Summary
Bu çalışmada yalıtım ve kültür vitro decidualization tahlil yapmak için insan endometrium stromal hücre için doğrulanmış ve en iyi duruma getirilmiş bir yordam sunar. Ayrıca, bu çalışmada çift insan endometrium stromal hücreler kullanarak belirli bir gen için verimli bir şekilde devirme detaylı bir yöntem sağlar.
Abstract
İnsan endometrium stromal hücrelerden (HESC) fibroblast benzeri görünüm salgı decidua içine farklılaşma anne rahim rahim astarı içine embriyo implantasyonu için gerekli bir dönüşümdür. Yanlış decidualization implantasyon başarısızlığı ve sonraki erken embriyo düşük için kök neden olarak kurulmuştur. Bu nedenle, decidualization temel moleküler mekanizmaları anlama başarılı Doğum oranı artırmak için avantajlıdır. Yapay decidualization dayalı in vivo çalışmalar kez etik ikilemler içinde hayvan modelleri translasyonel komplikasyonlar yanı sıra insan araştırma ile ilişkili nedeniyle sınırlı hale gelir. Sonuç olarak, vitro deneyleri birincil hücre kültürü aracılığıyla sık sık decidualization modülasyon hormonlar keşfetmek için kullanılmaktadır. Bu çalışmada HESC yalıtım ve sonraki yapay decidualization kodlamayla orta hormonların takviyesi ile detaylı bir protokol sağlar. Daha fazla, bu çalışmada nakavt iyi tasarlanmış bir yönteme herhangi bir gen ilgi lipid tabanlı siRNA transfections kullanarak sağlar. Bu iletişim kuralı kültür saflık yanı sıra ürün verim, böylece bu modeli moleküler mekanizmalar decidualization ve bir sonraki miktar temel anlamak için güvenilir bir yöntem kullanma özelliğini maksimize optimizasyonu izin verir. decidualized rahim stromal hücreler tarafından salgılanan ajanlar.
Introduction
Marche aşamaları ve menopoz arasında üreme çağındaki kadınların rahim yayılması hormon düzenlenir, farklılaşma ve sonraki gebelikte adet1 bilinen bir işlem için hazırlık dökülme aylık döngüleri geçmesi ,2. İnsan endometrium tür fiziksel değişiklikler1rahim duvarı içine uygun embriyo implantasyonu için gereklidir. Morfolojik ve biyokimyasal uyarlamaları, dahil olmak üzere endometrium, değişikliklere aracılı yumurtalık steroid hormonlar östrojen ve progesteron (P4) üzerinden adet döngüsü boyunca3,4,5. (Veya) foliküler proliferatif faz içinde endometrium kalınlaşma başlatılıyor artış, preovulatory östrojen düzeyleri. Yumurtlama, salgı (ya da luteal) evre rahim stromal hücre (ESC) morfolojik dönüştürme inducing P4 konsantrasyonlarda önemli bir artış fibroblast benzeri çıkışı yuvarlak hücrelere, epitel benzeri decidual teşvik decidualization4,6bilinen bir işlem içinde. Yanlış decidualization implantasyon başarısızlığı ve sonraki erken embriyo düşük4,7,8için bir kök neden olarak kurulmuştur. Bu nedenle, decidualization temel moleküler mekanizmaları anlama tanı ve tedavisinde erken gebelik kaybı için avantajlıdır.
Şu anda, çeşitli metodolojiler endometrium stromal hücre decidualization temel etkilerini araştırmak için kullanılmaktadır. Vivo, fare rahim yapay olarak mekanik stimülasyon (tırmalamakYani,) üzerinden decidualization için indüklenen veya yağ enjeksiyonu hormonal astarlanmalıdır rahim9. Farklı insanlar, sentetik Bu uyarımı rahim lümen farklılaşma blastosist varlığı, kemirgenler10,11decidualization başlatılması için gerekli bir adım görünümünü sağlayarak teşvik etmektedir. Buna göre hayvan modelleri ve temel in vivo çalışmalar insanlarda çevreleyen etik ikilemler ile ilgili translasyonel komplikasyonlar nedeniyle decidualization dayalı modelleri en başarılı bir şekilde incelendiği tüp bebek.
Bu çalışmada, konular aracılığıyla yerel hem İngilizce hem de İspanyolca gazete reklam yerleşimini işe. Bu çalışma için uygun adaylar olarak tanımlanan konular potansiyel riskleri tam açıklanması açıklanmıştır araştırma koordinatörü ile karşılamak için toplanırlar. Potansiyel risklerini tam bir anlayış onayı, yazılı ve sözlü formlarda konularda izni elde edilebilir. Konu izni izni (1) geçmesi flebotomi (2) uzun süreli depolama gelecekteki araştırma amacıyla onların dokuların ve kabul (3) birincil kültürler oluşturma için toplanan doku örnekleri içerir. Rıza konular yarış/etnisite ve/veya sağ gizlilik için izin verilen hangi kendi içinde tamamlamak için bir form verilir. Bir sonraki ziyaret ilgilinin adet döngüsü üzerinde dayalı endometrium biyopsi ulaşmak için planlanmıştır. Bu çalışma için işe gönüllü St. Louis metropolitan bölgesi etnik ve ırksal demografisi 2012 sayım tarafından belirtildiği gibi yansıtmak ve hamile kadınlar, fetus, embriyo de dahil olmak üzere herhangi bir savunmasız nüfus katılımı dahil değil, 18 yaş altı yaş veya diğer korunmasız grupların çocuklar. Uygunluk şartları biyopsi örnek koleksiyon katılım için yaş arası 18-45 yıl (2) (3) hiçbir geçerli gebelik veya hormonal/intrauterin aygıt kontraseptif kullanımı sahip normal siklus (25-32 gün) sahip olmak (1) dahil hiçbir geçerli vajinal enfeksiyon veya cinsel yolla bulaşan hastalıklar (5) hiçbir mevcut antibiyotik tedaviler ve (6) sahip sahip için 30 gün önce kayıt (4) hiçbir geçerli anormal Pap smear sahip.
