Summary
מחקר זה מציג שגרה מאומת וממוטב עבור הבידוד של התרבות האנושית תאי סטרומה רירית הרחם לנהל במבחנה decidualization assay. יתרה מזאת, מחקר זה מספק שיטה מפורט ביעילות תמונות ציפורים גנים ספציפיים באמצעות siRNAs בתאי סטרומה רירית הרחם אדם.
Abstract
הבידול של רירית הרחם סטרומה תאים אנושיים (HESC) ממראה כמו פיברובלסט. לתוך רותמי הפרשה היא שינוי נדרש השרשת לתוך הרחם רירית רחם אימהי. Decidualization לא תקין נוצרה כמו שורש לבעיה כשל השרשה, הבאים הפלה העובר מוקדם. לכן, להבין את המנגנונים המולקולריים שבבסיס decidualization הוא יתרון בשיפור שיעור לידות מוצלחות. In vivo המבוסס על מחקרים של decidualization מלאכותיים הם הגבלת לעיתים קרובות עקב דילמות אתיות המשויך מחקר אנושי, כמו גם הסיבוכים translational בתוך חייתיים. כתוצאה מכך, במבחנה מבחני דרך התרבות התא הראשי מנוצלים לעיתים קרובות כדי לחקור את האפנון של decidualization באמצעות הורמונים. מחקר זה מספק נוהל מפורט בידודו של HESC ו- decidualization מלאכותיים עוקבות באמצעות תוספת של הורמונים למדיום culturing. עוד יותר, מחקר זה מספק שיטה מעוצב היטב נוקאאוט בכל הגן עניין על-ידי ניצול siRNA מבוססי השומנים transfections. פרוטוקול זה מאפשר אופטימיזציה של טוהר התרבות, כמו גם התשואה מוצר, ובכך למקסם את היכולת לנצל את המודל הזה בתור שיטה אמינה כדי להבין את המנגנונים המולקולריים שבבסיס decidualization, כימות עוקבות של סוכנים מופרשים על-ידי decidualized תאי סטרומה רירית הרחם.
Introduction
בין השלבים של הוסת, גיל המעבר, נשים בגיל הפריון לעבור מחזורים חודשיים של הורמון מוסדר התפשטות רירית הרחם, בידול, ושפך הבאים לקראת הריון בתהליך המכונה הווסת1 ,2. ושינויים פיזיים אלו של רירית הרחם האדם נחוצים להשתלת עובר תקין לתוך הרחם1. שינויים של רירית הרחם, כולל עיבודים מורפולוגי וביוכימי, הן מתווכת לאורך המחזור החודשי באמצעות הורמונים סטרואידים השחלות אסטרוגן ופרוגסטרון (P4)3,4,5. במסגרת שלב המקדימות (או הזקיקים), רמות אסטרוגן preovulatory עלייה, ייזום עיבוי רירית הרחם. בעקבות ביוץ, השלב הפרשה (או luteal) מקדמת לעלייה משמעותית בריכוז P4, גרימת שינוי מורפולוגי תאי סטרומה רירית הרחם (ESC) של פיברובלסט דמוי מראה מעוגל, תאי אפיתל דמויי decidual בתהליך המכונה decidualization4,6. Decidualization לא תקין נוצרה כמו שורש לבעיה עבור ההשתלה כשל ו עוקבות בתחילת העובר הפלה4,7,8. לכן, להבין את המנגנונים המולקולריים שבבסיס decidualization הוא יתרון באבחון וטיפול של אובדן הריון מוקדם.
כיום, מספר מתודולוגיות מנוצלים כדי לחקור את ההשפעות הבסיסית של decidualization על תאי סטרומה רירית הרחם. In vivo, הרחם העכבר יכולה להיגרם באופן מלאכותי על decidualization באמצעות גירוי מכני (קרי,מגרד) או שמן ההזרקה הרחם הורמונאלית להתקפת9. נבדל בני אדם, גירוי מלאכותי זה מקדם את הבידול של לומן הרחם על ידי מתן את המראה של הבלסטוציסט נוכחות, צעד זה נדרש עבור אתחול של decidualization מכרסמים10,11. בהתאם לכך, עקב סיבוכים translational הקשורים בבעלי חיים של דילמות סביב ויוו המבוסס על מחקרים בבני אדם, decidualization מבוסס מודלים ביותר בהצלחה נלמדים במבחנה.
במחקר זה, נושאים מגויסים דרך המיקום של פרסומות בעיתונים מקומיים בשתי באנגלית ובספרדית. נושאים מזוהה מועמדים מתאימים למחקר זה מובאים להיפגש עם מתאם מחקר, שבו מתוארים על גילוי מלא של סיכונים פוטנציאליים. אישור ההזמנה הבנה מלאה של הסיכונים הפוטנציאליים, מושגת ההסכמה של הנבדקים בצורות בכתב ומילולית. נושא הסכמה כוללת רשות (1) עוברים דם ורידי אחסון (2) לטווח ארוך של הרקמות שלהם למטרות מחקר עתידי, (3) מסכים ליצירתו של תרבויות העיקרי של דגימות רקמה שנאספו. בעקבות הסכמה, נותנים לנסיינים טופס כדי להשלים איזו self-identification המותר של גזע/מוצא אתני ו/או הזכות של סודיות. ביקור עוקבות מתוזמנת כדי להשיג את הביופסיה רירית הרחם בהתבסס על המחזור החודשי של הנושא. מתנדבים מגויס מחקר זה לשקף שני אתנית וגזעית דמוגרפיים של אזור המטרופולין סנט לואיס כפי שתועדו בידי מפקד 2012 ו לא היה כרוך ההשתתפות של כל אוכלוסיה פגיעה כולל נשים בהריון, העוברים, עוברי, ילדים מתחת לגיל 18 שנים של גיל או קבוצות פגיעות אחרות. דרישות הכשירות להשתתפות האוסף דגימת ביופסיה כוללים (1) להיות בין הגילאים 18-45 שנים (2) שיש מווסת סדירה (25-32 ימים) (3) לאחר ההריון הנוכחי וללא שימוש באמצעי מניעה הורמונליים/תוך רחמי ההתקן 30 ימים לפני ההרשמה (4) אין זיהום נרתיקי הנוכחי או מחלות המועברות במגע מיני (5) נתקל אין טיפולים אנטיביוטיים הנוכחי, ו (6) נתקל אין פאפ חריגות הנוכחי.
