaljerte trinn kreves for effektiv knockdown med et bestemt interesseområde siRNA og lipid-baserte transfections. Sammen presenterer denne metoden muligheten til å studere den underliggende cellulære og molekylære mechanism(s) forbundet med HESC decidualization.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Dette arbeidet er støttet av finansiering fra National Institutes of Health (NIH) / National Institute of Child Health and Human Development (NICHD) grant (R00 HD080742) og Washington University School of Medicine oppstart midler til RK Vi vil gjerne takke Washington University fertilitetsklinikk for å gi endometrial biopsi prøvene.
Acknowledgments
Forfatterne ikke avsløre.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Opti-MEM I (1X) Reduced Serum Medium | Gibco | 31985-070 | For decidualization media |
| DMEM / F12 (1:1) (1X) | Gibco | 11330-032 | |
| Trypan Blue Stain (0.4%) | Gibco | 15250-061 | For cell count |
| PureLink RNA Mini Kit | Invitrogen | 12183018A | For RNA Isolation/Purification |
| TaqMan 2X Universal PCR Master Mix | Applied Biosystems | 4304437 | |
| High Capacity cDNA Reverse Transcription Kit | Applied Biosystems | 4374967 | |
| Eukaryotic 18S rRNA Endogenous Control | Life Technologies | 4319413E | For qPCR internal control |
| TaqMan Gene Expression Assay Prolactin Probe | Applied Biosystems | 4331182 | For qPCR internal control |
| TaqMan Gene Expression Assay IGFBP1 Probe | Applied Biosystems | 4331182 | For qPCR internal control |
| Phalloidin-iFluor 488 Reagent - CytoPainter | Abcam | ab176753 | |
| Human Prolactin ELISA Kit | Invitrogen | EHIAPRL | |
| 16% Paraformaldehyde | Alfa Aesar | 30525-89-4 | Fixative |
| Lipofectamine RNAiMAX | Invitrogen | 13778150 | Transfection Reagent |
| ProLong Gold antifade reagent with DAPI | Invitrogen | P36935 | For mounting |
| 0.25% Trypsin-EDTA (1X) | Gibco | 25200-056 | |
| Penicillin Streptomycin | Gibco | 15140-122 | |
| Charcoal Stripped Fetal Bovine Serum | Sigma | F6765-500ML | |
| Sodium Bicarbonate (7.5%) | Gibco | 25080-094 | |
| Ficoll-Paque PLUS Reagent | Fisher Scientific | 45001749 | |
| Collagenase from Clostridium histolyticum | Sigma | C0130-1G | |
| Deoxyribonuclease I from bovine pancreas | Sigma | DN25-100MG | |
| Medroxyprogesterone 17-acetate | Sigma | M1629-1G | For EPC Media |
| Estradiol | Sigma | E1024-1G | For EPC Media |
| cAMP | Sigma | A6885-100MG | For EPC Media |
| Fine straight stitch scissors | Fine Science Tools | 15396-00 | |
| TaqMan Gene Expression Assay NCOA2 Probe | Applied Biosystems | 4351372 | |
| Fetal Bovine Serum, heat inactivated | Gibco | 10-082-147 | |
| Antibiotic-antimycotic | Thermo Scientific | 15240062 | |
| Hank’s Balanced Salt Solution | Corning | 21-021-cv | |
| 50 mL conical polypropylene Falcon tube | Corning | 352098 | |
| Dumont #5/45 Forceps | Fine Science Tools | 11251-35 | |
| 100 x 15 mm Glass Petri dish | VWR | 75845-546 | |
| 40 micron cell strainer | Midsci | 229481 | |
| Isotemp 215 Water bath | Fisher Scientific | FS-215 | |
| LSE Centrifuge | Corning | 6755 | |
| Human NCOA2 siRNA | Dharmacon | L-020159-00 | Gene specific qPCR probe |
| Steri-cycle i160 CO2 Incubator | Thermo Scientific | 51030301 | |
| NanoDrop 2000 | Thermo Scientific | ND-2000 | For RNA quantification |
| Phosphate Buffered Saline | Fisher Scientific | 50146771 | |
| 75 cm Canted Neck Cell Culture flask | Corning | 430641U | |
| 6 well Non-Pyrogenic Cell Culture Plate | Corning | 3506 | |
| Pipet Controller Ultra | Corning | 4099 | |
| Photoshop | Adobe | 19.0.1.334 | |
| 25 cm Canted Neck Cell Culture flask | Corning | 7200876 | |
| Triton X-100 | Sigma | X100-1L | |
| 15 mL conical polypropylene Falcon tube | Corning | 352099 | |
| 10 mL Syringe | BD | 302995 | |
| 1300 Series A2 Biological Safety Hood | Thermo Scientific | 1377 | |
| accuspin Micro17 centrifuge | Fisher Scientific | 13100675 | |
| 7500 Fast real time PCR system | Applied Biosystems | 3052632 | |
| EVOS FL Immunofluorescence Microscope | Life Technologies | 01414-155G-291 | |
| Leica Inverted Light Microscope | Leica | DMi1 | |
| Illrustrator | Adobe | 22.0.1.253 | |
| Excel Spreadsheets | Microsoft | 2016 | |
| Deckglaser 18 mm cover glasses | NeuVitro | GG-18 | |
| Reichert Bright-Line Hemacytometer | Sigma | Z359629-1EA | |
| 2-mercaptoethanol | Fisher Bioreagents | BP176-100 | For RNA lysis buffer |
| 1.2mL External Threaded Polypropylene Cryogenic Vial | Corning | 430658 | For freezing HESC cells |
| Dimethyl Sulfoxide (DMSO) | Sigma | D2650-100mL | For freezing media |
References
- Maruyama, T., Yoshimura, Y. Molecular and cellular mechanisms for differentiation and regeneration of the uterine endometrium. Endocrine Journal. 55, 795-810 (2008).