Bu çalışma içinde insan endometrium stromal hücreler (HESC) kültürlü ve vitro decidualization (estradiol (E2), medroxyprogesterone asetat (MPA) ve siklik adenozin hormonların takviyesi üzerinden geçmesi yapay indüklenen monofosfattır (kampı)) orta. Bu yöntemde, decidualization derecesine göre gün hormonal tedavinin toplam sayısı değişir. Hücre iskeleti düzenlenmesi ile birlikte, hormon takviyesi biyokimyasal uyarlamalar decidual hücreler salgı benzeri nitelikleri2,4deneyim neden olmaktadır. Prolaktin (PRL) ve insülin benzeri büyüme faktörü bağlayıcı protein 1 (IGFBP1), gibi hallmark genlerin ifade onaylamak ve HESC decidualization5,12, derecesini ölçmek için kullanılması gereken 13 , 14. önemli, gen belirli nakavt yapmak için bu iletişim kurallarını canlılığı de gösterdi.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Bu çalışma için toplanan tüm insan endometrium biyopsi Washington Üniversitesi St. Louis, kadın hastalıkları Bölümü'nden elde ve bir kurumsal İnceleme Kurulu (IRB) kullanarak kadın hastalıkları yazılı onayı formu onaylı.
1. hazırlık
- 1 x Hank'in dengeli tuz çözüm (HBSS) 500 mL (HBSS + aracı olarak daha fazla başvurulan) medya içeren şişe 100 U/mL penisilin ve 100 µg/mL streptomisin ekleyerek hazırlayın.
- Dulbecco'nın modifiye kartal orta 500 mL hazırlamak: fenol red, L-glutamine ve 15 mM 4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic asit (HEPES) % 1 antibiyotik antimycotic çözüm (son konsantrasyonu ekleyerek besin karışımı F-12 (DMEM/F12) 100 U/mL penisilin, 100 µg/mL streptomisin ve 0,25 µg/mL Fungizone) (daha fazla HESC yalıtım ortamı olarak başvurulan) şişe içeren medya için.
- %10 Fetal sığır Serum (FBS), 1 x Na2HCO3ve % 1 ekleyerek DMEM/F12 500 mL fenol red, L-glutamine ve 15 mM HEPES hazırlamak penisilin (10.000 U/mL) ve streptomisin (10.000 µg/mL) (kalem Strep) medyaya (daha fazla şişe içeren HESC medya başvuru olarak).
- L-Glutamine, 2.4 g/L sodyum bikarbonat ve HEPES ile Serum orta azaltılmış 500 mL % 2 ile hazırlamak kömür Stripped Fetal sığır Serum (csFBS) ve % 1 kalem Strep (daha fazla Decidualization medya başvurulan) şişe içeren medya için.
- Fenol (daha fazla değişim medya başvurulan) şişe içeren medya fetal Sığır serum (csFBS) ücretsiz DMEM/2% kömür ekleyerek F12 elimden kırmızı 500 mL hazırlayın.
- 10 nM estradiol (E2), 1 µM medroxyprogesterone asetat (MPA) ve 50 µM siklik adenozin monofosfattır (kampı) 15 mL polipropilen konik tüp içinde hazırlamak ve vitro için önceden hazırlanmış decidualization ortamının iyi aliquot başına 2 mL ekleyin decidualization tahlil (EPC medya daha fazla başvurulan).
- Medya %90 FBS ve % 10 dimetil sülfoksit (DMSO) ile (daha fazla buz gibi medya başvurulan) 50 mL polipropilen konik tüp buz gibi 50 mL hazırlayın.
- 25 mg Collagenase ve 5 mg DNaz önceden tartmak ben bir 50 mL konik polipropilen boru ve store-20 ° C'de
2. insan Endometrium biyopsi alma
- İnsan endometrium biyopsi örnekleri proliferatif faz (gün 9 - gün 12) toplanan HBSS onaylı IRB klinikte adet döngüsü elde.
- Biyopsi örnekleri prewarmed 37 ° C HBSS + orta 1 mL ile yıkama ve aşırı kan kaldırmak için hafifçe sallayın ve mukus.
3. yalıtım insan endometrium Stromal hücre (HESC)
Not: Bu yalıtım yordamı biyolojik güvenlik Kabin altında steril bir ortamda gerçekleştirilir.
- 10 mL içeren bir 50 mL konik Polipropilen santrifüj tüpüne ile sterilize forseps biyopsi aktarım taze HBSS.
- Biyopsiyi 500 x g 90 için de oda sıcaklığında santrifüj kapasitesi s.
- Hücre Pelet yırtığı yeniden spin eğer biyopsi 90 için 2.000 x g, s.
- 1 mL damlalıklı kullanarak medyayı çıkarın ve yıkama ile 37 ° C 10 mL prewarmed HESC yalıtım medya Santrifüjü 500 x g 90 için de ardından s.
- 1 mL damlalıklı kullanarak medyayı çıkarın ve şiddetle 3 mL taze HESC yalıtım biyopsi çıkarmak için medya ekleyin.
- Biyopsi HESC yalıtım medya 5 mL içeren bir Petri kabına dikkatle boşaltmak.
- Yaklaşık 20 dakika #5 forseps ve iyi düz dikiş makas kullanarak mümkün olduğunca küçük parçalar olarak biyopsiyi içine kıyma.
- DNaz hazırlamak için önceden ağırlığını DNaz 10 mL HESC yalıtım medya ekleyerek Collagenase enzimler ve ben ben (0,5 mg/mL) ve Collagenase (2.5 mg/mL). Damlalıklı ile karıştırın.