במסגרת מחקר זה, תאי סטרומה רירית הרחם (HESC) אדם תרבותי, המושרה באופן מלאכותי לעבור במבחנה decidualization דרך תוספת של הורמונים (אסטרדיול (E2) medroxyprogesterone אצטט (MPA), אדנוזין מחזורית monophosphate (מחנה)) למדיום. בשיטה זו, היא מידת decidualization שונה בהתבסס על המספר הכולל של ימים של טיפול הורמונלי. יחד עם התמורות cytoskeletal, תוספי ההורמונלי גורם עיבודים ביוכימי שבו התאים decidual לחוות הפרשה כמו איכויות2,4. הביטוי של גנים הולמרק, פרולקטין (PRL) ו פקטורי גדילה דמויי אינסולין מחייב חלבון 1 (IGFBP1), יכול להיות מנוצל כדי לאשר ולכמת את מידת HESC decidualization5,12, 13 , 14. חשוב, הכדאיות של פרוטוקול זה לנהל גנים ספציפיים נוקאאוט גם הוכח.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
כל ביופסיות רירית הרחם האנושי שנאספו במחקר זה פיקחו את אוניברסיטת וושינגטון בסנט לואיס, המחלקה למיילדות, גינקולוגיה באמצעות לוח סקירה מוסדיים (IRB) אישור טופס הסכמה בכתב.
1. הכנה
- להכין 500 מ של 1 x מאוזנת מלח פתרון (HBSS של האנק) על-ידי הוספת פניצילין U/mL 100 100 סטרפטומיצין µg/mL הבקבוק מכיל מדיה (הפניה נוספות כמו HBSS + בינוני).
- הכנת 500 מ"ל של מדיום נשר שונה של Dulbecco: F-12 תערובת חומרי מזון (DMEM/F12) עם פנול אדום-גלוטמין, 15 מ מ 4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic חומצה (HEPES) על-ידי הוספת 1% פתרון אנטיביוטיקה-antimycotic (סופי הריכוז פניצילין U/mL 100, 100 µg/mL סטרפטומיצין ו 0.25 µg/mL Fungizone) בכלי התקשורת המכיל בקבוק (הפניה נוספות כמו HESC בידוד מדיה).
- הכנת 500 מ"ל של DMEM/F12 עם פנול אדום-גלוטמין, 15 מ מ HEPES על-ידי הוספת 10% סרום שור עוברית (FBS), 1 x נה HCO23ו 1% פניצילין (10,000 U/mL), סטרפטומיצין (10,000 µg/mL) (עט חיידק) לתקשורת המכיל בקבוק (בהמשך הפניה כמו מדיה HESC.)
- הכנת 500 מ"ל מופחת סרום בינוני עם L-גלוטמין, 2.4 g/L סודיום ביקרבונט HEPES עם 2% פחם הפשיטו עוברית שור סרום (csFBS) ו- 1% עט חיידק למדיה המכיל בקבוק (הפניה נוספות כמו Decidualization מדיה).
- הכנת 500 מ"ל של פנול אדום DMEM/F12 חינם על-ידי הוספת 2% פחם הפשיטו סרום שור עוברית (csFBS) בתקשורת המכיל בקבוק (הפניה נוספות כמו שינוי מדיה).
- הכינו 10 ננומטר אסטרדיול (E2), אצטט medroxyprogesterone 1 מיקרומטר (MPA) ו 50 מיקרומטר מחזורית אדנוזין monophosphate (מחנה) צינור חרוטי פוליפרופילן 15 מ"ל ולהוסיף 2 מ לכל aliquot טוב של decidualization בעבר מוכן מדיה עבור במבחנה decidualization assay (הפניה נוספות כמו EPC מדיה).
- להכין 50 מ של קפוא מדיה עם 90% FBS ו 10% דימתיל סולפוקסיד (דימתיל סולפוקסיד) 50 מ ל צינור חרוטי פוליפרופילן (הפניה נוספות כמו מדיה קפוא).
- מראש לשקול 25 מ ג של Collagenase ו- 5 מ"ג של DNase אני צינור פוליפרופילן חרוט 50 מ ל, חנות ב-20° C.
2. רכישת ביופסיה רירית הרחם אנושי
- להשיג דגימות ביופסיה רירית הרחם האנושי שנאספו בשלב המקדימות (9 יום - יום 12) של המחזור החודשי מהמרפאה IRB אושרה ב- HBSS.
- לשטוף את דגימות ביופסיה עם 1 מ"ל של prewarmed 37 ° C HBSS + בינוני וללחוץ בעדינות כדי להסיר את עודף דם, ריריות.
3. בידוד של תאי סטרומה רירית הרחם אדם (HESC)
הערה: הליך זה בידוד מתבצע בסביבה סטרילית תחת בטיחות ביולוגית ארון.
- להעביר את הביופסיה עם מלקחיים סטיריליים לתוך שפופרת צנטרפוגה פוליפרופילן חרוט 50 מ ל, המכיל 10 מ"ל HBSS טריים.
- Centrifuge את הביופסיה בטמפרטורת החדר 500 g x עבור 90 s.
- אם יתבקע צניפה התא, ספין מחדש את הביופסיה-g x 2,000 עבור 90 s.
- להסיר את המדיה באמצעות pipet של 1 מ"ל, לשטוף עם 10 מ"ל של 37 ° C prewarmed HESC בידוד מדיה ואחריו צנטריפוגה ב 500 x g עבור 90 s.
- מסיר את המדיה באמצעות pipet של 1 מ"ל, והוסף נמרצות 3 מ"ל של מדיה בידוד HESC טריים לנתק את הביופסיה.
- Decant את הביופסיה לתוך צלחת פטרי המכיל 5 מ של HESC בידוד מדיה.
- מינצ את הביופסיה לתוך כמו חתיכות קטנות ככל האפשר באמצעות #5. מלקחיים ומספריים בסדר תפר ישר למשך 20 דקות.
- להכין DNase אני ואנזימים Collagenase על-ידי הוספת 10 מ"ל אמצעי בידוד HESC DNase שנשקל מראש אני (0.5 mg/mL), Collagenase (2.5 mg/mL). מערבבים עם pipet.
