Summary
Här beskriver vi en metod för att separera och berika komponenter i den tumör immun och icke-immun närmiljön i etablerade subkutana tumörer. Denna teknik möjliggör separat analys av tumören immun infiltrera och icke-immun tumör fraktioner som kan möjliggöra omfattande karakterisering av den tumör immun mikromiljö.
Abstract
Den tumör immun närmiljön (tid) har nyligen erkänts som en kritisk mediator av behandlingssvar i solida tumörer, särskilt för immunterapi. Senaste kliniska framsteg inom immunterapi belysa behovet av reproducerbara metoder att korrekt och noggrant karakterisera tumören och dess associerade immun infiltrera. Tumör enzymatisk nedbrytning och flöde flödescytometrisk analys tillåter bred karakterisering av talrika immunceller underdelar och fenotyper; dock begränsas ofta djup analys av fluorophore restriktioner på panel design och behovet av att förvärva stora tumörprover för att observera sällsynta immun populationer av intresse. Därför har vi utvecklat en effektiv och hög genomströmning metod för separering och berika den tumör immun infiltrera från icke-immun tumör komponenter. Beskrivna tumör matsmältningen och centrifugal densitet-baserade separation teknik tillåter separat karakterisering av tumör och tumör immun infiltrera fraktioner och bevarar cellulära livskraft, och ger således en bred karakterisering av tumören immunologiska tillstånd. Denna metod användes för att karakterisera den omfattande rumsliga immun heterogenitet i solida tumörer, vilket ytterligare visar behovet av konsekventa hela tumören immunologisk profilering tekniker. Sammantaget ger denna metod en effektiv och anpassningsbar teknik för immunologisk karakterisering av subkutan solid murina tumörer; som sådan, detta verktyg kan användas för att bättre karaktärisera de tumoral immunologiska funktionerna och i prekliniska utvärderingen av romanen immunoterapeutisk strategier.
Introduction
Suppressiv tiden har nyligen erkänts som ett kännetecken för cancer, och är känd för att spela en betydande roll i utveckling, progression och skydd av solid tumör cancer samt mildra deras känslighet för immunterapi1. TIDEN består av många cellulära underdelar och fenotyper, alla ger kritisk insikt i det immunologiska tillståndet av tumören. Dessa immunologisk undergrupper kan vara ytterligare stratifierat i celler av lymfocyter eller myeloisk ursprung, som tillsammans utgör majoriteten av de medfödda och adaptiva immunsvaret2,3. Senaste framstegen inom området för immunterapi mot cancer har visat att immunoterapeutisk strategier (dvs immun checkpoint-hämmare, chimär antigen receptorn T-celler, etc.) har potential att inducera tålig cancer regressioner; de är dock fortfarande relativt ineffektiva i solid tumör cancer4,5. Många grupper har visat det avgörande hindret att tiden kan spela på behandling framgång6,7, och således finns det fortfarande ett behov av att noggrant utvärdera nya immunterapier i inställningen prekliniska specifikt fokusera på sin förmåga att modulera eller övervinna den tid8.
Aktuella insatser att karakterisera tiden vanligtvis använda antingen mikroskopi eller flödescytometri tillsammans med antikropp märkning strategier för att identifiera immun cellulära underdelar och deras funktioner9,10. Dessa två strategier ge unikt olika information, som mikroskopi kan fysisk apprecieringen av cellulära delmängder och flödescytometri ger hög genomströmning och bredare kvantifiering av cellulära förändringar. Trots de senaste förbättringarna i fluorescerande multiplex immunohistokemi optimera spektrala bildsystem, som nu kan stödja upp till 7 parametrar, begränsad panel storlek försvårar bred nivå immun profilering och således denna teknik är ofta reserverade för mer fokuserade analyser. Som ett resultat, förblir flödescytometri en av de mest använda immun profilering tekniker. Trots dess utbredda användning i tid karakterisering är metoderna som används för beredning och färgning ganska variabel. Oftast protokoll utnyttja en tumör separera enzym (dvs kollagenaser, DNase, etc.) och manuell dissociation metoder att uppnå encelliga suspensioner, följt av antikropp färgning och analys7. Trots fördelarna med varje metod, har talrika grupper visat den omfattande variationen som kan induceras genom dessa tekniker11. Detta gör cross-studien jämförelser av tumör mikromiljö profilering extremt svårt, även vid bedömningen av samma modell som murina tumör. Dessutom dessa metoder ger begränsade möjligheter att bedöma tumör cellulära och tumör immun infiltrera komponenter självständigt, eftersom båda komponenterna varvas efter matsmältningen. Prov kvantitet sedan begränsar multi-panel färgning och analys, som blir en viktig fråga när du försöker karaktärisera sällsynta immunologisk undergrupper (d.v.s. tumör-specifika T-celler)12. Nyare tekniker såsom massa flödescytometri eller flödescytometri av flygtiden (CyTOF), möjliggöra högdimensionella fenotypiska analys av cellulära undergrupper med vissa system som stöder panel design som är större än 42 oberoende parametrar13. Trots den enorma kraften i CyTOF teknik i immun profilering, det är fortfarande begränsad på grund av bekostnad, analys expertis och tillgång till utrustningen. Dessutom många CyTOF protokoll rekommenderar rening av immun underdelar att förbättra signal-brus-förhållanden14, och därför föreslår vi att vår anrikning metod skulle kunna användas uppströms CyTOF analys för att förbättra datakvaliteten.