- Pipet 1 mL damlalıklı yeni 50 mL konik Polipropilen tüp kullanarak doku örnekleri kesti. HESC yalıtım Media 7 mL ile yıkayın ve tam örnek almaya polipropilen boru ekleyin.
- Santrifüj örnek vasıl 800 x g oda sıcaklığında 2 dakika süreyle yavaşça çıkarın süpernatant pipet tarafından.
- Ben ve Collagenase çözüm 0.2 µm filtresi ile 10 mL şırınga Pelet üzerine doğrudan bağlı DNaz filtre.
- 10 için girdap Pelet resuspend s.
- Özet 37 ° C su banyosu 1,5 saat için vortexing için 10 s iyice her 10 kadar doku sindirilmiş min.
- Filtre örnek bir 40 µm hücre süzgeç aracılığıyla epitel hücre ve doku enkaz kaldırmak için bir 50 mL konik polipropilen boru yığılmış.
Not: 50 mL konik polipropilen boru Stromal hücreler vardır. - 50 mL konik polipropilen boru vasıl 800 x g oda sıcaklığında 2.5 dk santrifüj kapasitesi. Yavaşça süpernatant 1 mL pipet ile çıkarın.
- Pelet 10 mL HESC yalıtım medya resuspend.
- Vasıl 800 x g oda sıcaklığında 2.5 dk santrifüj kapasitesi. Süpernatant Aspire edin ve HESC medya ve pipet ileriye ve geriye doğru karıştırmak için 6 mL hücrelerde resuspend.
- Yavaş yavaş katmanda yoğunluk resuspended kalan kan hücreleri katmanları karıştırmak değil dikkatli olmak stromal hücrelerden ayrı hücrelere degrade medya 3 mL.
- 400 x g için oda sıcaklığında 30 dk de 15 mL polipropilen boru santrifüj kapasitesi.
- 5 mL süpernatant yeni 50 mL polipropilen tüp içinde de toplamak ve hücreleri resuspend için bir ek 5 mL HESC ortam ekleyin.
- Vasıl 800 x g süpernatant kaldırılması ve ek 6 mL HESC medya takip oda sıcaklığında 2.5 dk santrifüj kapasitesi. Girdap örnek 10 s ve pipetting tarafından mix için ileriye ve geriye doğru 5 kere.
- Yeniden askıya alınan hücrelerin hücre sayısı için 1.5 mL microcentrifuge tüp aliquot 10 µL.
- 10 µL %0,4 Trypan mavi leke aliquot hücre ve damlalıklı ile karışımı ekleyin. Aliquot 10 µL yük ve bir hemasitometre kullanarak hücreleri saymak.
- Uygun bir şişeye toplam hücre sayısı 15 mL HESC medya bağımlı hücreleri plaka.
- Hücre toplam sayısı 1 milyondan az ise, 25 cm balon bulunan bütün hücreler HESC medya ile 6 mL plaka. Hücre toplam sayısı 1 milyondan fazla ise, tüm hücrelerde 75 cm şişesi 15 mL HESC medya ile plaka.
- 37 ° C'de kuluçka %5 CO2 en az uygun hücre yapışma sağlamak ve medya HESC medyaya değiştirmek için 6 h hücre kültür.
- 3-%5 80-90 confluency kaplama bir balonun içinde elde bir monolayer hücreleri oluşana kadar günlük bir süre için 37 ° C'de % 5 CO2 kuluçka izole HESC kültür.
- HESC medya iki günde değiştirin.
- Sıcak HESC medya için 15-20 dk 37 ° C su banyosunda.
- Şişeye medyadan Aspire edin ve taze HESC medya için balonun ekleyin (çalışma birimi: 8 mL veya 16 mL 25 cm veya 75 cm şişe başına sırasıyla).
- % 80-90 confluency elde kadar şişeyi geri % 5 CO2 kuluçka 37 ° C'de yerleştirin.
- HESC hale sonra % 80-90 birleşmesi, hücreleri üç 75 cm şişeler için 25-cm 75 cm şişesi için veya bir 75 cm şişesi aktarın.
Not: HESC donmuş ve gelecekteki deneyler için şu anda daha sonra kullanım için saklanır.
4. dondurma ve çözme HESCs
- 75 cm şişeye medyadan Aspire edin ve tripsin-EDTA 2 mL ekleyin.
- Hücreleri şişeye çıkarmak kadar 2-3 dk 37 ° C'de % 5 CO2 kuluçka kuluçkaya.
- 7 mL ileriye ve geriye doğru HESC medya ve de pipetting tarafından karışımı ekleyin.
- Vasıl 800 x g 2.5 dk santrifüj kapasitesi ve süpernatant Aspire edin.
- Dondurucu tüpleri hücre kültürünü, tarihini ve geçiş numarası ile etiketleyin.
- Hücre Pelet medya dondurma 5 mL içinde yeniden askıya alma.
- -80 ° C dondurucu her tüp ve transfer tüpler için yeniden askıya alınmış HESC aliquot 1 mL.
- Tüpler için sıvı azot 24 saat içinde aktarın.
Not: Eğer hücreler yakın gelecekte çözülme planlama, mağaza-80 ° C'de hücreler için bir ay donmuş. - HESCs çözdürme için HESC medya için 20 dk önceden ısıtmak.
- Önceden ısıtılmış HESC medya 8 mL 25 cm şişesi için ekleyin.
- Dondurucu tüp sıvı azot tankı veya-80 ° C almak ve 37 ° C su banyosu için 1-2 dk hücreleri çözülme tüpte daldırın.
- Gecede 37 ° C'de % 5 CO2 kuluçka kuluçkaya ve HESC medya ile 25 cm şişesi çözdürülen HESC transfer
- Ertesi gün, HESC ortam değiştirmek ve 2-3 gün HESC konfluent olmak ve 75 cm şişesi aşağıda ayrıntılı olarak açıklandığı gibi iletişim kuralı 5 hücreleri transfer kadar bekleyin.
