Summary
כאן אנו מתארים שיטה כדי להפריד ולהעשיר את מרכיבי microenvironment המערכת החיסונית והחיסון של הגידול גידולים הוקמה תת עורית. טכניקה זו מאפשרת ניתוח נפרד של הגידול לחדור המערכת החיסונית ושברים -החיסון הגידול אשר יכולים להרשות אפיון מקיף של microenvironment מערכת החיסון הגידול.
Abstract
הגידול חסין microenvironment (זמן) לאחרונה הוכר כמתווך קריטי של תגובה לטיפול בגידולים מוצקים, במיוחד עבור immunotherapies. התפתחויות אחרונות קליניים חיסוני מדגישות את הצורך שיטות לשחזור לאפיין במדויק וביסודיות הגידול, שלה לחדור המערכת החיסונית המשויך. עיכול אנזימטי הגידול וניתוח cytometric זרימה מאפשרים אפיון רחבה של קבוצות משנה תא החיסון הרבות פנוטיפים; עם זאת, וניתוח מעמיק לעיתים קרובות מוגבל fluorophore הגבלות על לוח עיצוב את הצורך לרכוש דגימות הגידול גדול להתבונן אוכלוסיות החיסון נדירים של ריבית. לכן, פיתחנו שיטה תפוקה גבוהה ויעילה עבור הפרדת ומעשירה הגידול לחדור המערכת החיסונית של הרכיבים הלא-החיסון הגידול. הגידול שתואר לעיכול, הפרדה צנטריפוגלית המבוסס על צפיפות הטכניקה מאפשרת אפיון נפרדים של הגידול, הגידול לחדור המערכת החיסונית שברים המשמרת את הכדאיות הסלולר ואני לפיכך, מספק אפיון רחבה של הגידול מצב אוטואימונית. בשיטה זו נעשה שימוש כדי לאפיין את מקיף המרחבי המערכת החיסונית הטרוגניות בגידולים מוצקים, אשר בהמשך מדגים את הצורך טכניקות פרופיל אוטואימונית עקבי כל הגידול. בסך הכל, שיטה זו מספקת טכניקה יעילה וישימה עבור אפיון אוטואימונית תת עורית מאתר גידולים מוצקים; ככזה, כלי זה יכול לשמש כדי לאפיין טוב יותר את התכונות tumoral אוטואימונית, בהערכה פרה של הרומן אסטרטגיות immunotherapeutic.
Introduction
הזמן מדכאים לאחרונה הוכר סימן היכר של סרטן, וידוע לשחק תפקיד משמעותי התפתחות, התקדמות והגנה של גידולים מוצקים סרטן, כמו גם להמתיק את הרגישות חיסוני1. הזמן מורכב של מספר קבוצות משנה הסלולר של הפנוטיפים, אשר כולם לספק תובנות קריטי למדינה אוטואימונית של הגידול. אלה קבוצות משנה אוטואימונית יכול להיות מרובדת יותר לתוך תאים של לימפוציטים או מיאלואידית המוצא, אשר יחד מהווים את הרוב של תגובות חיסוניות מולדת, גמישים,2,3. ההתקדמות בתחום חיסוני סרטן הראו כי אסטרטגיות immunotherapeutic (קרי, מעכבי המערכת החיסונית במחסום, chimeric אנטיגן קולטן תאי-T, וכו ') יש פוטנציאל לגרום סרטן עמיד regressions; עם זאת, הם נשארים יעיל יחסית גידולים מוצקים-סרטן-4,-5. קבוצות רבות הראו המשוכה קריטי כי הזמן יכול לשחק על טיפול הצלחה6,7, לפיכך, נותר צורך להעריך במדויק את immunotherapies החדש בהגדרת קליניים במיוחד התמקדות שלהם היכולת לווסת או להתגבר על הזמן8.
המאמצים הנוכחיים כדי לאפיין את הזמן בדרך כלל לנצל או מיקרוסקופ או לזרום cytometry יחד עם נוגדן תיוג אסטרטגיות כדי לזהות קבוצות משנה התאית החיסונית שלהם תכונות9,10. אלה שתי אסטרטגיות לספק מידע שונים ייחודי, כמו מיקרוסקופ מאפשר הערכה המרחבי של קבוצות משנה הסלולר cytometry זרימה מספק תפוקה גבוהה, כימות רחבה של שינויים סלולריים. למרות השיפורים בפלורסנט אימונוהיסטוכימיה מולטיפלקס אופטימיזציה של מערכות הדמיה ספקטרלי, אשר כעת יכול לתמוך עד 7 פרמטרים, גודל לוח מוגבל מקשה רחבה רמת החיסון פרופיל, ובכך טכניקה זו היא לעתים קרובות שמורות יותר ממוקד ניתוחים. כתוצאה מכך, cytometry זרימה נשאר באחת החיסון הנפוצה ביותר. פרופילים טכניקות. למרות השימוש הנרחב שלה באפיון זמן, השיטות המשמש לעיבוד של צביעת הן משתנה מאוד. בדרך כלל פרוטוקולים לנצל את גידול בריא אנזים (קרי, collagenases, DNase, וכו) שיטות דיסוציאציה ידנית כדי להשיג את המתלים מתא בודד, ואחריו נוגדן מכתים וניתוח7. למרות היתרונות של כל אחת מהשיטות, קבוצות רבות הראו ההשתנות נרחב זה יכול להיגרם באמצעות טכניקות אלה11. זה עושה השוואות קרוס-מחקר של גידול microenvironment פרופיל קשה מאוד, גם כאשר הערכת המודל מאתר הגידול באותו. יתר על כן, שיטות אלה מספקים פוטנציאל מוגבל כדי להעריך את תאי הגידול, הגידול החיסון לחדור רכיבים באופן עצמאי, שכן שני הרכיבים הם וביניהם לאחר עיכול. כמות הדגימה מגביל ואז רב הפאנל מכתים וניתוח, אשר הופך להיות נושא מרכזי כאשר מנסים לאפיין קבוצות משנה אוטואימונית נדירה (קרי, הגידול הספציפי תאי-T)12. טכניקות מאוחרים יותר כגון cytometry המונית או cytometry מאת שעת הטיסה (CyTOF), מאפשרים ניתוח פנוטיפי גבוהה-ממדי הסלולר קבוצות משנה עם כמה מערכות תמיכה לוח עיצובים של יותר מ 42 פרמטרים עצמאיים13. למרות הכוח העצום של טכנולוגיה CyTOF פרופיל החיסונית, נותר מוגבל בשל ההוצאות, ניתוח מומחיות, גישה לציוד. בנוסף, פרוטוקולים CyTOF רבים ממליצים על טיהור של קבוצות משנה המערכת החיסונית כדי לשפר את יחס אות לרעש14, ועל כן אנו מציעים כי שיטת העשרה שלנו יכול לשמש הזרם של CyTOF ניתוח לשיפור איכות הנתונים.