Detta dokument beskriver vi en tumör mikromiljö matsmältningen och analys metod som innehåller tumören immun infiltrera separation. Syftet med denna metod är att tillåta oberoende hög genomströmning profilering av tumör immun infiltrera och tumör cellulära fraktioner för bredare karaktärisering av den tumör mikromiljö. Med den här metoden visar vi ytterligare vikten av att utföra hela tumören analys, som en subkutan solid tumör modell har visat sig ha betydande rumsliga immunologisk heterogenitet. Sammantaget kan denna metod mer exakt och konsekvent jämföra mellan prover eftersom det berikar för immun cellulära undergrupper inom tumören och möjliggör oberoende profilering av tumör cell och immun bråkdelar av en tumör.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alla metoderna som beskrivs här har godkänts av den institutionella djur vård och användning kommittén (IACUC) av Baylor College of Medicine.
1. tumör skörd och matsmältning
Obs: Den tid som krävs för skörd är ~ 3-5 min/tumör, och den tid som krävs för bearbetning är ~ 1 h + 2-3 min/tumör.
- Euthanize möss av koldioxid inandning och spraya varje mus ner med 70% etanol före skörd för att förhindra hår kontaminering. Kirurgiskt ta bort subkutana tumörer från möss och se till att tumörer är fria från eventuella kontaminerande vävnad (dvs, hår, hud, bukhinnan, etc.). Placera varje tumör i 1.8 mL bas RPMI-1640 media utan fetalt bovint serum (FBS) i en 24-bra platta. För större skördar, hålla plattorna kall på is att bevara cellulära livskraft.
Obs: Om sterilitet krävs, alla tumör dissektioner måste utföras i en biosäkerhet skåp med sterila kirurgiska verktyg (dvs, sax, pincett, etc.), samt eventuella ytterligare steg. Tumörer med den längsta diametern mellan 0,5 - 1 cm är optimal, och större eller mindre tumörer kräver skalning av reagenser. - Använd sax för att klippa tumörer i mindre än 1 mm3 stycken i varje brunn.
- Förbereda en 10 x matsmältningen cocktail genom upplösning kollagenas jag 10 mg/ml, kollagenas IV på 2.500 U/mL och DNAS jag 200 U/ml i bas RPMI-1640 media (utan FBS).
Obs: Matsmältningen cocktail kan förberedas en dag i förväg och förvaras vid-20 ° C; långvarig lagring rekommenderas dock inte eftersom enzymer förlorar aktivitet över tid en gång upplöst. - Tillsätt 200 µL 10 x dissociation cocktail som innehåller kollagenas I, kollagenas IV och DNAS I till varje brunn med 1 mm3 bitar.
- Kan proverna att smälta för 1 h vid 37 ° C medan lätt skakar på 60-100 varv med en orbital plattan shaker.
Obs: Höjd temperatur till 37 ° C under enzymatisk nedbrytning kan orsaka immunceller aktivering. - Efter 1 h, neutralisera reaktionen genom att tillsätta 1 mL RPMI-1640 media kompletteras med 5% FBS och 2 mM EDTA till varje brunn.
- Pipettera tumör matsmältningen och kvarvarande tumör bitarna i en 40 µm cell SIL sittande ovanpå en 50 mL centrifugrör.
Obs: Skär spetsen av en 1 mL pipettspetsen för enklare överföring av tumör matsmältningen till Silen. - Använd en 10 mL sprutkolven att mekaniskt uppdelade tumör bitar genom Silen. Skölj regelbundet silen med 2 mL kompletterade RPMI-1640 media (som innehåller 5% FBS) och upprepa tills cellen silen framgår av tumör.
Obs: Ca 4-10 mL totala media bör vara tillräckligt att adekvat skölja silen av tumör.
Obs: Placera prover på is tills detta steg är slutfört för alla prover att bevara cellulära livskraft. - Justera varje 50 mL centrifugrör till samma volym med hjälp av kompletterade RPMI-1640-medier.
