Summary
이 연구는 분리와 decidualization 분석 결과 생체 외에서 실시 하 인간의 자궁내 막 기질 세포의 문화에 대 한 검증 및 최적화 절차를 선물 한다. 또한,이 연구를 효율적으로 최저의 자세한 방법을 siRNAs를 사용 하 여 인간의 자궁내 막 기질 세포에서 특정 유전자를 제공 한다.
Abstract
인간의 자궁내 막 기질 세포 (HESC) 분 비 decidua에 구와 같은 모습에서의 분화는 어머니 자 궁의 자 궁 내벽에 배아 이식에 필요한 변환입니다. 잘못 된 decidualization 이식 실패와 이후의 초기 태아 유산에 대 한 근본 원인으로 설립 되었습니다. 따라서, 밑에 decidualization 분자 메커니즘을 이해 성공적인 출생의 속도 향상에 유리 하다. Vivo에서 기반 인공 decidualization의 연구는 종종 동물 모델에서 변환 합병증 뿐 아니라 인간의 연구와 관련 된 윤리적 딜레마 때문 제한 됩니다. 결과적으로, 기본 세포 배양을 통해 분석 실험 체 외에 호르몬을 통해 decidualization의 변조를 탐험 자주 활용 됩니다. 이 연구는 HESC 고립과 자란 보통 호르몬의 보충을 통해 후속 인공 decidualization에 대 한 상세한 프로토콜을 제공합니다. 또한,이 연구 하면 잘 설계 된 최저에 관심사의 어떤 유전자 지질 기반 siRNA transfections를 활용 하 여 있습니다. 이 프로토콜 허용 기본 decidualization, 및의 후속 정량화 하는 분자 메커니즘을 이해 하는 신뢰할 수 있는 방법으로이 모델을 활용 하는 능력을 극대화 함으로써 제품의 수율 뿐 아니라 문화 순도의 최적화 decidualized 자궁내 막 기질 세포에 의해 분 비 대리인입니다.
Introduction
Menarche의 단계와 폐 경, 생식 연령의 여성 호르몬 규제 자궁내 막 증식, 차별화, 임신 생리1 이라는 프로세스에 대 한 준비에 후속 흘리기의 월별 주기 받아야 ,2. 인간의 endometrium의 실제 수정 등은 자 궁 벽1에 적절 한 배아 이식 필요 합니다. 난소 스테로이드 호르몬 에스트로겐과 황 체 호르몬 (P4)를 통해 생리 주기 변경 endometrium, 형태학 및 생화학 적인 적응을 포함 하 여의 중재는3,,45. 증식 (follicular) 단계 내 preovulatory 에스트로겐 수준의 증가, endometrium 두껍게 시작. 배 란, 다음 분 비 (또는 luteal) 단계 반올림, 상피 같은 decidual 셀 구와 같은 모습에서 자궁내 막 기질 세포 (ESC)의 형태학 상 변화를 유도 하는 P4 농도에 상당한 증가 촉진 decidualization4,6로 알려진 프로세스. 잘못 된 decidualization 이식 실패와 이후의 초기 태아 유산4,,78에 대 한 근본 원인으로 설립 되었습니다. 따라서, 밑에 decidualization 분자 메커니즘을 이해 진단과 초기 임신 손실의 처리에 유리 하다.
현재, 자궁내 막 기질 세포에서 decidualization의 기본 효과 탐험 여러 방법론 활용 됩니다. Vivo에서, 마우스 궁 기계적 자극 (즉,긁 적)를 통해 decidualization에 대 한 인위적으로 유도 될 수 있다 또는 기름9hormonally 끝났다 자 궁 주입. 다른 인간,이 합성 자극 blastocyst 존재, 설치류10,11decidualization의 개시에 필요한 단계의 모양을 제공 하 여 자 궁 루멘의 분화를 촉진 합니다. 따라서, 동물 모델 및 인간에서 vivo에서 기반 연구를 둘러싼 윤리적 딜레마와 관련 된 변환 합병증으로 인해 decidualization 기반 모델은 가장 성공적으로 공부 생체 외에서.
이 연구에서 과목 두 지역 영어와 스페인어 신문에서 광고의 배치를 통해 채용 됩니다. 과목이이 연구에 대 한 적합 한 후보자로 식별 되는 가져온 연구 코디 네이 터, 잠재적인 위험의 전체 공개 토론 된다와 나. 관련 된 잠재적인 위험에 대 한 완전 한 이해의 확인, 과목의 동의 서 면과 구두 모양에서 달성 했다. 주제 동의 (1) 받을 미래 연구 목적을 위해 그들의 조직의 정 (2) 장기 저장 (3) 수집 된 조직 표본에서의 기본 문화 창조에 동의 하는 권한이 포함 됩니다. 동의 다음 과목 인종/민족성의 비공개에 대 한 권리는 허용 된 자가 식별에 완료 하는 폼을 받는다. 후속 방문 endometrium 생의 생리 주기에 따라 달성 예정 이다. 이 연구에 모집 하는 자원 봉사자로 2012 인구에 의해 문서화 세인트 루이스 수도권의 민족과 인종 인구를 반영 하 고 임산부, 태아, 태아를 포함 하 여 모든 취약 한 주민들의 참여를 포함 하지 않았다 나이, 또는 다른 취약 한 그룹의 18 세 미만 어린이. 생 검 샘플 컬렉션에 참여 하기 위한 자격 요건 포함 (1) 일반 생리 주기 (25-32 일) (3) 현재 임신 이나 호르몬 자궁내 장치 피임약의 사용 하는 데는 데 18-45 년 (2)의 나가 사이 되 고 현재 질 감염이 나 성병 (5) 없는 현재 항생제 치료와 (6) 등록 (4) 전 30 일에 대 한 없음 현재 비정상적인 경부 데.