במסמך זה אנו מתארים של גידול microenvironment לעיכול, ניתוח בשיטה המשלבת הגידול החיסון לחדור ההפרדה. מטרת שיטה זו היא לאפשר תפוקה גבוהה עצמאית פרופיל של הגידול לחדור המערכת החיסונית ואת הגידול שברים הסלולר עבור אפיון רחבה יותר של microenvironment הגידול. באמצעות שיטה זו, רחוק נדגים את החשיבות של ביצוע ניתוח כל הגידול, כמו דוגמנית גידולים מוצקים תת עורית נמצאה משמעותי הטרוגניות אוטואימונית מרחבית. בסך הכל, שיטה זו באפשרותך יותר מדויק ועקבי להשוות בין מדגמים כי זה מעשיר את מערכת החיסון התאית קבוצות משנה בתוך הגידול ומאפשר בניית פרופיל עצמאית של גידול תאים ושברים המערכת החיסונית של הגידול.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
כל השיטות המתוארות כאן אושרו על ידי טיפול בעלי חיים מוסדיים ועל שימוש הוועדה (IACUC) של ביילור לרפואה.
1. הגידול הקציר ועיכול
הערה: הזמן הדרוש הקציר הוא ~ 3-5 דקות/גידול, ואת הזמן הדרוש לעיבוד הוא ~ 1 h + 2-3 דקות/גידול.
- המתת חסד עכברים על ידי שאיפת פחמן דו-חמצני, לרסס כל העכבר למטה עם אתנול 70% לפני הקציר כדי למנוע זיהום שיער. בניתוח להסיר גידולים תת עורית של העכברים ולהבטיח כי הגידולים הם ללא כל רקמות מזהמים (קרי, שיער, עור, הצפק, וכו '). מקם כל הגידול 1.8 מ של מדיה RPMI-1640 הבסיס ללא סרום שור עוברית (FBS) לתוך צלחת 24-. טוב. לאסיפים גדול יותר, לשמור על צלחות קר על קרח כדי לשמר את הכדאיות הסלולר.
הערה: אם נדרשת עקרות, כל הגידול והניתוחים תצטרך להתבצע באבטחה ארון עם כלי ניתוח סטרילי (קרי, מספריים, מלקחיים, וכו '), וכן צעדים נוספים. גידולים בקוטר הארוך בין 0.5 - 1 ס מ אופטימלית, גידולים גדולים יותר או קטנים יותר ידרוש שינוי קנה מידה של ריאגנטים. - להשתמש במספריים לחתוך הגידולים בתוך פחות מ 1 מ"מ3 חתיכות בתוך כל טוב.
- הכינו 10 x קוקטייל לעיכול על ידי המסת collagenase אני ב- 10 מ"ג/מ"ל, collagenase הרביעי 2,500 U/mL, ו DNase. אני ב- U/mL 200 בתקשורת RPMI-1640 בסיס (ללא FBS).
הערה: קוקטייל העיכול ניתן להכין יום מראש, המאוחסנים ב-20 ° C; עם זאת, אחסון ממושך לא מומלץ כי אנזימים תאבד את הפעילות לאורך זמן פעם התפרקה. - להוסיף 200 µL של 10 x דיסוציאציה קוקטייל המכיל collagenase, collagenase הרביעי ואני DNase I כל טוב עם החלקים3 1 מ מ.
- לאפשר את הדגימות לעיכול עבור h 1 ב 37 מעלות צלזיוס תוך רועדת קלות במהירות של 60-100 סל ד באמצעות של שייקר צלחת מסלולית.
הערה: העלאת טמפרטורה ל- 37 ° C במהלך עיכול אנזימטי עלול לגרום להפעלת תא החיסון. - לאחר 1 h, לנטרל את התגובה על-ידי הוספת 1 מ"ל של התקשורת RPMI-1640 בתוספת EDTA FBS ו- 2 מ מ 5% על כל טוב.
- Pipette העיכול הגידול ואת החלקים הנותרים של הגידול לתוך מסננת תא 40 µm יושב על גבי שפופרת צנטרפוגה 50 מ.
הערה: חותכים את הטיפ ממני טיפ פיפטה 1 מ"ל להעברה קלה של עיכול הגידול כדי מסננת. - להשתמש מכנית disaggregate החלקים הגידול דרך מסננת פומפה מזרק 10 מ"ל. מעת לעת לשטוף את מסננת עם 2 מ"ל של התקשורת RPMI-1640 שהושלם (המכילה 5% FBS) וחזור עד מסננת התא היא ברורה של הגידול.