Obs: Justering av volym är kritiska för centrifug balansering. Hoppa över detta steg kan resultera i centrifug skador eller personskada. - Centrifugera cellsuspensioner (5 min, 805 x g, 4 ° C), kassera supernatanterna och resuspendera i 2 mL kompletterade RPMI-1640 media.
Obs: En cell aggregat kan bilda efter den centrifugering som är svår att resuspendera. Använda en 5 mL serologiska pipett och blanda snabbt för att bryta upp det innan du fortsätter.
2. separation av immun- och tumör cellulära fraktioner
Obs: Den tid som krävs för det här steget är ca 1 h.
- Tillsätt 3 mL täthet lutning medium längst ned i en 15 mL centrifugrör. Förbereda och etiketten tillräckligt rör för varje tumör.
- Lagret i 2 mL cellsuspension tumör ovanpå det täthet lutning mediet genom pipettering långsamt ner på sidan av tuben för att förhindra blandning av de två skikten.
- Noggrant placera skiktad rören i centrifug och spin i 20 min på 805 x g, 20 ° C, med ingen broms.
Obs: Det är extremt viktigt att kontrollera korrekt balansering och säkerställa att ingen broms används under centrifugeringen. Störningar i denna process kommer att resultera i lager blandning och full prov återhämtningen kommer att bli svårt. - Noggrant överföra tumören infiltrerar leukocyt (TIL) lagret och topp media lagret till en ny 15 mL tub med överföring pipett. Ignorera alla återstående täthet lutning medium och återsuspendera pelleten tumör på botten av röret i 2 mL kompletterade RPMI-1640.
Obs: Efter centrifugeringen kommer det att finnas fyra synliga lager från toppen till botten som respektive motsvarar: media, TILs, täthet lutning medium och tumör cellpelleten. Se figur 2A exempel på olika lager. - Centrifugera båda TIL och tumörprover i separata rör (5 min, 805 x g, 4 ° C) och kasta bort supernatanten.
- Återsuspendera TIL provet i 200 µL och tumör pelleten i 2 mL kompletterade RPMI-1640 media. Håll på isen att bevara livskraften.
3. plätering och färgning
Obs: Den tid som krävs för plätering är 30 s/tumör; den tid som krävs för surface färgning är 1 h; den tid som krävs för intracellulära färgning är 40 min; den tid som krävs för flödescytometri Flödesanalys är 1 - 4 min/tumör.
- Förbereda och etikett en 96 brunnar U-botten platta för varje immun färgning panel och en extraskylt för cell räknas.
Obs: Vanligtvis tre plåtar är beredda totalt: en lymfocyt-fokuserad panel, en myeloisk-fokuserad panel tallrik, och en cell count plåt. - Alikvotens encelliga upphängningarna in i varje färgningen panel tallrikar och en fast volym i antal plattan.
Obs: Räkna plattan används för att beräkna det totala antalet celler som tillsätts varje färgning panelen, som därmed tillåter korrekt blodkroppar befolkningen. En flödescytometer med plattan med 96 brunnar provtagning och volymetrisk analys funktioner kan ge antalet celler per µL i varje prov, och därför beräkna antalet celler som tillsätts varje färgning panel. Antal plattor kan förvärvas dagen efter fixering övernattning på 4 ° C, sköljning med FACs buffert (fosfatbuffrad saltlösning (PBS) med 2% FBS), och omblandning i en fast volym på FACs buffert. - Tvätta cellerna två gånger med 200 µL Dulbeccos fosfatbuffrad saltlösning (DPBS) per prov genom centrifugering (5 min, 805 x g, 4 ° C) och kasta bort supernatanten mellan varje skölj bort eventuella gratis FBS.
- Tillsätt 50 µL av Fc block, Blanda proverna med flerkanalig pipett och Inkubera under 20 minuter vid 4 ° C.
- Tillsätt 50 μl av 2 x koncentrerad extracellulära inriktning antikropp och fastställbara livskraft fläcken blandningen, blanda med flerkanalig pipett, och inkubera i 30 min i mörker vid RT eller 4 ° C.
Observera: De exakta färgning villkoren för antikroppen beror på tillverkarens anvisningar. Alla färgning utspädningar måste vara i DPBS, med inga extra FBS att förhindra mättnad av fastställbara livskraft färgämnet. Vänligen se Tabellen av material/utrustning för de optimala utspädningarna av panelen färgning används i detta manuskript. Antikropp och fastställbara livskraft färgning lösning är beredd vid en koncentration av 2 x att tillhandahålla en slutlig 1 x färgning koncentration i 100 µL av totala färgning när läggas till Fc blocket. - Tvätta av prov två gånger med FACs buffert genom centrifugering (5 min, 805 x g, 4 ° C) och kasseras supernatanterna mellan varje sköljning.