이 연구에서 인간의 자궁내 막 기질 세포 (HESC) 배양 하 (estradiol (e 2), medroxyprogesterone 아세테이트 (MPA), 및 순환 아데노신 호르몬의 보충을 통해 생체 외에서 decidualization을 인위적으로 유발 monophosphate (캠프)) 매체에. 이 방법에서는, decidualization의 정도 호르몬 치료의 일의 총 수에 따라 변경 됩니다. Cytoskeletal 재배치와 함께, 호르몬 보충 decidual 세포 분 비 같은 자질2,4를 경험 하는 생 화 확 적인 적응을 유도 합니다. Prolactin (PRL)와 인슐린 같은 성장 인자 의무적인 단백질 1 (IGFBP1), 같은 각 인 유전자의 표정은 확인 하 고 계량 HESC decidualization5,12, 의 정도를 이용 될 수 있다 13 , 14. 중요 한 것은,이 프로토콜을 유전자 특정 최저 생존도 시연 했다.
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Protocol
세인트 루이스, 산부인과 학과에서 워싱턴 대학에서이 연구를 위해 수집 하는 모든 인간의 endometrium biopsies 달성 했다 고 부인과 기관 검토 위원회 (IRB)를 사용 하 여 서 면된 동의서를 승인.
1입니다. 준비
- 100 U/mL 페니실린과 100 µ g/mL 스 미디어 포함 병 (HBSS + 매체 추가 참조)에 추가 하 여 1 x 행 크의 균형 소금 솔루션 (HBSS)의 500 mL를 준비 합니다.
- Dulbecco의 수정이 글 중간의 500 mL를 준비: 페 놀 레드, L-글루타민와 15 mM 4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic 산 (HEPES) 1% 항생제 antimycotic 솔루션 (최종 농도 추가 하 여 영양소 혼합 F-12 (DMEM/F12) 100 U/mL 페니실린, 100 µ g/mL 스, 그리고 0.25 µ g/mL Fungizone) 병 (HESC 절연 매체로 참조 추가)를 포함 하는 미디어를.
- 10% 태아 둔감 한 혈 청 (FBS), 1 x 나2HCO3및 1%를 추가 하 여 페 놀 레드, L-글루타민와 15 mM HEPES DMEM/F12의 500 mL를 준비 페니실린 (10000 U/mL)와 스 (10000 µ g/mL) (펜 Strep) 미디어 (추가 병 포함 HESC 미디어로 참조).
- 2%의 감소 혈 청 L-글루타민, 2.4 g/L 나트륨 중 탄산염와 HEPES 500 mL를 준비 숯 박탈 태아 둔감 한 혈 청 (csFBS)와 1% 펜 Strep 병 (Decidualization 미디어 추가 참조)를 포함 하는 미디어.
- 페 놀 레드 숯불 2%를 추가 하 여 무료 DMEM/F12 (더 변경 미디어 참조) 병을 포함 하는 미디어에 소 태아 혈 청 (csFBS) 박탈의 500 mL를 준비 합니다.
- 10 nM estradiol (e 2), 1 µ M medroxyprogesterone 아세테이트 (MPA), 및 15 mL 폴 리 프로필 렌 원뿔 튜브, 50 µ M 순환 아데노신 monophosphate (캠프) 준비 하 고 이전 준비 decidualization 미디어 생체 외에서 의 잘 약 수 당 2 mL에 추가 decidualization 분석 결과 (EPC 미디어 추가 참조).
- 50 mL 50 mL 폴 리 프로필 렌 원뿔 튜브 (고정 미디어 추가 참조)에서 90 %FBS 10% 디 메 틸 sulfoxide (DMSO) 미디어를 동결을 준비 합니다.
- 전 콜라와 DNase의 5 mg 25 밀리 그램 무게 50 mL 원뿔 폴 리 프로필 렌 튜브에-20 ° c.에 게 나
2. 인간의 Endometrium 생 검 획득
- HBSS에 IRB 승인 클리닉에서 생리 주기의 증식 단계 (하루 9-12 일)에서 수집 된 인간의 endometrium 생 샘플을 가져옵니다.
- Prewarmed 37 ° C HBSS + 매체 1 mL와 함께 생 검 견본을 세척 하 고 부드럽게 흔들어 과잉 혈액을 제거 하 고 점액.
3. 인간의 자궁내 막 기질 세포 (HESC)의 절연
참고:이 격리 절차 생물 안전 캐비닛 아래 무 균 환경에서 수행 됩니다.
- 포함 된 10 mL 50 mL 원뿔 폴 리 프로필 렌 원심 분리기 관으로 소독된 겸 자 생 검 전송 신선한 HBSS.
- 90 x 500g에 실 온에서 생 검 원심 s.
- 셀 펠 릿 파열 90 2000 x g에 생을 다시 회전 경우 s.
- 1 mL를 피펫으로 사용 하 여 미디어를 제거 하 고 37 ° C의 10 mL로 씻어 HESC 격리 미디어 500 x 90 g에서 원심 분리 뒤 prewarmed s.
- 1 mL 피펫으로 사용 하 여 미디어를 제거 하 고 적극적으로 생 검 꺼내 려 신선한 HESC 격리 미디어의 3 mL를 추가 합니다.
- HESC 격리 미디어의 5 mL를 포함 하는 배양 접시에 생 검을 가만히 따르다.
