Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Developmental Biology
Click here for the English version

Developmental Biology

Isolering af menneskelige endometrie stromale celler til In vitro- Decidualization

Published: September 1, 2018 doi: 10.3791/57684
Automatic Translation
*1, *1, 1, 1
1Department of Obstetrics and Gynecology, Center for Reproductive Health Sciences, Washington University School of Medicine
* These authors contributed equally

Summary

Denne undersøgelse præsenterer et godkendt og optimeret procedure for isolation og kultur af human endometrie stromale celler til at gennemføre i vitro decidualization analyse. Yderligere, denne undersøgelse giver en detaljeret metode til effektivt knockdown et bestemt gen ved hjælp af siRNAs i menneskelige endometrie stromale celler.

Abstract

Differentiering af humane endometrie stromale celler (menneskelige Stamceller) fra fibroblast-lignende udseende til sekretoriske decidua er en transformation, der kræves til embryo implantering i livmoderslimhinden mødre livmoderen. Forkert decidualization er blevet oprettet som en grundlæggende årsag til implantation fiasko og efterfølgende tidlig embryo abort. Derfor er forstå de molekylære mekanismer bag decidualization en fordel at forbedre hastigheden af vellykkede fødsler. In vivo baseret undersøgelser af kunstige decidualization er ofte begrænsende på grund af etiske dilemmaer forbundet med human forskning samt translationel komplikationer i dyremodeller. Som et resultat, er in vitro- assays gennem primære cellekultur ofte udnyttet til at udforske graduering af decidualization via hormoner. Denne undersøgelse giver en detaljeret protokol for isolering af menneskelige Stamceller og efterfølgende kunstige decidualization via tilskud af hormoner til dyrkningsbaserede medium. Yderligere, denne undersøgelse giver et veldesignet metode til knockdown enhver gen af interesse ved at udnytte lipid-baserede siRNA transfections. Denne protokol tillader optimering af kultur renhed samt produkt udbytte, hvilket maksimerer muligheden for at udnytte denne model som en pålidelig metode til at forstå de molekylære mekanismer bag decidualization, og den efterfølgende kvantificering af udskilles agenter af decidualized endometrie stromale celler.

Introduction

Mellem stadier af første menstruation og overgangsalder undergår kvinder i den fødedygtige alder månedlige cyklusser af hormon-regulerede endometrie spredning, differentiering og efterfølgende afgivelse i forberedelse til graviditet i en proces kendt som menstruation1 ,2. Sådanne fysiske ændringer af den menneskelige endometriet er nødvendige for korrekt embryo implantering i livmodervæggen1. Ændringer i endometriet, herunder morfologiske og biokemiske tilpasninger, er medieret gennem hele menstruationscyklus via æggestokkene steroid hormoner østrogen og progesteron (P4)3,4,5. Inden for den proliferative (eller follikulært) fase, preovulatory østrogen niveauer stigning, iværksætte endometriet fortykkelse. Efter ægløsning fremmer den sekretoriske (eller luteal) fase en betydelig stigning i P4 koncentrationer, inducerende morfologiske omdannelsen af endometrie stromale celler (ESC) fra fibroblast-lignende udseende til afrundet, epithelial-lignende decidual celler i en proces kendt som decidualization4,6. Forkert decidualization er blevet oprettet som en grundlæggende årsag til implantation fiasko og efterfølgende tidlig embryo abort4,7,8. Derfor er forstå de molekylære mekanismer bag decidualization fordelagtig for diagnosticering og behandling af tidlig graviditet tab.

I øjeblikket er flere metoder udnyttet til at udforske underliggende virkningerne af decidualization på endometrie stromale celler. In vivo, mus livmoderen kan fremkaldes kunstigt for decidualization via mekaniske stimulation (dvs., skrabe) eller olie injektion i en hormonrelaterede PRIMES livmoderen9. Adskilt fra mennesker, denne syntetiske stimulation fremmer differentiering af uterin lumen ved at give udseende af blastocyst tilstedeværelse, et skridt, der er nødvendig for indledningen af decidualization i gnavere10,11. Derfor, på grund af translationel komplikationer forbundet med dyremodeller og de etiske dilemmaer omkring i vivo baseret undersøgelser hos mennesker, decidualization baserede modeller er mest held studerede in vitro-.

I denne undersøgelse rekrutteres emner gennem placeringen af reklamer i både engelsk og spansk Lokalaviser. Emner identificeret som egnede kandidater til denne undersøgelse er bragt at mødes med koordinatoren for forskning, som en fuld offentliggørelse af potentielle risici diskuteres. Efter bekræftelse af en komplet forståelse af potentielle risici, er registreredes samtykke opnået i både skriftlige og mundtlige former. Emnet samtykke omfatter tilladelse til (1) gennemgå tapning (2) på langtidsopbevaring af deres væv for fremtidig forskning og (3) tilslutter sig oprettelsen af primære kulturer fra enheder, der opsamlet væv. Efter samtykke får emner en form for at fuldføre i som tilladt selv-identifikation af race/Etnicitet og/eller ret til hemmeligholdelse. Et efterfølgende besøg er planlagt til at nå endometriet biopsi baseret på motivets menstruationscyklus. Volontører rekrutteret til undersøgelsen afspejler både etniske og racemæssige demografi af St. Louis metropolitan region, som dokumenteret af folketællingen i 2012 og indebærer ikke deltagelse af alle sårbare befolkning, herunder gravide kvinder, fostre, embryoer, børn under 18 år af alder eller andre sårbare grupper. Krav for deltagelse i biopsi prøve samling omfatter (1) at være i alderen 18-45 år (2) der har regelmæssig menstruationscyklus (25-32 dage) (3) har ingen aktuelle graviditet eller brug af hormonel/intrauterin enhed prævention for 30 dage før tilmelding (4) har ingen aktuelle vaginal infektion eller seksuelt overførte sygdomme (5) har ingen aktuelle antibiotika behandlinger, og (6), hvis ingen aktuelle unormal celleprøve.