- Återsuspendera i 200 µL 1 x fixering/permeabilisering lösning och inkubera över natten vid 4 ° C skyddas från ljus.
Obs: Experimentet kan pausas under natten på denna punkt: hålla prover vid 4 ° C skyddas från ljus. - Följande dag, Centrifugera plattorna (5 min, 805 x g, 4 ° C) och Kassera supernatanten.
- Skölj en gång med 200 µL 1 x permeabilisering buffert, centrifug (5 min, 805 x g, 4 ° C), och kasta bort supernatanten.
- Tillsätt 100 µL av 1 x koncentrerad intracellulära antikropp färgning panel beredd i 1 x permeabilisering buffert och inkubera i 30 min i mörker vid RT eller 4 ° C (beroende på färgning rekommendationer från tillverkaren).
- Skölj en gång med 1 x permeabilisering buffert (5 min, 805 x g, 4 ° C), avlägsna supernatanten och skölj en andra gång med FACs buffert (PBS med 2% FBS).
- Återsuspendera proverna i 300 µL av FACs buffert (PBS med 2% FBS), överföra proverna till flöde flödescytometri rör och utföra flödescytometri Flödesanalys.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Våra resultat visar betydande fördelen TIL separation från icke-immun tumör komponenter, såsom förklaras i protokollet. Dessutom, Visa med den beskrivna metoden vi betydande immunologisk heterogenitet etablerade solida tumörer.
Ett betydande problem med många tumör dissociation tekniker är förlusten av provet livskraft, oftast till följd av hård matsmältningen villkor (dvs förhöjda temperaturer, bristfällig näringstillförsel, etc.). Användning av metoden beskrivs matsmältningen, med eller utan densitet gradient medium berikning, ger ca 70-90% totala cellular lönsamhet mätt med flödescytometri (figur 1A). Liknande förmåga observerades i TIL berikad och tumör berikad fraktioner, vilket tyder på att denna metod orsakar minimal totala toxicitet (figur 1, figur 2C). Dessutom täthet lutning medium anrikningen främjas en större än 2-faldig ökning av CD45 positiva TIL bråk bland totalt viabla celler analyseras jämfört med icke-berikade tumör tumörheterogenitet (figur 1B, C). Dessutom befanns anrikning öka talrika immunceller delmängder vanligen bedömas i immun mikromiljö studier, inklusive myeloisk-derived suppressor-celler (MDSCs), dendritiska celler (DCs), makrofager, CD8 T-celler och CD4 T-celler ( Figur 1D, E). Detta tyder på att täthet lutning medium anrikningen främjar global immunocyte rikedomar och inte isolerar särskilda lymfocyter eller myeloisk populationer (se kompletterande figur 1A, B för den flödescytometri gating metod som används för att identifiera viss cellpopulationer). Det är värt att notera dock att många kommersiellt tillgängliga täthet lutning separation medier tillåter en större del av erytrocyter och granulocyter passera fasen separation. Sålunda, om dessa populationer är av intresse, ytterligare protokoll optimering kan vara nödvändigt.
Figur 1 : Skonsam och effektiv anrikning av tumör immun infiltrera. Etablerade MEER tumörer var censurerade och smälts med den beskrivna metoden. Efter matsmältningen, encelliga suspensioner delades så att hälften genomgick täthet lutning medium anrikning och den andra hälften direkt var målat. (A) Kumulativ flöde flödescytometri bedömning av cellulära livskraft för tumör tumörheterogenitet med eller utan täthet lutning medium berikning. (B) representativa flödescytometri gating tomter visar CD45 positiva immunceller anrikning av en enda tumör matsmältning med och utan täthet lutning medium berikning. (C) Kumulativ flöde flödescytometri CD45 positiv cell procentsatser bland totalt viabla celler från tumören tumörheterogenitet med eller utan täthet lutning medium berikning. (D) berikning nyckeltal av olika myeloisk och lymfocyter immun populationer. Tumörer var rötas till encelliga suspension före att vara målat direkt eller genomgår täthet lutning anrikning före färgning och flöde flödescytometri analys. Varje celltyp anrikning baserat beräknades genom att dela en viss cell-befolkning andel (bland totalt viabla celler utvärderas) från täthet lutning berikad tumör matsmältningen av dess icke-berikade motsvarighet. Bar linjer som representerar medianen och kanterna på baren lägsta och högsta nyckeltalen. (E) tabell över immun cellulära markör uttryck används för att identifiera varje immunceller befolkningen analyseras. Statistisk signifikans bestämdes med ett oparat t-test eller Mann-Whitney test. p < 0,05, **p < 0,01, ***p < 0,001, ***p < 0,0001, (n = 20 tumörer, N = 2 för alla grafer). Klicka här för att se en större version av denna siffra.