- 약 20 분 동안 #5 집게와 좋은 스트레이트 스티치가 위를 사용 하 여 가능한 작은 조각으로로 생을 말하다.
- DNase 준비 나 하 고 미리 무게 DNase를 HESC 격리 미디어의 10 mL를 추가 하 여 콜라 효소 나 (0.5 mg/mL)와 콜라 (2.5 mg/mL). 피펫으로 믹스.
- 피 펫 1 mL를 피펫으로 새로운 50 mL 원뿔 폴 리 프로필 렌 튜브로 사용 하 여 조직 샘플을 잘라. HESC 격리 미디어의 7 mL로 세척 하 고 전체 샘플 얻으려고 폴 리 프로필 렌 튜브에 추가.
- 2 분에 대 한 원심 분리기 샘플 800 x g에 실 온에서 부드럽게 피 펫은 상쾌한을 제거 합니다.
- 어 0.2 µ m 필터를 통해 콜라 솔루션 10 mL 주사기 펠 릿에 직접에 연결 하는 DNase를 필터링 합니다.
- 10 소용돌이 펠 릿 resuspend s.
- 1.5 h에 대 한 37 ° C 물 목욕, vortexing 10에 대 한 다이제스트의 조직 소화 될 때까지 철저 하 게 모든 10 분.
- 필터 40 µ m 셀 스 트레이너를 통해 샘플 상피 세포와 조직 파편을 제거 하는 50 mL 원뿔 폴 리 프로필 렌 튜브에 쌓입니다.
참고: Stromal 세포 50 mL 원뿔 폴 리 프로필 렌 튜브에 있습니다. - 실 온에서 2.5 분 800 x g에서 50 mL 원뿔 폴 리 프로필 렌 튜브 원심 부드럽게 1 mL 피 펫과 상쾌한을 제거 합니다.
- HESC 격리 미디어 10 mL에 펠 릿을 resuspend.
- 실 온에서 2.5 분 800 x g에서 원심. 상쾌한, 발음 하 고 혼합 HESC 미디어 정방향 및 역방향 피 펫의 6 mL에 셀 resuspend.
- 천천히 밀도 그라데이션 미디어 레이어를 혼합 하지 않도록 주의 되 고 stromal 세포에서 남아 있는 혈액 세포를 분리 하는 resuspended 세포를 3 mL에 레이어.
- 실 온에서 30 분 400 x g에서 15 mL 폴 리 프로필 렌 튜브 원심
- 새로운 50 mL 폴 리 프로필 렌 튜브에 상쾌한의 5 mL을 수집 하 고 셀을 resuspend 하는 추가 5 mL HESC 미디어 추가.
- 실내 온도에, 뒤에 상쾌한의 제거 및 추가 6 mL HESC 미디어의 2.5 분 800 x g에서 원심. 소용돌이 10 s를 pipetting으로 혼합 샘플 앞으로 반전 5 번.
- Aliquot 10 µ L 셀 개수에 대 한 1.5 mL microcentrifuge 튜브를 다시 일시 중단 된 세포의.
- 0.4 %Trypan 푸른 얼룩 약 수를 셀을 피펫으로 믹스의 10 µ L를 추가 합니다. 약 수의 10 µ L을 로드 하 고는 hemocytometer를 사용 하 여 셀.
- 15 mL HESC 미디어에서 총 세포 수에 따라 적절 한 플라스 크에 세포 격판덮개
- 셀의 총 수 1 백만 보다는 더 적은 인 경우에, 25 cm 플라스 크에 있는 모든 셀 HESC 미디어의 6 mL 접시. 경우 셀의 총 수는 1 백만 이상, 75 cm 플라스 크에 있는 모든 셀 HESC 미디어의 15 mL 접시.
- 문화는 5% CO2 인큐베이터에서 37 ° C에서 최소 6 h 적절 한 세포 접착을 보장 하는 HESC 미디어는 미디어 변경에 대 한 셀.
- 37 ° C에서 5% CO2 배양 기에서 격리 HESC 세포 형성 단층 도금된 플라스 크에 80-90 %confluency 달성 될 때까지 3-5 일의 기간에 대 한 문화.
- HESC 미디어 매 2 일 변경.
- 15-20 분 동안 37 ° C 물 욕조에 따뜻한 HESC 미디어.
- 플라스 크에서 미디어를 발음 하 고 신선한 HESC 미디어 플라스 크를 추가 (작업 볼륨: 8 mL 또는 16 mL 당 25 cm 또는 75 cm 플라스 크 각각).
- 80-90 %confluency 달성 될 때까지 플라스 크를 37 ° C에서 5% CO2 배양 기에 다시 놓습니다.
- HESC 되 면 80-90% 합칠, 전송 셀 75 cm 플라스 크를 25 cm 또는 한 75 cm 플라스 크에서 세 75 cm 플라스 크.
참고: HESC 냉동 고 미래 실험을 위해이 이번에 최신 사용을 위해 저장 될 수 있습니다.
4. 중지 및 재개 HESCs
- 75 cm 플라스 크에서 미디어를 발음 하 고 트립 신-EDTA의 2 개 mL를 추가 합니다.
- 세포는 플라스 크에서 빠질 때까지 37 ° C에서 2-3 분 5% CO2 배양 기에서 품 어.
- 앞으로 역 HESC 미디어와 pipetting으로 잘 섞어 7 mL를 추가 합니다.
- 800 x g 2.5 분에서 centrifuge 고는 상쾌한 발음.
- 레이블 셀 라인, 날짜, 및 통로 수 튜브를 동결.
