Summary
여기 우리가 설립된 피하 종양에서 종양 면역 및 비 면역 microenvironment의 구성 요소를 풍부 하 게 분리 하는 방법을 설명 합니다. 이 기술은 종양 면역 침투 및 비 면역 종양 분수는 종양 면역 microenvironment의 포괄적인 특성화를 허용할 수 있는 별도 분석에 대 한 수 있습니다.
Abstract
종양 면역 microenvironment (시간) 최근 특히 immunotherapies에 대 한 단단한 종양에서 치료 응답의 중요 한 중재자로 인정 받고 있습니다. 최근 임상 발전 immunotherapy 정확 하 고 철저 하 게 종양 및 그 관련된 면역 침투 특성 재현 방법에 대 한 필요성을 강조 표시 합니다. 종양 효소 소화 및 흐름 cytometric 분석 허용 광범위 한 특성 수많은 면역 세포 하위 집합 및 고기; 그러나, 분석의 깊이 종종 fluorophore 제한 패널 설계 및 큰 종양 샘플을 확보 하는 필요의 희귀 면역 인구를 관찰에 의해 제한 됩니다. 따라서, 우리는 분리 및 농축 비 면역 종양 구성 요소에서 종양 면역 침투에 대 한 효과적이 고 높은 처리량 방법을 개발 했습니다. 설명된 종양 소화와 밀도 기반 원심 분리 기술은 종양 및 종양에 대 한 별도 특성 면역 침투 분수 및 세포 생존을 유지 있으며 따라서 종양의 광범위 한 특성을 제공 합니다 면 역학적 상태입니다. 이 방법은 하는 광범위 한 공간 면역이 단단한 종양에서 더 일관 된 전체 종양 면역학 프로 파일링 기법에 대 한 필요성을 보여주는 사용 되었다. 이 방법은 피하 고체 murine 종양; 면 역학적 특성에 대 한 효과적이 고 융통성 있는 기법을 제공 하는 전반적으로, 이 도구를 사용 하 수 있다 더 나은 종양 면역학 기능을 특성화 하는 등, 소설 immunotherapeutic 전략의 전 임상 평가.
Introduction
진압 시간 최근 암의 각 인으로 인정을 받고 있다 그리고 immunotherapy1그들의 민감성을 완화 뿐만 아니라 개발, 진행, 그리고 고체 종양 암의 보호에 중요 한 역할을 알려져 있습니다. 에 수많은 세포 하위 집합 및 고기, 종양의 면 역학적 상태에 중요 한 통찰력을 제공 하는 모두는 구성 됩니다. 이러한 면 역학적 하위 집합 추가 함께 타고 난 및 적응형 면역 반응2,3의 대다수를 구성 하는 림프 구 또는 골수성 근원의 세포로 층 화 될 수 있다. Immunotherapeutic 전략 (즉, 검사점 면역 억제제, 공상 항 원 수용 체 T-세포, 등) 튼튼한 암 유발 가능성이 있는 암 immunotherapy 분야의 최근 발전 증명 재발; 그러나, 그들은 상대적으로 단단한 종양 암4,5에서 효과 유지. 수많은 그룹 시간 치료 성공6,7을 재생할 수 및 따라서, 거기에 특별히 초점을 맞추고 전 임상 설정에서 새로운 immunotherapies 정확 하 게 평가할 필요가 남아 있다 중요 한 장애물이 나타났습니다 그들의 변조 또는8시간 극복 하는 능력.
일반적으로 시간을 특성화 하기 위해 현재 노력 중 현미경 활용 또는 항 체 면역 세포 하위 집합 및 그들의 기능9,10식별 하는 전략을 라벨 함께 cytometry 흐름. 이 두 가지 전략 현미경 세포 하위 집합의 공간 감사 있으며 cytometry 제공 높은 처리량 및 세포 변화의 광범위 한 정량화 고유 하 게 서로 다른 정보를 제공 합니다. 형광 성 다중 immunohistochemistry 지금 최대 7 매개 변수를 지원할 수, 스펙트럼 이미징 시스템 최적화에 최근 개선에도 불구 하 고 제한 된 패널 크기 어려운 광범위 한 레벨 프로 파일링 면역 이며 따라서이 기술을 자주 자세한 예약 집중 분석. 결과적으로, cytometry는 가장 널리 사용 되는 면역 프로 파일링 기법 중 하나 남아 있다. 시간 특성에 그것의 광범위 한 사용, 처리 및 얼룩을 위해 사용 되는 방법을 매우 변수는 있습니다. 가장 자주 프로토콜 활용 종양 효소 해리 (즉, collagenases, DNase, 등) 및 수동 분리 방법은 단일 셀 정지를 달성 하기 위해 다음 항 체 얼룩이 지 고 분석7. 각 방법의 장점에도 불구 하 고 수많은 그룹11이러한 기법 통해 유도 될 수 있는 광범위 한 다양성을 보여주었다. 이것은 종양 microenvironment 프로 파일링의 크로스-연구 비교 매우 어려운 동일한 murine 종양 모델을 평가 하는 경우에 합니다. 또한, 종양 세포를 평가 하기 위해 제한 된 잠재력을 제공 하는 이러한 메서드 및 종양 면역 침투 하지 구성 요소 독립적으로, 때문에 두 구성 요소는 소화 후 산재. 샘플 수량 다음 제한 멀티 패널 얼룩 및 분석, 희귀 면역학 하위 집합 특성 하려고 할 때 주요 문제 되는 (즉, 종양 관련 T-세포)12. 대량 cytometry cytometry (CyTOF), 비행 시간 등 최근 기술 42 독립적인 매개 변수13보다 큰 패널 디자인을 지 원하는 일부 시스템 셀룰러 하위 집합의 차원 높은 phenotypic 분석 허용. CyTOF 기술에 면역 프로 파일링의 엄청난 힘에도 불구 하 고 그것은 비용, 분석 전문 및 장비에 대 한 액세스 제한 된 남아 있습니다. 또한, 많은 CyTOF 프로토콜 추천14, 신호 대 잡음 비율 개선 하기 위해 면역 하위 집합의 정화 그리고 따라서 좋습니다 우리의 농축 메서드를 사용할 수는 업스트림 데이터 품질 향상을 위한 CyTOF 분석의.