En av de mest betydande fördelar som metoden ger är möjligheten att självständigt profil andelen icke-immun tumör. Efter isolering av andelen pelleterat icke-immun tumör som passerar genom fasen täthet lutning medium, kan komplexa tumör profilering paneler utföras som tidigare kan ha varit begränsad av fluorophore nummer och prov kvantitetsbegränsningar. Figur 2 A visar ett exempel på tumör flöde flödescytometri karakterisering med över 70% livskraft och 99% CD45 negativa cell anrikning. CD45 negativa fraktionen kan sedan vara profilerade för många tumör funktioner såsom övergripande tumören livskraft eller apoptos (dvs kaspas 3, annexin V, etc.), spridning kapacitet (dvs, Ki67) och uttryck för olika immunsuppressiv markörer (d.v.s. programmerad död-ligand 1 (PD-L1) eller PD-L2). Det bör dock noteras att den CD45 negativa fraktionen innehåller tumörceller såväl som andra stromaceller och vaskulär element av den tumör mikromiljö. Således, om det krävs direkt tumör cell karakterisering, en tumör cell specifik markör skulle behöva vara används (dvs cytokeratin, specifik tumör-associerad antigen, etc.). Likaså kan andra stromal tumör-element lätt identifieras och karakteriseras efter märkning med en celltyp specifik markör som tumör vaskulära endotelceller (CD31) och cancer associerade fibroblaster (α-smooth muscle aktin). Livskraft och CD45 negativa cell berikning ändå mycket konsekvent över upprepade prover, som anger robustheten av täthet lutning separation tekniken för icke-immun tumör komponent berikning (figur 2B, C ).
Figur 2 : Anrikning och profilering av de icke-immun tumör komponent funktionerna. (A) representativ bild av ett prov efter densitet gradient medium berikning med synliga media lager (rosa), TIL lager (tunna skumma vit), täthet lutning medelstora lager (klar) och tumör pellets på botten av röret. (B) representativa flödescytometri gating strategi som används för profilering komponenten icke-immun tumör, med cell livskraft spridningsdiagram (överst), CD45 negativa cell anrikning spridningsdiagram (nederst till vänster) och tre oberoende markörer av intresse uttryck via histogram tomter (PD-L1 top, PD-L2 mitten och Ki67 botten). FMO histogrammet representerar ett urval färgas med alla andra panelen färger men saknar markören av intresse. Kumulativa flöde flödescytometri bedömning av (C) cellulär livskraft och (D) CD45 negativa cell procentsatser bland totalt viabla celler i tumören pellet bråket efter densitet gradient medium anrikning (n = 7-8 tumörer). Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Trots betydande ansträngningar att karakterisera den genetiska heterogeniteten av solida tumörer, har lite arbete detaljerade immunologisk delmängder i solida tumörer rumslig heterogenitet. Vi syftar således till att bestämma hur myeloisk och lymfocyter immunologisk deluppsättningar drastiskt varierat genom en enda solid tumör. Således, en etablerad MEER tumör delades in i fyra lika stora delar med särskild omsorg för att se till varje avsnitt innehöll ungefär lika intra-tumoral regioner, samt lika dermal och peritoneal-vetter mot delar (figur 3A). Varje tumör bit var rötas separat, och sedan berikas av täthet lutning medium och delas mellan en myeloisk och lymfocyter panel. Detta tillät kvantifiering av olika funktioner, inklusive ett antal vanligen bedömda immunocyte populationer: T-celler, CD4 + T-celler, CD8 + T-celler, makrofager, DCs, MDSCs (se kompletterande figur 1A, B för den flödescytometri gating strategi). Inom en enda tumör var betydande cell variabiliteten mellan olika tumör partitionerna noterade (figur 3b). Exempelvis både DC och T-cell totala blodkroppar befanns variera så mycket som 4 till 5 gånger bland intilliggande tumör delar. Dessa drastiska förändringar noterades också när analysera cell populationer som andel av totala viabla celler (kompletterande figur 2A) och observerades på liknande nivåer i två andra oberoende tumörer (kompletterande figur 2B, C). Dessa data visar vikten av att isolera och analysera hela tumören när immun mikromiljö analyser, vilket kan tyckas bakvända om nuvarande protokoll inkluderar dividera tumören för att tillåta kompletterande analys av oberoende metoder (dvs, histologi, RNA kvantifiering, etc.). Dessutom, kan dessa data förklara skillnader i immunologiska analyser av tumör biopsier, som regionala intratumoral immunologiska heterogenitet kan drastiskt skeva biopsi resultat.