- Sıcak HESC medya için 15-20 dk 37 ° C su banyosunda.
- Şişeye medyadan Aspire edin ve taze HESC medya için balonun ekleyin (çalışma birimi: 8 mL veya 16 mL 25 cm veya 75 cm şişe başına sırasıyla).
- % 80-90 confluency elde kadar şişeyi geri % 5 CO2 kuluçka 37 ° C'de yerleştirin.
5. insan endometrium Stromal hücre (HESC) kültürü
Not: Bu Culturing yordam biyolojik güvenlik Kabin altında steril bir ortamda gerçekleştirilir.
- HESC medya ön bir su banyosu için 20-30 dk içinde 37 ° C'de ısı.
- Şişeye medyadan Aspire edin ve % 0.25 tripsin ethylenediaminetetraacetic asit (EDTA) (1 mL 25 cm şişesi veya 75 cm şişesi için 2 mL) ekleyin.
- Hücreleri çıkarmak kadar 37 ° C'de kuluçka %5 CO2 2-3 dakika için kuluçkaya.
- Kalan hücreleri çıkarmak için şişesi duvarlar hafifçe dokunun. 7 mL ileriye ve geriye doğru HESC medya ve de pipetting tarafından karışımı ekleyin.
- Damlalıklı 50 mL konik polipropilen boru ve 2.5 dakika oda sıcaklığında 800 x g, santrifüj içine hücre karışımı.
- Süpernatant Aspire edin ve hücre Pelet HESC medyada yeniden askıya alma.
- 15 mL 25 cm şişesi veya 75 cm şişesi (15 mL her) için 45 mL ekleyin.
- 5 mL veya 15 mL hücre süspansiyon her 25 cm veya 75 cm şişesi için sırasıyla ekleyin.
- 3-%5 80-90 confluency kaplama bir balonun içinde elde bir monolayer hücreleri oluşana kadar günlük bir süre için 37 ° C'de % 5 CO2 kuluçka izole HESC kültür.
- HESC medya iki günde değiştirin.
- Sıcak HESC medya için 15-20 dk 37 ° C su banyosunda.
- Şişeye medyadan Aspire edin ve taze HESC medya için balonun ekleyin (çalışma birimi: 8 mL veya 16 mL 25 cm veya 75 cm şişe başına sırasıyla).
- % 80-90 confluency elde kadar şişeyi geri % 5 CO2 kuluçka 37 ° C'de yerleştirin.
6. insan endometrium Stromal hücre (HESC) kaplama ve siRNA Transfection
Not: Bu transfection yordam biyolojik güvenlik Kabin altında steril bir ortamda gerçekleştirilir.
- 75 cm şişeye ortamdan HESC Aspire edin ve 2 mL % 0.25 tripsin-EDTA çözeltisi ekleyin.
- Hücreleri çıkarmak kadar % 5 CO2 kuluçka 37 ° C'de 2-3 dk kuluçkaya.
- Hücreleri balonun yerinden sonra HESC Media 7 mL ekleyin ve karışımı yavaşça ileri pipetting ve 5 kez ters.
- Damlalıklı 50 mL konik polipropilen boru ve 2.5 dakika oda sıcaklığında 800 x g, santrifüj içine hücre karışımı. Süpernatant Aspire edin ve hücre Pelet 10 mL HESC medya yeniden askıya alma.
Not: birden fazla şişeye hücrelerden kaplama, sade bir şekilde HESC ortam birimi artırın. - Bir hemasitometre kullanarak hücreleri saymak.
- Aliquot 10 µL 1.5 mL microcentrifuge tüp içine yeniden askıya alınan hücre.
- 0,4 Trypan mavi hücresine aliquot leke ve geriye doğru ve ileri pipetting tarafından mix % 10 µL ekleyin.
- 6-şey plakaları bir kuyu başına plaka 0.8 x 105 hücre. İki gün sonra hücrelerin % 60-70 birleşmesi için en uygun transfection olmalıdır.
- Her siRNA transfection örnek için kompleksleri siRNA (60 nanomoles) için transfection reaktif kullanarak hazırlayın.
- İndirimli serum ücretsiz medya 150 µL transfection reaktif 5 µL sulandırmak ve 5 min için kuluçkaya.
- İndirimli serum ücretsiz medya 100 µL siRNA 60 nanomoles sulandırmak ve 5 min için kuluçkaya.
- 5 dakika sonra seyreltilmiş siRNA seyreltilmiş transfection reaktif çözüm ile birleştirmek ve karışımı yavaşça ileri pipetting tarafından ve 5 kez ters.
Not: bir veya daha fazla siRNA birden çok Wells transfecting, 10 mL ana karışımda polistren tüpler hazırlamanız. - SiRNA-transfection reaktif kompleksleri, oda sıcaklığında 5 min için kuluçkaya.
- Bu kuluçka sırasında her şey değişim medya 1 mL ekleyin.
- Kuluçka 5 dk sonra 500 x g çözüm toplamak ve siRNA-transfection reaktif kompleksleri 250 µL her şey hücreleri ve medya içeren eklemek 2 min için de tüpler santrifüj kapasitesi.
- Yavaşça Rock yaparak mix ve 5 h için % 5 CO2 kuluçka 37 ° C'de hücreler kuluçkaya.
- 5 h sonra medya HESC medya için değiştirin.
- %5 CO2 kuluçka 37 ° C'de hücreler bir vitro decidualization tahlil için hazırlık 2 gün kuluçkaya.
7. Vitro Decidualization tahlil
Not: Bu tahlil biyolojik güvenlik Kabin altında steril bir ortamda gerçekleştirilir.
- Vitro decidualization tedavi Camden ve ark. içinde açıklandığı gibi başlatma öncesinde EPC ortam hazırlamak 3 (1,6 bakın).
- HESC transfected hattı 6,16 adımından inkübe post-48 saat medyadan Aspire edin.