여기 우리가 종양 microenvironment 소화 및 분석 분리를 침투 하는 종양 면역을 통합 하는 방법을 설명 합니다. 이 방법의 목적은 종양 면역 침투 및 종양 microenvironment의 광범위 한 특성 분석을 위한 종양 세포 분수의 독립적인 높은 처리량 프로 파일링 수 있도록. 이 방법을 사용 하 여, 더 설명 전체 종양 분석의 중요성으로 피하 고체 종양 모델은 중요 한 공간 면역학이 발견 합니다. 전반적으로,이 방법은 더 정확 하 고 일관 되 게 비교할 수 샘플 사이의 종양 내에서 면역 세포 하위 집합에 대 한 풍요롭게 종양 세포와 종양의 면역 분수의 독립적인 프로 파일링을 허용 하기 때문에.
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Protocol
여기에 설명 된 모든 메서드는 기관 동물 관리 및 사용 위원회 (IACUC)의 베일 러 대학의과 대학에 의해 승인 되었습니다.
1. 종양 수확 및 소화
참고: 수확에 필요한 시간은 3-5 분/종양, 및 처리에 필요한 시간 1 ~ h + 2-3 분/종양.
- 이산화탄소 흡입 하 여 마우스를 안락사와 머리 오염을 방지 하기 위해 수확 하기 전에 70% 에탄올과 아래로 각 마우스 스프레이. 수술로 쥐에서 피하 종양을 제거 하 고 종양 어떤 오염 조직 (즉, 머리, 피부, 복 막, 등)의 무료 인지 확인. 각 종양 태아 둔감 한 혈 청 (FBS) 24-잘 접시에서 없이 기본 RPMI 1640 미디어의 1.8 mL에 놓습니다. 큰 수확에 대 한 계속 판 찬 세포 생존 능력을 유지 하기 위해 얼음에.
참고: 불 임이 필요한 경우 모든 종양 ╂ biosafety 어떤 추가 단계 뿐 아니라 불 임 수술 도구 (즉, 가 위, 집게, 등), 캐비닛에서 필요 합니다. 0.5-1 ㎝ 사이 가장 긴 직경이 종양은 최적의 그리고 더 큰 또는 작은 종양 시 약의 스케일링 필요 합니다. - 가 위를 사용 하 여 각 잘 내3 조각을 1 m m 미만으로 종양을 잘라.
- 콜라를 용 해 하 여 소화 칵테일 x 10을 준비 10 mg/mL, 2500 U/mL, 그리고 DNase에서 콜라 4에서 나 기본 RPMI 1640 미디어 (FBS) 없이 200 U/mL에서 나.
참고: 소화 칵테일 사전에 하루를 준비 하 고 수-20 ° C에 저장 그러나, 효소 활동 한번 해산 시간이 지남에 잃게됩니다 장기간된 보관 권장 하지 않습니다. - 난, 콜라 4, 및 DNase 콜라를 포함 하는 분리 칵테일 x 10의 200 µ L을 추가 나 1 m m3 조각으로 각 잘 하.
- 60-100 rpm 궤도 격판덮개 셰이 커를 사용 하 여 가볍게 흔들어 동안 37 ° C에서 1 시간에 대 한 소화 샘플 수 있습니다.
참고: 효소 소화 하는 동안 37 ° C에 온도를 상승 면역 세포 활성화를 발생할 수 있습니다. - 1 시간 후 RPMI 1640 미디어 각 음을 5 %FBS 2 mM EDTA와 보충의 1 mL을 추가 하 여 반응 중화.
- 50 mL 원심 분리기 튜브 위에 앉아 40 µ m 셀 스 트레이너로 종양 소화와 나머지 종양 조각 플라스틱.
참고: 종양 소화는 스 트레이너를 쉽게 전송에 대 한 1 mL 피 펫 팁의 끝을 잘라. - 10 mL 주사기 플런저를 사용 하 여 기계적으로 스 트레이너를 통해 종양 조각 세분화. 주기적으로 보충된 RPMI 1640 미디어의 2 mL와 여과기를 헹 굴 (포함 하는 5 %FBS) 셀 스 트레이너는 종양의 명확한 때까지 반복.
참고: 전체 미디어의 약 4-10 mL 적절 하 게 종양의 여과기를 헹 구 게 충분 해야 한다.