הערה: כ- 4-10 מ"ל של מדיה סה כ צריך להיות מספיק כדי שלמאחה לשטוף את מסננת של הגידול.
הערה: במקום דוגמאות על הקרח עד להשלמת שלב זה עבור כל הדגימות לשמר את הכדאיות הסלולר. - התאם כל שפופרת צנטריפוגה 50 מ ל אותו אמצעי אחסון באמצעות התקשורת RPMI-1640 שהושלם.
הערה: ההתאמה של אמצעי חיוני לאיזון צנטריפוגה. דילוג על שלב זה יכול לגרום נזק צנטריפוגה או פציעה אישית. - Centrifuge את המתלים תא (5 דקות, 805 x g, 4 ° C), למחוק את supernatants, וכן להשעות מחדש ב- 2 מ"ל של התקשורת RPMI-1640 שהושלם.
הערה: צבירה תא שעלול להיווצר בעקבות צנטריפוגה שקשה resuspend. שימוש בסיסמה פיפטה 5 מ"ל סרולוגית לערבב במהירות לשבור אותה. לפני שתמשיך.
2. הפרדה בין שברים התאית החיסונית ואת הגידול
הערה: הזמן הנדרש עבור שלב זה הוא כ 1 h.
- להוסיף 3 מ"ל של צפיפות בינונית מעבר הצבע התחתון של שפופרת צנטרפוגה 15 מ"ל. להכין, תווית מספיק צינורות עבור כל גידול.
- שכבת mL 2 של גידול התא השעיה על המדיום הדרגתיות צפיפות מאת pipetting לאט לאט במורד צינור כדי למנוע ערבוב של שתי השכבות.
- בזהירות המקום הצינורות בשכבות צנטריפוגה, ספין בשביל 20 דקות ב 805 x g, 20 ° C, עם בלי בלמים.
הערה: חשוב מאוד לוודא איזון נאות ולהבטיח כי בלי בלמים משמש במהלך צנטריפוגה. כל הפרעה של תהליך זה יביא שכבת ערבוב, התאוששות מלאה מדגם יהיה קשה. - להעביר בזהירות את הגידול שחדר ליקוציט (TIL) שכבה של השכבה העליונה מדיה לרכבת התחתית 15 mL החדש באמצעות פיפטה של העברת. למחוק את כל שאר צפיפות בינונית הדרגתיות, resuspend בגדר גידול בתחתית הצינורית ב 2 מ של RPMI-1640 שהושלם.
הערה: לאחר צנטריפוגה יהיו ארבע השכבות הגלויות מלמעלה למטה המקבילים בהתאמה: מדיה, הפדגוגי, צפיפות בינונית הדרגתיות, גידול התא גלולה. ראה איור 2א לקבלת דוגמה של הרבדים השונים. - Centrifuge TIL את שניהם, דגימות הגידול ב להפריד בין צינורות (5 דקות, g x 805, 4 ° C) ולמחוק את תגובת שיקוע.
- Resuspend המדגם TIL ב- 200 µL, בגדר גידול ב- 2 מ"ל של התקשורת RPMI-1640 שהושלם. לשמור על הקרח כדי לשמר את יכולת הקיום.
3. ציפוי ולא מכתים
הערה: הזמן הדרוש ציפוי הוא s 30/גידול; הזמן הנדרש עבור צביעת משטח הוא 1 h; הזמן הנדרש עבור צביעת תאיים הוא 40 דקות; הזמן הנדרש עבור ניתוח cytometry זרימה הוא 1 - 4 דקות/גידול.
- להכין וסופרת לוחית התווית 96-ובכן U-תחתון עבור כל החיסון צביעת לוח, צלחת נוספת עבור תא.
הערה: בדרך כלל, שלושה לוחות מוכנים סה כ: צלחת לוח ממוקדות לימפוציט צלחת מיאלואידית ממוקד לוח, צלחת ספירת תאים. - Aliquot המתלים תא בודד לתוך כל ההכתמה פאנל צלחות ונפח קבועים המשקולת ספירה.
הערה: הצלחת לספור משמש כדי לחשב את המספר הכולל של תאים יתווספו כל לוח מוכתמים, ובכך לאפשר מדויק של האוכלוסייה ספירת. Cytometer זרימה עם יכולות דיגום וניתוח volumetric צלחת 96-ובכן יכול לספק את מספר התאים לכל µL בכל מדגם, לכן, לחשב את מספר התאים שיתווספו כל לוח מכתימים. לוחות ספירת ניתן לרכוש למחרת לאחר קיבוע בין לילה ב 4 ° C, שטיפה עם FACs מאגר (buffered פוספט תמיסת מלח (PBS) עם 2% FBS), ו resuspending בנפח קבוע של מאגר FACs. - לשטוף את התאים פעמיים עם µL 200 תמיסת פוספט באגירה של Dulbecco (DPBS) עבור דגימה על-ידי צריך שתוציאו (5 דקות, 805 x g, 4 ° C) ומחיקת את תגובת שיקוע בין כל שטיפה להסרת כל FBS חינם.
- להוסיף 50 µL של גוש Fc, לערבב את הדגימות באמצעות פיפטה רב ערוצית ולאחר תקופת דגירה של 20 דקות ב 4 º C.
- להוסיף 50 µL של 2 x מרוכז נוגדן מיקוד חוץ-תאית, תערובת הכתם הכדאיות ניתן לתיקון, לערבב בעזרת פיפטה רב ערוצית ולאחר תקופת דגירה של 30 דקות בחושך RT או 4 ° C.