- 다시 미디어를 동결의 5 mL에 셀 펠 릿을 일시 중단 합니다.
- -80 ° C 냉장고를 각 튜브 및 전송 관에 다시 중단된 HESC의 aliquot 1 mL.
- 24 시간 이내에 액체 질소를 튜브를 전송 합니다.
참고: 즉시 미래에 있는 세포를 해 동 계획 저장 냉동된 셀-80 ° C에서 한 달 동안. - 녹고 있는 HESCs 대 한 HESC 미디어 20 분 예 열.
- 25 cm 플라스 크를 데워 HESC 미디어의 8 mL를 추가 합니다.
- 액체 질소 탱크 또는-80 ° C에서 냉동 관을 검색 하 고 세포를 해 동 1-2 분 동안 37 ° C 물 목욕에서 튜브 잠수함.
- 해 동된 HESC HESC 미디어 25 cm 플라스 크를 전송 하 고 37 ° c.에 하룻밤 5% CO2 배양 기에서 품 어
- 다음 날, HESC 미디어를 변경 하 고 2-3 일 HESC confluent 되 고 아래에 설명된대로 프로토콜 5 75 cm 플라스 크에 세포를 전송 될 때까지 기다립니다.
- 15-20 분 동안 37 ° C 물 욕조에 따뜻한 HESC 미디어.
- 플라스 크에서 미디어를 발음 하 고 신선한 HESC 미디어 플라스 크를 추가 (작업 볼륨: 8 mL 또는 16 mL 당 25 cm 또는 75 cm 플라스 크 각각).
- 80-90 %confluency 달성 될 때까지 플라스 크를 37 ° C에서 5% CO2 배양 기에 다시 놓습니다.
5. 인간의 자궁내 막 기질 세포 (HESC) 경작
참고:이 Culturing 절차 생물 안전 캐비닛 아래 무 균 환경에서 수행 됩니다.
- 20-30 분 물 목욕에서 37 ° C에서 사전 열 HESC 미디어.
- 플라스 크에서 미디어를 발음 하 고 0.25% Trypsin ethylenediaminetetraacetic 산 (EDTA) (1 개 mL를 추가 25 cm 플라스 크 또는 75 cm 플라스 크 2 mL).
- 셀 꺼내 때까지는 5% CO2 인큐베이터에서 37 ° C에서 2-3 분 동안 품 어.
- 부드럽게 플라스 크 벽 꺼내 나머지 셀을 누릅니다. 앞으로 역 HESC 미디어와 pipetting으로 잘 섞어 7 mL를 추가 합니다.
- 피펫으로 50 mL 원뿔 폴 리 프로필 렌 튜브 및 실 온에서 2.5 분 800 x g에서 원심 분리기로 셀 혼합물.
- 발음은 상쾌한 고 다시 셀 펠 릿 HESC 미디어에서 일시 중지.
- 25 cm 플라스 크 또는 45 mL 플라스 크 75 cm (각 15 mL)에 대 한 15 mL를 추가 합니다.
- 각 25 cm 또는 75 cm 플라스 크에 각각 5 mL 또는 15 mL 셀 정지를 추가 합니다.
- 37 ° C에서 5% CO2 배양 기에서 격리 HESC 세포 형성 단층 도금된 플라스 크에 80-90 %confluency 달성 될 때까지 3-5 일의 기간에 대 한 문화.
- HESC 미디어 매 2 일 변경.
- 15-20 분 동안 37 ° C 물 욕조에 따뜻한 HESC 미디어.
- 플라스 크에서 미디어를 발음 하 고 신선한 HESC 미디어 플라스 크를 추가 (작업 볼륨: 8 mL 또는 16 mL 당 25 cm 또는 75 cm 플라스 크 각각).
- 80-90 %confluency 달성 될 때까지 플라스 크를 37 ° C에서 5% CO2 배양 기에 다시 놓습니다.
6. 인간의 자궁내 막 기질 세포 (HESC) 도금 및 siRNA Transfection
참고:이 transfection 절차 생물 안전 캐비닛 아래 무 균 환경에서 수행 됩니다.
- 75 cm 플라스 크에서 HESC 미디어를 발음 하 고 0.25% trypsin EDTA 용액 2 mL를 추가 합니다.
- 셀을 꺼내 때까지 2-3 분 동안 37 ° C에서 5% CO2 인큐베이터에서 품 어.
- 일단 세포는 플라스 크에서 빠질 HESC 미디어의 7 mL를 추가 하 고 앞으로 pipetting으로 부드럽게 혼합 역 5 번.
- 피펫으로 50 mL 원뿔 폴 리 프로필 렌 튜브 및 실 온에서 2.5 분 800 x g에서 원심 분리기로 셀 혼합물. 발음은 상쾌한 고 다시 HESC 미디어 10 mL에 셀 펠 릿을 일시 중단.
참고: 둘 이상의 플라스 크에서 셀 도금, 경우 단순히 HESC 미디어 볼륨 증가. - Hemocytometer를 사용 하 여 셀을 계산 합니다.
- Aliquot 10 µ L 1.5 mL microcentrifuge 튜브로 다시 일시 중단 된 세포의.
- 0.4 %Trypan 파랑 셀 aliquot 얼룩 및 앞으로 pipetting으로 혼합 및 반전의 10 µ L를 추가 합니다.
- 6 잘 플레이트에 잘 당 0.8 x 10 접시5 셀. 이틀 후, 셀 최적의 transfection에 대 한 60-70% 합칠 이어야 한다.
- 각 siRNA transfection 샘플에 대 한 단지 transfection 시 약에 siRNA (60 nanomoles)를 사용 하 여 준비 합니다.