참고:이 단계는 세포 생존 능력을 유지 하기 위해 모든 샘플에 대 한 완료 될 때까지 얼음에 샘플을 놓습니다. - 각 50ml 원심 분리기 튜브 보충된 RPMI 1640 미디어를 사용 하 여 동일한 볼륨을 조정 합니다.
참고: 볼륨 조정은 원심 분리기 균형 중요 합니다. 이 단계를 건너뛰는 원심 분리기 손상 또는 상해 될 수 있습니다. - 셀 정지 (5 분, 805 x g, 4 ° C) 원심 supernatants, 삭제 하 고, 다시 보충된 RPMI 1640 미디어의 2 mL에 일시 중단.
참고: 셀 집계를 resuspend 어려운 원심 분리에 따라 형성 수 있습니다. 계속 하기 전에 헤어 5 mL 혈 청 학적인 피 펫과 혼합 빠르게 사용 합니다.
2. 면역과 종양 세포 분수의 분리
참고:이 단계에 필요한 시간은 약 1 시간입니다.
- 15 mL 원심 분리기 튜브의 하단에 밀도 그라데이션 매체의 3 mL를 추가 합니다. 준비 하 고 각 종양에 대 한 충분 한 튜브 라벨.
- 레이어 2 개의 층의 혼합을 방지 하기 위해 튜브의 측면 아래로 천천히 pipetting으로 밀도 그라데이션 매체 위에 종양 세포 현 탁 액 2 mL.
- 조심 스럽게 원심 분리기에 스핀 805 x g, 20 ° C, 아니 브레이크에서 20 분에 대 한 계층화 된 튜브를 놓습니다.
참고: 그것은 매우 적절 한 균형을 확인 하 고 아무 브레이크 원심 분리 하는 동안 사용 되도록 하는 것이 중요입니다. 이 과정의 혼선 레이어 혼합 되며 전체 샘플 복구는 어려울 것 이다. - 조심 스럽게 (틸) 계층과 전송 피 펫을 사용 하 여 새로운 15 mL 튜브에 최고의 미디어 계층 백혈구 침투 종양 전송. 모든 나머지 밀도 그라데이션 매체를 삭제 하 고 보충된 RPMI-1640의 2 ml에서 튜브의 하단에 종양 펠 릿 resuspend.
참고: 원심 분리 후 있을 것입니다 아래로 각각 해당 하는 위에서 보이는 4 개의 층: 미디어, TILs, 밀도 그라데이션 매체, 및 종양 세포 펠 릿. 그림 2 다양 한 계층의 예를 참조 하십시오. - 모두 때까지 원심 종양 샘플 튜브 (5 분, 805 x g, 4 ° C)를 분리 하 고 삭제는 상쾌한.
- Resuspend 200 µ L에 때까지 샘플 및 보충된 RPMI 1640 미디어의 2 mL에 종양 펠 릿. 생존 능력을 유지 하기 위해 얼음에 계속.
3. 도금 및 얼룩
참고: 도금에 필요한 시간은 30 s/종양; 표면 얼룩에 필요한 시간은 1 시간; 세포내 얼룩에 필요한 시간은 40 분; 필요한 흐름 cytometry 분석-1 시간 4 분/종양.
- 준비 하 고 얼룩 패널 및 셀에 대 한 추가 판 각 면역에 대 한 레이블 96 잘 U-하단 플레이트 계산.
참고: 일반적으로, 3 개의 접시 준비가 총에서: 림프 구 집중 패널 판, 골수성 집중 패널 플레이트, 그리고 셀 수 접시. - Aliquot는 얼룩의 각 단일 셀 정지 패널 접시와 설정된 볼륨 수 접시에.
참고: 카운트 접시 정확한 세포 인구 수 수 있도록 각 착 색 패널에 추가 하는 셀의 총 수를 계산 하는 데 사용 됩니다. 96 잘 접시 샘플링 및 volumetric 분석 기능 교류 cytometer 각 샘플 µ L 당 세포 수를 제공 하 고 그러므로, 각 착 색 패널에 추가 하는 셀의 수를 계산 수 있습니다. 수 판 고정 FACs 버퍼와 rinsing 4 ° C에서 하룻밤 후 다음 날 취득 될 수 있다 (인산 2% 식 염 수 (PBS) 버퍼링 FBS), FACs 버퍼의 설정된 볼륨에서 resuspending 및. - (5 분, 805 x g, 4 ° C) centrifuging와 모든 무료 FBS를 제거 하려면 각 린스 사이 상쾌한 삭제 샘플 당 Dulbecco의 버퍼링 하는 인산 염 (DPBS)의 200 µ L로 두 번 셀 워시.