הערה: התנאים מכתימים המדויק הנוגדן תלויים להוראות היצרן. דילולים צביעת כל חייב להיות DPBS, עם אין FBS נוספה כדי למנוע הרוויה של לצבוע הכדאיות ניתן לתיקון. נא עיין טבלה של חומרים/ציוד דילולים אופטימלית של הפאנל מכתימים בשימוש כתב היד הזה. נוגדן ואת הכדאיות שניתן לתקן צביעת פתרון מוכן-ריכוז 2 x כדי לספק 1 הסופי x מכתים ריכוז ב 100 µL הנפח הכולל צביעת כאשר הוסיף את הבלוק Fc. - לשטוף את הדגימות פעמיים עם FACs מאגר מאת צריך שתוציאו (5 דקות, 805 x g, 4 ° C) ומחיקת את supernatants בין כל שטיפה.
- Resuspend ב µL 200 1 x פיקסציה/permeabilization פתרון, דגירה בין לילה ב 4 ° C מוגן מפני אור.
הערה: הניסוי ניתן להשהות למשך הלילה בנקודה זו: לשמור דגימות ב 4 ° C מוגן מפני אור. - למחרת, centrifuge הלוחות (5 דקות, 805 x g, 4 ° C) וזורקים את תגובת שיקוע.
- לשטוף פעם עם µL 200 1 x permeabilization מאגר, צנטריפוגה (5 דקות, g x 805, 4 ° C), ולמחוק את תגובת שיקוע.
- להוסיף 100 µL 1 x נוגדן תאיים מרוכז מכתימים ' בחלונית ' מוכן במאגר permeabilization 1 x, תקופת דגירה של 30 דקות בחושך RT או 4 ° C (זה תלוי המלצות מכתימים מהיצרן).
- שטיפה פעם עם 1 x permeabilization מאגר (5 דקות, 805 x g, 4 ° C), למחוק את תגובת שיקוע ולאחר שטיפה פעם שניה עם FACs מאגר (PBS עם 2% FBS).
- Resuspend את הדגימות ב µL 300 FACs מאגר (PBS עם 2% FBS), להעביר את הדגימות צינורות cytometry זרימה, ולבצע ניתוח cytometry זרימה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
התוצאות שלנו להפגין היתרון המשמעותי של TIL ההפרדה של רכיבים שאינם-החיסון הגידול, כפי שהוסבר בפרוטוקול. בנוסף, באמצעות השיטה המתוארת נדגים את הטרוגניות אוטואימונית משמעותית של גידולים מוצקים הוקמה.
בעיה משמעותית עם טכניקות רבות של דיסוציאציה הגידול הוא אובדן יכולת הקיום לדוגמה, לרוב כתוצאה תנאים קשים לעיכול (קרי, מוגבה טמפרטורות, אספקת מזונם לקוי, וכו '). שימוש בשיטת עיכול המתואר, עם או בלי צפיפות העשרה בינוני הדרגתיות, מספק כ 70-90% סה כ הכדאיות הסלולר כפי לאומדן cytometry זרימה (איור 1א'). Viabilities דומה נצפתה את TIL מועשר והעשירו הגידול שברים, רומז כי שיטה זו גורמת רעילות מינימלית הכללית (איור 1, איור 2C). יתר על כן, העשרת הדרגתיות בינוני צפיפות קידום גדול יותר 2-fold עלייה CD45 חיובי TIL שבר בין התאים קיימא הכולל מנותח digestions גידול בהשוואה שאינם מועשרים (איור 1ב, ג). בנוסף, נמצאה העשרה כדי לשפר רבות קבוצות משנה תא החיסון העריך נפוץ במחקרים microenvironment המערכת החיסונית, לרבות התאים מיאלואידית נגזר משתיק קול (MDSCs), תאים דנדריטים (Dc), מקרופאגים, תאי-T CD8 תאי-T CD4 ( איור 1D, E). זה מרמז כי העשרת הדרגתיות בינוני צפיפות מקדמת immunocyte גלובל enrichments ובידוד לא לימפוציט ספציפי או מיאלואידית אוכלוסיות (ראה את משלימה איור 1A, B עבור cytometry זרימה gating שיטה המשמשת לזיהוי אוכלוסיות תאים מסוים). ראוי לציין, כי רבים זמינים מסחרית צפיפות ההפרדה הדרגתיות מדיות לאפשר חלק קטן משמעותית אריתרוציטים גרנולוציטים לעבור שלב ההפרדה. לפיכך, אם אוכלוסיות אלה עניין, בהמשך פרוטוקול אופטימיזציה ייתכן שיהיה צורך.