- EPC medya 2 mL her kuyuya ekleyin.
Not: bir denetim, bir hücre kümesi EPC medya ile tedavi edilmezse bırakın. Bunun yerine, 2 mL HESC medya denetim wells için ekleyin. - %5 CO2 kuluçka 37 ° C'de hücreler için 6 gün kuluçkaya.
- EPC medya 48 saatte değiştirin.
- Sıcak ve EPC medya bir 37 ° C su banyosunda 15-20 dk için hazırlamak.
- Kuyu medyadan Aspire edin ve taze EPC medya ekleyin.
- Plaka %5 CO2 kuluçka 37 ° C'de geri yerleştirin
- EPC medya 48 saatte değiştirin.
- Altıncı gün sonra stromal hücre decidualization ELISA ve qRT-PCR ile ölçüde (aşağıda açıklandığı gibi) analiz.
8. kantitatif gerçek zamanlı PCR (qRT-PCR) kullanılarak In Vitro Decidualization doğrulama
Not: daha önce Kommagani ve ark10içinde açıklandığı gibi qRT-PCR tamamlanır.
- Piyasada bulunan bir RNA izolasyon kiti protokolü kullanan HESC üzerinden toplam RNA yalıtmak.
- RNA miktarı ve saflık (bir260/A280) Garcia-Elias ve ark15' te açıklandığı gibi bir NanoDrop veya benzer metodoloji kullanarak analiz.
- Piyasada bulunan Ters transkripsiyon kiti protokolü üzerinden toplam RNA'ın 1 µg üzerinden cDNA sentez.
- QRT-PCR reaksiyon bir piyasada bulunan qRT-PCR kiti protokolünde açıklandığı gibi çalıştırın.
- Piyasada bulunan bir gerçek zamanlı PCR Master Mix kullanarak tepki gerçekleştirmek ve gen belirli probları ile birlikte iç sistem denetimleri (18s, PRLve IGFBP1).
9. ELISA kullanılarak In Vitro Decidualization doğrulama
- Piyasada bulunan bir prolaktin ELISA kiti kullanarak doku kültürü ortamdan salgılanan Prolaktin düzeyleri ölçmek.
10. Phalloidin boyama kullanılarak In Vitro Decidualization doğrulaması.
- Steril coverslips 12 iyi plaka her kuyunun içine yerleştirin.
- 6.1-6,5 olan adımları yineleyin.
- 12 iyi plaka kuyu başına plaka 0.8 x 105 hücre.
- %5 CO2 kuluçka 37 ° C'de hücreler için 2 gün kuluçkaya.
- Medya Aspire edin.
- 7.3-7,4 adımları yineleyin.
- %4 paraformaldehyde (PFA) hücrelerde fosfat tamponlu tuz (PBS), oda sıcaklığında 30 dk için fix.
- Fiksasyon çözüm Aspire edin ve 3 kez PBS 1 mL 5 dakika yıkayın.
- % 0.1 iyonik olmayan yüzey aktif Polietilen glikol tert-Oktil fenil eter PBS içinde 5 min için geçirgenlik artırmak için sabit hücrelere ekleme.
- 3 kez PBS 1 mL 5 dakika yıkayın.
- Phalloidin çözüm coverslip başına 100 µL ekleyin ve 90 dakika oda sıcaklığında kuluçkaya.
- 1: 100 seyreltme PBS içinde 5 µL başına 1 adet içinde bir phalloidin hisse senedi çözüm kullanarak hazırlayın.
- 3 kez PBS 1 mL 5 dakika yıkayın.
- Slaytları 4', 6-Diamidino-2-Phenylindole içeren montaj ile orta (DAPI) bağlayın.
- Confocal mikroskop kullanarak hücreleri gözlemlemek.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
HESC kültür decidualization
Yalıtım, insan endometrium stromal hücreler için monolayer oluşumu ile % 80-90 confluency kültürlü ve vitro decidualization için 10 nM E2, 1 µM MPA ve 50 µM kampı ile tedavisi ile indüklenen (EPC). Vitro decidualization ile ilişkili morfolojik vardiya Şekil 1A' görüntülenir. Decidualization HESCs uzun, fibroblastic hücrelerinden hücre iskeleti yeniden yuvarlak epithelioid hücrelere tabi. Böylece, phalloidin boyama HESC decidualization sırasında hücre iskeleti yeniden yapılanma onaylamak için gerçekleştirildi. Phalloidin aktin filamentleri için leke için kullanılan bir çok seçici bicyclic peptid böylece hücre iskeleti düzenlenmesi vitro decidualization ile (Şekil 1B) tutarlı görselleştirme olduğunu.
Yazı EPC tedavilerin altı gün PRL ve IGFBP1 mRNA düzeyleri qRT-PCR ile decidualization (Şekil 2A) derecesini onaylamak için değerlendirildi. PRL ve IGFBP1 düzeyleri kontrol aracı ile tedavi HESC ile karşılaştırıldığında önemli ölçüde artar (p < 0.001). Decidualization ile ilişkili biyokimyasal değişiklikler ayrıca kodlamayla Orta (Şekil 2B) salgılanan PRL seviyeleri miktar üzerinden değerlendirildi. Transkript düzeyleri ile tutarlı, PRL düzeyleri yüksek olarak yükseltilmiş EPC denetime göre HESC kültürlü (p < 0.001).