- Fc 블록의 50 µ L 멀티 채널 피 펫을 사용 하 여 샘플 혼합 및 4 ° c.에 20 분 동안 품 어 추가
- 2 x의 50 µ L 집중 extracellular 대상 항 체와 고칠 수 생존 얼룩 혼합물, 다중 채널 피 펫을 사용 하 여 혼합 하 고 RT 또는 4 ° C에서 어둠 속에서 30 분 동안 품 어 추가
참고: 정확한 착 조건 항 체에 대 한 제조업체의 지침에 따라 달라 집니다. 모든 얼룩 희석 DPBS, 고칠 수 생존 염료의 포화를 방지 하기 위해 아무 추가 FBS와 이어야 합니다. 이 원고에 사용 되는 착 색 패널의 최적의 희석에 대 한 테이블의 재료/장비 를 참조 하십시오. 항 체와 고칠 수 생존 솔루션 얼룩 얼룩 Fc 블록에 추가 될 때 전체 얼룩 볼륨 100 µ L에서 농도 x 최종 1을 2 배 농도에서 준비가 되어 있습니다. - (5 분, 805 x g, 4 ° C) centrifuging와 각 린스 사이 supernatants 삭제 FACs 버퍼와 두 번 샘플을 씻으십시오.
- 고정/permeabilization 솔루션 x 1의 200 µ L에서 resuspend 하 고 빛 으로부터 보호 하는 4 ° C에서 밤새 품 어.
참고: 실험 일시 중지할 수 있습니다 하룻밤이 시점에서: 빛 으로부터 보호 하는 4 ° C에서 샘플을 계속. - 다음 날, 원심 판 (5 분, 805 x g, 4 ° C) 그리고는 상쾌한 삭제.
- Permeabilization 버퍼, 원심 분리기 (5 분, 805 x g, 4 ° C), x 1의 200 µ L로 한 번 헹 구 고는 상쾌한 삭제.
- 1 x 집중된 세포내 항 체 얼룩 패널 1 x permeabilization 버퍼에 준비의 100 µ L을 추가 하 고 실시간 또는 (이 제조 업체에서 얼룩 권장 사항에 따라 달라 집니다) 4 ° C에서 어둠 속에서 30 분 동안 품 어.
- 1 x permeabilization와 버퍼 (5 분, 805 x g, 4 ° C), 상쾌한, 삭제 되 면 헹 구 고 린스 FACs 버퍼와 함께 두 번째 시간 (PBS 2 %FBS).
- FACs 버퍼의 300 µ L에서 샘플을 resuspend (PBS 2 %FBS), 교류 cytometry 튜브 샘플 전송 및 흐름 cytometry 분석 수행.
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Representative Results
우리의 결과 프로토콜에 설명 된 대로 비 면역 종양 구성 요소에서 분리 할 때의 중요 한 혜택을 보여 줍니다. 또한, 설립된 단단한 종양의 중요 한 면역학이 설명한 방법을 사용 하 여 설명 합니다.
많은 종양 분리 기술로 중요 한 문제는 가혹한 소화 조건 (즉, 높은 온도, 부적절 한 영양 공급, 등)의 결과로 수시로 샘플 생존 능력의 손실. 설명된 소화 방법의 사용 하거나 밀도 없이 그라데이션 중간 농축, cytometry (그림 1A)에 의해 평가 약 70-90% 총 세포 생존 능력을 제공 합니다. 유사한 viabilities에는 때까지 관찰 되었다 농축 하 고 종양이이 방법 (그림 1, 그림 2C) 최소한의 전반적인 독성 발생 하는 것을 건의 하는 분수. 또한, 밀도 그라데이션 중간 농축 큰 승진은 CD45 2-fold 증가 보다 총 가능한 셀 간에 분수 위해선 긍정적인 분석 농축 비에 비해 종양 소화 (그림 1B, C). 또한, 농축 등 억압 파생 골수성 세포 (MDSCs), 모 수석 세포 (DCs), 대 식 세포, CD8 T 세포, CD4 T-세포 ( 면역 microenvironment 연구에서 일반적으로 평가 하는 수많은 면역 세포 하위 집합을 향상 발견 됐다 그림 1D, E). 이것은 밀도 그라데이션 중간 농축 글로벌 immunocyte 풍부를 촉진 하 고 특정 림프 구 또는 골수성 인구 (cytometry 게이팅 식별 하는 데 사용 하는 방법에 대 한 보충 그림 1A, B 참조를 분리 하지 않습니다. 특정 세포 인구)입니다. 그러나, 많은 상용 밀도 그라데이션 분리 매체 적혈구와 분리 단계 통과 granulocytes의 중요 한 일부분을 허용 지적 가치가 있다. 따라서, 이러한 인구 관심의 경우, 추가 프로토콜 최적화 필요할 수 있습니다.