איור 1 : העשרת עדין ויעיל של הגידול לחדור החיסון. גידולים מיר הוקמה היו טוחנות, מתעכל באמצעות השיטה המתוארת. בעקבות עיכול, תא בודד המתלים חולקו כך מחציתם עברו צפיפות בינונית העשרה הדרגתיות והשני שחצי ישירות היו מוכתמים. (א) תזרים מצטבר cytometry הערכת הכדאיות הסלולר עבור גידול digestions עם או בלי צפיפות בינונית העשרה הדרגתיות. Cytometry זרימה נציג gating חלקות מציג CD45 העשרה חיובי תא החיסון העיכול גידול יחיד עם וללא צפיפות בינונית העשרה מעבר צבע (B). (ג) תזרים מצטבר cytometry CD45 חיובי תא באחוזים בין התאים קיימא הכולל של גידול digestions עם או בלי צפיפות בינונית העשרה הדרגתיות. (ד) יחסי העשרה שונות מיאלואידית ואוכלוסיות לימפוציטים חיסוניים. גידולים היו מתעכל לתוך תא יחיד התלוי לפני להיות מוכתם ישירות או שעברו צפיפות העשרה מעבר צבע לפני צביעת לזרום cytometry וניתוח. יחס העשרה כל סוג התא מחושב על ידי חלוקת אחוזים תא נתון-האוכלוסייה (בין התאים קיימא הכולל מוערך) של צפיפות הגידול מועשר הדרגתיות העיכול על ידי המקביל שאינם מועשרים. בר קווים מייצג החציון ו הקצוות של הבר מייצג את יחס מינימום ומקסימום. שולחן (E) של מערכת החיסון התאית סמן ביטוי המשמש לזיהוי כל אוכלוסיית תאים חיסוניים מנותח. מובהקות סטטיסטית נקבע מבחן t אינטראקצית או מבחן מאן ויטני. p < 0.05, * *p < 0.01, * * *p < 0.001, * * *p < 0.0001, (n = 20 גידולים, N = 2 עבור כל גרפים). אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
אחד היתרונות המשמעותיים ביותר המספק בשיטה זו היא היכולת לעשות באופן עצמאי פרופיל השבר-החיסון הגידול. לאחר בידוד של השבר מגורען הגידול הלא-החיסון עוברת דרך שלב מעבר צבע צפיפות בינונית, הגידול מורכב פרופיל לוחות יכול להתבצע אשר בעבר עשוי להיות מוגבל לפי מספר fluorophore והמגבלות כמות הדגימה. איור 2 א מראה דוגמה של אפיון cytometry זרימה הגידול עם למעלה מ-70% הכדאיות והעשרה תא השלילי 99% CD45. השבר CD45 שלילי יכול אז שיהיה עליי פרופיל עבור תכונות רבות הגידול כגון הכדאיות הגידול הכללי או אפופטוזיס (קרי, קספאז 3, annexin V, וכו '), יכולת התפשטות (קרי, Ki67) הביטוי שונים סמני לדיכוי המערכת החיסונית (קרי, מתוכנת מוות-ליגנד 1 (PD-L1) או PD-L2). יודגש עם זאת, כי השבר שלילי CD45 כוללת הן תאים סרטניים, כמו גם אלמנטים אחרים סטרומה ואת כלי הדם של microenvironment הגידול. לפיכך, אם נדרש גידול ישיר תא אפיון, סמן ספציפי של תאי הגידול היה צריך להיות בשימוש (קרי, cytokeratin, אנטיגן ספציפי סרטניים הקשורים, וכו '). באופן דומה, רכיבים סטרומה אחרים הגידול יכול להיות בקלות לזהות, מאופיין לאחר תיוג עם סמן סוג התא ספציפיים כגון גידול תאי אנדותל כלי הדם (CD31) סרטן הקשורים fibroblasts (שריר α-חלק אקטין). בכל זאת, רמת הכדאיות והעשרה התא שלילי CD45 היא מאוד עקבי מדגמים חוזרות ונשנות, המציין את היציבות של טכניקת ההפרדה הדרגתיות צפיפות הגידול הלא-החיסון רכיב העשרה (איור 2B, C ).
איור 2 : העשרה והגדרת פרופיל התכונות רכיב שאינו-החיסון הגידול. (א) תמונת הנציגה של מדגם בעקבות מעבר צבע צפיפות בינונית העשרה בשכבת המדיה גלוי (ורוד), עד שכבה (דק לבן עכור), צפיפות צבע בינוני שכבה (ברור), הגידול צניפה בתחתית הצינורית. (B) cytometry זרימה נציג gating אסטרטגיה המשמשת עבור פרופיל הרכיב הלא-החיסון הגידול, עם תא הכדאיות פיזור מגרש (למעלה), CD45 תא שלילי העשרה פיזור מגרש (משמאל למטה), שלושה סמנים עצמאית עניין ביטוי דרך חלקות היסטוגרמה (PD-L1, PD-L2 התיכון, ובתחתיתו Ki67). FMO היסטוגרמה מייצגת מדגם צבעונית עם כל שאר לוח הצבעים אבל חסר דה מרקר עניין. תזרים מצטבר cytometry ובחינת הכדאיות הסלולר (C) ואחוזים (D) CD45 תא שלילי בין התאים קיימא הכולל של השבר צניפה הגידול בעקבות צפיפות בינונית העשרה מעבר צבע (n = 7-8 גידולים). אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
למרות מאמצים משמעותיים על מנת לאפיין את הטרוגניות גנטית של גידולים מוצקים, עבודה מפורט של הטרוגניות המרחבי של קבוצות משנה אוטואימונית בגידולים מוצקים. אנחנו ובכך שמטרתה לקבוע איך מיאלואידית ו לימפוציטים אוטואימונית קבוצות משנה באופן דרסטי מגוונות לאורך כל גידול מוצק אחד. לפיכך, גידול מיר הוקמה היה מחולק לארבעה חלקים שווים עם טיפול מיוחד כדי להבטיח שכל מקטע הכיל כ שווה אזורים אינטרה-tumoral, כמו גם חלקים שווים עורי של הצפק-הפונה (איור 3א). כל חתיכה הגידול היה מתעכל בנפרד, ואז מועשר על ידי צפיפות בינונית הדרגתיות, לפצל בין לוח מיאלואידית ו לימפוציטים. זו אפשרה כימות של תכונות שונות כולל מספר אוכלוסיות immunocyte בדרך כלל הערכה: תאי T, תאי CD4 + T, תאי CD8 + T, מקרופאגים, DCs, MDSCs (ראה איור משלים 1A, B עבור cytometry זרימה gating אסטרטגיה). בתוך גידול יחיד, השתנות בתא משמעותיים בין המחיצות גידול שונים הייתה ראוה (איור 3ב'). לדוגמה, DC ו- T cell סך תא ספירת נמצאו בהתאם ככל 4 כדי 5 פי בקרב חלקים הגידול סמוכים. שינויים דרסטיים אלה נרשמו גם כאשר ניתוח תא אוכלוסיות כאחוז של התאים קיימא הכולל (איור משלים 2A), נצפו רמות דומות שני גידולים עצמאיים אחרים (איור משלים 2B, C). נתונים אלה להדגים את חשיבותה של בידוד וניתוח הגידול כולו בעת ביצוע ניתוחים microenvironment המערכת החיסונית, אשר אולי נראה שלא נראית מציאותית אם פרוטוקולים הנוכחי כולל חלוקת הגידול כדי לאפשר ניתוח משלימים מאת עצמאית שיטות (קרי, היסטולוגיה, כימות RNA, וכו '). בנוסף, נתונים אלה עשוי להסביר סתירות ניתוחים אוטואימונית של הגידול ביופסיות, כפי intratumoral אזוריים הטרוגניות אוטואימונית באופן דרסטי יכול להטות את תוצאות הביופסיה.