Figur 3 : Bedömning av etablerad tumör immun heterogenitet. (A) representativ bild av en etablerad MEER tumör efter kirurgisk resektion (vänster) och efter lika uppdelning i 4 angränsande delar (höger). Skalstapeln är 1 cm, visas i svart på varje bild. (B) vik ändras av olika myeloisk och lymfocyter blodkroppar mellan var och en av de 4 närliggande tumör delarna; varje tumör avsnitt genomgick samma matsmältning, täthet lutning medium anrikning förfarandet, färgning, och analys. Varje tumör del visas som en cell count faldig förändring, som bestäms av dess celltal divideras med den tumör delen med det lägsta analyserade celltalet för en viss cell befolkningen. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Kompletterande bild 1: representativa flödescytometri gating strategi som används för tumör immun komponent profilering. (A) Gating strategi med respektive spridningsdiagram används för lymfocyter immun profilering. (B) Gating strategi med respektive spridningsdiagram används för tumör myeloisk immun profilering. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Kompletterande bild 2: ytterligare bedömning av etablerad tumör heterogenitet. (A) cellulär andel bland totalt viabla celler faldig förändring från 4 lika tumör delar visas i figur 3. (B) och (C) är två ytterligare etablerade MEER tumörer indelat i 4 angränsande delar och analyseras för tumör immun heterogenitet. Räkna fold cellförändringar (vänster) och cell procentsatser bland totalt viabla celler vik förändringar (höger) för varje myeloisk och lymfocyter cell befolkningen analyseras visar variationen i var och en av de 4 närliggande tumör delarna. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
TIDEN består av olika och komplexa cellulära komponenter och molekyler. Nyligen tyder på att korrekt karakterisering av denna miljö kan ge en bättre förståelse för behandlingframgång eller misslyckande, och kan även hjälpa till att identifiera terapeutiska resistensmekanismer. Exempelvis kan öka intratumoral för olika immunsuppressiva celler (dvs. MDSCs, regulatoriska T-celler, etc.) minska effektor immunsvar och upphäva immunoterapeutisk effekter. Däremot, kan ökande intratumoral förekomsten av effektor immun populationer (t.ex. tumör-specifika CD8 + T-celler, naturliga mördarceller, T-hjälpare celler) vara kraftfulla prediktorer för behandlingframgång. En annan karakterisering som fortsätter att korrekt representera tumör immunologiska status är de fenotypiska funktionerna av tumörcellerna själva. Detta inkluderar uttryck för olika immunsuppressiva ligander, enzymer eller molekyler som syftar till downregulating effektor immunsvar (dvs, PD-L1, PD-L2, indolamine 2,3 dioxygenas, kväveoxid, etc.). Sammantaget visar detta behovet av korrekta och bred karakterisering av både immunförsvaret och tumör cellulära funktioner av solida tumörer.
Tekniken beskrivs häri gör separation och anrikning av både immunförsvaret och tumör cell komponenter av solid murina subkutana tumörer. Sedan, oberoende flöde flödescytometrisk profilering kan utföras så att full tid och interaktion av tumörceller med tiden kan uppskattas. Efter anrikning, omfattande immun flöde flödescytometri paneler kan optimeras så att karakterisering av viktiga myeloiska och lymfoida cellulära komponenter, liksom en mängd funktioner som beskriver deras fenotypisk status. Likaså kan omfattande tumör cell fokuserat panel användas självständigt ge bred karakterisering av tumör cell funktioner samt. Den relativa enkelheten av denna teknik möjliggör samtidig analys av stora mängder murina tumörer, som är avgörande för Observera trender trots den biologiska variationen av murina tumör modeller. Dessutom ger tumör immun anrikning bättre identifiering av sällsynta immunologisk undergrupper (d.v.s. tumör-specifika cytotoxiska T-celler), som är ofta kraftigt underrepresenterade inom tumören jämfört med andra icke-immun cell komponenter . Optimering av denna teknik kan tillåta ytterligare nedströms analyser på dessa isolerade grupper som kräver berikning, såsom coculture ex vivo analyser, mRNA profilering eller adoptiv cellstudier överföring.