Belirli bir gen ‹ptal HESCs decidualization hücresel ve moleküler değişiklikler üzerinde etkisi değerlendirildi SRC-2 aday gen (Şekil 3) kullanarak. Transfection denetimi veya SRC-2 siRNA ile 48 saatlik HESC kültürlü içinde EPC medya 6 gün. Denetim siRNA gösterdi HESC hücresel ve moleküler değişikliklerin tutarlı bir Arnavut kaldırımlı morfolojik değişiklik ve artan transkript düzeyleri decidualization işaretleri PRL ve IGFBP1de dahil olmak üzere uygun decidualization ile transfected. SRC-2 siRNA nakavt ile beklendiği gibi görünüm denetimi siRNA karşılaştırıldığında fibroblastic kaldı HESC HESC (Şekil 3A) transfected. Bu hücresel değişiklik ile tutarlı, PRL ve IGFBP1 transkript seviyeleri önemli ölçüde azalma SRC-2 siRNA içinde HESC, bir kazada decidualization programlama SRC-2 nakavt ile gösteren transfected (* **p < 0.001). SRC-2 transkript düzeyleri önemli ölçüde azalmıştır SRC-2 ' de siRNA bir verimli gen bizim yöntemiyle susturmak gösteren siRNA, kontrol etmek için zaman göre HESC transfected (***p < 0.001) (Şekil 3B).
Resim 1 : Sırasında insan endometrium stromal hücre hücresel değişiklikler vitro decidualization. HESCs izole ve araç veya E2, MPA ve kamp (EPC) içeren medya altı gün boyunca kültürlü. A) epithelioid hücrelere fibroblastic gelen hücresel morfoloji değişimler gösteren hücre görüntüler. B) Phalloidin burada mavi çekirdeği (DAPI) gösterir vitro decidualization ile ilişkili hücre iskeleti değişimler (yeşil) gösteren HESC görüntülerini lekeli. Kırmızı ok decidualized hücreleri temsil eder. Siyah oku fibroblastic hücreleri gösterir. Ölçek çubuğu: 100 µm. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Resim 2 : Moleküler değişiklikler sırasında insan endometrium stromal hücrelerdeki vitro decidualization. A) Toplam RNA içeren medyayı araç veya E2, MPA ve kamp (EPC) altı gün kültürlü HSECs yalıtılmış ve PRL ve IGFBP1 transkript düzeyleri algılamaya qRT-PCR analize tabi. B) Kültür Medya içine salgılanan PRL seviyeleri HESC altı gün boyunca EPC her iki araca kültürlü bir ELISA dayalı tahlil kullanarak ölçüldü. p < 0,05, ** p < 0,01, *** p < 0,001. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 3 : Nakavt SRC-2 insan endometrium stromal hücrelerdeki etkiler vitro decidualization. A) siRNA morfolojik değişiklikler kültür EPC medya ile 6 gündür takip HESC transfected (top panelleri: denetim siRNA zaman puan 0 gün ve gün 6, alt paneller: SRC-2 siRNA zaman puan 0 gün ve gün 6). B) SRC-2, PRLve IGFBP1 gün 0 ve EPC gün 6 transkript düzeyleri kontrol veya SRC-2 siRNA ile transfected HESC tedavi. Siyah oku decidualized hücreleri temsil eder. Beyaz ok fibroblastic hücreleri gösterir. Ölçek çubuğu: 200 µm. *** p < 0,001. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Kadın üreme adet döngüsü progesteron seviyeleri luteal faz boyunca böylece ESC decidualization yuvarlak, epitel benzeri salgı hücreleri3,8inducing bir artış ile karakterizedir. Decidualization inisiyasyon bağımlı türüdür. Fareler blastosist varlığı10,11gerektirir, ancak insanlarda decidualization progesteron konsantrasyon, yükselişi kendiliğinden oluşur. Decidualization bu tutarsızlık insan hücre hatlarında hücresel başkalaşım eğitim translasyonel yararları örneğidir. Birincil hücre kültürü ile in vitro deneyleri kez decidualization modülasyon hormonlar4,6,10keşfetmek için kullanılmaktadır. Ancak, bu yöntem sınırlamaları döngüsü aşaması ve gebelik geçmiş önemli değişimler olmadan insan dokusu büyük örneklem büyüklüğü obtainability üzerine oluşabilir. Yine de, sınırlamalar yeteri kadar önceden yeterli örnekleri garanti altına almak için çalışma ve adet döngüsü proliferatif faz (gün 9 - gün 12) zamanlama biyopsi planlama ile en aza indirilir sağlamak için önlemler alınabilir.
Bu çalışmada, HESC kültürlü ve yapay olarak ilk Brosens vd. açıklanan bir roman yöntemi ile decidualized 16 hangi hormonlar E2 ', P4 ve kamp 6 günlük kuluçka süresi boyunca kodlamayla orta eklenmiştir. Tipik olarak, alternatif yöntemler12, bir genişletilmiş 14 günlük kuluçka dönemi E2 ve MPA eklenmesi yapay decidualization için astarlanmalıdır14 hücre kültürleri. Kodlamayla medya kampa takviyesi sinerjik ESC decidualization bir kısaltılmış süre içinde aynı anda etkinleşmiş kamp duyarlı öğe organizatörü bölgeler (Örneğin, içeren gen ifade ederken güçlendirir 12,13 PRL ve IGFBP1). Bu yöntem, Kommagani vd. açıklanan protokol dayalı 10, tecrit optimizasyonu ve kültür HESC izin verir. Hücre kültür saflık stromal ve epitel hücre satırları ayırmak için bir 40 µm hücre süzgeç kullanarak optimize edildi. Ayrıca, Ficoll-Paque PLUS reaktif kan hücreleri örnekten kaldırılması üzerine saf stromal hücre uygun, yüksek verim yalıtım sağlamak için uygulandı. Bir ek Santrifüjü adım (30 dk 400 x g) kan hücreleri tam ortadan kaldırılması hücre popülasyondan sağlamak için dahil aşağıdaki Ficoll yanı sıra oldu. Son olarak, HESC canlılığı ve verim % 95'i confluency için decidualization kadar hücre kültürü çalışmalarının üzerine optimize. Özet olarak, aşağıdaki ek adımları uygun, yüksek verim HESC saf kültür sağlamıştır.