Inden for denne undersøgelse, menneskelige endometrie stromale celler (menneskelige Stamceller) kulturperler og kunstigt fremkaldt til undergår in vitro- decidualization gennem tilskud af hormoner (estradiol (E2), medroxyprogesteronacetat (MPA) og cyklisk adenosin monophosphate (cAMP)) til medium. I denne metode ændres graden af decidualization baseret på det samlede antal dage af hormonel behandling. I forbindelse med cytoskeletal omlejring inducerer hormonel supplering biokemiske tilpasninger, hvor de decidual celler opleve sekretoriske-lignende kvaliteter2,4. Udtryk af hallmark gener, som prolaktin (PRL) og insulin-lignende vækstfaktor bindende protein 1 (IGFBP1), kan udnyttes til at bekræfte og kvantificere graden af menneskelige Stamceller decidualization5,12, 13 , 14. vigtigere, levedygtigheden af denne protokol til at foretage genet specifikke knockdown fremgår også.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Alle menneskelige endometriet biopsier indsamlet for denne undersøgelse blev opnået fra Washington University i St. Louis, Institut for Obstetrik og Gynækologi ved hjælp af en institutionel Review Board (IRB) godkendt skriftlige samtykkeerklæring.

1. forberedelse

  1. Forberede 500 mL af 1 x Hank's Balanced Salt løsning (HBSS) ved at tilføje 100 U/mL penicillin og 100 µg/mL streptomycin medier indeholdende flasken (yderligere refereres til som HBSS + medium).
  2. Forberede 500 mL af Dulbeccos modificerede Eagle Medium: næringsstof blanding F-12 (DMEM/F12) med phenol rød, L-glutamin og 15 mM 4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic syre (HEPES) ved at tilføje 1% antibiotikum-antimykotikum løsning (endelige koncentration er 100 U/mL Penicillin, 100 µg/mL Streptomycin og 0,25 µg/mL Fungizone) til de medier, der indeholder flaske (yderligere henvises til som menneskelige Stamceller isoleret Media).
  3. Forbered 500 mL DMEM/F12 med phenol rød, L-glutamin og 15 mM HEPES ved at tilføje 10% føtal bovin Serum (FBS), 1 x Na2HCO3og 1% Penicillin (10.000 U/mL) og Streptomycin (10.000 µg/mL) (Pen Strep) til medierne der indeholder flaske (yderligere refereret som menneskelige Stamceller Media).
  4. Forberede 500 mL af nedsat Serum Medium med L-glutamin, 2,4 g/L natriumbicarbonat og HEPES med 2% trækul strippet føtal bovint Serum (csFBS) og 1% Pen Strep til medier indeholdende flaske (yderligere refereres til som Decidualization Media).
  5. Forberede 500 mL af Phenol rød gratis DMEM/F12 ved at tilføje 2% trækul strippet føtal bovint serum (csFBS) i den medier indeholdende flaske (yderligere henvises til som Change Media).
  6. Forberede 10 nM estradiol (E2), 1 µM medroxyprogesteronacetat (MPA) og 50 µM cyklisk adenosin fra (cAMP) i en 15 mL polypropylen koniske rør, og tilføje en 2 ml pr. godt alikvot af tidligere forberedt decidualization media for in vitro- decidualization analyse (yderligere henvises til som EPC Media).
  7. Forberede 50 mL af frysning medier med 90% FBS og 10% dimethylsulfoxid (DMSO) i 50 mL polypropylen koniske rør (yderligere henvises til som indefrysning Media).
  8. Pre afvejes 25 mg Collagenase og 5 mg DNase jeg i en 50 mL konisk polypropylen rør og opbevares ved-20 ° C.

2. menneskelige endometriet biopsi erhvervelse

  1. Få menneskelige endometriet biopsi prøver indsamlet i den proliferative fase (dag 9 - dag 12) af menstruationscyklus fra IRB godkendt klinikken i HBSS.
  2. Vaske biopsi prøver med 1 mL af forvarmet 37 ° C HBSS + medium og Ryst forsigtigt for at fjerne overskydende blod og slim.

3. isolering af menneskelige endometrie stromale celler (menneskelige Stamceller)

Bemærk: Denne isolation procedure er udført i et sterilt miljø under et biologisk sikkerhed kabinet.