그림 1 : 종양 면역 침투의 온화 하 고 효과적인 농축. 설립된 어 종양 excised 했다 고 설명한 방법을 사용 하 여 소화. 소화, 다음 단일 셀 정지 절반 밀도 그라데이션 중간 농축 하 고 다른 절반은 직접 스테인드 받았다 그런 분할 되었다. (A) 또는 밀도 그라데이션 중간 농축 없이 종양 소화에 대 한 세포 생존 능력의 누적 흐름 cytometry 평가. (B) 대표 cytometry 게이팅 음모와 밀도 그라데이션 중간 농축 없이 단일 종양 소화의 CD45 긍정적인 면역 세포 농축을 보여주는. (C) 누적 흐름 cytometry CD45 긍정적인 세포 종양 소화 또는 밀도 그라데이션 중간 농축 없이에서 총 실행 가능한 세포 중 비율. (D) 농축 비율이 다양 한 골수성과 림프 구 면역 인구. 종양은 직접 얼룩이 되 고 또는 얼룩이 지 고 교류 cytometry 분석 전에 밀도 그라데이션 농축을 진행 하기 전에 단일 세포 현 탁 액으로 소화 했다. 각 셀 형 농축 비율 농축 비 대응으로 밀도 그라데이션 풍부한 종양 소화에서 (총 가능한 셀 평가) 중 특정된 세포 인구 비율을 분할 하 여 계산 되었다. 라인 바 중간 나타내고 막대의 가장자리는 최소 및 최대 비율을 나타냅니다. 면역 세포 마커 식 분석 각 면역 세포 인구를 식별 하는 데 사용의 (E) 테이블. 통계적 의미는 짝이 없는 t-검정 또는 맨 휘트니 테스트로 결정 했다. p < 0.05, * *p < 0.01, * * *p < 0.001, * * *p < 0.0001, (n = 20 종양, N = 2 모든 그래프에 대 한). 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
이 방법을 제공 하는 가장 중요 한 장점 중의 하나 비 면역 종양 부분을 독립적으로 프로 파일링 능력입니다. 밀도 그라데이션 중간 단계를 통과 하는 수송과 비 면역 종양 분수의 격리, 후 패널을 프로 파일링 하는 복잡 한 종양 수행할 수는 이전 수는 제한 되어 fluorophore 번호 및 샘플 수량 제한. 그림 2 A 이상 70% 생존 및 99 %CD45 부정적인 세포 농축 종양 흐름 cytometry 특성의 예를 보여 줍니다. CD45 부정적인 분수 다음 전체 종양 생존 또는 apoptosis (즉, caspase 3, annexin V, 등), 확산 (즉, Ki67), 용량과 다양 한 표현 등 수많은 종양 기능에 대 한 프로 파일링 할 수 있습니다. 면역 표식 (즉, 죽음-ligand 1 (PD-L1) 프로그램 또는 PD-L2). 그러나 그것은 CD45 부정적인 분수 모두 종양 세포 뿐만 아니라 다른 기질 및 혈관 종양 microenvironment의 요소를 포함 한다, 주목 해야한다. 따라서, 직접 종양 세포 특성화 해야 하는 경우 종양 세포 특정 마커 해야 할 것 이다 (즉, cytokeratin, 특정 종양 관련 항 원, 등)을 사용. 마찬가지로, 다른 종양 stromal 요소 수 쉽게 식별 되며 종양 혈관 내 피 세포 (CD31) 등 암 세포 형 특정 표시와 관련 된 섬유 아 세포 (α-부드러운 근육 걸) 라벨 후 특징. 그럼에도 불구 하 고, 생존 및 CD45 부정적인 세포 농축 수준이 높게 일관 된 비 면역 종양 구성 요소 농축 (그림 2B, C에 대 한 밀도 그라데이션 분리 기술의 견고성을 나타내는 반복된 샘플에서 ).
그림 2 : 농축 및 비 면역 종양 구성 요소 기능의 프로 파일링. (A) 레이어 (얇은 어두운 흰색), 밀도 그라데이션 중간 레이어 (명확한), 및 튜브의 하단에 펠 릿 종양까지 보이는 미디어 레이어 (분홍색), 밀도 그라데이션 중간 농축 다음 샘플의 대표 이미지. (B) 대표 cytometry 게이팅 비 면역 종양 구성 요소 셀 생존 점도 (위), CD45 부정적인 세포 농축 산 점도 (왼쪽 아래), 그리고 관심의 3 개의 독립적인 마커를 프로 파일링에 사용 하는 전략 히스토그램 플롯 (PD L1, PD-L2 중간, 위아래 Ki67) 통해 식입니다. FMO 히스토그램 샘플을 다른 모든 패널 색상으로 얼룩진 하지만 부족의 마커를 나타냅니다. (C) 세포 생존 및 밀도 그라데이션 중간 농축에 따라 종양 펠 릿 분수의 총 실행 가능한 세포 중 (D) CD45 부정적인 세포 백분율의 누적 흐름 cytometry 평가 (n = 7-8 종양). 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
단단한 종양의 유전자이 하 중요 한 노력에도 불구 하 고 작은 일에서 고체 종양 면역학 하위 집합의 공간이 자세한 있다. 우리 이렇게 결정 하는 목적으로 어떻게 골수성과 림프 톨 면역학 하위 집합 크게 단일 고체 종양에 걸쳐 다양 한. 따라서, 설립된 어 종양 같은 피부 및 복 막-연결 부분 (그림 3A)로 서 동일한 내부 종양 지역, 각 섹션에 약 포함 된 보장 하기 위해 특별 한 주의 함께 4 개의 동등한 부품으로 분할 되었다. 각 종양은 별도로, 소화 그리고 밀도 그라데이션 매체에 의해 농축 조각과 골수성과 림프 구 패널 분할. 이 일반적으로 평가 immunocyte 인구 수를 포함 한 다양 한 기능의 정량화를 허용: T 세포, CD4 + T 세포, CD8 + T 세포, 대 식 세포, Dc, MDSCs (전략 게이팅 cytometry 보충 그림 1A, B 참조). 단일 종양 내의 다른 종양 파티션 사이 중요 한 세포 변화 지적된 (그림 3b) 했다. 예를 들어 DC 및 T 세포 총 셀 수로 4 5-fold를 발견 했다 인접 한 종양 부분 중. 이러한 급격 한 변화 또한 때 총 가능한 셀 (보충 그림 2A)의 인구를 세포 분석 지적 했다 하 고 다른 두 개의 독립적인 종양 (보충 그림 2B, C)와 비슷한 수준에서 관찰 되었다. 이러한 데이터는 분리 하 고 현재 프로토콜 포함 독립에 의해 보완 분석을 허용 하는 종양을 분할 어 긋 보일 수 있습니다 면역 microenvironment 분석을 수행할 때 전체 종양을 분석의 중요성을 입증 방법 (즉, 조직학, RNA 정량화, 등). 또한, 이러한 데이터 지역 intratumoral 면역학이 크게 생 검 결과 왜곡 수로 종양 biopsies의 면 역학적 분석에서 차이 설명할 수 있다.