Med denna teknik i en subkutan murina tumör modell, visar vi betydande anrikningen av globala och oberoende immun delmängder. Vi visar också icke-immun tumören profilering som kan uppnås samma tumör prover. Slutligen visar vi vikten av att hela tumören immunologisk profilering, som vi observerat betydande immunologisk heterogenitet i angränsande delar av en tumör. Idealiskt, denna teknik av kollagenas och DNAS-baserade matsmältningen och gradient-baserade separation av tumör immun och icke-immun fraktioner skulle kunna tillämpas på flesta av murina tumör modeller, båda ortotop och subkutant. Vi har också observerat att små icke-etablerade tumörer och mindre kollagen-tät tumör modeller (dvs B16 melanom) ofta inte kräver en enzymatisk nedbrytning steg att generera encelliga suspensioner15; toning-baserade immun anrikning utför dock lika samt i dessa tumör modeller, ytterligare validera dess mångsidighet. Trots tidigare farhågor om kollagenas antigen matsmältningen på enskilda cellulära undergrupper11har vi ännu att iaktta en betydande förlust av färgning kvalitet för någon av de markörer som vi har profilerade. Ändå, antigen känslighet för dessa matsmältningen villkor bör bedömas med hjälp av lämplig icke-smält kontrollprover innan brett antagandet av denna teknik.
Sammanfattningsvis kan vår teknik för korrekt, bred och hög genomströmning karaktärisering av tumör immun och icke-immun komponenterna i murina solida tumörer. Genom att utföra oberoende profilering av dessa undergrupper, kan forskarna i stort sett kännetecknar tiden och få bättre mekanistisk insikt i solid tumör prekliniska terapier. Metoden kan enkelt tillämpas på majoriteten av murina tumör modeller för hög genomströmning analys av lymfocyter och myeloisk immunocyte befolkningen räknas och fenotyper via flödescytometri eller andra nedströms analyser som kräver delmängd anrikning.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har något att avslöja.
Acknowledgments
JMN erkänner finansiellt stöd från National Institute of General Medical Sciences (T32GM088129) och nationella institutet för Dental & kraniofaciala forskning (F31DE026682) båda av National Institutes of Health. Innehållet ansvarar enbart för författarna och representerar inte nödvändigtvis officiella ståndpunkter av National Institutes of Health. Projektet stöddes också av flödescytometri och Cell sortering Core vid Baylor College of Medicine med finansiering från NIH (P30 AI036211, P30 CA125123 och S10 RR024574) och expert hjälp av Joel M. Sederstrom.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 6 to 12 week old male C57BL/6 mice | Jackson Laboratory | N/A | Mice used in our tumor studies |
| MEER Murine Syngeneic Cancer Cell line | Acquired from collaborator | N/A | E6/E7 HPV antigen expressing murine tonsillar epithelial cancer cell line |
| 70% isopropyl alcohol | EMD Milipore | PX1840 | |
| Murine surgical tool kit | World Precision Instruments | MOUSEKIT | Primarily only need scissors, tweezers, and a scalpel. |
| 24-well plate | Denville Scientific Inc. | T1024 | Or any 24-well flat bottom plate. |
| RPMI-1640 media | Sigma-Aldrich | R0883 | |
| Collagenase I | EMD Milipore | 234153 | |
| Collagenase IV | Worthington Biochemical Corporation | LS004189 | |
| DNase I | Sigma-Aldrich | 11284932001 | |
| Low Speed Orbital Shaker | BioExpress (supplier: Genemate) | S-3200-LS | Or any orbital shaker. |
| Thermoregulating incubator | Fisher Scientific | 13-255-27 | Or any other thermo-regulated incubator |
| FBS | Sigma-Aldrich | F8192 | |
| EDTA | AMRESCO | E177 | |
| 1 mL Pipette and tips | Eppendorf | 13-690-032 | Or any other pipette and tips |
| 40 um Cell Strainers | Fisher Scientific | 22363547 | |
| 50 mL Centrifuge Tubes | Denville Scientific Inc. | C1062-P | |
| 15 mL Conical Tubes | Denville Scientific Inc. | C1012 | |
| 10 mL Luer-Lok Syringe without needles | BD | 309604 | |
| Lymphoprep Density Gradient Medium | STEMCELL Technologies | 7811 | |
| Transfer Pipettes | Denville Scientific Inc. | P7212 | |
| 96-well U-bottom plates | Denville Scientific Inc. | ||
| DPBS | Sigma Aldrich | D8573 | |