  1. Overføre biopsi med steriliseret pincet i en 50 mL konisk polypropylen centrifugerør indeholdende 10 mL frisk HBSS.
  2. Centrifugeres biopsi ved stuetemperatur på 500 x g for 90 s.
    1. Hvis celle pellet bristninger, re-spin biopsi på 2.000 x g for 90 s.
  3. Fjerne medierne ved hjælp af en 1 mL pipette og vask med 10 mL af 37 ° C forvarmet menneskelige Stamceller isoleret Media efterfulgt af centrifugering ved 500 x g for 90 s.
  4. Fjerne medierne ved hjælp af en 1 mL pipette, og energisk tilsættes 3 mL frisk menneskelige Stamceller isoleret medier til at løsne biopsi.
  5. Dekanteres biopsi i en petriskål, der indeholder 5 mL af menneskelige Stamceller isoleret medier.
  6. Hakkekød biopsi ind som små stykker som muligt ved hjælp af #5 pincet og fine lige sting saks i ca 20 minutter.
  7. Forberede DNase jeg og Collagenase enzymer ved at føje 10 mL af menneskelige Stamceller isoleret medier til pre vejes DNase jeg (0,5 mg/mL) og Collagenase (2,5 mg/mL). Bland med pipette.
  8. Pipette skære vævsprøver ved hjælp af en 1 mL pipette ind i en ny 50 mL konisk polypropylen rør. Vask med 7 mL af menneskelige Stamceller isoleret medier og tilføje til polypropylen røret at erhverve den fulde prøve.
  9. Centrifuge prøve ved stuetemperatur på 800 x g i 2 min. Fjern forsigtigt supernatanten med pipette.
  10. Filtrer DNase Collagenase løsning gennem 0,2 µm filter og jeg knyttet til 10 mL sprøjte direkte på pellet.
  11. Vortex for 10 s til resuspend pellet.
  12. Digest i 37 ° C vandbad til 1,5 h, vortexing for 10 s grundigt hver 10 min, indtil væv er fordøjet.
  13. Prøven filtreres på en 40 µm celle si stablet i et 50 mL konisk polypropylen rør til at fjerne epitel celler og væv debris.
    Bemærk: Stromale celler er i 50 mL konisk polypropylen røret.
  14. Der centrifugeres 50 mL konisk polypropylen røret på 800 x g for 2,5 min ved stuetemperatur. Forsigtigt fjerne supernatanten med 1 mL pipette.
  15. Resuspenderes i 10 mL af menneskelige Stamceller isoleret medier.
  16. Der centrifugeres ved 800 x g for 2,5 min ved stuetemperatur. Opsug supernatanten, og derefter resuspend celler i 6 mL af menneskelige Stamceller medier og pipette frem og bak til at blande.
  17. Langsomt lag på 3 mL af tæthed gradient media til de resuspenderede celler til at udskille resterende blodlegemer fra stromale celler, være omhyggelig med ikke at blande lagene.
  18. Der centrifugeres i 15 mL polypropylen røret ved 400 x g i 30 min. ved stuetemperatur.
  19. Indsamle 5 mL af supernatanten i en ny 50 mL polypropylen tube og tilføje en ekstra 5 mL menneskelige Stamceller medier for at resuspend cellerne.
  20. Der centrifugeres ved 800 x g i 2,5 minut ved stuetemperatur, efterfulgt af fjernelse af supernatanten og tilsætning af 6 mL menneskelige Stamceller medier. Vortex prøve for 10 s og mix af pipettering frem og bak 5 gange.
  21. Alikvot 10 µL af re suspenderede celler til en 1,5 mL microcentrifuge tube for celletal.
  22. Tilsæt 10 µL af 0,4% Trypan Blue stain at celle delprøve og bland med pipette. Indlæse 10 µL af alikvot og tælle de celler ved hjælp af en hemocytometer.
  23. Plade celler i en passende kolbe afhængig af samlede celletal i 15 mL menneskelige Stamceller medier.
    1. Hvis det samlede antal celler er mindre end 1 million, plade alle celler i 25-cm kolbe med 6 mL af menneskelige Stamceller medier. Hvis det samlede antal celler er mere end 1 million, plade alle celler i 75 cm kolbe med 15 mL af menneskelige Stamceller medier.
  24. Kultur celler i en 5% CO2 inkubator ved 37 ° C i mindst 6 h at sikre ordentlig celle vedhæftning og ændre medierne til menneskelige Stamceller medier.
  25. Kultur det isolerede menneskelige Stamceller i en 5% CO2 inkubator ved 37 ° C i en periode på 3-5 dage, indtil cellerne danner en éncellelag at nå 80-90% confluency i en forgyldt kolbe.
  26. Ændre menneskelige Stamceller Media hver to dage.
    1. Varm menneskelige Stamceller medier i et 37 ° C vandbad i 15-20 min.
    2. Opsug medier fra kolben og tilføje frisk menneskelige Stamceller Media kolben (arbejder bind: 8 mL eller 16 mL pr. 25 cm. eller 75 cm kolbe henholdsvis).
    3. Placere kolbe tilbage i 5% CO2 inkubator ved 37 ° C, indtil 80-90% confluency er opnået.
  27. Når menneskelige Stamceller bliver 80-90% sammenflydende, overføre celler fra 25 cm til 75 cm kolbe eller en 75-cm kolbe til tre 75 cm kolber.
    Bemærk: Menneskelige Stamceller kan være frosset og gemt til senere brug på dette tidspunkt for fremtidige eksperimenter.

4. nedfrysning og optøning HESCs

  1. Opsug medier fra 75 cm kolbe og tilsættes 2 mL trypsin-EDTA.
  2. Der inkuberes i en 5% CO2 inkubator for 2-3 minutter ved 37 ° C, indtil cellerne løsne fra kolben.
  3. Tilføje 7 mL af menneskelige Stamceller medier og bland godt ved pipettering frem og bak.
  4. Der centrifugeres ved 800 x g for 2,5 min og Opsug supernatanten.
  5. Label frysning rør med cellelinie, dato og passage nummer.
  6. Genopslæmmes celle pellet i 5 mL frysning medier.
  7. Alikvot 1 mL af den re suspenderede menneskelige Stamceller til hver tube og overførsel rør til-80 ° C fryser.
  8. Overføre rør til flydende kvælstof inden for 24 timer.
    Bemærk: Hvis planlægger at tø celler i nærmeste fremtid, butikken frosne celler i-80 ° C i en måned.
  9. For optøning HESCs Forvarm menneskelige Stamceller medier i 20 min.
  10. Tilføje 8 mL af forvarmet menneskelige Stamceller medier til 25-cm kolbe.
  11. Hente indefrysning røret fra flydende kvælstof tank eller-80 ° C og nedsænkes røret i 37 ° C vandbad i 1-2 min. at tø cellerne.
  12. Overføre optøede menneskelige Stamceller til en 25-cm kolbe med menneskelige Stamceller medier og inkuberes i en 5% CO2 inkubator natten over ved 37 ° C.
  13. Næste dag, ændre den menneskelige Stamceller medier og vente 2-3 dage indtil menneskelige Stamceller blive sammenflydende og Overfør celler til 75 cm kolbe som beskrevet nedenfor i protokol 5.
    1. Varm menneskelige Stamceller medier i et 37 ° C vandbad i 15-20 min.
    2. Opsug medier fra kolben og tilføje frisk menneskelige Stamceller Media kolben (arbejder bind: 8 mL eller 16 mL pr. 25 cm. eller 75 cm kolbe henholdsvis).
    3. Placere kolbe tilbage i 5% CO2 inkubator ved 37 ° C, indtil 80-90% confluency er opnået.