그림 3 : 설립된 종양 면역이의 평가. (A) 대표 이미지는 설립된 어 종양 외과 절제술 (왼쪽) 다음의 전후 4 인접으로 동일 부서 부품 (오른쪽). 눈금 막대는 각 이미지에 검은색에서 표시 1 cm. (B) 배 각종 골수성의 변화와 림프 구 세포; 4 인접 한 종양 부분의 각 사이 계산 각 종양 섹션 같은 소화, 밀도 그라데이션 중간 농축 절차, 얼룩, 및 분석을 받았다. 각 종양 부분으로 주어진된 세포 인구에 대 한 낮은 분석된 세포 수와 종양 부분에 의해 그것의 세포 수를 나누어 결정 셀 수 배 변경으로 표시 됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
추가 그림 1: 종양 면역 구성 요소 프로 파일링에 사용 하는 전략을 게이팅 하는 대표적인 cytometry. (A) 각각 점도 림프 구 면역 프로 파일링에 사용 된 전략을 게이팅. (B) 각각 점도 종양 골수성 면역 프로 파일링에 사용 된 전략을 게이팅. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
추가 그림 2: 설립된 종양이 추가 평가. 4 동등한 종양에서 총 실행 가능한 세포 배 변화 중 세포 비율 (A) 그림 3에에서 표시 된 부품. (B)와 (C)는 두 개의 추가 설립된 어 종양 4 인접 한 부품으로 분할 및 종양 면역이 대 한 분석. 셀 수 배 변화 (왼쪽)와 총 실행 가능한 세포 중 세포 비율 변화 (오른쪽) 각 접어 골수성과 림프 구 세포 인구 분석 4 인접 한 종양 부분의 각각의 다양성을 보여주는. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
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Discussion
에 다양 하 고 복잡 한 세포 구성 성분과 분자의 구성 됩니다. 최근 기록은이 환경의 정확한 특성 치료 성공 또는 실패의 더 나은 이해를 제공할 수 있습니다 식별할 수 있습니다 심지어 치료 저항 메커니즘 제안. 예를 들어 intratumoral 수준 (즉, MDSCs, T 규정 하는 세포, 등) 다양 한 면역 세포의 증가 이펙터 면역 반응을 완화를 immunotherapeutic 효과 파기 됩니다. 다른 한편으로, 이펙터 면역 인구 (예를 들어, 종양 관련 CD8 + T 세포, 자연 킬러 세포, T 보조 세포)의 증가 intratumoral 존재 치료 성공의 강력한 predictors 수 있습니다. 종양 면역학 상태를 정확 하 게 나타내는 것을 계속 하는 또 다른 특성은 종양 세포 자체의 phenotypic 특징 이다. 이 포함 하는 다양 한 면역 ligands, 효소, 또는 겨냥 downregulating 이펙터 면역 반응 분자의 표현 (즉, PD-L1, PD-L2, indolamine 2, 3 dioxygenase, 산화 질소, 등). 함께 찍은,이 단단한 종양의 면역 및 종양 세포 기능에 대 한 정확 하 고 광범위 한 특성에 대 한 필요성을 보여 줍니다.
여기 설명 하는 기술은 고체 murine 피하 종양의 세포 구성 요소를 분리 및 농축 면역 종양의 있습니다. 다음, 독립적인 흐름 cytometric 프로 파일링 수행할 수 있습니다 풀 타임 및 종양 세포의 상호 작용 시간으로 평가 될 수 있다 그래야. 농축, 다음 주요 골수성과 림프 세포 구성 성분, 뿐만 아니라 다양 한 그들의 phenotypic 상태를 설명 하는 기능 특성을 허용 하도록 광범위 한 면역 흐름 cytometry 패널을 최적화할 수 있습니다. 마찬가지로, 광범위 한 종양 세포 집중 패널 사용할 수 있습니다 하지 독립적으로 종양 세포 기능 뿐만 아니라 광범위 한 특성을 제공 하. 이 기술은의 상대적 단순 murine 종양의 많은 수의 동시 분석에 대 한이 murine 종양 모델의 생물 학적 다양성에도 불구 하 고 추세를 관찰 하는 매우 중요 있습니다. 종양 면역 농축 희귀 면역학 하위 집합 (즉, 특정 종양 세포 독성 T 세포), 다른 비 면역 세포 구성 요소에 비해 종양 내에서 이루어지지 종종 크게는 더 id를 제공 하는 또한, . 이 기술의 최적화 이러한 mRNA 프로 파일링, 농축, coculture ex vivo 분석 실험, 등을 요구 하는 격리 된 하위 집합 또는 입양 셀 전송 연구에 추가적인 다운스트림 분석 허용할 수 있습니다.