- פיפטה לחתוך דגימות רקמה באמצעות pipet של 1 מ"ל לתוך 50 מ ל חרוט פוליפרופילן צינור. לשטוף עם mL 7 אמצעי בידוד HESC ולהוסיף צינור פוליפרופילן לרכוש המדגם המלא.
- צנטריפוגה המדגם בטמפרטורת החדר ב 800 x g עבור 2 דק להסיר בעדינות את תגובת שיקוע בעזרת פיפטה.
- לסנן את DNase Collagenase פתרון באמצעות מסנן 0.2 µm ואני מחובר 10 מ"ל מזרק ישירות על גבי גלולה.
- מערבולת 10 s כדי resuspend גלולה.
- תקציר ב- 37 מעלות צלזיוס המים הרותחים עבור 1.5 h, vortexing 10 s ביסודיות כל 10 דקות, עד רקמות מתעכלת.
- לסנן את הדגימה דרך מסננת תא 40 µm מוערמים על צינור חרוטי 50 מ ל פוליפרופילן כדי להסיר תאים אפיתל ופסולת רקמות.
הערה: תאי סטרומה הם בצינור פוליפרופילן חרוט 50 מ. - Centrifuge 50 מ ל צינור פוליפרופילן חרוט ב g 800 x 2.5 דקות בטמפרטורת החדר. הסר בעדינות את תגובת שיקוע עם פיפטה 1 מ"ל.
- Resuspend בגדר ב 10 מ"ל אמצעי בידוד HESC.
- צנטריפוגה ב g 800 x 2.5 דקות בטמפרטורת החדר. וארוקן את תגובת שיקוע ולאחר מכן resuspend תאים 6 מ של מדיה HESC פיפטה ואחורה לערבב.
- לאט לאט שכבה על 3 מ"ל של מדיה הדרגתיות צפיפות התאים resuspended כדי להפריד את כדוריות הדם הנותרים של תאי סטרומה, נזהר שלא לערבב את השכבות.
- Centrifuge 15 mL צינור פוליפרופילן ב g x 400 למשך 30 דקות בטמפרטורת החדר.
- לאסוף 5 מיליליטר תגובת שיקוע בתוך צינור פוליפרופילן 50 מ"ל ולהוסיף של 5 מ"ל HESC מדיה נוספים כדי resuspend את התאים.
- צנטריפוגה ב g 800 x 2.5 דקות בטמפרטורת החדר, ואחריו הסרת תגובת שיקוע, תוספת של 6 מ ל HESC מדיה. מערבולת המדגם עבור 10 s ומיקס על ידי pipetting קדימה, להפוך 5 פעמים.
- Aliquot µL 10 תאים מחדש על תנאי צינור microcentrifuge 1.5 mL עבור ספירת תאים.
- להוסיף 10 µL של 0.4% Trypan Blue כתם תא aliquot ולערבב עם pipet. לטעון 10 µL של aliquot ולספור את התאים באמצעות hemocytometer.
- צלחת התאים את הבקבוק המתאים תלויים ספירת התאים הכולל בתקשורת HESC 15 mL.
- אם המספר הכולל של תאים פחות מ 1 מיליון, צלחת כל התאים את הבקבוק 25 ס מ עם 6 מ של המדיה HESC. אם מספר התאים הכולל יותר מ- 1 מיליון, צלחת כל התאים את הבקבוק 75 ס מ עם 15 מ"ל של המדיה HESC.
- התרבות התאים CO 5%2 החממה ב 37 מעלות צלזיוס למשך תקופה מינימלית של 6 שעות כדי להבטיח התא הנכון אדהזיה ולשנות התקשורת למדיה HESC.
- תרבות של HESC מבודדים בתוך חממה2 CO 5% ב 37 מעלות צלזיוס במשך תקופה של 3-5 ימים עד התאים יוצרים טפט להשגת 80-90% confluency בבקבוקון מצופה.
- שינוי HESC מדיה כל יומיים.
- מדיה HESC חמים בתוך אמבט מים 37 º C למשך 15-20 דקות.
- תשאף המדיה מן הבקבוק ולהוסיף מדיה HESC טריים הבקבוק (אמצעי אחסון של עבודה: 8 mL או 16 מ"ל לכל הבקבוק 25 ס מ או 75 ס מ בהתאמה).
- מקם את הבקבוק בחזרה לתוך החממה 5%2 CO ב 37 ° C עד 80-90% confluency מושגת.
- ברגע HESC הופכים confluent 80-90%, העברת תאים מתוך 25-ס"מ עד 75 ס מ את הבקבוק או מתוך הבקבוק 75 ס מ אחד שלוש מבחנות 75 ס מ.
הערה: HESC יכול להיות קפוא ומאוחסנים לשימוש מאוחר יותר בשלב זה לניסויים עתידיים.
4. הקפאה והפשרה HESCs
- האחות המדיה מן הבקבוק 75 ס מ ומוסיפים 2 מ של טריפסין-EDTA.
- דגירה ב חממה2 CO 5% למשך 2-3 דקות ב 37 ° C עד התאים לסלק מן הבקבוק.
- להוסיף 7 מ של מדיה HESC, לערבב היטב על ידי pipetting ואחורה.
- צנטריפוגה ב g 800 x 2.5 דקות, וארוקן את תגובת שיקוע.
- תווית קפוא צינורות עם שורת התאים, תאריך ומספר המעבר.
- מחדש להשעות בגדר תא ב 5 מ של הקפאת מדיה.
- Aliquot 1 מ"ל של HESC מושעה מחדש את כל צינורות צינור והעברה ל-80 מעלות צלזיוס מקפיא.
- העברת צינורות חנקן נוזלי בתוך 24 שעות.
הערה: אם תכנון להפשיר תאים בתקופה הקרובה, לאחסן תאים קפוא ב-80 מעלות צלזיוס למשך חודש אחד. - עבור מפשיר את HESCs מחממים HESC מדיה עבור 20 דקות.
- הוסף 8 מ של מדיה HESC טרופה הבקבוק 25 ס מ.
- לאחזר את הצינור הקפאה מיכל חנקן נוזלי או-80 ° C ויציפו את הצינור ב- 37 מעלות צלזיוס המים הרותחים למשך 1-2 דקות. להפשיר את התאים.