5. menneskelige endometrie stromale celle (menneskelige Stamceller) dyrkning

Bemærk: Denne Culturing procedure er udført i et sterilt miljø under et biologisk sikkerhed kabinet.

  1. Før varme menneskelige Stamceller medier ved 37 ° C i et vandbad i 20-30 min.
  2. Opsug medier fra kolben og tilføje 0,25% Trypsin ethylendiamintetra syre (EDTA) (1 mL 25-cm kolbe eller 2 mL til 75 cm kolbe).
  3. Der inkuberes i en 5% CO2 inkubator ved 37 ° C i 2-3 min, indtil cellerne løsne.
  4. Tryk forsigtigt på kolben væggene for at løsne de resterende celler. Tilføje 7 mL af menneskelige Stamceller medier og bland godt ved pipettering frem og bak.
  5. Med pipette overfoeres celle blandingen i en 50 mL konisk polypropylen rør og centrifugeres ved 800 x g i 2,5 min ved stuetemperatur.
  6. Opsug supernatanten og genopslæmmes celle pellet i menneskelige Stamceller medier.
    1. Der tilsættes 15 mL 25-cm kolbe eller 45mL til 75 cm kolbe (15 mL).
  7. Tilføj 5 mL eller 15 mL cellesuspension til hver 25 cm. eller 75 cm kolbe henholdsvis.
  8. Kultur det isolerede menneskelige Stamceller i en 5% CO2 inkubator ved 37 ° C i en periode på 3-5 dage, indtil cellerne danner en éncellelag at nå 80-90% confluency i en forgyldt kolbe.
  9. Ændre menneskelige Stamceller Media hver to dage.
    1. Varm menneskelige Stamceller medier i et 37 ° C vandbad i 15-20 min.
    2. Opsug medier fra kolben og tilføje frisk menneskelige Stamceller Media kolben (arbejder bind: 8 mL eller 16 mL pr. 25 cm. eller 75 cm kolbe henholdsvis).
    3. Placere kolbe tilbage i 5% CO2 inkubator ved 37 ° C, indtil 80-90% confluency er opnået.

6. menneskelige endometrie stromale celle (menneskelige Stamceller) Plating og siRNA Transfektion

Bemærk: Denne Transfektion procedure er udført i et sterilt miljø under et biologisk sikkerhed kabinet.

  1. Opsug menneskelige Stamceller medier fra 75 cm kolbe og tilsættes 2 mL 0,25% trypsin-EDTA-oploesning.
  2. Inkuber i 5% CO2 inkubator ved 37 ° C i 2-3 min, indtil cellerne løsne.
  3. Når celler er fortrængt fra kolben, tilføje 7 mL af menneskelige Stamceller medier og bland forsigtigt af pipettering frem og vende 5 gange.
  4. Med pipette overfoeres celle blandingen i en 50 mL konisk polypropylen rør og centrifugeres ved 800 x g i 2,5 min ved stuetemperatur. Opsug supernatanten og genopslæmmes celle toerstoffet i 10 mL af menneskelige Stamceller medier.
    Bemærk: Hvis plating celler fra mere end én kolbe, skal i blot forøge den menneskelige Stamceller Media volumen.
  5. Tælle celler ved hjælp af en Hemocytometer.
    1. Alikvot 10 µL af re suspenderede celler ind i en 1,5 mL microcentrifuge rør.
    2. Tilsæt 10 µL af 0,4% Trypan Blue stain at celle alikvot og mix af pipettering frem og vende.
  6. Plade 0,8 x 105 celler pr. brønd i 6-godt plader. Efter to dage, bør celler være 60-70% sammenflydende for optimal Transfektion.
  7. For hver siRNA Transfektion prøve, forberede komplekser med siRNA (60 nanomoles) til Transfektion reagens.
  8. Fortynd 5 µL Transfektion reagens i 150 µL af reducerede serum frie medier og Inkuber i 5 min.
  9. Fortynd 60 nanomoles af siRNA i 100 µL af reducerede serum frie medier og Inkuber i 5 min.
  10. Efter 5 minutter, kombinere fortyndet siRNA med fortyndet Transfektion reagens løsning og bland forsigtigt af pipettering frem og vende 5 gange.
    Bemærk: Hvis transfecting en eller flere siRNA i flere brønde, forberede master mix i 10 mL polystyren rør.
  11. Inkuber siRNA-Transfektion reagens komplekser i 5 min ved stuetemperatur.
  12. Under denne inkubering tilsættes 1 mL af Change Media til hver brønd.
  13. Efter 5 min inkubation, der centrifugeres rør ved 500 x g i 2 min til at indsamle løsning og tilføje de 250 µL af siRNA-Transfektion reagens komplekser til hver godt indeholder celler og medier.
  14. Mix af blidt vuggende og inkuberes celler ved 37° C i en 5% CO2 inkubator for 5 h.
  15. Efter 5 h, ændre medierne til menneskelige Stamceller medier.
  16. Inkuber celler ved 37 ° C i en 5% CO2 inkubator i 2 dage under forberedelse for en in vitro- decidualization analyse.