피하 murine 종양 모델에이 기술을 사용 하 여, 글로벌 하 고 독립적인 면역 하위 집합의 중요 한 농축 보여 줍니다. 우리는 또한 같은 종양 샘플에서 얻을 수 있는 프로 파일링 비 면역 종양을 보여 줍니다. 마지막으로, 우리는 우리가 관찰 한 종양의 인접 한 섹션에 중요 한 면역학이 전체 종양 면역학 프로 파일링의 중요성을 보여줍니다. 이상적으로, 콜라와 DNase 기반 소화의이 기술과 종양 면역 및 비 면역 분수의 그라데이션 기반 분리 두 orthotopic murine 종양 모델의 대부분에 적용 될 수 있고 피하. 우리는 또한 관찰 그 작은 설립 비 종양 및 적은 콜라겐 밀도 종양 모델 (즉, B16 흑색 종) 종종 단일 셀 정지15;를 생성 하는 효소 소화 단계를 필요 하지 않습니다 그러나 그라데이션 기반 면역 농축 동등 하 게 수행 하는, 뿐만 아니라 이러한 종양 모델에서 더 다재 다능 한 검증. 특정 세포 하위 집합11콜라 항 소화에 대 한 사전 우려에도 불구 하 고 우리는 아직 관찰 얼룩 마커를 우리가 프로 파일링에 대 한 품질의 주목할 만한 손실. 그럼에도 불구 하 고, 이러한 소화 조건에 항 원 감도이 기술의 광범위 한 채택 하기 전에 적절 한 비-소화 컨트롤 샘플을 사용 하 여 평가 한다.
결론적으로, 우리의 기술, 광범위 한, 정확 하 고 높은 처리량 특성 murine 단단한 종양의 종양 면역 및 비 면역 구성 요소 수 있습니다. 이러한 하위 집합의 독립 프로 파일링을 수행 하 여 광범위 하 게 연구 시간 특성 고 단단한 종양 임상 치료에 더 나은 기계적 통찰력을 얻을 수 있습니다. 이 메서드는 림프 구 및 골수성 immunocyte 인구 수와 고기, cytometry 통해 높은 처리량 분석 murine 종양 모델의 대부분 또는 일부 농축을 필요로 하는 다른 다운스트림 분석에 쉽게 적용할 수 있습니다.
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Disclosures
저자는 공개 없다.
Acknowledgments
JMN 국립 연구소의 종합 의료 과학 (T32GM088129)과 국립 연구소의 치과 Craniofacial 연구 (F31DE026682)에서 재정 지원의 건강의 국가 학회 둘 다 인정합니다. 내용은 전적으로 저자의 책임 이며 반드시 국립 보건원의 공식 의견을 대표 하지 않는다. 이 프로젝트 또한 NIH (P30 AI036211, P30 CA125123, 및 S10 RR024574)와 조 엘 M. Sederstrom의 전문가 지원 자금 Cytometry 베일 러 의과대학에서 셀 정렬 코어에 의해 지원 되었다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 6 to 12 week old male C57BL/6 mice | Jackson Laboratory | N/A | Mice used in our tumor studies |
| MEER Murine Syngeneic Cancer Cell line | Acquired from collaborator | N/A | E6/E7 HPV antigen expressing murine tonsillar epithelial cancer cell line |
| 70% isopropyl alcohol | EMD Milipore | PX1840 | |
| Murine surgical tool kit | World Precision Instruments | MOUSEKIT | Primarily only need scissors, tweezers, and a scalpel. |
| 24-well plate | Denville Scientific Inc. | T1024 | Or any 24-well flat bottom plate. |
| RPMI-1640 media | Sigma-Aldrich | R0883 | |
| Collagenase I | EMD Milipore | 234153 | |
| Collagenase IV | Worthington Biochemical Corporation | LS004189 | |
| DNase I | Sigma-Aldrich | 11284932001 | |
| Low Speed Orbital Shaker | BioExpress (supplier: Genemate) | S-3200-LS | Or any orbital shaker. |
| Thermoregulating incubator | Fisher Scientific | 13-255-27 | Or any other thermo-regulated incubator |
| FBS | Sigma-Aldrich | F8192 | |
| EDTA | AMRESCO | E177 | |
| 1 mL Pipette and tips | Eppendorf | 13-690-032 | Or any other pipette and tips |
| 40 um Cell Strainers | Fisher Scientific | 22363547 | |
| 50 mL Centrifuge Tubes | Denville Scientific Inc. | C1062-P | |
| 15 mL Conical Tubes | Denville Scientific Inc. | C1012 | |
| 10 mL Luer-Lok Syringe without needles | BD | 309604 | |
| Lymphoprep Density Gradient Medium | STEMCELL Technologies | 7811 | |
| Transfer Pipettes | Denville Scientific Inc. | P7212 | |
| 96-well U-bottom plates | Denville Scientific Inc. | ||
| DPBS | Sigma Aldrich | D8573 | |
| FoxP3 Transcription Factor Staining Buffer Set | ThermoFisher Scientific | 00-5523-00 | Fix/Permeabilization Buffer and Permeabilization Buffer |
| Thermoregulated Centrifuge | Eppendorf | 5810 R | |
| Attune NxT Flow Cytometer | ThermoFisher Scientific | N/A | For 96-well cell volumetric counting |
| Purified Rat Anti-Mouse CD16/CD32 (Mouse BD Fc Block) Clone 2.4G2 | ThermoFisher Scientific | 553141 | Fc Block |
| LIVE/DEAD Fixable Blue Dead Cell Stain Kit, for UV excitation | ThermoFisher Scientific | L34962 | Fixable viability stain |
| CD45 Monoclonal Antibody (30-F11), APC-eFluor 780 | ThermoFisher Scientific | 47-0451-80 | |