- להעביר HESC המופשרים בקבוקון 25 ס מ עם HESC מדיה, דגירה ב חממה2 CO 5% בין לילה ב 37 º C.
- ביום למחרת, לשנות את התקשורת HESC והמתן 2-3 ימים עד HESC הופכים confluent להעביר תאים 75 ס מ הבקבוק כפי שיפורט להלן פרוטוקול 5.
- מדיה HESC חמים בתוך אמבט מים 37 º C למשך 15-20 דקות.
- תשאף המדיה מן הבקבוק ולהוסיף מדיה HESC טריים הבקבוק (אמצעי אחסון של עבודה: 8 mL או 16 מ"ל לכל הבקבוק 25 ס מ או 75 ס מ בהתאמה).
- מקם את הבקבוק בחזרה לתוך החממה 5%2 CO ב 37 ° C עד 80-90% confluency מושגת.
5. תאי סטרומה רירית הרחם (HESC) אדם Culturing
הערה: הליך זה Culturing מתבצע בסביבה סטרילית תחת בטיחות ביולוגית ארון.
- מראש בחום HESC מדיה ב 37 מעלות צלזיוס בתוך אמבט מים למשך 20-30 דקות.
- האחות המדיה מן הבקבוק ולהוסיף 0.25% טריפסין ethylenediaminetetraacetic חומצה (EDTA) (1 מ"ל הבקבוק 25 ס מ או 2 מ"ל על הבקבוק 75 ס מ).
- דגירה ב CO 5%2 החממה ב 37 מעלות צלזיוס למשך 2-3 דקות עד לסלק התאים.
- טפח בעדינות על הקירות את הבקבוק מכך התאים הנותרים. להוסיף 7 מ של מדיה HESC, לערבב היטב על ידי pipetting ואחורה.
- Pipet התערובת תא לתוך צינור פוליפרופילן חרוט 50 מ ל צנטריפוגה ב 800 x g 2.5 דקות בטמפרטורת החדר.
- וארוקן את תגובת שיקוע, מחדש להשעות בגדר תא HESC בתקשורת.
- להוסיף 15 מ"ל 25 ס מ את הבקבוק או 45 מ עבור הבקבוק 75 ס מ (15 מ ל כל אחד).
- להוסיף התליה תא מ ל או 15 מ"ל כל הבקבוק 25 ס מ או 75 ס מ בהתאמה.
- תרבות של HESC מבודדים בתוך חממה2 CO 5% ב 37 מעלות צלזיוס במשך תקופה של 3-5 ימים עד התאים יוצרים טפט להשגת 80-90% confluency בבקבוקון מצופה.
- שינוי HESC מדיה כל יומיים.
- מדיה HESC חמים בתוך אמבט מים 37 º C למשך 15-20 דקות.
- תשאף המדיה מן הבקבוק ולהוסיף מדיה HESC טריים הבקבוק (אמצעי אחסון של עבודה: 8 mL או 16 מ"ל לכל הבקבוק 25 ס מ או 75 ס מ בהתאמה).
- מקם את הבקבוק בחזרה לתוך החממה 5%2 CO ב 37 ° C עד 80-90% confluency מושגת.
6. האדם יופיצ תא (HESC) סטרומה רירית הרחם ואת siRNA תרביות תאים
הערה: הליך זה תרביות תאים מתבצע בסביבה סטרילית תחת בטיחות ביולוגית ארון.
- האחות HESC המדיה מן הבקבוק 75 ס מ ומוסיפים 2 מ"ל של 0.25% טריפסין-EDTA פתרון.
- דגירה ב- 5% CO חממה2 ב 37 מעלות צלזיוס למשך 2-3 דקות עד לסלק התאים.
- ברגע תאים נעקרות את הבקבוק, להוסיף 7 מ של מדיה HESC, לערבב בעדינות על ידי pipetting קדימה, להפוך 5 פעמים.
- Pipet התערובת תא לתוך צינור פוליפרופילן חרוט 50 מ ל צנטריפוגה ב 800 x g 2.5 דקות בטמפרטורת החדר. וארוקן את תגובת שיקוע, מחדש להשעות בגדר תא ב- 10 מ"ל של המדיה HESC.
הערה: אם ציפוי תאים מן הבקבוק אחד או יותר, פשוט להגדיל את נפח המדיה HESC. - ספירת תאים באמצעות של Hemocytometer.
- µL 10 aliquot של תאים מושעה מחדש לתוך צינור microcentrifuge 1.5 mL.
- להוסיף 10 µL של 0.4% Trypan Blue כתם תא aliquot, לערבב על ידי pipetting קדימה, הפוך.
- צלחת 0.8 x 105 תאים לכל טוב טוב 6 צלחות. לאחר יומיים, תאים צריך להיות 60-70% confluent של האופטימלית תרביות תאים.
- עבור כל דגימה siRNA תרביות תאים, להכין את מתחמי באמצעות siRNA (60 nanomoles) כדי ריאגנט תרביות תאים.
- לדלל 5 µL של תרביות תאים ריאגנט ב 150 µL מדיה פנויה מופחת סרום, תקופת דגירה של 5 דקות.
- לדלל 60 nanomoles של siRNA ב 100 µL מדיה פנויה מופחת סרום, תקופת דגירה של 5 דקות.
- לאחר 5 דקות, לשלב siRNA מדולל עם תרביות תאים מדולל ריאגנט פתרון, לערבב בעדינות על ידי pipetting קדימה, להפוך 5 פעמים.
הערה: אם transfecting אחד או יותר siRNA בבארות מרובים, להכין מיקס מאסטר ב- 10 מ"ל צינורות פוליסטירן. - דגירה מתחמי ריאגנט siRNA-תקנים עבור 5 דקות בטמפרטורת החדר.
- במהלך זה דגירה, להוסיף 1 מ"ל של שינוי מדיה מכל קידוח.
- אחרי 5 דקות של דגירה, צנטריפוגה צינורות ב 500 g x למשך 2 דקות לאסוף את הפתרון ולהוסיף את µL 250 של מתחמי ריאגנט siRNA-תקנים לכל טוב המכיל תאים ומדיה.