- Yu, J., et al. Endometrial Stromal Decidualization Responds Reversibly to Hormone Stimulation and Withdrawal. Endocrinology. 157, 2432-2446 (2016).
- Ahn, J. I., et al. cAMP-Response Element-Binding 3-Like Protein 1 (CREB3L1) is Required for Decidualization and its Expression is Decreased in Women with Endometriosis. Current Molecular Medicine. 16, 276-287 (2016).
- Gellersen, B., Brosens, J. J. Cyclic decidualization of the human endometrium in reproductive health and failure. Endocrine Reviews. 35, 851-905 (2014).
- Telgmann, R., Gellersen, B. Marker genes of decidualization: activation of the decidual prolactin gene. Human Reproduction Update. 4, 472-479 (1998).
- Camden, A. J., et al. Growth regulation by estrogen in breast cancer 1 (GREB1) is a novel progesterone-responsive gene required for human endometrial stromal decidualization. Molecular Human Reproduction. 23, 646-653 (2017).
- Kommagani, R., et al. The Promyelocytic Leukemia Zinc Finger Transcription Factor Is Critical for Human Endometrial Stromal Cell Decidualization. PLoS Genetics. 12, e1005937 (2016).
- Large, M. J., DeMayo, F. J. The regulation of embryo implantation and endometrial decidualization by progesterone receptor signaling. Molecular and Cellular Endocrinology. 358, 155-165 (2012).
- Zhang, X. H., et al. The mesenchymal-epithelial transition during in vitro decidualization. Reproductive Sciences. 20, 354-360 (2013).
- Kommagani, R., et al. Acceleration of the glycolytic flux by steroid receptor coactivator-2 is essential for endometrial decidualization. PLoS Genetics. 9, e1003900 (2013).
- Ramathal, C. Y., Bagchi, I. C., Taylor, R. N., Bagchi, M. K. Endometrial decidualization: of mice and men. Seminars in Reproductive Medicine. 28, 17-26 (2010).
- Tamura, I., et al. Novel Function of a Transcription Factor WT1 in Regulating Decidualization in Human Endometrial Stromal Cells and Its Molecular Mechanism. Endocrinology. 158, 3696-3707 (2017).
- Vinketova, K., Mourdjeva, M., Oreshkova, T. Human Decidual Stromal Cells as a Component of the Implantation Niche and a Modulator of Maternal Immunity. Journal of Pregnancy. , 8689436 (2016).
- Wu, D., et al. Chronic endometritis modifies decidualization in human endometrial stromal cells. Reproductive Biology and Endocrinology. 15, 16 (2017).
- Garcia-Elias, A., et al. Defining quantification methods and optimizing protocols for microarray hybridization of circulating microRNAs. Scientific Reports. 7, 7725 (2017).
- Brosens, J. J., et al. Human endometrial fibroblasts immortalized by simian virus 40 large T antigen differentiate in response to a decidualization stimulus. Endocrinology. 137, 2225-2231 (1996).
- Koukouritaki, S. B., Margioris, A. N., Gravanis, A., Hartig, R., Stournaras, C. Dexamethasone induces rapid actin assembly in human endometrial cells without affecting its synthesis. Journal of Cellular Biochemistry. 65, 492-500 (1997).