7. in Vitro Decidualization analyse

Bemærk: Denne analyse udføres i et sterilt miljø under et biologisk sikkerhed kabinet.

  1. Forberede EPC medierne forud for indledningen til in vitro- decidualization behandling, som beskrevet i Camden et al. 3 (Se 1,6).
  2. Opsug medier fra den post-48 timers transfekteret linje af menneskelige Stamceller inkuberes fra trin 6.16.
  3. Der tilsættes 2 mL af EPC medier i hver brønd.
    Bemærk: som en kontrol, Efterlad et sæt celler, ubehandlet med EPC medier. I stedet, tilsættes 2 mL af menneskelige Stamceller Media control brønde.
  4. Inkuber celler i 5% CO2 inkubator ved 37 ° C i 6 dage.
    1. Ændre EPC medierne hver 48 timer.
      1. Varm og forberede EPC medier i et 37 ° C vandbad i 15-20 min.
      2. Opsug medier fra brønden og tilføje frisk EPC medier.
      3. Læg pladen tilbage i 5% CO2 inkubator ved 37 ° C.
  5. Efter den sjette dag, analysere omfanget af stromale celle decidualization via ELISA og qRT-PCR (som beskrevet nedenfor).

8. validering af In Vitro Decidualization udnytte kvantitative Real Time PCR (qRT-PCR)

Bemærk: qRT-PCR er afsluttet som tidligere beskrevet i Kommagani mfl10.

  1. Isolere den samlede RNA fra menneskelige Stamceller udnytte protokol fra en kommercielt tilgængelig RNA isolering kit.
    1. Analysere RNA mængde og renhed (280, en260af /A) ved hjælp af en NanoDrop eller tilsvarende metode som beskrevet i Garcia-Elias al.15.
  2. Syntetisere cDNA fra 1 µg af total RNA gennem en kommercielt tilgængelig reverse transkription kit protokol.
  3. Køre en qRT-PCR reaktion, som beskrevet i et kommercielt tilgængelige qRT-PCR kit protokol.
    1. Udføre reaktionen ved hjælp af en kommercielt tilgængelig Real-Time PCR Master Mix og gen specifikke sonder sammen med interne system kontrol (18s, PRLog IGFBP1).

9. validering af In Vitro Decidualization udnytte ELISA

  1. Kvantificere de udskilles prolaktinniveauet fra vævskultur medierne udnytter en kommercielt tilgængelig prolaktin ELISA kit.

10. validering af In Vitro Decidualization udnytter Phalloidin farvning.

  1. Indsæt sterile coverslips i hvert hul i en 12 godt plade.
  2. Gentag trin 6.1-6.5.
  3. Plade 0,8 x 105 celler pr. brønd af et 12 godt plade.
  4. Inkuber celler i 5% CO2 inkubator ved 37 ° C i 2 dage.
  5. Opsug mediet.
  6. Gentag trin 7.3-7,4.
  7. Fix celler i 4% PARAFORMALDEHYD (PFA) i fosfatbufferet saltopløsning (PBS) ved stuetemperatur i 30 min.
  8. Opsug fiksering løsning og vask 3 gange med 1 mL PBS i 5 min.
  9. Tilføje 0,1% nonionisk overfladeaktivt stof polyethylenglycol tert-octyl phenyl ether i PBS for 5 min til de faste celler til at øge permeabilitet.
  10. Vask 3 gange med 1 mL PBS i 5 min.
  11. Tilsæt 100 µL af phalloidin løsning pr. coverslip og inkuberes ved stuetemperatur i 90 min.
    1. Forberede 1: 100 fortynding i PBS fra ved hjælp af en stamopløsning, hvis phalloidin i 1 enhed pr. 5 µL.
  12. Vask 3 gange med 1 mL PBS i 5 min.
  13. Montere diasene med montering medium indeholdende 4', 6-Diamidino-2-Phenylindole (DAPI).
  14. Iagttage cellerne udnytter en Konfokal mikroskop.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Decidualization i menneskelige Stamceller kultur

Efter isolering, menneskelige endometrie stromale celler blev kultiveret til en éncellelag dannelse med 80-90% confluency og induceret for in vitro- decidualization ved at behandle med 10 nM E2, 1 µM MPA og 50 µM cAMP (EPC). Morfologiske ændringer forbundet med in vitro- decidualization blev visualiseret i figur 1A. På decidualization gennemgår HESCs cytoskeletal omlægning fra langstrakte, fibroblastic celler til afrundede epithelioid celler. Således blev phalloidin farvning udført for at bekræfte den cytoskeletal reorganisering under menneskelige Stamceller decidualization. Phalloidin er en yderst selektiv bicykliske peptid, som er udnyttet til at pletten for actin filamenter, derved visualisere den cytoskeletal omlejring overensstemmelse med in vitro- decidualization (figur 1B).

I seks dage af post EPC behandlinger, blev PRL og IGFBP1 mRNA niveauer vurderet via qRT-PCR at bekræfte graden af decidualization (figur 2A). PRL og IGFBP1 niveauer var steget betydeligt i forhold til menneskelige Stamceller, behandlet med kontrol køretøj (p < 0,001). Biokemiske ændringer forbundet med decidualization blev også vurderet ved kvantificeringen af udskilles PRL niveauer fra de dyrkningsbaserede middel (figur 2B). Overensstemmelse med udskrift niveauer, PRL niveauet var højt ophøjet i den europæiske Patentkonvention kulturperler menneskelige Stamceller i forhold til kontrol (p < 0,001).