- לערבב במוזיקת בעדינות, דגירה התאים ב- 37 מעלות צלזיוס חממה2 CO 5% במשך 5 שעות.
- לאחר 5 שעות, לשנות את המדיה HESC מדיה.
- דגירה התאים ב- 37 מעלות צלזיוס ב חממה2 5% CO 2 ימים לקראת assay decidualization במבחנה .
7. במבחנה Decidualization Assay
הערה: זו assay מתבצע בסביבה סטרילית תחת בטיחות ביולוגית ארון.
- להכין כלי התקשורת EPC לפני מתחיל את הטיפול decidualization במבחנה כמתואר בקמדן. et al. 3 (ראה 1.6).
- האחות המדיה מן השעה פוסט-48 transfected שורה של HESC מודגרות מהשלב 6.16.
- להוסיף 2 מיליליטר EPC מדיה בכל טוב.
שימו לב: כמו פקד, השאר ערכה אחת של תאים לא מטופל עם EPC מדיה. במקום זאת, הוסף 2 מ"ל של מדיה HESC הבארות שליטה. - דגירה התאים 5% CO2 החממה ב 37 ° C ל-6 ימים.
- לשנות את המדיה EPC כל 48 שעות.
- חם ולהתכונן EPC מדיה באמבט מים 37 ° C 15-20 דקות.
- האחות מדיה מן הבאר והוסף מדיה EPC טריים.
- מקם את הצלחת בחזרה לתוך החממה 5%2 CO ב 37 º C.
- לשנות את המדיה EPC כל 48 שעות.
- לאחר יום השישי, לנתח את היקף סטרומה תא decidualization ויה ELISA ו לרביעיית-PCR (כמפורט להלן).
8. אימות של Decidualization ב חוץ גופית ניצול בזמן אמת כמותיים PCR (לרביעיית-PCR)
הערה: לרביעיית-PCR הושלמה כאמור שמתואר ואחKommagani10.
- לבודד את הרנ א סה כ מ HESC ניצול פרוטוקול ערכה זמינים מסחרית של בידוד ה-RNA.
- לנתח את כמות ה-RNA וטוהר (260/A280) באמצעות NanoDrop או מתודולוגיה דומה כפי שמתואר גרסיה-אליאס ואח15.
- לסנתז cDNA מ 1 µg של RNA הכולל דרך פרוטוקול ערכת זמינים מסחרית שעתוק במהופך.
- להפעיל תגובת לרביעיית-PCR כפי שמתואר פרוטוקול ערכת לרביעיית זמינים מסחרית-PCR.
- לבצע את התגובה באמצעות שילוב PCR מאסטר זמינים מסחרית בזמן אמת, גנים ספציפיים רגשים יחד עם פקדים מערכת פנימיים (18s, PRLו IGFBP1).
9. אימות של Decidualization ב חוץ גופית ניצול אליסה
- לכמת את רמות פרולקטין המופרש מהתקשורת תרביות רקמה ניצול ערכת דיאגנוסטיקה פרולקטין זמינים מסחרית.
10. אימות של Decidualization ב חוץ גופית ניצול Phalloidin מכתים.
- הכנס coverslips סטרילי כל טוב של צלחת טוב 12.
- חזור על שלבים 6.1-6.5.
- צלחת 0.8 x 105 תאים לכל טוב של צלחת טוב 12.
- דגירה התאים 5% CO2 החממה ב 37 מעלות צלזיוס במשך יומיים.
- האחות התקשורת.
- חזור על שלבים 7.3-7.4.
- לתקן את התאים ב- 4% paraformaldehyde (PFA) buffered פוספט תמיסת מלח (PBS) בטמפרטורת החדר למשך 30 דקות.
- האחות הפתרון קיבוע ולשטוף 3 פעמים עם 1 מ"ל של PBS למשך 5 דקות.
- להוסיף 0.1% חומרים פעילי שטח ללא יונית פוליאתילן גליקול טרט-תמצית phenyl אתר ב- PBS עבור 5 דקות לתאים קבועות כדי להגדיל את חדירות.
- לשטוף 3 פעמים עם 1 מ"ל של PBS למשך 5 דקות.
- להוסיף 100 µL phalloidin פתרון לכל coverslip, דגירה בטמפרטורת החדר במשך 90 דקות.
- להכין מטריים דילול ב- PBS באמצעות פתרון מניות phalloidin ביחידה 1 לכל 5 µL.
- לשטוף 3 פעמים עם 1 מ"ל של PBS למשך 5 דקות.
- הר השקופיות הרכבה בינונית המכיל 4', 6-Diamidino-2-Phenylindole (דאפי).
- לבחון את התאים ניצול מיקרוסקופ קונפוקלי.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Decidualization בתרבות HESC
בעקבות בידוד, תאי סטרומה רירית הרחם אדם היו בתרבית היווצרות חד שכבתי עם 80-90% confluency, שנגזרות עבור במבחנה decidualization בטיפול עם 10 ננומטר E2 1 מיקרומטר MPA, מחנה 50 מיקרומטר (EPC). משמרות מורפולוגי המשויך במבחנה decidualization היו דמיינו ב איור 1A. על decidualization, HESCs לעבור שחלוף cytoskeletal מתאי מוארך, fibroblastic לתאים epithelioid מעוגלות. לפיכך, phalloidin מכתים בוצעה כדי לאשר לארגונו מחדש cytoskeletal במהלך HESC decidualization. Phalloidin הוא פפטיד bicyclic סלקטיבי מאוד אשר מנוצל כתם על חוטים אקטין, ובכך להמחיש את התמורות cytoskeletal בקנה אחד עם במבחנה decidualization (איור 1B).
שישה ימים של פוסט EPC טיפולים PRL ואת רמות ה-mRNA IGFBP1 היו העריכו ויה לרביעיית-PCR כדי לוודא את מידת decidualization (איור 2 א). PRL ורמות IGFBP1 היו גדל באופן משמעותי בהשוואה HESC מטופלים עם שליטה ברכב (p < 0.001). שינויים ביוכימיים הקשורים decidualization היו גם העריכו באמצעות כימות של רמות PRL המופרש מן המדיום culturing (איור 2B). בקנה אחד עם התעתיק רמות, רמות PRL היו מאוד גבוהות EPC תרבותי HESC בהשוואה הפקד (p < 0.001).