| FoxP3 Transcription Factor Staining Buffer Set | ThermoFisher Scientific | 00-5523-00 | Fix/Permeabilization Buffer and Permeabilization Buffer |
| Thermoregulated Centrifuge | Eppendorf | 5810 R | |
| Attune NxT Flow Cytometer | ThermoFisher Scientific | N/A | For 96-well cell volumetric counting |
| Purified Rat Anti-Mouse CD16/CD32 (Mouse BD Fc Block) Clone 2.4G2 | ThermoFisher Scientific | 553141 | Fc Block |
| LIVE/DEAD Fixable Blue Dead Cell Stain Kit, for UV excitation | ThermoFisher Scientific | L34962 | Fixable viability stain |
| CD45 Monoclonal Antibody (30-F11), APC-eFluor 780 | ThermoFisher Scientific | 47-0451-80 | |
| TCR beta Monoclonal Antibody (H57-597), APC | ThermoFisher Scientific | 17-5961-82 | |
| CD8-α Antibody (KT15), PE | Santa Cruz Biotechnology | sc-53473 | |
| CD4 Monoclonal Antibody (GK1.5), PE-Cyanine5 | ThermoFisher Scientific | 15-0041-81 | |
| MHC Class II (I-A/I-E) Monoclonal Antibody (M5/114.15.2), Alexa Fluor 700 | ThermoFisher Scientific | 56-5321-82 | |
| CD11c Monoclonal Antibody (N418), PE-Cyanine5 | ThermoFisher Scientific | 15-0114-82 | |
| F4/80 Monoclonal Antibody (BM8), eFluor 450 | ThermoFisher Scientific | 48-4801-80 | |
| CD11b Monoclonal Antibody (M1/70), APC | ThermoFisher Scientific | 17-0112-81 | |
| Ly-6G (Gr-1) Monoclonal Antibody (RB6-8C5), PE | ThermoFisher Scientific | 12-5931-82 | |
| CD274 (PD-L1, B7-H1) Monoclonal Antibody (MIH5), PE-Cyanine7 | ThermoFisher Scientific | 25-5982-80 | |
| CD273 (B7-DC) Monoclonal Antibody (122), PerCP-eFluor 710 | ThermoFisher Scientific | 46-9972-82 | |
| Ki-67 Monoclonal Antibody (B56), BV711 | BD Biosciences | 563755 |
References
- Fouad, Y. A., Aanei, C. Revisiting the hallmarks of cancer. American Journal of Cancer Research. 7 (5), 1016-1036 (2017).
- Gajewski, T. F., Schreiber, H., Fu, Y. -X. Innate and adaptive immune cells in the tumor microenvironment. Nature Immunology. 14 (10), 1014-1022 (2013).
- Whiteside, T. L. The tumor microenvironment and its role in promoting tumor growth. Oncogene. 27 (45), 5904-5912 (2008).
- Chiou, V. L., Burotto, M. Pseudoprogression and Immune-Related Response in Solid Tumors. Journal of Clinical Oncology. 33 (31), 3541-3543 (2015).
- Menon, S., Shin, S., Dy, G. Advances in Cancer Immunotherapy in Solid Tumors. Cancers. 8 (12), 106 (2016).
- Denkert, C., et al. Tumor-Associated Lymphocytes As an Independent Predictor of Response to Neoadjuvant Chemotherapy in Breast Cancer. Journal of Clinical Oncology. 28 (1), 105-113 (2010).
- Lee, Y., et al. Therapeutic effects of ablative radiation on local tumor require CD8+ T cells: changing strategies for cancer treatment. Blood. 114 (3), 589-595 (2009).
- Stakheyeva, M., et al. Role of the immune component of tumor microenvironment in the efficiency of cancer treatment: perspectives for the personalized therapy. Current Pharmaceutical Design. 23, (2017).
- Gerner, M. Y., Kastenmuller, W., Ifrim, I., Kabat, J., Germain, R. N. Histo-Cytometry: A Method for Highly Multiplex Quantitative Tissue Imaging Analysis Applied to Dendritic Cell Subset Microanatomy in Lymph Nodes. Immunity. 37 (2), 364-376 (2012).
- Bayne, L. J., Vonderheide, R. H. Multicolor Flow Cytometric Analysis of Immune Cell Subsets in Tumor-Bearing Mice. Cold Spring Harbor Protocols. 2013 (10), (2013).
- Goodyear, A. W., Kumar, A., Dow, S., Ryan, E. P. Optimization of murine small intestine leukocyte isolation for global immune phenotype analysis. Journal of Immunological Methods. 405, 97-108 (2014).
- Casadevall, A., Fang, F. C. Rigorous Science: A How-To Guide. mBio. 7 (6), 01902-01916 (2016).
- Yao, Y., et al. CyTOF supports efficient detection of immune cell subsets from small samples. Journal of Immunological Methods. 415, 1-5 (2014).
- Kay, A. W., Strauss-Albee, D. M., Blish, C. A. Application of Mass Cytometry (CyTOF) for Functional and Phenotypic Analysis of Natural Killer Cells. Methods Mol. Biol. 1441, 13-26 (2016).
- Pachynski, R. K., Scholz, A., Monnier, J., Butcher, E. C., Zabel, B. A. Evaluation of Tumor-infiltrating Leukocyte Subsets in a Subcutaneous Tumor Model. Journal of Visualized Experiments. (98), (2015).
