Summary
Denna studie presenterar en validerad och optimerad förfarande för isolering och kultur av mänskliga livmodercancer stromaceller att föra in vitro- decidualization assay. Ytterligare, denna studie ger en detaljerad metod för att effektivt knockdown en specifik gen som använder siRNAs i mänskliga livmodercancer stromaceller.
Abstract
Differentiering av mänskliga livmodercancer stromaceller (HESC) från fibroblast-liknande utseende till sekretoriska decidua är en omvandling som krävs för embryo implantation i livmoderslemhinnan maternell livmoderslemhinnan. Felaktig decidualization har etablerats som en grundorsak för implantation fel och efterföljande tidig embryo missfall. Förstå de molekylära mekanismerna bakom decidualization är därför fördelaktigt att förbättra andelen framgångsrika födslar. In vivo baserade studier av konstgjorda decidualization begränsar ofta på grund av etiska dilemman som är associerad med mänsklig forskning, liksom translationell komplikationer inom djurmodeller. In vitro- analyser genom primär cellkultur används därför ofta för att utforska moduleringen av decidualization via hormoner. Denna studie ger en detaljerad protokoll för isolering av HESC och efterföljande konstgjorda decidualization via komplettering av hormoner till culturing medium. Ytterligare, denna studie ger en väl utformad metod att knockdown någon gen av intresse genom att utnyttja lipid-baserade siRNA transfections. Detta protokoll tillåter optimering av kultur renhet samt produkt avkastning, vilket maximerar möjligheten att använda denna modell som en tillförlitlig metod att förstå de molekylära mekanismerna bakom decidualization och den efterföljande kvantifieringen av utsöndrade ombud av decidualized livmodercancer stromaceller.
Introduction
Mellan stadier av menarche och menopaus genomgår kvinnor i fertil ålder månatliga cykler av hormon-reglerade livmodercancer proliferation, differentiering och efterföljande shedding inför graviditet i en process som kallas menstruation1 ,2. Sådana fysiska ändringar av mänskliga endometriet är nödvändiga för korrekt embryo implantation i livmoderväggen1. Förändringar i endometriet, inklusive både morfologiska och biokemiska anpassningar, förmedlas under hela menstruationscykeln via steroid äggstockshormoner östrogen och progesteron (P4)3,4,5. Inom den proliferativa (eller follikulära) fasen, preovulatory östrogen nivåerna ökar, inleda endometriet förtjockning. Efter ägglossningen främjar den sekretoriska (eller luteala) fasen en betydande ökning i P4 koncentrationer, inducera morfologiska omvandlingen av livmodercancer stromaceller (ESC) från fibroblast-liknande utseende till rundade, epitelial-liknande decidual celler i en process som kallas decidualization4,6. Felaktig decidualization har etablerats som en grundorsak för implantation misslyckande och efterföljande tidig embryo missfall4,7,8. Förstå de molekylära mekanismerna bakom decidualization är därför fördelaktigt att diagnos och behandling av tidiga missfall.
För närvarande används flera metoder för att utforska decidualization underliggande effekter på endometriet stromaceller. In vivo, mus livmodern kan vara artificiellt inducerad för decidualization via mekanisk stimulering (dvs, repor) eller olja injektion i en hormonellt primade livmodern9. Skild från människor, denna syntetiska stimulering främjar differentiering av livmoderns lumen genom uppkomsten av blastocysten närvaro, ett steg som krävs för initiering av decidualization gnagare10,11. Följaktligen på grund av translationell komplikationer i samband med djurmodeller och de etiska dilemman som omger i vivo baserade studier på människor, decidualization baserade modeller studeras mest framgångsrikt in vitro-.
I denna studie rekryteras försökspersoner genom placering av reklam i både engelska och spanska lokaltidningar. Ämnen som identifierats som lämpliga kandidater för denna studie förs in att träffa den forskningskoordinator, där en fullständig redovisning av potentiella risker diskuteras. Vid bekräftelse av en fullständig förståelse av potentiella riskerna uppnås registrerades samtycke i både skriftliga och muntliga former. Angående medgivande omfattar behörigheten att (1) genomgå flebotomi (2) långvarig lagring av sina vävnader för framtida forskningsändamål och (3) samtycka till skapandet av primära kulturer från insamlade vävnadsprover. Efter samtycke ges ämnen ett formulär att fylla i som tillåtna självidentifikation av ras/etnicitet och rätten för yppandeförbud. En efterföljande besök planeras att uppnå endometriet biopsi baserat på motivets menstruationscykeln. Volontärer som rekryteras till denna studie återspeglar både etniska och rasmässiga demografin för regionen metropolitan St Louis som dokumenteras av folkräkningen 2012 och innebar inte någon sårbara befolkningens inklusive gravida kvinnor, foster, embryon, deltagande barn under 18 års ålder eller andra utsatta grupper. Behörighetskrav för deltagande i samlingen biopsi prov omfattar (1) att vara i åldern 18-45 år (2) att ha regelbundna menstruationscykler (25-32 dagar) (3) att ha inga nuvarande graviditet eller användning av hormonella/intrauterin anordning preventivmedel för 30 dagar före inskrivning i studien (4) att ha inga aktuella vaginal infektion eller sexuellt överförbara sjukdomar (5) att ha inga aktuella antibiotika behandlingar, och (6) har inga aktuella onormala cellprov.