- Transfection 시에 감소 된 혈 청 자유로운 미디어의 150 µ L의 5 µ L를 희석 하 고 5 분 동안 품 어.
- 감소 된 혈 청 자유로운 미디어의 100 µ L에 siRNA의 60 nanomoles 희석 하 고 5 분 동안 품 어.
- 5 분 후 희석된 transfection 시 솔루션 희석된 siRNA를 결합 하 고 앞으로 pipetting으로 부드럽게 혼합 5 번 역.
참고: 하나 이상의 siRNA에 여러 우물을 transfecting, 준비 10 mL에 마스터 믹스 폴리스 티 렌 튜브. - 실 온에서 5 분에 대 한 siRNA transfection 시 약 단지를 품 어.
- 이 부 화 하는 동안 각 잘을 변경 미디어의 1 mL를 추가 합니다.
- 외피의 5 분 후 솔루션을 수집 하 여 siRNA transfection 시 약 단지의 250 µ L 각 잘 셀 및 미디어를 포함을 추가 2 분 동안 500 x g에서 튜브 원심.
- 락을 부드럽게 혼합 하 고 37 ° c 5 h 5% CO2 배양 기에서 세포를 품 어.
- 5 h 후 HESC 미디어 미디어 변경 합니다.
- 생체 외에서 decidualization 분석 결과 대 한 준비에 2 일 동안 37 ° c 5% CO2 배양 기에서 세포를 품 어.
7. 생체 외에서 Decidualization 분석 결과
참고:이 분석 결과 생물 안전 캐비닛 아래 무 균 환경에서 수행 됩니다.
- Camden 외 에 설명 된 대로 생체 외에서 decidualization 치료를 시작 하기 전에 EPC 미디어 준비 3 (1.6 참조).
- 게시물 48 시간 단계 6.16에서에서 incubated HESC의 transfected 라인에서에서 미디어 발음
- 각 우물에 EPC 미디어의 2 개 mL를 추가 합니다.
참고:로 컨트롤을 두고 한 일련의 셀의 EPC 미디어와 치료. 대신, 컨트롤 우물에 HESC 미디어의 2 개 mL를 추가 합니다. - 6 일 동안 37 ° C에서 5% CO2 배양 기에서 세포를 품 어.
- EPC 미디어 48 시간 마다 변경 됩니다.
- 따뜻한 고 15-20 분 동안 37 ° C 물 욕조에 EPC 미디어를 준비 합니다.
- 우물에서 미디어를 발음 하 고 신선한 EPC 미디어를 추가 합니다.
- 37 ° c.에 5% CO2 배양 기에 다시 접시를 놓습니다
- EPC 미디어 48 시간 마다 변경 됩니다.
- 6 일 후 (아래와 같이) ELISA와 qRT-PCR을 통해 stromal 세포 decidualization의 정도 분석 합니다.
8. 양적 실시간 PCR (qRT-PCR)을 이용 하 여 체 외에서 Decidualization의 유효성 검사
참고: qRT-PCR Kommagani 외10에 앞에서 설명한 완료 됩니다.
- 상용 RNA 격리 키트에서 프로토콜을 활용 하는 HESC에서 총 RNA 격리 합니다.
- RNA의 양과 순도 (는260/A280) 가르시아-일 라이 어스 외15에 설명 된 대로 NanoDrop 또는 유사한 방법론을 사용 하 여 분석 합니다.
- 상업적으로 이용 가능한 반전 녹음 방송 키트 프로토콜을 통해 총 RNA의 1 µ g에서 cDNA를 음성 합성.
- 상용 qRT-PCR 키트 프로토콜에 설명 된 대로 qRT-PCR 반응을 실행 합니다.
- 상업적으로 사용 가능한 실시간 PCR 주인 혼합을 사용 하 여 반응을 수행 하 고 내부 시스템 컨트롤 (18s, PRL및 IGFBP1) 함께 특정 유전자 프로브.
9. ELISA를 이용 하 여 체 외에서 Decidualization의 유효성 검사
- 계량 상용 Prolactin ELISA 키트를 활용 하 여 조직 문화 매체에서 secreted Prolactin 수준.
10. Phalloidin 얼룩을 이용 하 여 체 외에서 Decidualization의 유효성 검사.
- 12 잘 플레이트의 각 음에 살 균 coverslips를 삽입 합니다.
- 6.1-6.5 단계를 반복 합니다.
- 12 잘 플레이트의 당 0.8 x 10 접시5 셀.
- 2 일 동안 37 ° C에서 5% CO2 배양 기에서 세포를 품 어.
- 미디어 발음
- 7.3-7.4 단계를 반복 합니다.
- 30 분 동안 실내 온도에 버퍼링 하는 인산 염 (PBS)에 4 %paraformaldehyde (PFA)에서 셀을 수정.
- 고정 솔루션을 발음 하 고 3 시간 5 분에 대 한 PBS의 1 mL로 씻어.
- 침투성 증가 고정된 셀에 5 분에 대 한 PBS에 0.1% 비 이온 계면 활성 제 폴 리 에틸렌 글리콜 tert-octyl 페 닐 에테르를 추가 합니다.
- 5 분에 대 한 PBS의 1 mL로 3 번 세척.
- Phalloidin 솔루션 coverslip 당 100 µ L을 추가 하 고 90 분 동안 실 온에서 품 어.
- 5 µ L 당 1 단위에서 phalloidin 재고 솔루션을 사용 하 여 PBS에 1: 100 희석을 준비 합니다.
- 5 분에 대 한 PBS의 1 mL로 3 번 세척.
- 설치 매체를 포함 4', 6-Diamidino-2-Phenylindole (DAPI)와 슬라이드를 탑재 합니다.
- Confocal 현미경을 이용 하 여 세포를 관찰 합니다.
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Representative Results
HESC 문화 decidualization
절연, 다음 인간 자궁내 막 기질 세포 80-90 %confluency 단층 형성에 교양 있었다 및 10 nM E2, MPA, 1 개의 µ M, 50 µ M 캠프와 치료에 의해 생체 외에서 decidualization에 대 한 유발 (EPC). 생체 외에서 decidualization와 관련 된 형태학 변화 그림 1A에서 구상 했다. Decidualization, 시 HESCs 둥근된 epithelioid 세포에 길쭉한, fibroblastic 세포에서 cytoskeletal 재배열을 겪는 다. 따라서, phalloidin 얼룩 HESC decidualization 중 cytoskeletal 개편을 확인 하기 위해 수행 되었다. Phalloidin cytoskeletal 재배치 (그림 1B) 생체 외에서 decidualization와 일치 함으로써 시각화 걸 필 라 멘 트에 대 한 얼룩에 이용 되는 높게 선택적인 bicyclic 펩 티 드 이다.
게시물 EPC 치료의 6 일, PRL 와 IGFBP1 mRNA 수준 qRT-PCR decidualization (그림 2A)의 정도 확인을 통해 평가 됐다. PRL 와 IGFBP1 수준을 크게 제어 차량으로 치료 하는 HESC에 비해 증가 했다 (p < 0.001). Decidualization와 관련 된 생화학 변화 자란 매체 (그림 2B)에서 분 비 PRL 레벨의 정량화를 통해 평가 했다. 성적 수준으로 일관 된, PRL 수준에서 매우 높은 했다 EPC HESC 컨트롤에 비해 교양 (p < 0.001).
특정 유전자 HESCs decidualization의 세포 및 분자 변화에 폐지의 효과 SRC-2 를 사용 하 여 후보 유전자 (그림 3)로 평가 됐다. Transfection 제어 또는 SRC-2 siRNA의 48 시간, 다음 HESC EPC 미디어에서 6 일 동안에 경작 되었다. 제어 siRNA 페 시연 하는 HESC 세포 및 분자 변화 PRL 와 IGFBP1decidualization 마커의 증가 성적 수준과 조약돌 형태학 상 변화를 포함 하 여 적절 한 decidualization와 일치. SRC-2 siRNA 최저로 예상 대로 컨트롤 siRNA에 비해 외관에 fibroblastic 남아 HESC 페 HESC (그림 3A). 이 세포 변화와 일치, PRL 및 IGFBP1 성적 레벨은 크게 SRC-2 siRNA 내 감소 페 HESC, SRC-2 최저와 decidualization 프로그래밍에 탈을 나타내는 (* * *p < 0.001). SRC-2 성적 수준이 크게 감소 했다 SRC-2 에 siRNA HESC 비해 siRNA, 우리의 방법으로 효율적인 유전자 침묵을 나타내는 제어 하 페 (* * *p < 0.001) (그림 3B).
그림 1 : 동안 인간의 자궁내 막 기질 세포의 세포질 변화 생체 외에서 decidualization. HESCs 고립 되었고 차량 또는 E2, MPA 및 캠프 (EPC)를 포함 하는 미디어에서 6 일 동안 경작. A) 셀 이미지 epithelioid 세포에 fibroblastic에서 세포 형태학에 있는 변화를 보여주는. B) Phalloidin 스테인드 HESC cytoskeletal 변화 (녹색) 생체 외에서 decidualization, 블루 (DAPI) 핵을 나타냅니다와 관련 된 설명의 이미지. 빨간색 화살표는 decidualized 셀을 나타냅니다. 검은색 화살표 fibroblastic 셀을 보여 줍니다. 눈금 막대: 100 µ m. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 2 : 인간의 자궁내 막 기질 세포 동안에 분자 변화 생체 외에서 decidualization. A) 총 RNA HSECs 차량 또는 E2, MPA 및 캠프 (EPC)를 포함 하는 미디어에서 6 일 동안 경작 으로부터 격리 되었고 PRL 와 IGFBP1 증명서 수준 감지 qRT-PCR 분석을 복종. 문화 미디어로 분 비 하는 PRL의 수준 B) EPC 어느 차량에 6 일 동안 배양 하는 HESC에서 ELISA 근거한 분석 결과 사용 하 여 측정 되었다. p < 0.05 * * p < 0.01, * * * p < 0.001. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 3 : 인간의 자궁내 막 기질 세포에서 SRC-2 의 최저에 영향을 미치는 생체 외에서 decidualization. SiRNA에 A) 형태학 상 변화 페 HESC EPC 미디어와 문화의 6 일 다음 (상위 패널: 시간 제어 siRNA 포인트 0 일과 하루 6, 하단 패널: 0와 하루 6 시간에서 SRC-2 siRNA 포인트). SRC-2, PRL, IGFBP1 0 및 EPC 하루 6의 B) 성적 수준 제어 또는 SRC-2 siRNA 페 HESC 취급. 검은색 화살표 decidualized 셀을 나타냅니다. 흰색 화살표는 fibroblastic 셀을 보여 줍니다. 눈금 막대: 200 µ m. * * * p < 0.001. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
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Discussion
여성 생식 생리 주기는 라운드, 상피 같은 분 비 세포3,8에 ESC의 decidualization를 유도 함으로써 상승 luteal 단계 내내 황 체 호르몬 수준에 의해 특징입니다. Decidualization의 개시는 종 의존. 인간에서는, decidualization 발생 합니다 자연 호르몬 농도의 증가 따라 쥐 해야 blastocyst 존재10,11. Decidualization에서의 이러한 불일치는 인간의 세포에 세포 분화의 변환 혜택을 예로 보여주. 1 차 세포 배양을 통해 생체 외 분석 실험 호르몬4,,610통해 decidualization의 변조를 탐험을 종종 활용 됩니다. 그러나,이 방법의 제한 주기 단계 및 임신 역사에서 중요 한 변화 없이 인간의 조직의 큰 샘플 크기의 obtainability에 따라 발생할 수 있습니다. 그럼에도 불구 하 고, 충분 한 샘플을 보장 하기 위해 사전에 충분 한 연구와 증식 단계 (하루 9-12 일) 월 경 주기의 일정 biopsies 계획 하 여 제한 최소화 되도록 조치를 취할 수 있습니다.
이 연구에서 HESC 배양 하 Brosens 그 외 여러분 에서 처음 설명한 소설 방법을 통해 인위적으로 decidualized 16 어떤 호르몬에서 E2, P4, 그리고 캠프 6 일간 잠복기를 걸쳐 자란 보통 보충 된다. 일반적으로, 양자 택일 방법12,14 액 셀 확장된 14 일간 잠복기를 통해 e 2와 MPA의 추가 통해 인공 decidualization에 대 한 문화. 자란 미디어 캠프의 보충 synergistically 증폭 하면서 동시에 upregulating 캠프 응답 요소 발기인 지구 (즉, 포함 된 유전자의 표정 단축된 기간에 ESC의 decidualization PRL 와 IGFBP1)12,13. Kommagani 외 에 설명 된 프로토콜에 따라이 메서드 10, 고립의 최적화와 HESC의 문화 수 있습니다. 셀 문화 순도 실질과 상피 세포 라인을 40 µ m 셀 스 트레이너를 이용 하 여 최적화 되었다. 또한, Ficoll-Paque 플러스 시 약 샘플에서 혈액 세포의 제거에 따라 순수 stromal 세포의 가능한, 높은 수확량 격리를 보장 하기 위해 적용 되었습니다. 추가 원심 분리 단계 (30 분 400 x g)은 세포 인구에서 혈액 세포의 완전 한 제거를 보장 하기 위해 포함된 다음 Ficoll 추가 이었다. 마지막으로, HESC 생존 및 수율 95% confluency decidualization에 대 한 때까지 세포 배양 시 최적화 했다. 다음 추가 단계 보장 가능한, 높은 수확량 HESC의 순수한 문화.
Decidualization 정도의 qRT-PCR, ELISA, 및 phalloidin cytoskeletal 재배치와 각 인 유전자의 upregulation를 얼룩을 활용 하 여 평가 했다. QRT-PCR, PRL 와 IGFBP1 decidualization 마커의 성적 수준은 평가 했다. HESC의 decidualization, 이전 연구6에서 설정 된 시간에 따라 패션에서 PRL 와 IGFBP1 수준 증가. PRL 레벨 분의 시간에 따른 증가 또한 ELISA 통해 HESC 조직 문화 미디어를 검사 하 여 확인 되었다. 또한, decidual 세포로 stromal 세포의 형태학 변경 phalloidin 및 핵 마커 4', 6-Diamidino-2-Phenylindole (DAPI)17통해 걸 필 라 멘 트의 costaining를 통해 시각 수 있습니다. 함께, 이러한 실험 결과 HESC E2, MPA, 캠프의 보완을 통해 배양의 효과를 확인 했다.
이 프로토콜의 기능을 유전자 특정 최저 공부 SRC-2에 대 한 siRNA를 활용 하 여 평가 했다. 형태학 상으로, SRC-2 페 HESC HESC epithelioid 세포에 decidualized 컨트롤 siRNA로 치료 하는 반면 fibroblastic, 남아 있었다. SRC-2 최저 효율 대 본 단계를 통해 평가 되었다 고 했다 크게 감소 하 고, 우리의 프로토콜 특정 유전자의 성공적인 입을 나타내는. 따라서, 우리의 프로토콜 묘사 endometrial decidualization에 특정 gene(s)의 역할에 관심을 가진 수 사관에 대 한 유용한 리소스를 수 있습니다.
Decidualization의 기본 분자 메커니즘을 이해에 있는 전진 한 동안 상당한 지식 격차는 여전히 특성에 존재 합니다. 잘못 된 decidualization 이식 실패와 후속 초기 태아 유산4,6,,710에 대 한 근본 원인으로 설립 되었습니다. 따라서, 추가 탐사 후 성적인 요소와 분자 통로의 특성에 관한 진단과 임신 실패의 치료를 위해 필요 하다.
결론적으로,이 연구를 통해 제시 하는 프로토콜 인간의 자궁내 막 기질 세포의 순수 하 고 가능한 라인 문화를 격리 하는 효율적인 방법을 설정 합니다. 호르몬 E2, MPA, 그리고 자란 미디어 캠프를 보완 하 여 인공 decidualization 유도 될 수 있다 qRT-PCR, ELISA에 의해 확인 및 Phalloidin 얼룩이 지기. 또한, 우리의 프로토콜 siRNA와 transfections 지질 기반을 사용 하 여 관심사의 특정 유전자의 효율적인 최저에 필요한 자세한 단계를 설명 합니다. 전부,이 메서드는 기본 세포 및 분자 따라 장치를 마더보드에 HESC decidualization와 관련 된 공부 하는 능력을 제공 합니다.
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Disclosures
이 작품은 여에서 국립 보건원 (NIH) 자금 지원/아동 건강과 인간 발달 (NICHD) 그랜트 (R00 HD080742)와 워싱턴 대학의과 대학 시작의 국립 연구소 R.K.에 자금 우리는 워싱턴 대학 불 임 클리닉 자궁내 막 생 검 견본을 제공 하기 위한 감사 하 고 싶습니다.
Acknowledgments
저자는 공개 없다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Opti-MEM I (1X) Reduced Serum Medium | Gibco | 31985-070 | For decidualization media |
| DMEM / F12 (1:1) (1X) | Gibco | 11330-032 | |
| Trypan Blue Stain (0.4%) | Gibco | 15250-061 | For cell count |
| PureLink RNA Mini Kit | Invitrogen | 12183018A | For RNA Isolation/Purification |
| TaqMan 2X Universal PCR Master Mix | Applied Biosystems | 4304437 | |
| High Capacity cDNA Reverse Transcription Kit | Applied Biosystems | 4374967 | |
| Eukaryotic 18S rRNA Endogenous Control | Life Technologies | 4319413E | For qPCR internal control |
| TaqMan Gene Expression Assay Prolactin Probe | Applied Biosystems | 4331182 | For qPCR internal control |
| TaqMan Gene Expression Assay IGFBP1 Probe | Applied Biosystems | 4331182 | For qPCR internal control |
| Phalloidin-iFluor 488 Reagent - CytoPainter | Abcam | ab176753 | |
| Human Prolactin ELISA Kit | Invitrogen | EHIAPRL | |
| 16% Paraformaldehyde | Alfa Aesar | 30525-89-4 | Fixative |
| Lipofectamine RNAiMAX | Invitrogen | 13778150 | Transfection Reagent |
| ProLong Gold antifade reagent with DAPI | Invitrogen | P36935 | For mounting |
| 0.25% Trypsin-EDTA (1X) | Gibco | 25200-056 | |
| Penicillin Streptomycin | Gibco | 15140-122 | |
| Charcoal Stripped Fetal Bovine Serum | Sigma | F6765-500ML | |
| Sodium Bicarbonate (7.5%) | Gibco | 25080-094 | |
| Ficoll-Paque PLUS Reagent | Fisher Scientific | 45001749 | |
| Collagenase from Clostridium histolyticum | Sigma | C0130-1G | |
| Deoxyribonuclease I from bovine pancreas | Sigma | DN25-100MG | |
| Medroxyprogesterone 17-acetate | Sigma | M1629-1G | For EPC Media |
| Estradiol | Sigma | E1024-1G | For EPC Media |
| cAMP | Sigma | A6885-100MG | For EPC Media |
| Fine straight stitch scissors | Fine Science Tools | 15396-00 | |
| TaqMan Gene Expression Assay NCOA2 Probe | Applied Biosystems | 4351372 | |
| Fetal Bovine Serum, heat inactivated | Gibco | 10-082-147 | |
| Antibiotic-antimycotic | Thermo Scientific | 15240062 | |
| Hank’s Balanced Salt Solution | Corning | 21-021-cv | |
| 50 mL conical polypropylene Falcon tube | Corning | 352098 | |
| Dumont #5/45 Forceps | Fine Science Tools | 11251-35 | |
| 100 x 15 mm Glass Petri dish | VWR | 75845-546 | |
| 40 micron cell strainer | Midsci | 229481 | |
| Isotemp 215 Water bath | Fisher Scientific | FS-215 | |
| LSE Centrifuge | Corning | 6755 | |
| Human NCOA2 siRNA | Dharmacon | L-020159-00 | Gene specific qPCR probe |
| Steri-cycle i160 CO2 Incubator | Thermo Scientific | 51030301 | |
| NanoDrop 2000 | Thermo Scientific | ND-2000 | For RNA quantification |
| Phosphate Buffered Saline | Fisher Scientific | 50146771 | |
| 75 cm Canted Neck Cell Culture flask | Corning | 430641U | |
| 6 well Non-Pyrogenic Cell Culture Plate | Corning | 3506 | |
| Pipet Controller Ultra | Corning | 4099 | |
| Photoshop | Adobe | 19.0.1.334 | |
| 25 cm Canted Neck Cell Culture flask | Corning | 7200876 | |
| Triton X-100 | Sigma | X100-1L | |
| 15 mL conical polypropylene Falcon tube | Corning | 352099 | |
| 10 mL Syringe | BD | 302995 | |
| 1300 Series A2 Biological Safety Hood | Thermo Scientific | 1377 | |
| accuspin Micro17 centrifuge | Fisher Scientific | 13100675 | |
| 7500 Fast real time PCR system | Applied Biosystems | 3052632 | |
| EVOS FL Immunofluorescence Microscope | Life Technologies | 01414-155G-291 | |
| Leica Inverted Light Microscope | Leica | DMi1 | |
| Illrustrator | Adobe | 22.0.1.253 | |
| Excel Spreadsheets | Microsoft | 2016 | |
| Deckglaser 18 mm cover glasses | NeuVitro | GG-18 | |
| Reichert Bright-Line Hemacytometer | Sigma | Z359629-1EA | |
| 2-mercaptoethanol | Fisher Bioreagents | BP176-100 | For RNA lysis buffer |
| 1.2mL External Threaded Polypropylene Cryogenic Vial | Corning | 430658 | For freezing HESC cells |
| Dimethyl Sulfoxide (DMSO) | Sigma | D2650-100mL | For freezing media |
References
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