Decidualization derecesi qRT-PCR, ELISA ve phalloidin hücre iskeleti düzenlenmesi ve hallmark genlerin upregulation gözlemlemek için boyama değerlendirildi. QRT-PCR transkript düzeyleri decidualization işaretleri PRL ve IGFBP1 değerlendirildi. HESC decidualization, PRL ve IGFBP1 düzeyleri olarak önceki araştırma6' dan kurulan bir saat-bağımlı biçimde arttı. Salgılanan PRL düzeyleri saat-bağımlı artması da ELISA üzerinden HESC doku kültürü medya incelenerek teyit edildi. Ayrıca, stromal hücreler morfolojik değişiklikler decidual hücrelere aktin filamentleri yolu ile phalloidin ve nükleer işaret 4', 6-Diamidino-2-Phenylindole (DAPI)17costaining aracılığıyla görüntülenmiştir. Birlikte, bu deneysel sonuçlar HESC E2, MPA ve kamp takviyesi ile kültür etkinliğini doğruladı.
Bu iletişim kuralı gen belirli nakavt çalışma yeteneği de siRNA SRC-2karşı kullanan değerlendirildi. Morfolojik, SRC-2 HESC HESC epithelioid hücrelere decidualized denetim siRNA ile tedavi ise fibroblastic, kaldı transfected. SRC-2 devirme verimlilik transkript düzey arası değerlendirildi ve önemli ölçüde azalma, bizim iletişim kuralı ile belirli bir gen bir başarılı susturmak gösteren. Böylece, bizim Protokolü endometrium decidualization belirli gene(s) rolü operasyona bir ilgi ile bu araştırmacılar için yararlı bir kaynak olabilir.
Decidualization temel moleküler mekanizmaları anlamada gelişmeler yapılmış ise, bir önemli bilgi boşluğu özelliklerini temel devam eder. Yanlış decidualization implantasyon başarısızlığı ve sonraki erken embriyo düşük4,6,7,10kök nedeni olarak kurulmuştur. Bu nedenle, daha fazla keşif epigenetik faktörler ve karakterizasyonu moleküler yolları ile ilgili tanı ve tedavisi gebelik başarısızlık için gereklidir.
Sonuç olarak, bu çalışma sunulan Protokolü yalıtmak ve bir saf ve uygun hattı insan endometrium stromal hücre kültür için verimli bir yöntem oluşturur. Hormonlar E2, MPA ve kodlamayla medya kampa ilave olarak, yapay decidualization qRT-PCR, ELISA, doğruladı gibi indüklenen ve Phalloidin boyama. Ayrıca, bizim iletişim kuralı siRNA ve lipid tabanlı transfections kullanarak ilgi belirli bir gen verimli nakavt için gereken ayrıntılı adımları özetliyor. Özet olarak, bu yöntem HESC decidualization ile ilişkili temel hücresel ve moleküler mechanism(s) çalışma olanağı sunuyor.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Bu eser ulusal kurumları sağlık (NIH den) finansman tarafından desteklenen / Ulusal Enstitüsü Çocuk Sağlığı ve insan geliştirme (NICHD) hibe (R00 HD080742) ve Washington Üniversitesi Tıp Fakültesi start-up yazar için fon Washington Üniversitesi doğurganlık klinik endometrium biyopsi örnekleri sağlamak için teşekkür etmek istiyorum.
Acknowledgments
Yazarlar ifşa gerek yok.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Opti-MEM I (1X) Reduced Serum Medium | Gibco | 31985-070 | For decidualization media |
| DMEM / F12 (1:1) (1X) | Gibco | 11330-032 | |
| Trypan Blue Stain (0.4%) | Gibco | 15250-061 | For cell count |
| PureLink RNA Mini Kit | Invitrogen | 12183018A | For RNA Isolation/Purification |
| TaqMan 2X Universal PCR Master Mix | Applied Biosystems | 4304437 | |
| High Capacity cDNA Reverse Transcription Kit | Applied Biosystems | 4374967 | |
| Eukaryotic 18S rRNA Endogenous Control | Life Technologies | 4319413E | For qPCR internal control |
| TaqMan Gene Expression Assay Prolactin Probe | Applied Biosystems | 4331182 | For qPCR internal control |
| TaqMan Gene Expression Assay IGFBP1 Probe | Applied Biosystems | 4331182 | For qPCR internal control |
| Phalloidin-iFluor 488 Reagent - CytoPainter | Abcam | ab176753 | |
| Human Prolactin ELISA Kit | Invitrogen | EHIAPRL | |
| 16% Paraformaldehyde | Alfa Aesar | 30525-89-4 | Fixative |
| Lipofectamine RNAiMAX | Invitrogen | 13778150 | Transfection Reagent |
| ProLong Gold antifade reagent with DAPI | Invitrogen | P36935 | For mounting |
| 0.25% Trypsin-EDTA (1X) | Gibco | 25200-056 | |
| Penicillin Streptomycin | Gibco | 15140-122 | |
| Charcoal Stripped Fetal Bovine Serum | Sigma | F6765-500ML | |
| Sodium Bicarbonate (7.5%) | Gibco | 25080-094 | |
| Ficoll-Paque PLUS Reagent | Fisher Scientific | 45001749 | |
| Collagenase from Clostridium histolyticum | Sigma | C0130-1G | |
| Deoxyribonuclease I from bovine pancreas | Sigma | DN25-100MG | |
| Medroxyprogesterone 17-acetate | Sigma | M1629-1G | For EPC Media |
| Estradiol | Sigma | E1024-1G | For EPC Media |
| cAMP | Sigma | A6885-100MG | For EPC Media |
| Fine straight stitch scissors | Fine Science Tools | 15396-00 | |
| TaqMan Gene Expression Assay NCOA2 Probe | Applied Biosystems | 4351372 | |
| Fetal Bovine Serum, heat inactivated | Gibco | 10-082-147 | |
| Antibiotic-antimycotic | Thermo Scientific | 15240062 | |
| Hank’s Balanced Salt Solution | Corning | 21-021-cv | |
| 50 mL conical polypropylene Falcon tube | Corning | 352098 | |