| TCR beta Monoclonal Antibody (H57-597), APC | ThermoFisher Scientific | 17-5961-82 | |
| CD8-α Antibody (KT15), PE | Santa Cruz Biotechnology | sc-53473 | |
| CD4 Monoclonal Antibody (GK1.5), PE-Cyanine5 | ThermoFisher Scientific | 15-0041-81 | |
| MHC Class II (I-A/I-E) Monoclonal Antibody (M5/114.15.2), Alexa Fluor 700 | ThermoFisher Scientific | 56-5321-82 | |
| CD11c Monoclonal Antibody (N418), PE-Cyanine5 | ThermoFisher Scientific | 15-0114-82 | |
| F4/80 Monoclonal Antibody (BM8), eFluor 450 | ThermoFisher Scientific | 48-4801-80 | |
| CD11b Monoclonal Antibody (M1/70), APC | ThermoFisher Scientific | 17-0112-81 | |
| Ly-6G (Gr-1) Monoclonal Antibody (RB6-8C5), PE | ThermoFisher Scientific | 12-5931-82 | |
| CD274 (PD-L1, B7-H1) Monoclonal Antibody (MIH5), PE-Cyanine7 | ThermoFisher Scientific | 25-5982-80 | |
| CD273 (B7-DC) Monoclonal Antibody (122), PerCP-eFluor 710 | ThermoFisher Scientific | 46-9972-82 | |
| Ki-67 Monoclonal Antibody (B56), BV711 | BD Biosciences | 563755 |
References
- Fouad, Y. A., Aanei, C. Revisiting the hallmarks of cancer. American Journal of Cancer Research. 7 (5), 1016-1036 (2017).
- Gajewski, T. F., Schreiber, H., Fu, Y. -X. Innate and adaptive immune cells in the tumor microenvironment. Nature Immunology. 14 (10), 1014-1022 (2013).
- Whiteside, T. L. The tumor microenvironment and its role in promoting tumor growth. Oncogene. 27 (45), 5904-5912 (2008).
- Chiou, V. L., Burotto, M. Pseudoprogression and Immune-Related Response in Solid Tumors. Journal of Clinical Oncology. 33 (31), 3541-3543 (2015).
- Menon, S., Shin, S., Dy, G. Advances in Cancer Immunotherapy in Solid Tumors. Cancers. 8 (12), 106 (2016).
- Denkert, C., et al. Tumor-Associated Lymphocytes As an Independent Predictor of Response to Neoadjuvant Chemotherapy in Breast Cancer. Journal of Clinical Oncology. 28 (1), 105-113 (2010).
- Lee, Y., et al. Therapeutic effects of ablative radiation on local tumor require CD8+ T cells: changing strategies for cancer treatment. Blood. 114 (3), 589-595 (2009).
- Stakheyeva, M., et al. Role of the immune component of tumor microenvironment in the efficiency of cancer treatment: perspectives for the personalized therapy. Current Pharmaceutical Design. 23, (2017).
- Gerner, M. Y., Kastenmuller, W., Ifrim, I., Kabat, J., Germain, R. N. Histo-Cytometry: A Method for Highly Multiplex Quantitative Tissue Imaging Analysis Applied to Dendritic Cell Subset Microanatomy in Lymph Nodes. Immunity. 37 (2), 364-376 (2012).
- Bayne, L. J., Vonderheide, R. H. Multicolor Flow Cytometric Analysis of Immune Cell Subsets in Tumor-Bearing Mice. Cold Spring Harbor Protocols. 2013 (10), (2013).
- Goodyear, A. W., Kumar, A., Dow, S., Ryan, E. P. Optimization of murine small intestine leukocyte isolation for global immune phenotype analysis. Journal of Immunological Methods. 405, 97-108 (2014).
- Casadevall, A., Fang, F. C. Rigorous Science: A How-To Guide. mBio. 7 (6), 01902-01916 (2016).
- Yao, Y., et al. CyTOF supports efficient detection of immune cell subsets from small samples. Journal of Immunological Methods. 415, 1-5 (2014).
- Kay, A. W., Strauss-Albee, D. M., Blish, C. A. Application of Mass Cytometry (CyTOF) for Functional and Phenotypic Analysis of Natural Killer Cells. Methods Mol. Biol. 1441, 13-26 (2016).
- Pachynski, R. K., Scholz, A., Monnier, J., Butcher, E. C., Zabel, B. A. Evaluation of Tumor-infiltrating Leukocyte Subsets in a Subcutaneous Tumor Model. Journal of Visualized Experiments. (98), (2015).