Effekten af bestemte gen ophævelse på de cellulære og molekylære ændringer i HESCs decidualization blev vurderet ved hjælp af SRC-2 som kandidat gen (figur 3). Efter 48 timer efter Transfektion med kontrol eller SRC-2 siRNA, var menneskelige Stamceller kulturperler i 6 dage i EPC medier. Kontrol siRNA transfekteret menneskelige Stamceller demonstreret cellulære og molekylære ændringer i overensstemmelse med korrekt decidualization, herunder en cobblestone morfologiske forandringer og øget udskrift niveauer af decidualization markører PRL og IGFBP1. Som forventet, med SRC-2 siRNA knockdown, transfekteret menneskelige Stamceller forblev fibroblastic i udseende i forhold til kontrol siRNA menneskelige Stamceller (figur 3A). I overensstemmelse med denne cellulære Skift, PRL og IGFBP1 udskrift niveauer var faldt betydeligt inden for SRC-2 siRNA transfekteret menneskelige Stamceller, der angiver en afsporing i decidualization programmering med SRC-2 knockdown (* **p < 0,001). SRC-2 udskrift niveauer var faldt betydeligt i SRC-2 siRNA transfekteret menneskelige Stamceller i forhold til at styre siRNA, med angivelse af en effektiv genhæmning med vores metode (***p < 0,001) (figur 3B).

Figure 1
Figur 1 : Cellulære ændringer af menneskelige endometrie stromale celler under in vitro- decidualization. HESCs blev isoleret og kulturperler i seks dage i medier indeholdende enten køretøj eller E2, MPA og cAMP (EPC). A) celle billeder illustrerer ændringer i cellulære morfologi fra fibroblastic til epithelioid celler. B) Phalloidin farvede billeder af menneskelige Stamceller illustrerer de cytoskeletal ændringer (i grønt) forbundet med in vitro- decidualization, hvor blå repræsenterer kernen (DAPI). Den røde pil repræsenterer decidualized celler. Den sorte pil viser fibroblastic celler. Skalalinjen: 100 µm. venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 2
Figur 2 : Molekylære ændringer i menneskelige endometrie stromale celler under in vitro- decidualization. A) total RNA blev isoleret fra HSECs kulturperler i seks dage i medier indeholdende enten køretøj eller E2, MPA og cAMP (EPC) og underkastes qRT-PCR analyse at opdage PRL og IGFBP1 udskrift niveauer. B) niveauer af PRL udskilles i kultur medier blev målt ved hjælp af en ELISA baseret analyse fra menneskelige Stamceller kulturperler i seks dage i enten køretøj til EPC. p < 0,05, ** p < 0,01, *** p < 0,001. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 3
Figur 3 : Knockdown af SRC-2 i menneskelige endometrie stromale celler påvirker in vitro- decidualization. A) morfologiske ændringer i siRNA transfekteret menneskelige Stamceller efter 6 dage af kultur med EPC medier (top paneler: kontrol siRNA samtidig peger dag 0 og dag 6, bunden paneler: SRC-2 siRNA samtidig peger dag 0 og dag 6). B) udskrift niveauer af SRC-2, PRLog IGFBP1 på dag 0 og dag 6 af EPC behandlet menneskelige Stamceller transfekteret med kontrol eller SRC-2 siRNA. Den sorte pil repræsenterer decidualized celler. Den hvide pil viser fibroblastic celler. Skalalinjen: 200 µm. *** p < 0,001.  Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Den kvindelige reproduktive menstruationscyklus er karakteriseret ved en stigning i progesteron niveauer i hele den luteale fase, dermed inducere decidualization af ESC i runde, epithelial-lignende sekretoriske celler3,8. Indledningen af decidualization er arter afhængige. Hos mennesker opstår decidualization spontant på stigningen i progesteron koncentrationen, mus kraever blastocyst tilstedeværelse10,11. Denne inkonsekvens i decidualization eksemplificerer translationel fordelene ved at studere Celledifferentiering i menneskers cellelinjer. In vitro-assays gennem primære cellekultur er ofte udnyttet til at udforske graduering af decidualization via hormoner4,6,10. Dog kan begrænsninger af denne metode forekomme ved anskaffe en stor prøvens størrelse af humant væv uden betydelige variationer i cyklus fase og graviditet historie. Dog kan der træffes foranstaltninger til at sikre begrænsninger er minimeret ved planlægning af undersøgelse langt nok i forvejen at sikre rigelig prøver og planlægning biopsier i den proliferative fase (dag 9 - dag 12) af menstruationscyklus.

I denne undersøgelse, menneskelige Stamceller kulturperler og kunstigt decidualized gennem en roman metode først beskrevet i Brosens et al. 16 i hvilke hormoner E2, P4 og cAMP er suppleret med de dyrkningsbaserede medium over hele en 6 dages inkubationstid. Typisk, alternative metoder12,14 primet celle kulturer for kunstige decidualization gennem tilsætning af E2 og MPA over en udvidet 14 dages inkubationstid. Tilskud af cAMP til dyrkningsbaserede medierne forstærker synergistisk decidualization af ESC i en kortere tidsramme mens samtidig upregulating udtryk af gener der indeholder lejr lydhør element promotor regioner (dvs. PRL og IGFBP1)12,13. Denne metode, baseret på den protokol, der er beskrevet i Kommagani et al. 10, tillader optimering af isolering og kultur af menneskelige Stamceller. Celle kultur renhed var optimeret ved at udnytte en 40 µm celle si for at adskille stromale og epitelial cellelinjer. Endvidere blev Ficoll-Paque PLUS reagens anvendt for at sikre en levedygtig, høj udbytte isolation af ren stromale celler ved fjernelse af blod celler fra prøven. En yderligere centrifugering trin (400 x g i 30 min) var inkluderet følgende Ficoll tilføjelse til at sikre den fuldstændige afskaffelse af blodlegemer fra celle population. Endelig, menneskelige Stamceller levedygtighed og udbyttet var optimeret ved dyrkning af celler indtil 95% confluency for decidualization. Helt, disse yderligere trin sikret den ren kultur levedygtig, høj udbyttesats menneskelige Stamceller.