| Dumont #5/45 Forceps | Fine Science Tools | 11251-35 | |
| 100 x 15 mm Glass Petri dish | VWR | 75845-546 | |
| 40 micron cell strainer | Midsci | 229481 | |
| Isotemp 215 Water bath | Fisher Scientific | FS-215 | |
| LSE Centrifuge | Corning | 6755 | |
| Human NCOA2 siRNA | Dharmacon | L-020159-00 | Gene specific qPCR probe |
| Steri-cycle i160 CO2 Incubator | Thermo Scientific | 51030301 | |
| NanoDrop 2000 | Thermo Scientific | ND-2000 | For RNA quantification |
| Phosphate Buffered Saline | Fisher Scientific | 50146771 | |
| 75 cm Canted Neck Cell Culture flask | Corning | 430641U | |
| 6 well Non-Pyrogenic Cell Culture Plate | Corning | 3506 | |
| Pipet Controller Ultra | Corning | 4099 | |
| Photoshop | Adobe | 19.0.1.334 | |
| 25 cm Canted Neck Cell Culture flask | Corning | 7200876 | |
| Triton X-100 | Sigma | X100-1L | |
| 15 mL conical polypropylene Falcon tube | Corning | 352099 | |
| 10 mL Syringe | BD | 302995 | |
| 1300 Series A2 Biological Safety Hood | Thermo Scientific | 1377 | |
| accuspin Micro17 centrifuge | Fisher Scientific | 13100675 | |
| 7500 Fast real time PCR system | Applied Biosystems | 3052632 | |
| EVOS FL Immunofluorescence Microscope | Life Technologies | 01414-155G-291 | |
| Leica Inverted Light Microscope | Leica | DMi1 | |
| Illrustrator | Adobe | 22.0.1.253 | |
| Excel Spreadsheets | Microsoft | 2016 | |
| Deckglaser 18 mm cover glasses | NeuVitro | GG-18 | |
| Reichert Bright-Line Hemacytometer | Sigma | Z359629-1EA | |
| 2-mercaptoethanol | Fisher Bioreagents | BP176-100 | For RNA lysis buffer |
| 1.2mL External Threaded Polypropylene Cryogenic Vial | Corning | 430658 | For freezing HESC cells |
| Dimethyl Sulfoxide (DMSO) | Sigma | D2650-100mL | For freezing media |
References
- Maruyama, T., Yoshimura, Y. Molecular and cellular mechanisms for differentiation and regeneration of the uterine endometrium. Endocrine Journal. 55, 795-810 (2008).
- Yu, J., et al. Endometrial Stromal Decidualization Responds Reversibly to Hormone Stimulation and Withdrawal. Endocrinology. 157, 2432-2446 (2016).
- Ahn, J. I., et al. cAMP-Response Element-Binding 3-Like Protein 1 (CREB3L1) is Required for Decidualization and its Expression is Decreased in Women with Endometriosis. Current Molecular Medicine. 16, 276-287 (2016).
- Gellersen, B., Brosens, J. J. Cyclic decidualization of the human endometrium in reproductive health and failure. Endocrine Reviews. 35, 851-905 (2014).
- Telgmann, R., Gellersen, B. Marker genes of decidualization: activation of the decidual prolactin gene. Human Reproduction Update. 4, 472-479 (1998).
- Camden, A. J., et al. Growth regulation by estrogen in breast cancer 1 (GREB1) is a novel progesterone-responsive gene required for human endometrial stromal decidualization. Molecular Human Reproduction. 23, 646-653 (2017).
- Kommagani, R., et al. The Promyelocytic Leukemia Zinc Finger Transcription Factor Is Critical for Human Endometrial Stromal Cell Decidualization. PLoS Genetics. 12, e1005937 (2016).
- Large, M. J., DeMayo, F. J. The regulation of embryo implantation and endometrial decidualization by progesterone receptor signaling. Molecular and Cellular Endocrinology. 358, 155-165 (2012).
- Zhang, X. H., et al. The mesenchymal-epithelial transition during in vitro decidualization. Reproductive Sciences. 20, 354-360 (2013).
- Kommagani, R., et al. Acceleration of the glycolytic flux by steroid receptor coactivator-2 is essential for endometrial decidualization. PLoS Genetics. 9, e1003900 (2013).
- Ramathal, C. Y., Bagchi, I. C., Taylor, R. N., Bagchi, M. K. Endometrial decidualization: of mice and men. Seminars in Reproductive Medicine. 28, 17-26 (2010).
- Tamura, I., et al. Novel Function of a Transcription Factor WT1 in Regulating Decidualization in Human Endometrial Stromal Cells and Its Molecular Mechanism. Endocrinology. 158, 3696-3707 (2017).
- Vinketova, K., Mourdjeva, M., Oreshkova, T. Human Decidual Stromal Cells as a Component of the Implantation Niche and a Modulator of Maternal Immunity. Journal of Pregnancy. , 8689436 (2016).
- Wu, D., et al. Chronic endometritis modifies decidualization in human endometrial stromal cells. Reproductive Biology and Endocrinology. 15, 16 (2017).
- Garcia-Elias, A., et al. Defining quantification methods and optimizing protocols for microarray hybridization of circulating microRNAs. Scientific Reports. 7, 7725 (2017).
- Brosens, J. J., et al. Human endometrial fibroblasts immortalized by simian virus 40 large T antigen differentiate in response to a decidualization stimulus. Endocrinology. 137, 2225-2231 (1996).
- Koukouritaki, S. B., Margioris, A. N., Gravanis, A., Hartig, R., Stournaras, C. Dexamethasone induces rapid actin assembly in human endometrial cells without affecting its synthesis. Journal of Cellular Biochemistry. 65, 492-500 (1997).