איור 3 : הערכה של הגידול הוקמה מערכת החיסון הטרוגניות. (א) תמונת הנציגה של גידול מיר הוקמה בעקבות כריתה כירורגית (משמאל) ואחרי החלוקה השווה לתוך סמוכים 4 חלקים (מימין). סולם בר הוא 1 ס מ, המוצג בשחור, על כל תמונה. (B) הקיפול שינויים שונים מיאלואידית וסופרת תא לימפוציט בין כל החלקים הסמוכים הגידול 4; כל מקטע הגידול עבר את אותה מערכת העיכול, בהליך הדרגתי העשרה בינוני צפיפות, מכתים, וניתוח. כל חלק הגידול מוצג שינוי קיפול ספירת תאים, כפי שנקבע על-ידי חלוקת ספירת התאים שלו על ידי החלק הגידול הנמוך ביותר שנותחה. ספירת עבור אוכלוסיה תא נתון. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
משלימה איור 1: cytometry זרימה נציג gating אסטרטגיה המשמשת עבור גידול המרכיב פרופיל. (א) Gating אסטרטגיה עם חלקות פיזור המתאימים לשימוש לימפוציטים חיסוניים פרופיל. (B) Gating אסטרטגיה עם פיזור המתאימים חלקות משמש גידול תאים מיאלואידים המערכת החיסונית פרופיל. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
משלימה איור 2: הערכה נוספת של הגידול הוקמה הטרוגניות. אחוז התאית (A) בין התאים קיימא סך הקיפול שינוי מהגידול שווה 4 חלקים המוצגת באיור 3. (B) ו- (ג) הם שני גידולים נוספים מיר הוקמה נחלק לארבעה חלקים סמוכים וניתח עבור גידול הטרוגניות המערכת החיסונית. תא ספירת הקיפול שינויים (משמאל) ואחוזי תא בין התאים קיימא הכולל מקפלים שינויים (מימין) עבור כל אחד מיאלואידית וניתח אוכלוסיית תאים לימפוציטים מציג ההשתנות של אחד החלקים הסמוכים הגידול 4. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
הזמן מורכב מרכיבי התא מגוונות ומורכבות ומולקולות. ממצאים אחרונים מעידים כי אפיון מדויק של סביבה זו יכולה לספק הבנה טובה יותר של הטיפול הצלחה או כישלון, יכול אפילו לעזור לזהות את מנגנוני ההתנגדות טיפולית. לדוגמה, הגדלת רמות intratumoral של תאים שונים לדיכוי המערכת החיסונית (קרי, MDSCs, תאי T רגולטוריים, וכו ') ניתן להמתיק את תגובות מערכת החיסון אפקטור, ביטל תופעות immunotherapeutic. מצד שני, נוכחות intratumoral הגוברת של אפקטור אוכלוסיות מערכת החיסון (למשל, גידול ספציפי CD8 + T תאים, תאים רוצח טבעי, תאי T helper) יכולים להיות גורמים מנבאים חזקים להצלחת הטיפול. אפיון נוסף שממשיך לייצג במדויק את מצב אוטואימונית הגידול הוא התכונות פנוטיפי של תאי הגידול עצמם. זה כולל את הביטוי של ליגנדים לדיכוי המערכת החיסונית, אנזימים שונים או מולקולות מכוון downregulating אפקטור תגובות מערכת החיסון (קרי, PD-L1, PD-L2, dioxygenase indolamine 2, 3, תחמוצת החנקן, וכו '). יחדיו, מדגים את הצורך אפיון מדויק ורחב מהתכונות התאית החיסונית והן הגידול של גידולים מוצקים.
הטכניקה שנתאר במסמך זה מאפשר הפרדה והעשרה של החיסון והן הגידול רכיבים תא של גידולים מוצקים מאתר תת עורית. לאחר מכן, זרימה עצמאית cytometric פרופיל ניתן לבצע כך במשרה מלאה ואת האינטראקציה של תאים סרטניים עם הזמן ניתן להערכה. בעקבות העשרה, לוחות cytometry זרימה נרחב מערכת החיסון ניתן למטב כדי לאפשר אפיון של רכיבי הסלולר מפתח מיאלואידית, הלימפה, כמו גם מגוון רחב של תכונות המתארות את מעמדם פנוטיפי. באופן דומה, גידול נרחב תא ממוקד לוח יכול לשמש באופן עצמאי כדי לספק אפיון רחבה של תכונות תא הגידול גם כן. הפשטות היחסית של טכניקה זו מאפשרת ניתוח בו זמנית של מספר רב של גידולים מאתר, אשר הוא קריטי עבור התבוננות מגמות למרות ההשתנות וחיסונים של מודלים מאתר הגידול. בנוסף, העשרת מערכת החיסון הגידול מספק זיהוי טוב יותר נדיר אוטואימונית קבוצות משנה (קרי, הגידול הספציפי T ציטוטוקסיים), אשר לעיתים קרובות באופן משמעותי הן מיעוט בתוך הגידול לעומת רכיבים אחרים שאינם-החיסון תא . אופטימיזציה של טכניקה זו תוכל לאפשר ניתוחים במורד הזרם נוספים על אלה קבוצות משנה מבודד אשר דורשים העשרה, כגון coculture ex-vivo מבחני, mRNA פרופיל, או מחקרים העברה לתא המאמצת.