ההשפעה של גנים ספציפיים וביטול השינויים תאית ומולקולרית של HESCs decidualization היו העריכו באמצעות SRC-2 כמו המועמד ג'ין (איור 3). לאחר 48 שעות של תרביות תאים עם שליטה או siRNA SRC-2 , HESC היו תרבותי ב 6 ימים בתקשורת EPC. שליטה siRNA transfected HESC הפגינו תאית ומולקולרית שינויים בקנה אחד עם decidualization תקין, כולל שינוי מורפולוגי המרוצף ורמות התעתיק מוגברת של סמנים decidualization PRL ו- IGFBP1. כצפוי, עם נוק-אאוט siRNA SRC-2 , HESC נשאר fibroblastic במראה לעומת siRNA פקד transfected HESC (איור 3 א). בקנה אחד עם השינוי הסלולר, PRL , תעתיק IGFBP1 רמות ירדו באופן משמעותי בתוך siRNA SRC-2 transfected HESC, המציין שימוט בתיכנות decidualization עם נוקאאוט SRC-2 (* * *p < 0.001). רמות התעתיק SRC-2 ירדו באופן משמעותי SRC - 2 siRNA transfected HESC בהשוואה לשלוט siRNA, המציין יעיל ג'ין להחרשת בשיטה שלנו (* * *p < 0.001) (איור 3B).
איור 1 : שינויים סלולריים של תאי סטרומה רירית הרחם אדם במהלך במבחנה decidualization. HESCs היו מבודדים, תרבותי במשך שישה ימים בתקשורת המכיל או רכב או E2, MPA, מחנה (EPC). א) תא תמונות הממחישות את השינויים במורפולוגיה הסלולר מ fibroblastic לתאים epithelioid. B) Phalloidin מוכתם תמונות של HESC הממחישות את השינויים cytoskeletal (בירוק) המשויך במבחנה decidualization, כאשר הכחול מייצג את הגרעין (דאפי). החץ האדום מייצג את התאים decidualized. החץ השחור מראה התאים fibroblastic. סרגל קנה מידה: 100 מיקרומטר. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 2 : שינויים מולקולריים בתאי סטרומה אדם רירית הרחם במהלך במבחנה decidualization. א) רנ א הכולל הופרדה מרשת HSECs תרבותי במשך שישה ימים בתקשורת המכיל או רכב או E2, MPA, מחנה (EPC) ונחשפו ניתוח לרביעיית-PCR לזיהוי PRL ואת רמות תעתיק IGFBP1 . B) רמות של PRL ומופרש אל התקשורת תרבות נמדדו באמצעות assay בהתבסס על אליסה מ HESC תרבותי במשך שישה ימים ברכב או כדי EPC. p < 0.05, * * p < 0.01, * * * p < 0.001. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 3 : נוקאאוט של SRC-2 בתאי סטרומה רירית הרחם אדם משפיע על במבחנה decidualization. א) שינויים מורפולוגיים ב siRNA transfected HESC לאחר 6 ימים של תרבות התקשורת EPC (top לוחות: שליטה siRNA בזמן נקודות יום 0 ויום 6, לוחות התחתון: SRC-2 siRNA בזמן נקודות יום 0 ו- 6 יום). ב) רמות תעתיק של SRC-2, PRL, IGFBP1 על יום 0 ו- 6 יום של EPC מטופלים HESC transfected עם שליטה או SRC-2 siRNA. החץ השחור מייצג את התאים decidualized. החץ הלבן מראה התאים fibroblastic. סרגל קנה מידה: 200 מיקרומטר. * * * p < 0.001. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
המחזור החודשי הרבייה הנשי מאופיין על ידי עלייה ברמות הפרוגסטרון לאורך כל שלב luteal, ובכך גרימת את decidualization של ESC לתוך תאים הפרשה עגול, אפיתל דמויי3,8. אתחול של decidualization הוא מין התלויים. בבני אדם, decidualization מתרחשת באופן ספונטני על עליית ריכוז הפרוגסטרון, ואילו עכברים דורשים הבלסטוציסט נוכחות10,11. זה חוסר עקביות decidualization מדגימה את היתרונות translational של הלומדים התמיינות תאים בשורות תאים אנושיים. מבחני במבחנה באמצעות התרבות התא הראשי מנוצלים לעיתים קרובות כדי לחקור את האפנון של decidualization באמצעות הורמונים4,6,10. עם זאת, מגבלות של שיטה זו יכולה להתרחש בעת obtainability של גודל מדגם גדולים של רקמה אנושית ללא וריאציות משמעותיות בהיסטוריה שלב והריון מחזור. ובכל זאת, אמצעים שניתן לנקוט כדי להבטיח המגבלות הן מזעריות על-ידי תכנון המחקר מספיק זמן מראש כדי להבטיח דגימות בשפע וביופסיות תזמון בשלב המקדימות (9 יום - יום 12) של המחזור החודשי.
במחקר זה, הם HESC תרבותי, decidualized באופן מלאכותי באמצעות שיטה תיאר לראשונה בשנת Brosens. et al. 16 ב אשר ההורמונים E2 P4, מחנה הם השלימו למדיום culturing לאורך כל תקופת דגירה של 6 ימים. בדרך כלל, שיטות אלטרנטיביות12,14 בשלה תא תרבויות עבור decidualization מלאכותי באמצעות התוספת של E2 ו- MPA לאורך תקופת דגירה ממושכת ל-14 יום. תוספת של מחנה למדיה culturing בסינרגיה מגביר את decidualization של ESC במסגרת זמן מקוצרת בזמן בו זמנית upregulating קולטני הביטוי של גנים המכיל רכיב מגיב המחנה יזם אזורים (קרי, PRL ו IGFBP1)12,13. שיטה זו, המבוססת על פרוטוקול המתואר Kommagani. et al. 10, מאפשר אופטימיזציה של הבידוד של התרבות HESC. טוהר התרבות התא היה מותאם על ידי ניצול מסננת תא 40 µm כדי להפריד בין שורות תאים סטרומה ואפיתל. יתר על כן, ריאגנט Ficoll-Paque בתוספת הוחל על מנת להבטיח תשואה גבוהה, קיימא בידוד תאי סטרומה טהור עם הסרת תאי דם מדגם. צעד נוסף צנטריפוגה (400 x גרם במשך 30 דקות) היה כלול תוספת Ficoll הבאים כדי להבטיח חיסול מוחלט של תאי דם מן האוכלוסייה התא. לבסוף, HESC הכדאיות ועם תשואה אופטימציה על culturing תאים עד 95% confluency עבור decidualization. בסך הכל אלה צעדים נוספים הבטיחו התרבות טהור של תשואה גבוהה, קיימא HESC.
מידת decidualization נאמד ניצול לרביעיית-PCR ELISA, phalloidin מכתים להתבונן cytoskeletal שחלוף של קולטנים upregulation של גנים הולמרק. ב לרביעיית-PCR, היו העריכו את רמות תעתיק של סמנים decidualization PRL ו- IGFBP1 . על decidualization של HESC, PRL ורמות IGFBP1 גדל באופן תלוי-זמן, כפי שנקבעו מחקר קודמות6. העלייה תלויי-זמן של רמות PRL המופרש אושר גם על ידי בחינת התקשורת תרביות רקמה HESC ויה אליסה. יתר על כן, ניתן לאבחן שינויים מורפולוגיים של תאי סטרומה תאים decidual דרך costaining של אקטין חוטים ויה phalloidin וסמן גרעיני 4', 6-Diamidino-2-Phenylindole (דאפי)17. יחד, תוצאות ניסויים אלה אישר את האפקטיביות של culturing HESC דרך תוספת של E2 MPA, מחנה.
היכולת של פרוטוקול זה ללמוד גנים ספציפיים נוקאאוט הוערכה גם ניצול siRNA נגד SRC-2. מורפולוגית, SRC-2 transfected HESC נשאר fibroblastic, ואילו HESC שטופלו siRNA שליטה decidualized לתוך התאים epithelioid. SRC-2 תמונות ציפורים הוערכה באמצעות רמת התעתיק ויעילות באופן משמעותי ירדו, המציין מוצלחת להחרשת גנים ספציפיים עם פרוטוקול שלנו. כך, הפרוטוקול שלנו יכול להיות משאב שימושי לחוקרים בעלי אינטרס בהתוויית תפקיד ספציפי gene (s) ב- decidualization רירית הרחם.
בעוד החידושים הבנת המנגנונים המולקולריים שבבסיס של decidualization נוצרו, פער ידע משמעותי עדיין קיים על הפרטים. Decidualization לא תקין נוצרה כמו שורש לבעיה כשל השרשה, עוקבות בתחילת העובר הפלה4,6,7,10. לכן, חקר נוסף לגבי גורמים epigenetic ו אפיון של מסלולים מולקולריים הוא צורך באבחון וטיפול של כישלון ההריון.
לסיכום, פרוטוקול שהוצגו במהלך מחקר זה יוצר שיטה יעילה כדי לבודד את תרבות קו טהור בר -קיימא של תאים אנושיים סטרומה רירית הרחם. מאת שכשהם ההורמונים E2 MPA, מחנה למדיה culturing, decidualization מלאכותי יכולה להיגרם כפי שאושר על-ידי לרביעיית-PCR, אליסה, ו Phalloidin מכתים. עוד, פרוטוקול שלנו מתאר בשלבים מפורטים הדרושים עבור נוקאאוט יעיל של גנים ספציפיים עניין באמצעות siRNA transfections מבוססי השומנים. בסך הכל, שיטה זו מציג את היכולת ללמוד mechanism(s) תאית ומולקולרית הבסיסית של המשויך HESC decidualization.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
עבודה זו נתמכת על ידי מימון של נבחרת מכונים לבריאות (NIH) / המכון הלאומי של גרנט ובריאות הילד והתפתחות האדם (NICHD) (R00 HD080742), בית הספר לרפואה של אוניברסיטת וושינגטון הזנק מממן את ר. ק ברצוננו להודות המרפאה לפוריות אוניברסיטת וושינגטון למתן את דגימות ביופסיה רירית הרחם.
Acknowledgments
המחברים אין לחשוף.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Opti-MEM I (1X) Reduced Serum Medium | Gibco | 31985-070 | For decidualization media |
| DMEM / F12 (1:1) (1X) | Gibco | 11330-032 | |
| Trypan Blue Stain (0.4%) | Gibco | 15250-061 | For cell count |
| PureLink RNA Mini Kit | Invitrogen | 12183018A | For RNA Isolation/Purification |
| TaqMan 2X Universal PCR Master Mix | Applied Biosystems | 4304437 | |
| High Capacity cDNA Reverse Transcription Kit | Applied Biosystems | 4374967 | |
| Eukaryotic 18S rRNA Endogenous Control | Life Technologies | 4319413E | For qPCR internal control |
| TaqMan Gene Expression Assay Prolactin Probe | Applied Biosystems | 4331182 | For qPCR internal control |
| TaqMan Gene Expression Assay IGFBP1 Probe | Applied Biosystems | 4331182 | For qPCR internal control |
| Phalloidin-iFluor 488 Reagent - CytoPainter | Abcam | ab176753 | |
| Human Prolactin ELISA Kit | Invitrogen | EHIAPRL | |
| 16% Paraformaldehyde | Alfa Aesar | 30525-89-4 | Fixative |
| Lipofectamine RNAiMAX | Invitrogen | 13778150 | Transfection Reagent |
| ProLong Gold antifade reagent with DAPI | Invitrogen | P36935 | For mounting |
| 0.25% Trypsin-EDTA (1X) | Gibco | 25200-056 | |
| Penicillin Streptomycin | Gibco | 15140-122 | |
| Charcoal Stripped Fetal Bovine Serum | Sigma | F6765-500ML | |
| Sodium Bicarbonate (7.5%) | Gibco | 25080-094 | |
| Ficoll-Paque PLUS Reagent | Fisher Scientific | 45001749 | |
| Collagenase from Clostridium histolyticum | Sigma | C0130-1G | |
| Deoxyribonuclease I from bovine pancreas | Sigma | DN25-100MG | |
| Medroxyprogesterone 17-acetate | Sigma | M1629-1G | For EPC Media |
| Estradiol | Sigma | E1024-1G | For EPC Media |
| cAMP | Sigma | A6885-100MG | For EPC Media |
| Fine straight stitch scissors | Fine Science Tools | 15396-00 | |
| TaqMan Gene Expression Assay NCOA2 Probe | Applied Biosystems | 4351372 | |
| Fetal Bovine Serum, heat inactivated | Gibco | 10-082-147 | |
| Antibiotic-antimycotic | Thermo Scientific | 15240062 | |
| Hank’s Balanced Salt Solution | Corning | 21-021-cv | |
| 50 mL conical polypropylene Falcon tube | Corning | 352098 | |
| Dumont #5/45 Forceps | Fine Science Tools | 11251-35 | |
| 100 x 15 mm Glass Petri dish | VWR | 75845-546 | |
| 40 micron cell strainer | Midsci | 229481 | |
| Isotemp 215 Water bath | Fisher Scientific | FS-215 | |
| LSE Centrifuge | Corning | 6755 | |
| Human NCOA2 siRNA | Dharmacon | L-020159-00 | Gene specific qPCR probe |
| Steri-cycle i160 CO2 Incubator | Thermo Scientific | 51030301 | |
| NanoDrop 2000 | Thermo Scientific | ND-2000 | For RNA quantification |
| Phosphate Buffered Saline | Fisher Scientific | 50146771 | |
| 75 cm Canted Neck Cell Culture flask | Corning | 430641U | |
| 6 well Non-Pyrogenic Cell Culture Plate | Corning | 3506 | |
| Pipet Controller Ultra | Corning | 4099 | |
| Photoshop | Adobe | 19.0.1.334 | |
| 25 cm Canted Neck Cell Culture flask | Corning | 7200876 | |
| Triton X-100 | Sigma | X100-1L | |
| 15 mL conical polypropylene Falcon tube | Corning | 352099 | |
| 10 mL Syringe | BD | 302995 | |
| 1300 Series A2 Biological Safety Hood | Thermo Scientific | 1377 | |
| accuspin Micro17 centrifuge | Fisher Scientific | 13100675 | |
| 7500 Fast real time PCR system | Applied Biosystems | 3052632 | |
| EVOS FL Immunofluorescence Microscope | Life Technologies | 01414-155G-291 | |
| Leica Inverted Light Microscope | Leica | DMi1 | |
| Illrustrator | Adobe | 22.0.1.253 | |
| Excel Spreadsheets | Microsoft | 2016 | |
| Deckglaser 18 mm cover glasses | NeuVitro | GG-18 | |
| Reichert Bright-Line Hemacytometer | Sigma | Z359629-1EA | |
| 2-mercaptoethanol | Fisher Bioreagents | BP176-100 | For RNA lysis buffer |
| 1.2mL External Threaded Polypropylene Cryogenic Vial | Corning | 430658 | For freezing HESC cells |
| Dimethyl Sulfoxide (DMSO) | Sigma | D2650-100mL | For freezing media |
References
- Maruyama, T., Yoshimura, Y. Molecular and cellular mechanisms for differentiation and regeneration of the uterine endometrium. Endocrine Journal. 55, 795-810 (2008).
- Yu, J., et al. Endometrial Stromal Decidualization Responds Reversibly to Hormone Stimulation and Withdrawal. Endocrinology. 157, 2432-2446 (2016).
- Ahn, J. I., et al. cAMP-Response Element-Binding 3-Like Protein 1 (CREB3L1) is Required for Decidualization and its Expression is Decreased in Women with Endometriosis. Current Molecular Medicine. 16, 276-287 (2016).
- Gellersen, B., Brosens, J. J. Cyclic decidualization of the human endometrium in reproductive health and failure. Endocrine Reviews. 35, 851-905 (2014).
- Telgmann, R., Gellersen, B. Marker genes of decidualization: activation of the decidual prolactin gene. Human Reproduction Update. 4, 472-479 (1998).
- Camden, A. J., et al. Growth regulation by estrogen in breast cancer 1 (GREB1) is a novel progesterone-responsive gene required for human endometrial stromal decidualization. Molecular Human Reproduction. 23, 646-653 (2017).
- Kommagani, R., et al. The Promyelocytic Leukemia Zinc Finger Transcription Factor Is Critical for Human Endometrial Stromal Cell Decidualization. PLoS Genetics. 12, e1005937 (2016).
- Large, M. J., DeMayo, F. J. The regulation of embryo implantation and endometrial decidualization by progesterone receptor signaling. Molecular and Cellular Endocrinology. 358, 155-165 (2012).
- Zhang, X. H., et al. The mesenchymal-epithelial transition during in vitro decidualization. Reproductive Sciences. 20, 354-360 (2013).
- Kommagani, R., et al. Acceleration of the glycolytic flux by steroid receptor coactivator-2 is essential for endometrial decidualization. PLoS Genetics. 9, e1003900 (2013).
- Ramathal, C. Y., Bagchi, I. C., Taylor, R. N., Bagchi, M. K. Endometrial decidualization: of mice and men. Seminars in Reproductive Medicine. 28, 17-26 (2010).
- Tamura, I., et al. Novel Function of a Transcription Factor WT1 in Regulating Decidualization in Human Endometrial Stromal Cells and Its Molecular Mechanism. Endocrinology. 158, 3696-3707 (2017).
- Vinketova, K., Mourdjeva, M., Oreshkova, T. Human Decidual Stromal Cells as a Component of the Implantation Niche and a Modulator of Maternal Immunity. Journal of Pregnancy. , 8689436 (2016).
- Wu, D., et al. Chronic endometritis modifies decidualization in human endometrial stromal cells. Reproductive Biology and Endocrinology. 15, 16 (2017).
- Garcia-Elias, A., et al. Defining quantification methods and optimizing protocols for microarray hybridization of circulating microRNAs. Scientific Reports. 7, 7725 (2017).
- Brosens, J. J., et al. Human endometrial fibroblasts immortalized by simian virus 40 large T antigen differentiate in response to a decidualization stimulus. Endocrinology. 137, 2225-2231 (1996).
- Koukouritaki, S. B., Margioris, A. N., Gravanis, A., Hartig, R., Stournaras, C. Dexamethasone induces rapid actin assembly in human endometrial cells without affecting its synthesis. Journal of Cellular Biochemistry. 65, 492-500 (1997).