Graden af decidualization blev vurderet udnytter qRT-PCR, ELISA og phalloidin farvning for at observere cytoskeletal omordning og opregulering af hallmark gener. I qRT-PCR vurderet udskrift niveauer af decidualization markører PRL og IGFBP1 . Ved decidualization af menneskelige Stamceller øget PRL og IGFBP1 niveauer i en tidsafhængig mode, som etableret fra tidligere forskning6. Tidsafhængig stigning af udskilles PRL niveauer blev også bekræftet ved at undersøge menneskelige Stamceller vævskultur medier via ELISA. Derudover kan morfologiske ændringer af stromale celler i decidual celler visualiseres gennem costaining af actin filamenter via phalloidin og nukleare markør 4', 6-Diamidino-2-Phenylindole (DAPI)17. Sammen, bekræftet disse eksperimentelle resultater effektiviteten af dyrkning menneskelige Stamceller gennem tilskud af E2, MPA og cAMP.

Kapacitet af denne protokol til at studere gen specifikke knockdown blev også vurderet udnytte siRNA mod SRC-2. Morfologisk, transfekteret SRC-2 menneskelige Stamceller forblev fibroblastic, menneskelige Stamceller behandling med kontrol siRNA decidualized ind i epithelioid celler. SRC-2 knockdown effektivitet blev vurderet gennem udskrift niveau og var faldt betydeligt, med angivelse af en vellykket hæmning af bestemte gen med vores protokol. Således, vores protokol kan være en nyttig ressource for efterforskerne med interesse for skildrer af specifikke molekylærgenetisk i endometrie decidualization rolle.

Mens fremskridt i forståelsen af de underliggende molekylære mekanismer for decidualization har foretaget, findes en betydelig videnskløft stadig på detaljerne. Forkert decidualization er blevet oprettet som en grundlæggende årsag til implantation fiasko og efterfølgende tidlig embryo abort4,6,7,10. Derfor er yderligere efterforskning vedrørende epigenetiske faktorer og karakterisering af molekylære veje nødvendige for diagnosticering og behandling af graviditet fiasko.

Afslutningsvis etablerer protokollen præsenteret i hele denne undersøgelse en effektiv metode til at isolere og kultur en ren og bæredygtig linje af menneskelige endometrie stromale celler. Kunstig decidualization ved at supplere hormoner E2, MPA og lejr til de dyrkningsbaserede medier, kan være fremkaldt som bekræftet af qRT-PCR, ELISA, og Phalloidin farvning. Yderligere, vores protokol beskriver detaljerede trin, der kræves for den effektive knockdown af et bestemt gen af interesse ved hjælp af siRNA og lipid-baseret transfections. Helt, denne metode giver mulighed for at studere de underliggende cellulære og molekylære mekanismer forbundet med menneskelige Stamceller decidualization.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Dette arbejde er støttet af midler fra National Institutes of Health (NIH) / nationale Institut for børns sundhed og menneskelige udvikling (NICHD) tilskud (R00 HD080742) og Washington University School of Medicine start-up penge til Lisbeth Vi vil gerne takke Washington University fertilitetsklinik for at give endometriebiopsi prøverne.

Acknowledgments

Forfatterne har ikke noget at oplyse.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Opti-MEM I (1X) Reduced Serum Medium Gibco 31985-070 For decidualization media
DMEM / F12 (1:1) (1X) Gibco 11330-032
Trypan Blue Stain (0.4%) Gibco 15250-061 For cell count
PureLink RNA Mini Kit Invitrogen 12183018A For RNA Isolation/Purification
TaqMan 2X Universal PCR Master Mix Applied Biosystems 4304437
High Capacity cDNA Reverse Transcription Kit Applied Biosystems 4374967
Eukaryotic 18S rRNA Endogenous Control Life Technologies 4319413E For qPCR internal control
TaqMan Gene Expression Assay Prolactin Probe Applied Biosystems 4331182 For qPCR internal control
TaqMan Gene Expression Assay IGFBP1 Probe Applied Biosystems 4331182 For qPCR internal control
Phalloidin-iFluor 488 Reagent - CytoPainter Abcam ab176753
Human Prolactin ELISA Kit Invitrogen EHIAPRL
16% Paraformaldehyde Alfa Aesar 30525-89-4 Fixative
Lipofectamine RNAiMAX Invitrogen 13778150 Transfection Reagent
ProLong Gold antifade reagent with DAPI Invitrogen P36935 For mounting
0.25% Trypsin-EDTA (1X) Gibco 25200-056
Penicillin Streptomycin Gibco 15140-122
Charcoal Stripped Fetal Bovine Serum Sigma F6765-500ML
Sodium Bicarbonate (7.5%) Gibco 25080-094
Ficoll-Paque PLUS Reagent Fisher Scientific 45001749
Collagenase from Clostridium histolyticum Sigma C0130-1G
Deoxyribonuclease I from bovine pancreas Sigma DN25-100MG
Medroxyprogesterone 17-acetate Sigma M1629-1G For EPC Media
Estradiol Sigma E1024-1G For EPC Media
cAMP Sigma A6885-100MG For EPC Media
Fine straight stitch scissors Fine Science Tools 15396-00
TaqMan Gene Expression Assay NCOA2 Probe Applied Biosystems 4351372
Fetal Bovine Serum, heat inactivated Gibco 10-082-147
Antibiotic-antimycotic Thermo Scientific 15240062
Hank’s Balanced Salt Solution  Corning 21-021-cv
50 mL conical polypropylene Falcon tube Corning 352098
Dumont #5/45 Forceps Fine Science Tools 11251-35
100 x 15 mm Glass Petri dish VWR 75845-546
40 micron cell strainer Midsci 229481
Isotemp 215 Water bath Fisher Scientific FS-215
LSE Centrifuge  Corning 6755
Human NCOA2 siRNA  Dharmacon L-020159-00 Gene specific qPCR probe
Steri-cycle i160 CO2 Incubator  Thermo Scientific 51030301
NanoDrop 2000 Thermo Scientific ND-2000 For RNA quantification
Phosphate Buffered Saline  Fisher Scientific 50146771
75 cm Canted Neck Cell Culture flask Corning 430641U
6 well Non-Pyrogenic Cell Culture Plate Corning 3506
Pipet Controller Ultra Corning 4099
Photoshop Adobe 19.0.1.334
25 cm Canted Neck Cell Culture flask Corning 7200876
Triton X-100 Sigma X100-1L
15 mL conical polypropylene Falcon tube Corning 352099
10 mL Syringe BD 302995
1300 Series A2 Biological Safety Hood Thermo Scientific 1377
accuspin Micro17 centrifuge Fisher Scientific 13100675
7500 Fast real time PCR system Applied Biosystems 3052632
EVOS FL Immunofluorescence Microscope Life Technologies 01414-155G-291
Leica Inverted Light Microscope Leica DMi1
Illrustrator Adobe 22.0.1.253
Excel Spreadsheets Microsoft 2016
Deckglaser 18 mm cover glasses NeuVitro GG-18
Reichert Bright-Line Hemacytometer Sigma Z359629-1EA
2-mercaptoethanol Fisher Bioreagents BP176-100 For RNA lysis buffer
1.2mL External Threaded Polypropylene Cryogenic Vial Corning 430658 For freezing HESC cells 
Dimethyl Sulfoxide (DMSO) Sigma D2650-100mL For freezing media