בעזרת טכניקה זו במודל של הגידול מאתר תת עורית, נדגים את העשרת משמעותית של קבוצות משנה המערכת החיסונית העולמית ועצמאית. אנחנו גם להוכיח את הגידול-החיסון פרופיל אשר יכולה להיות מושגת בין דגימות הגידול באותו. לבסוף, אנו מראים את החשיבות של כל הגידול פרופיל אוטואימונית, כפי הבחנו משמעותי הטרוגניות אוטואימונית מקטעים סמוכים של הגידול. באופן אידיאלי, טכניקה זו של collagenase והעיכול מבוססות-DNase והפרדה מבוססי הדרגתי של שברים מחוסן והחיסון הגידול יכול להיות מיושם עבור רוב הגידול מאתר מודלים, שני orthotopic ו התת-עורית. גם הבחנו כי גידולים קטנים שאינם ומודלים הגידול קולגן צפוף פחות (קרי, B16 מלנומה) לעיתים קרובות אינם דורשים צעד עיכול אנזימטי ליצירת תא בודד המתלים15; לעומת זאת, מבוסס צבע העשרה המערכת החיסונית מבצע באותה מידה כמו גם במודלים אלה הגידול, בהמשך אימות צדדיות שלה. למרות חששות קודמים לגבי collagenase אנטיגן לעיכול התאית הנדונים11, יש לנו עדיין להתבונן לאובדן הבולטים של צביעת איכות עבור כל סמני את זה יש הרכבנו. למרות זאת, אנטיגן רגישות לתנאי עיכול אלה וצריך להעריך באמצעות שליטה שאינו מתעכל דגימות לפני אימוץ רחב של טכניקה זו.
לסיכום, הטכניקה שלנו מאפשרת אפיון מדויק רחבה, תפוקה גבוהה מרכיבי גידול מחוסן והחיסון מאתר גידולים מוצקים. על ידי ביצוע בניית פרופיל עצמאית של קבוצות משנה אלה, חוקרים יכולים בהרחבה לאפיין את הזמן ולהשיג יותר מכניסטית תובנה טיפולים פרה גידולים מוצקים. בשיטה זו ניתן להחיל בקלות את הרוב המכריע של הגידול מאתר מודלים לניתוח תפוקה גבוהה של לימפוציטים, ספירות אוכלוסייה immunocyte מיאלואידית פנוטיפים ויה cytometry זרימה או מבחני במורד הזרם אחרים הדורשים משנה העשרה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
המחברים אין לחשוף.
Acknowledgments
JMN מאשר תמיכה כספית מ הלאומית המכון של כללי למדעי הרפואה (T32GM088129), נבחרת המכון של שיניים ותחקיר ואסטתיים (F31DE026682) של מכוני הבריאות הלאומיים. התוכן הוא אך ורק באחריות המחברים, ואינם מייצגים בהכרח את הנופים הרשמי של מכוני הבריאות הלאומיים. פרויקט זה גם נתמך על ידי Cytometry התא מיון הליבה ביילור לרפואה במימון NIH (P30 AI036211 P30 CA125123, S10 RR024574) ואת הסיוע מומחה של ג'ואל מ Sederstrom.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 6 to 12 week old male C57BL/6 mice | Jackson Laboratory | N/A | Mice used in our tumor studies |
| MEER Murine Syngeneic Cancer Cell line | Acquired from collaborator | N/A | E6/E7 HPV antigen expressing murine tonsillar epithelial cancer cell line |
| 70% isopropyl alcohol | EMD Milipore | PX1840 | |
| Murine surgical tool kit | World Precision Instruments | MOUSEKIT | Primarily only need scissors, tweezers, and a scalpel. |
| 24-well plate | Denville Scientific Inc. | T1024 | Or any 24-well flat bottom plate. |
| RPMI-1640 media | Sigma-Aldrich | R0883 | |
| Collagenase I | EMD Milipore | 234153 | |
| Collagenase IV | Worthington Biochemical Corporation | LS004189 | |
| DNase I | Sigma-Aldrich | 11284932001 | |
| Low Speed Orbital Shaker | BioExpress (supplier: Genemate) | S-3200-LS | Or any orbital shaker. |
| Thermoregulating incubator | Fisher Scientific | 13-255-27 | Or any other thermo-regulated incubator |
| FBS | Sigma-Aldrich | F8192 | |
| EDTA | AMRESCO | E177 | |
| 1 mL Pipette and tips | Eppendorf | 13-690-032 | Or any other pipette and tips |
| 40 um Cell Strainers | Fisher Scientific | 22363547 | |
| 50 mL Centrifuge Tubes | Denville Scientific Inc. | C1062-P | |
| 15 mL Conical Tubes | Denville Scientific Inc. | C1012 | |
| 10 mL Luer-Lok Syringe without needles | BD | 309604 | |
| Lymphoprep Density Gradient Medium | STEMCELL Technologies | 7811 | |
| Transfer Pipettes | Denville Scientific Inc. | P7212 | |
| 96-well U-bottom plates | Denville Scientific Inc. | ||
| DPBS | Sigma Aldrich | D8573 | |
| FoxP3 Transcription Factor Staining Buffer Set | ThermoFisher Scientific | 00-5523-00 | Fix/Permeabilization Buffer and Permeabilization Buffer |
| Thermoregulated Centrifuge | Eppendorf | 5810 R | |
| Attune NxT Flow Cytometer | ThermoFisher Scientific | N/A | For 96-well cell volumetric counting |
| Purified Rat Anti-Mouse CD16/CD32 (Mouse BD Fc Block) Clone 2.4G2 | ThermoFisher Scientific | 553141 | Fc Block |
| LIVE/DEAD Fixable Blue Dead Cell Stain Kit, for UV excitation | ThermoFisher Scientific | L34962 | Fixable viability stain |
| CD45 Monoclonal Antibody (30-F11), APC-eFluor 780 | ThermoFisher Scientific | 47-0451-80 | |
| TCR beta Monoclonal Antibody (H57-597), APC | ThermoFisher Scientific | 17-5961-82 | |
| CD8-α Antibody (KT15), PE | Santa Cruz Biotechnology | sc-53473 | |
| CD4 Monoclonal Antibody (GK1.5), PE-Cyanine5 | ThermoFisher Scientific | 15-0041-81 | |
| MHC Class II (I-A/I-E) Monoclonal Antibody (M5/114.15.2), Alexa Fluor 700 | ThermoFisher Scientific | 56-5321-82 | |
| CD11c Monoclonal Antibody (N418), PE-Cyanine5 | ThermoFisher Scientific | 15-0114-82 | |
| F4/80 Monoclonal Antibody (BM8), eFluor 450 | ThermoFisher Scientific | 48-4801-80 | |
| CD11b Monoclonal Antibody (M1/70), APC | ThermoFisher Scientific | 17-0112-81 | |
| Ly-6G (Gr-1) Monoclonal Antibody (RB6-8C5), PE | ThermoFisher Scientific | 12-5931-82 | |
| CD274 (PD-L1, B7-H1) Monoclonal Antibody (MIH5), PE-Cyanine7 | ThermoFisher Scientific | 25-5982-80 | |
| CD273 (B7-DC) Monoclonal Antibody (122), PerCP-eFluor 710 | ThermoFisher Scientific | 46-9972-82 | |
| Ki-67 Monoclonal Antibody (B56), BV711 | BD Biosciences | 563755 |
References
- Fouad, Y. A., Aanei, C. Revisiting the hallmarks of cancer. American Journal of Cancer Research. 7 (5), 1016-1036 (2017).
- Gajewski, T. F., Schreiber, H., Fu, Y. -X. Innate and adaptive immune cells in the tumor microenvironment. Nature Immunology. 14 (10), 1014-1022 (2013).
- Whiteside, T. L. The tumor microenvironment and its role in promoting tumor growth. Oncogene. 27 (45), 5904-5912 (2008).
- Chiou, V. L., Burotto, M. Pseudoprogression and Immune-Related Response in Solid Tumors. Journal of Clinical Oncology. 33 (31), 3541-3543 (2015).
- Menon, S., Shin, S., Dy, G. Advances in Cancer Immunotherapy in Solid Tumors. Cancers. 8 (12), 106 (2016).
- Denkert, C., et al. Tumor-Associated Lymphocytes As an Independent Predictor of Response to Neoadjuvant Chemotherapy in Breast Cancer. Journal of Clinical Oncology. 28 (1), 105-113 (2010).
- Lee, Y., et al. Therapeutic effects of ablative radiation on local tumor require CD8+ T cells: changing strategies for cancer treatment. Blood. 114 (3), 589-595 (2009).
- Stakheyeva, M., et al. Role of the immune component of tumor microenvironment in the efficiency of cancer treatment: perspectives for the personalized therapy. Current Pharmaceutical Design. 23, (2017).
- Gerner, M. Y., Kastenmuller, W., Ifrim, I., Kabat, J., Germain, R. N. Histo-Cytometry: A Method for Highly Multiplex Quantitative Tissue Imaging Analysis Applied to Dendritic Cell Subset Microanatomy in Lymph Nodes. Immunity. 37 (2), 364-376 (2012).
- Bayne, L. J., Vonderheide, R. H. Multicolor Flow Cytometric Analysis of Immune Cell Subsets in Tumor-Bearing Mice. Cold Spring Harbor Protocols. 2013 (10), (2013).
- Goodyear, A. W., Kumar, A., Dow, S., Ryan, E. P. Optimization of murine small intestine leukocyte isolation for global immune phenotype analysis. Journal of Immunological Methods. 405, 97-108 (2014).
- Casadevall, A., Fang, F. C. Rigorous Science: A How-To Guide. mBio. 7 (6), 01902-01916 (2016).
- Yao, Y., et al. CyTOF supports efficient detection of immune cell subsets from small samples. Journal of Immunological Methods. 415, 1-5 (2014).
- Kay, A. W., Strauss-Albee, D. M., Blish, C. A. Application of Mass Cytometry (CyTOF) for Functional and Phenotypic Analysis of Natural Killer Cells. Methods Mol. Biol. 1441, 13-26 (2016).
- Pachynski, R. K., Scholz, A., Monnier, J., Butcher, E. C., Zabel, B. A. Evaluation of Tumor-infiltrating Leukocyte Subsets in a Subcutaneous Tumor Model. Journal of Visualized Experiments. (98), (2015).