Inom denna studie mänskliga livmodercancer stromaceller (HESC) odlade och artificiellt inducerad genomgår in vitro- decidualization genom komplettering av hormoner (estradiol (E2), medroxiprogesteronacetat (MPA) och cykliskt adenosin monofosfat (cAMP)) till medium. I denna metod ändras graden av decidualization baserat på det totala antalet dagar av hormonell behandling. I samband med cytoskeletal ombildning inducerar hormonella tillskott biokemiska anpassningar där de decidual cellerna uppleva sekretoriska-liknande kvaliteter2,4. Uttrycket av hallmark gener, såsom prolaktin (PRL) och insulin-liknande tillväxtfaktor bindande protein 1 (IGFBP1), kan utnyttjas för att bekräfta och kvantifiera graden av HESC decidualization5,12, 13 , 14. allt livskraften hos detta protokoll att föra genen specifika knockdown demonstreras också.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alla mänskliga endometriet biopsier som samlats in för denna studie avlades från Washington University i St Louis, avdelningen för obstetrik och gynekologi med hjälp av en institutionell granskning Board (IRB) godkända skriftliga medgivande.
1. beredning
- Förbereda 500 mL 1 x Hank's Balanced Salt lösning (HBSS) genom att lägga till 100 U/mL penicillin och 100 µg/mL streptomycin media som innehåller flaskan (ytterligare refereras som HBSS + medium).
- Förbereda 500 mL Dulbeccos modifierade Eagle Medium: näringsämne blandning F-12 (DMEM/F12) med fenolrött, L-glutamin och 15 mM 4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic syra (HEPES) genom att lägga till 1% antibiotika-antimycotic lösning (slutliga koncentration är 100 U/mL Penicillin, 100 µg/mL Streptomycin och 0,25 µg/mL Fungizone) till media som innehåller flaska (ytterligare refereras till som HESC isolering Media).
- Förbereda 500 mL DMEM/F12 med fenolrött, L-glutamin och 15 mM HEPES genom att lägga till 10% fetalt bovint Serum (FBS), 1 x Na2HCO3och 1% Penicillin (10.000 U/mL) och Streptomycin (10 000 µg/mL) (penna Strep) till media som innehåller flaska (ytterligare kallad HESC Media).
- Förbereda 500 mL minskade Serum Medium med L-glutamin, 2,4 g/L natriumbikarbonat och HEPES med 2% träkol strippad fetalt bovint Serum (csFBS) och 1% penna Strep till media som innehåller flaska (ytterligare refereras till som Decidualization Media).
- Förbereda 500 mL fenolrött gratis DMEM/F12 genom att lägga till 2% träkol strippad fetalt bovint serum (csFBS) i media som innehåller flaska (ytterligare refereras som förändring Media).
- Förbereda 10 nM estradiol (E2), 1 µM medroxiprogesteronacetat (MPA) och 50 µM cykliskt adenosinmonofosfat (cAMP) i en 15 mL polypropylen koniska rör och till 2 mL per väl alikvot av tidigare beredda decidualization media för in vitro- decidualization assay (ytterligare refereras som EPC Media).
- Förbereda 50 mL frysning media med 90% FBS och 10% dimetyl sulfoxid (DMSO) i 50 mL polypropylen koniska rör (ytterligare refereras som frysning Media).
- Pre väger 25 mg kollagenas och 5 mg av DNAS I en 50 mL konisk polypropylen rör och förvaras vid-20 ° C.
2. mänskliga endometriet biopsi förvärv
- Få mänskliga endometriet biopsi prov som samlats i den proliferativa fasen (dag 9 - dag 12) av menstruationscykeln från IRB godkända kliniken i HBSS.
- Tvätta biopsiprover med 1 mL av förvärmd 37 ° C HBSS + medium och skaka försiktigt för att ta bort överflödigt blod och slem.
3. isolering av mänskliga livmodercancer stromaceller (HESC)
Obs: Denna isolering procedur utförs i en steril miljö under biologiska säkerhetsdragskåp.
- Överföra biopsi med steriliserad pincett i en 50 mL konisk polypropylen centrifugrör innehållande 10 mL färsk HBSS.
- Centrifugera biopsi vid rumstemperatur vid 500 x g för 90 s.
- Om cell pellets bristningar, re-spin biopsi vid 2000 x g i 90 s.
- Ta bort medier använder en 1 mL Pipettera och tvätta med 10 mL 37 ° C föruppvärmd HESC isolering Media följt av centrifugering vid 500 x g för 90 s.
- Ta bort medier använder en 1 mL Pipettera och kraftfullt tillsätts 3 mL färsk HESC isolering Media rubba biopsi.
- Häll upp biopsi i en petriskål innehållande 5 mL HESC isolering Media.
- Finhacka biopsi i som små bitar som möjligt med hjälp #5 pincett och fina raksöm sax i ca 20 minuter.
- Förbereda DNAS jag och kollagenas enzymer genom att lägga till 10 mL av HESC isolering Media före vägde DNAS jag (0,5 mg/mL) och kollagenas (2,5 mg/mL). Blanda med Pipettera.
- Pipett skär vävnadsprover med en 1 mL Pipettera till en 50 mL konisk polypropylen reservrör. Tvätta med 7 mL HESC isolering Media och Lägg till polypropylen röret att förvärva hela provet.
- Centrifugera provet vid rumstemperatur vid 800 x g i 2 min. Ta försiktigt bort supernatanten med pipett.
- Filtrera den DNAS jag och kollagenas lösning genom 0,2 µm filter bifogas med 10 mL spruta direkt på pellet.
- Virvel för 10 s att resuspendera pelleten.
- Sammanfattad i 37 ° C vattenbad för 1,5 h, vortexa för 10 s noggrant varje 10 min, tills vävnaden är rötas.
- Filtrera provet genom en 40 µm cell SIL staplade över en 50 mL konisk polypropylen röret ta bort epitelceller och vävnad skräp.
Obs: Stromaceller är i 50 mL koniska polypropylen röret. - Centrifugera 50 mL koniska polypropylen röret vid 800 x g i 2,5 minuter i rumstemperatur. Ta försiktigt bort supernatanten med 1 mL pipett.
- Återsuspendera pelleten i 10 mL av HESC isolering Media.
- Centrifugera vid 800 x g i 2,5 minuter i rumstemperatur. Aspirera supernatanten och sedan Omsuspendera cellerna i 6 mL HESC Media och pipett framåt och bakåt för att blanda.
- Långsamt lager på 3 mL täthet lutning media till återsuspenderade celler att skilja ut återstående blodkroppar från de stromaceller, vara noga med att inte blanda lager.
- Centrifugera 15 mL polypropylen röret vid 400 x g i 30 min i rumstemperatur.
- Samla 5 mL av supernatanten i en ny 50 mL polypropylen rör och lägga till en ytterligare 5 mL HESC Media för att resuspendera cellerna.
- Centrifugera vid 800 x g i 2,5 minuter i rumstemperatur, följt av borttagning av supernatanten och tillägg av 6 mL HESC Media. Vortex provet för 10 s och mix av pipettering framåt och bakåt 5 gånger.
- Alikvotens 10 µL åter suspenderade celler till ett 1,5 mL mikrocentrifug rör för celltal.
- Tillsätt 10 µL av 0,4% Trypan blå fläckar cell alikvot och blanda med Pipettera. Ladda 10 µL av alikvoten och räkna cellerna med hjälp av en hemocytometer.
- Platta celler i en lämplig kolv som är beroende av totala celltal i 15 mL HESC Media.
- Om det totala antalet celler är mindre än 1 miljon, platta alla celler i 25 cm kolv med 6 mL av HESC Media. Om det totala antalet celler är mer än 1 miljon, platta alla celler i 75 cm kolv med 15 mL av HESC Media.
- Odla cellerna i en 5% CO2 inkubator vid 37 ° C i minst 6 h att säkerställa korrekt celladhesion och ändra media till HESC Media.
- Kultur den isolerade HESC i en 5% CO2 inkubator vid 37 ° C under en period av 3-5 dagar tills cellerna bildar en enskiktslager uppnå 80-90% konfluens i en förkromad kolv.
- Ändra HESC Media varannan dag.
- Varm HESC Media i 37 ° C vattenbad i 15-20 min.
- Aspirera media från kolven och Lägg färska HESC Media till kolven (arbetar volym: 8 eller 16 mL per 25 cm eller 75 cm kolv respektive).
- Placera kolven tillbaka i 5% CO2 inkubatorn vid 37 ° C tills 80-90% konfluens uppnås.
- När HESC blivit 80-90% konfluenta, överföra celler från 25 cm till 75 cm kolv eller en 75 cm kolv till tre 75 cm kolvar.
Obs: HESC kan frysas och lagras för senare användning vid denna tid för framtida experiment.
4. frysning och upptining HESCs
- Sug ut media från 75 cm kolven och tillsätt 2 mL av trypsin-EDTA.
- Inkubera i en 5% CO2 inkubator för 2-3 min vid 37 ° C tills cellerna lossnar från kolven.
- Lägg till 7 mL HESC Media och blanda väl genom pipettering framåt och bakåt.
- Centrifugera vid 800 x g i 2,5 min och Aspirera supernatanten.
- Etiketten frysning rör med cellinje, datum, och passage.
- Återsuspendering cellpelleten i 5 mL frysning media.
- Alikvotens 1 mL av den åter svävande HESC till varje tub och överföring rör till-80 ° C frys.
- Överföra rören till flytande kväve inom 24 timmar.
Obs: Om planering Tina celler inom snar framtid, lagra frusna celler i-80 ° C för en månad. - För upptining av HESCs Värm HESC Media i 20 min.
- Tillsätt 8 mL förvärmd HESC Media till 25 cm kolv.
- Hämta frysning röret från flytande kväve tanken eller -80 ° C och dränka röret i 37 ° C vattenbad för 1-2 min Tina cellerna.
- Överföra upptinade HESC till en 25 cm kolv med HESC Media och inkubera i en 5% CO2 inkubator över natten vid 37 ° C.
- Nästa dag, ändra HESC Media och vänta 2-3 dagar tills HESC blivit konfluenta och överföra celler till 75 cm kolv som anges nedan i protokoll 5.
- Varm HESC Media i 37 ° C vattenbad i 15-20 min.
- Aspirera media från kolven och Lägg färska HESC Media till kolven (arbetar volym: 8 eller 16 mL per 25 cm eller 75 cm kolv respektive).
- Placera kolven tillbaka i 5% CO2 inkubatorn vid 37 ° C tills 80-90% konfluens uppnås.
5. mänskliga livmodercancer Stromal Cell (HESC) odling
Obs: Denna Culturing procedur utförs i en steril miljö under biologiska säkerhetsdragskåp.
- Förvärm HESC Media vid 37 ° C i ett vattenbad för 20-30 min.
- Sug ut media från kolven och Lägg till 0,25% Trypsin etylendiamintetraättiksyrans dinatriumsalt (EDTA) (1 mL för 25 cm kolv eller 2 mL för 75 cm kolv).
- Inkubera i en 5% CO2 inkubator vid 37 ° C i 2-3 min tills cellerna lossnar.
- Knacka försiktigt på kolven väggarna för att få bort de återstående cellerna. Lägg till 7 mL HESC Media och blanda väl genom pipettering framåt och bakåt.
- Pipettera cell blandningen i en 50 mL konisk polypropylen rör och centrifugera vid 800 x g under 2,5 minuter i rumstemperatur.
- Aspirera supernatanten och slamma cellpelleten i HESC Media.
- Tillsätt 15 mL för 25 cm kolv eller 45mL för 75 cm kolv (15 mL vardera).
- Tillsätt 5 mL eller 15 mL cellsuspension i varje 25 cm eller 75 cm kolv respektive.
- Kultur den isolerade HESC i en 5% CO2 inkubator vid 37 ° C under en period av 3-5 dagar tills cellerna bildar en enskiktslager uppnå 80-90% konfluens i en förkromad kolv.
- Ändra HESC Media varannan dag.
- Varm HESC Media i 37 ° C vattenbad i 15-20 min.
- Aspirera media från kolven och Lägg färska HESC Media till kolven (arbetar volym: 8 eller 16 mL per 25 cm eller 75 cm kolv respektive).
- Placera kolven tillbaka i 5% CO2 inkubatorn vid 37 ° C tills 80-90% konfluens uppnås.
6. mänskliga livmodercancer Stromal Cell (HESC) plätering och siRNA Transfection
Obs: Denna transfection procedur utförs i en steril miljö under biologiska säkerhetsdragskåp.
- Aspirera HESC Media från 75 cm kolven och tillsätt 2 mL av 0,25% trypsin-EDTA lösning.
- Inkubera i 5% CO2 inkubator vid 37 ° C i 2-3 min tills cellerna lossnar.
- När cellerna är lossnat från kolven, tillsätt 7 mL HESC Media och blanda försiktigt genom pipettering framåt och omvända 5 gånger.
- Pipettera cell blandningen i en 50 mL konisk polypropylen rör och centrifugera vid 800 x g under 2,5 minuter i rumstemperatur. Aspirera supernatanten och slamma cellpelleten i 10 mL av HESC Media.
Obs: Om plätering celler från fler än en kolv, helt enkelt öka volymen HESC Media. - Räkna celler som använder en Hemocytometer.
- Alikvotens 10 µL åter suspenderade celler i ett 1,5 mL mikrocentrifug rör.
- Tillsätt 10 µL av 0,4% Trypan blå fläcken till cell alikvotens och blanda genom pipettering framåt och bakåt.
- Plåt 0,8 x 105 celler per brunn i 6 brunnar. Efter två dagar, bör celler vara 60-70% konfluenta för optimal transfection.
- För varje siRNA transfection prov, förbereda komplex med siRNA (60 nanomol) till transfection reagens.
- Späd 5 µL transfection reagens i 150 µL av minskade serum fria medier och inkubera i 5 min.
- Späd 60 nanomol av siRNA i 100 µL av minskade serum fria medier och inkubera i 5 min.
- Efter 5 minuter, kombinera utspädda siRNA med utspädda transfection reagenslösningen och blanda försiktigt genom pipettering framåt och omvända 5 gånger.
Obs: Om transfecting en eller flera siRNA i flera brunnar, förbereda master mix i 10 mL polystyren rör. - Inkubera siRNA-transfection reagens komplex för 5 min i rumstemperatur.
- Under denna inkubation, tillsätt 1 mL förändring Media till varje brunn.
- Efter 5 min inkubering, Centrifugera rören vid 500 x g i 2 min att samla lösning och tillsätt den 250 µL av siRNA-transfection reagens komplex till varje brunn innehållande celler och media.
- Blanda genom att försiktigt skaka och inkubera cellerna vid 37° C i en 5% CO2 inkubator för 5 h.
- Efter 5 h, ändra media till HESC Media.
- Inkubera cellerna vid 37 ° C i en 5% CO2 inkubator i 2 dagar i förberedelse för en in vitro- decidualization analys.
7. in Vitro Decidualization Assay
Obs: Denna analys utförs i en steril miljö under biologiska säkerhetsdragskåp.
- Förbered EPC innan den in vitro- decidualization behandlingen som beskrivs i Camden o.a. 3 (se 1.6).
- Sug upp media från den post-48 timmars transfekterade rad HESC inkuberas från steg 6.16.
- Tillsätt 2 mL av EPC Media i varje brunn.
Observera: som en kontroll, lämna en uppsättning celler obehandlade med EPC Media. Istället, tillsätt 2 mL av HESC Media till kontrollbrunnarna. - Inkubera cellerna i 5% CO2 inkubator vid 37 ° C i 6 dagar.
- Ändra EPC Media varje 48 timmar.
- Varm och Förbered EPC i 37 ° C vattenbad för 15-20 min.
- Sug ut media från brunnen och lägga till färska EPC Media.
- Placera plattan tillbaka i 5% CO2 inkubatorn vid 37 ° C.
- Ändra EPC Media varje 48 timmar.
- Efter den sjätte dagen, analysera omfattningen av stromal cell decidualization via ELISA och qRT-PCR (som beskrivs nedan).
8. validering av In Vitro Decidualization utnyttja kvantitativa Real Time PCR (qRT-PCR)
Obs: qRT-PCR är klar som tidigare beskrivs i Kommagani et al10.
- Isolera den total-RNA från HESC utnyttja i protokollet från ett kommersiellt tillgängliga RNA isolering kit.
- Analysera den RNA kvantitet och renhet (en260/a280) med en NanoDrop eller liknande metod som beskrivs i Garcia-Elias et al15.
- Syntetisera cDNA från 1 µg totalt RNA genom ett kommersiellt tillgängliga omvänd Transkription kit protokoll.
- Kör en qRT-PCR-reaktion som beskrivs i ett kommersiellt tillgängliga qRT-PCR kit protokoll.
- Utföra den reaktion som använder en kommersiellt tillgänglig Real-Time PCR Master Mix och gen särskilda sonder tillsammans med interna systemkontroller (18s, PRLoch IGFBP1).
9. validering av In Vitro Decidualization utnyttja ELISA
- Kvantifiera de utsöndrade prolaktinnivåer från vävnadsodling media använder en kommersiellt tillgänglig prolaktin ELISA-kit.
10. validering av In Vitro Decidualization utnyttja Phalloidin färgning.
- Infoga sterila coverslips i varje brunn 12 väl platta.
- Upprepa steg 6.1-6.5.
- Plåt 0,8 x 105 celler per brunn 12 väl platta.
- Inkubera cellerna i 5% CO2 inkubator vid 37 ° C i 2 dagar.
- Aspirera media.
- Upprepa steg 7,3-7.4.
- Fixa cellerna i 4% PARAFORMALDEHYD (PFA) i fosfatbuffrad saltlösning (PBS) i rumstemperatur i 30 min.
- Aspirera fixering lösningen och tvätta 3 gånger med 1 mL PBS för 5 min varje.
- Lägg 0,1% icke-joniska ytaktiva ämnet polyetylenglykol tert-octyl fenyl eter i PBS för 5 min till fast celler att öka permeabiliteten.
- Tvätta 3 gånger med 1 mL PBS för 5 min varje.
- Tillsätt 100 µL av phalloidin lösning per täckglas och inkubera vid rumstemperatur i 90 min.
- Bered 1: 100 utspädningen i PBS från använder phalloidin stamlösning i 1 enhet per 5 µL.
- Tvätta 3 gånger med 1 mL PBS för 5 min varje.
- Montera bilder med monteringsmedium innehållande 4', 6-diamidin-2-fenylindol (DAPI).
- Iaktta de celler som utnyttjar confocal Mikroskop.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Decidualization i HESC kultur
Efter isolering, mänskliga livmodercancer stromaceller var odlade till en enskiktslager formation med 80-90% konfluens och inducerad för in vitro- decidualization genom att behandla med 10 nM E2, 1 µM MPA och 50 µM cAMP (EPC). Morfologiska förändringar associerade med in vitro- decidualization var visualiserat i figur 1A. Vid decidualization genomgå HESCs cytoskeletal ombildning från långsträckt, fibroblastic celler till rundade epithelioid celler. Således, phalloidin färgning utfördes för att bekräfta cytoskeletal omorganiseringen under HESC decidualization. Phalloidin är en mycket selektiv bicykliska peptid som utnyttjas för att färga för aktin filament, därmed visualisera cytoskeletal omordningen överensstämmer med in vitro- decidualization (figur 1B).
På sex dagar post EPC behandlingar bedömdes PRL och IGFBP1 mRNA nivåer via qRT-PCR bekräfta graden av decidualization (figur 2A). PRL - och IGFBP1 nivåer var betydligt ökat jämfört med den HESC som behandlade med kontroll fordonet (p < 0,001). Biokemiska förändringar i samband med decidualization bedömdes också genom kvantifiering av utsöndrade PRL-nivåer från culturing medium (figur 2B). Konsekvent med avskrift nivåer, PRL nivåerna var mycket förhöjda i EPC odlade HESC jämfört med kontroll (p < 0,001).
Effekten av specifik gen avbrytande på cellulära och molekylära förändringarna av HESCs decidualization bedömdes med SRC-2 som kandidat gene (figur 3). Efter 48 timmars transfection med kontroll eller SRC-2 siRNA odlades HESC i 6 dagar i EPC media. Kontroll siRNA transfekterade HESC visat cellulära och molekylära förändringar förenliga med korrekt decidualization, inklusive en kullersten morfologisk förändring och ökad avskrift nivåer av decidualization markörer PRL - och IGFBP1. Som förväntat, med SRC-2 siRNA knockdown, transfekterade HESC återstod fibroblastic i utseende jämfört med den kontroll siRNA HESC (figur 3A). Förenliga med denna cellulära förändring, PRL och IGFBP1 avskrift nivåer var signifikant minskad inom SRC-2 siRNA transfekterade HESC, som anger en urspårning i decidualization programmering med SRC-2 knockdown (* **p < 0,001). SRC-2 avskrift nivåer minskade avsevärt i SRC-2 siRNA transfekterade HESC jämfört för att styra siRNA, som anger en effektiv nedtystning med vår metod (***p < 0,001) (figur 3B).
Figur 1 : Cellulära förändringar av människors livmodercancer stromaceller under in vitro- decidualization. HESCs var isolerade och odlade i sex dagar i media som innehåller antingen fordon eller E2, MPA och cAMP (EPC). (A) cell bilder som illustrerar förändringar i cellulära morfologi från fibroblastic till epithelioid celler. (B) Phalloidin målat bilder av HESC illustrerar de cytoskeletal förändringarna (i grönt) vid in vitro- decidualization, där blå representerar kärnan (DAPI). Den röda pilen representerar decidualized celler. Den svarta pilen visar fibroblastic celler. Skalstapeln: 100 µm. vänligen klicka här för att visa en större version av denna siffra.
Figur 2 : Molekylära förändringar i människors livmodercancer stromaceller under in vitro- decidualization. (A) total-RNA isolerades från HSECs odlade i sex dagar i media som innehåller antingen fordon eller E2, MPA och cAMP (EPC) och utsätts för qRT-PCR analys för att upptäcka PRL och IGFBP1 avskrift nivåer. (B) nivåer av PRL utsöndras i kultur media mättes med en baserade ELISA-analys från HESC odlade i sex dagar i antingen fordon till EPC. p < 0,05, ** p < 0,01, *** p < 0,001. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3 : Knockdown för SRC-2 i mänskliga livmodercancer stromaceller påverkar in vitro- decidualization. (A) morfologiska förändringar i siRNA transfekterade HESC efter 6 dagar kultur med EPC media (topp paneler: kontroll siRNA helst pekar dag 0 och dag 6, bottenpaneler: SRC-2 siRNA helst pekar dag 0 och dag 6). (B) Avskrift nivåer av SRC-2, PRLoch IGFBP1 på dag 0 och dag 6 av EPC behandlade HESC transfekterade med kontroll eller SRC-2 siRNA. Den svarta pilen representerar decidualized celler. Den vita pilen visar fibroblastic celler. Skalstapeln: 200 µm. *** p < 0,001. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Kvinnliga reproduktiva menstruationscykeln kännetecknas av en ökning av progesteronnivåer under lutealfas, därmed förmå decidualization av ESC i runda, epitelial-liknande sekretoriska celler3,8. Inledandet av decidualization är arter som är beroende. Människor uppstår decidualization spontant vid uppkomsten av progesteron koncentration, möss kräver blastocysten närvaro10,11. Denna inkonsekvens i decidualization exemplifierar translationell fördelarna av att studera celldifferentiering i mänskliga cellinjer. In vitro-analyser genom primär cellkultur används ofta för att utforska moduleringen av decidualization via hormoner4,6,10. Begränsningar av denna metod kan dock uppstå vid tillgänglighet av en stor provstorlek av mänsklig vävnad utan betydande variationer i cykel fas och graviditet historia. Dock kan åtgärder för att säkerställa begränsningar minimeras genom att planera studien tillräckligt långt i förväg för att garantera gott om prover och schemaläggning biopsier i menstruationscykeln proliferativa fas (dag 9 - dag 12).
I denna studie HESC är odlade och artificiellt decidualized genom en ny metod som först beskrivs i Brosens o.a. 16 i vilka hormoner E2, P4 och cAMP kompletteras till culturing medium under en 6-dagars inkubationstid. Typiskt, alternativa metoder12,14 primas cell kulturer för konstgjorda decidualization genom tillägg av E2 och MPA över en utökad 14 dagars inkubationstid. Komplettering av lägret till culturing media förstärker synergistiskt decidualization av ESC i en kortare tidsram medan samtidigt upregulating uttrycket av gener som innehåller cAMP responsive element arrangören regioner (dvs. PRL - och IGFBP1)12,13. Denna metod, som bygger på det protokoll som beskrivs i Kommagani et al. 10, tillåter optimering av isolering och kultur av HESC. Cell kultur renhet var optimerad genom att utnyttja en 40 µm cell sil för att separera stromal och epitelial cell linjer. Dessutom tillämpades Ficoll-Paque PLUS reagens för att säkerställa en bärkraftig, hög avkastning isolering av ren stromaceller vid avlägsnande av blodkroppar från provet. En ytterligare centrifugeringssteget (400 x g i 30 min) var ingår följande Ficoll-tillägg att säkerställa ett fullständigt avskaffande av blodkroppar från cell befolkningen. Slutligen var HESC lönsamhet och avkastning optimerad vid odling av celler tills 95% konfluens för decidualization. Sammantaget garanteras dessa ytterligare steg renkultur av livskraftiga, hög avkastning HESC.
Graden av decidualization bedömdes utnyttja qRT-PCR, ELISA och phalloidin färgning för att iaktta cytoskeletal rearrangering och uppreglering av hallmark gener. I qRT-PCR bedömdes avskrift nivåerna av decidualization markörer PRL - och IGFBP1 . Vid decidualization av HESC ökat PRL - och IGFBP1 nivåer i en tidsberoende mode, som upprättades från tidigare forskning6. Tidsberoende ökningen av utsöndrade PRL-nivåer bekräftades också genom att undersöka HESC vävnadsodling media via ELISA. Morfologiska förändringar av stromaceller i decidual celler kan dessutom visualiseras genom den costaining av aktin filament via phalloidin och nukleära markör 4', 6-diamidin-2-fenylindol (DAPI)17. Tillsammans, bekräftade dessa experimentella resultat effektiviteten av odling HESC genom komplettering av E2, MPA och cAMP.
Detta protokoll förmåga att studera genen specifika knockdown bedömdes även utnyttja siRNA mot SRC-2. Morfologiskt, transfekterade SRC-2 HESC förblev fibroblastic, medan HESC behandlade med kontroll siRNA decidualized i epithelioid celler. SRC-2 knockdown effektivitet bedömdes genom avskrift nivå och betydligt minskade, som anger en lyckad Tystande av specifik gen med våra protokoll. Våra protokoll kan således vara en användbar resurs för utredare med intresse för avgränsar specifika gene(s) i endometriet decidualization roll.
Framsteg i att förstå de bakomliggande molekylära mekanismerna för decidualization har gjorts, finns fortfarande en betydande kunskapsgap på detaljerna. Felaktig decidualization har etablerats som en grundorsak för implantation fel och efterföljande tidig embryo missfall4,6,7,10. Därför behövs ytterligare prospektering angående de epigenetiska faktorer och karakterisering av molekylära vägar för diagnos och behandling av graviditet misslyckande.
Sammanfattningsvis, fastställs i protokollet som presenteras under denna studie en effektiv metod för att isolera och kultur en ren och hållbar linje av mänskliga livmodercancer stromaceller. Genom att komplettera hormoner E2, MPA och lägret till culturing media, konstgjorda decidualization kan induceras som bekräftas av qRT-PCR, ELISA, och Phalloidin färgning. Dessutom beskrivs våra protokoll detaljerade steg som krävs för den effektiva Nedslagning av en särskild gen av intresse med siRNA och lipid-baserade transfections. Sammantaget presenterar denna metod möjligheten att studera de underliggande cellulära och molekylära mekanismerna som är associerad med HESC decidualization.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Detta arbete stöds av finansiering från National Institutes of Health (NIH) / National Institute of Child Health och mänsklig utveckling (NICHD) grant (R00 HD080742) och Washington University School of Medicine start-up medel att R.K. Vi vill tacka Washington University fertilitetsklinik för att tillhandahålla endometriebiopsi proverna.
Acknowledgments
Författarna har något att avslöja.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Opti-MEM I (1X) Reduced Serum Medium | Gibco | 31985-070 | For decidualization media |
| DMEM / F12 (1:1) (1X) | Gibco | 11330-032 | |
| Trypan Blue Stain (0.4%) | Gibco | 15250-061 | For cell count |
| PureLink RNA Mini Kit | Invitrogen | 12183018A | For RNA Isolation/Purification |
| TaqMan 2X Universal PCR Master Mix | Applied Biosystems | 4304437 | |
| High Capacity cDNA Reverse Transcription Kit | Applied Biosystems | 4374967 | |
| Eukaryotic 18S rRNA Endogenous Control | Life Technologies | 4319413E | For qPCR internal control |
| TaqMan Gene Expression Assay Prolactin Probe | Applied Biosystems | 4331182 | For qPCR internal control |
| TaqMan Gene Expression Assay IGFBP1 Probe | Applied Biosystems | 4331182 | For qPCR internal control |
| Phalloidin-iFluor 488 Reagent - CytoPainter | Abcam | ab176753 | |
| Human Prolactin ELISA Kit | Invitrogen | EHIAPRL | |
| 16% Paraformaldehyde | Alfa Aesar | 30525-89-4 | Fixative |
| Lipofectamine RNAiMAX | Invitrogen | 13778150 | Transfection Reagent |
| ProLong Gold antifade reagent with DAPI | Invitrogen | P36935 | For mounting |
| 0.25% Trypsin-EDTA (1X) | Gibco | 25200-056 | |
| Penicillin Streptomycin | Gibco | 15140-122 | |
| Charcoal Stripped Fetal Bovine Serum | Sigma | F6765-500ML | |
| Sodium Bicarbonate (7.5%) | Gibco | 25080-094 | |
| Ficoll-Paque PLUS Reagent | Fisher Scientific | 45001749 | |
| Collagenase from Clostridium histolyticum | Sigma | C0130-1G | |
| Deoxyribonuclease I from bovine pancreas | Sigma | DN25-100MG | |
| Medroxyprogesterone 17-acetate | Sigma | M1629-1G | For EPC Media |
| Estradiol | Sigma | E1024-1G | For EPC Media |
| cAMP | Sigma | A6885-100MG | For EPC Media |
| Fine straight stitch scissors | Fine Science Tools | 15396-00 | |
| TaqMan Gene Expression Assay NCOA2 Probe | Applied Biosystems | 4351372 | |
| Fetal Bovine Serum, heat inactivated | Gibco | 10-082-147 | |
| Antibiotic-antimycotic | Thermo Scientific | 15240062 | |
| Hank’s Balanced Salt Solution | Corning | 21-021-cv | |
| 50 mL conical polypropylene Falcon tube | Corning | 352098 | |
| Dumont #5/45 Forceps | Fine Science Tools | 11251-35 | |
| 100 x 15 mm Glass Petri dish | VWR | 75845-546 | |
| 40 micron cell strainer | Midsci | 229481 | |
| Isotemp 215 Water bath | Fisher Scientific | FS-215 | |
| LSE Centrifuge | Corning | 6755 | |
| Human NCOA2 siRNA | Dharmacon | L-020159-00 | Gene specific qPCR probe |
| Steri-cycle i160 CO2 Incubator | Thermo Scientific | 51030301 | |
| NanoDrop 2000 | Thermo Scientific | ND-2000 | For RNA quantification |
| Phosphate Buffered Saline | Fisher Scientific | 50146771 | |
| 75 cm Canted Neck Cell Culture flask | Corning | 430641U | |
| 6 well Non-Pyrogenic Cell Culture Plate | Corning | 3506 | |
| Pipet Controller Ultra | Corning | 4099 | |
| Photoshop | Adobe | 19.0.1.334 | |
| 25 cm Canted Neck Cell Culture flask | Corning | 7200876 | |
| Triton X-100 | Sigma | X100-1L | |
| 15 mL conical polypropylene Falcon tube | Corning | 352099 | |
| 10 mL Syringe | BD | 302995 | |
| 1300 Series A2 Biological Safety Hood | Thermo Scientific | 1377 | |
| accuspin Micro17 centrifuge | Fisher Scientific | 13100675 | |
| 7500 Fast real time PCR system | Applied Biosystems | 3052632 | |
| EVOS FL Immunofluorescence Microscope | Life Technologies | 01414-155G-291 | |
| Leica Inverted Light Microscope | Leica | DMi1 | |
| Illrustrator | Adobe | 22.0.1.253 | |
| Excel Spreadsheets | Microsoft | 2016 | |
| Deckglaser 18 mm cover glasses | NeuVitro | GG-18 | |
| Reichert Bright-Line Hemacytometer | Sigma | Z359629-1EA | |
| 2-mercaptoethanol | Fisher Bioreagents | BP176-100 | For RNA lysis buffer |
| 1.2mL External Threaded Polypropylene Cryogenic Vial | Corning | 430658 | For freezing HESC cells |
| Dimethyl Sulfoxide (DMSO) | Sigma | D2650-100mL | For freezing media |
References
- Maruyama, T., Yoshimura, Y. Molecular and cellular mechanisms for differentiation and regeneration of the uterine endometrium. Endocrine Journal. 55, 795-810 (2008).
- Yu, J., et al. Endometrial Stromal Decidualization Responds Reversibly to Hormone Stimulation and Withdrawal. Endocrinology. 157, 2432-2446 (2016).
- Ahn, J. I., et al. cAMP-Response Element-Binding 3-Like Protein 1 (CREB3L1) is Required for Decidualization and its Expression is Decreased in Women with Endometriosis. Current Molecular Medicine. 16, 276-287 (2016).
- Gellersen, B., Brosens, J. J. Cyclic decidualization of the human endometrium in reproductive health and failure. Endocrine Reviews. 35, 851-905 (2014).
- Telgmann, R., Gellersen, B. Marker genes of decidualization: activation of the decidual prolactin gene. Human Reproduction Update. 4, 472-479 (1998).
- Camden, A. J., et al. Growth regulation by estrogen in breast cancer 1 (GREB1) is a novel progesterone-responsive gene required for human endometrial stromal decidualization. Molecular Human Reproduction. 23, 646-653 (2017).
- Kommagani, R., et al. The Promyelocytic Leukemia Zinc Finger Transcription Factor Is Critical for Human Endometrial Stromal Cell Decidualization. PLoS Genetics. 12, e1005937 (2016).
- Large, M. J., DeMayo, F. J. The regulation of embryo implantation and endometrial decidualization by progesterone receptor signaling. Molecular and Cellular Endocrinology. 358, 155-165 (2012).
- Zhang, X. H., et al. The mesenchymal-epithelial transition during in vitro decidualization. Reproductive Sciences. 20, 354-360 (2013).
- Kommagani, R., et al. Acceleration of the glycolytic flux by steroid receptor coactivator-2 is essential for endometrial decidualization. PLoS Genetics. 9, e1003900 (2013).
- Ramathal, C. Y., Bagchi, I. C., Taylor, R. N., Bagchi, M. K. Endometrial decidualization: of mice and men. Seminars in Reproductive Medicine. 28, 17-26 (2010).
- Tamura, I., et al. Novel Function of a Transcription Factor WT1 in Regulating Decidualization in Human Endometrial Stromal Cells and Its Molecular Mechanism. Endocrinology. 158, 3696-3707 (2017).
- Vinketova, K., Mourdjeva, M., Oreshkova, T. Human Decidual Stromal Cells as a Component of the Implantation Niche and a Modulator of Maternal Immunity. Journal of Pregnancy. , 8689436 (2016).
- Wu, D., et al. Chronic endometritis modifies decidualization in human endometrial stromal cells. Reproductive Biology and Endocrinology. 15, 16 (2017).
- Garcia-Elias, A., et al. Defining quantification methods and optimizing protocols for microarray hybridization of circulating microRNAs. Scientific Reports. 7, 7725 (2017).
- Brosens, J. J., et al. Human endometrial fibroblasts immortalized by simian virus 40 large T antigen differentiate in response to a decidualization stimulus. Endocrinology. 137, 2225-2231 (1996).
- Koukouritaki, S. B., Margioris, A. N., Gravanis, A., Hartig, R., Stournaras, C. Dexamethasone induces rapid actin assembly in human endometrial cells without affecting its synthesis. Journal of Cellular Biochemistry. 65, 492-500 (1997).