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Maruyama, T., Yoshimura, Y. Molecular and cellular mechanisms for differentiation and regeneration of the uterine endometrium. Endocrine Journal. 55, 795-810 (2008).
  2. Yu, J., et al. Endometrial Stromal Decidualization Responds Reversibly to Hormone Stimulation and Withdrawal. Endocrinology. 157, 2432-2446 (2016).
  3. Ahn, J. I., et al. cAMP-Response Element-Binding 3-Like Protein 1 (CREB3L1) is Required for Decidualization and its Expression is Decreased in Women with Endometriosis. Current Molecular Medicine. 16, 276-287 (2016).
  4. Gellersen, B., Brosens, J. J. Cyclic decidualization of the human endometrium in reproductive health and failure. Endocrine Reviews. 35, 851-905 (2014).
  5. Telgmann, R., Gellersen, B. Marker genes of decidualization: activation of the decidual prolactin gene. Human Reproduction Update. 4, 472-479 (1998).
  6. Camden, A. J., et al. Growth regulation by estrogen in breast cancer 1 (GREB1) is a novel progesterone-responsive gene required for human endometrial stromal decidualization. Molecular Human Reproduction. 23, 646-653 (2017).
  7. Kommagani, R., et al. The Promyelocytic Leukemia Zinc Finger Transcription Factor Is Critical for Human Endometrial Stromal Cell Decidualization. PLoS Genetics. 12, e1005937 (2016).
  8. Large, M. J., DeMayo, F. J. The regulation of embryo implantation and endometrial decidualization by progesterone receptor signaling. Molecular and Cellular Endocrinology. 358, 155-165 (2012).
  9. Zhang, X. H., et al. The mesenchymal-epithelial transition during in vitro decidualization. Reproductive Sciences. 20, 354-360 (2013).
  10. Kommagani, R., et al. Acceleration of the glycolytic flux by steroid receptor coactivator-2 is essential for endometrial decidualization. PLoS Genetics. 9, e1003900 (2013).
  11. Ramathal, C. Y., Bagchi, I. C., Taylor, R. N., Bagchi, M. K. Endometrial decidualization: of mice and men. Seminars in Reproductive Medicine. 28, 17-26 (2010).
  12. Tamura, I., et al. Novel Function of a Transcription Factor WT1 in Regulating Decidualization in Human Endometrial Stromal Cells and Its Molecular Mechanism. Endocrinology. 158, 3696-3707 (2017).
  13. Vinketova, K., Mourdjeva, M., Oreshkova, T. Human Decidual Stromal Cells as a Component of the Implantation Niche and a Modulator of Maternal Immunity. Journal of Pregnancy. , 8689436 (2016).
  14. Wu, D., et al. Chronic endometritis modifies decidualization in human endometrial stromal cells. Reproductive Biology and Endocrinology. 15, 16 (2017).
  15. Garcia-Elias, A., et al. Defining quantification methods and optimizing protocols for microarray hybridization of circulating microRNAs. Scientific Reports. 7, 7725 (2017).
  16. Brosens, J. J., et al. Human endometrial fibroblasts immortalized by simian virus 40 large T antigen differentiate in response to a decidualization stimulus. Endocrinology. 137, 2225-2231 (1996).
  17. Koukouritaki, S. B., Margioris, A. N., Gravanis, A., Hartig, R., Stournaras, C. Dexamethasone induces rapid actin assembly in human endometrial cells without affecting its synthesis. Journal of Cellular Biochemistry. 65, 492-500 (1997).

Tags

Udviklingsmæssige biologi sag 139 udviklingsmæssige biologi progesteron østrogen cAMP primære kulturer menneskelige endometrie stromale celler siRNA Transfektion og in vitro- decidualization
Isolering af menneskelige endometrie stromale celler til <em>In vitro-</em> Decidualization
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Michalski, S. A., Chadchan, S. B.,… More

Michalski, S. A., Chadchan, S. B., Jungheim, E. S., Kommagani, R. Isolation of Human Endometrial Stromal Cells for In Vitro Decidualization. J. Vis. Exp. (139), e57684, doi:10.3791/57684 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter