Summary
Qui descriviamo un metodo per separare e arricchire i componenti del microambiente tumorale immuni e non immuni in tumori sottocutanei stabiliti. Questa tecnica permette l'analisi separata di tumore immuni si infiltra in e frazioni non immune tumore che possono consentire la caratterizzazione completa del microambiente tumorale immuni.
Abstract
Microambiente tumorale immuni (tempo) recentemente è stato riconosciuto come un mediatore critico di risposta al trattamento nei tumori solidi, soprattutto per le immunoterapie. Recenti progressi clinici nell'immunoterapia evidenziano l'esigenza di metodi riproducibili caratterizzare accuratamente e completamente il tumore e suoi associati si infiltrano in immuni. Digestione enzimatica del tumore e l'analisi cytometric di flusso permettono ampia caratterizzazione di numerosi sottoinsiemi delle cellule immuni e fenotipi; Tuttavia, profondità di analisi è spesso limitata dalla fluoroforo restrizioni sul design del pannello e la necessità di acquisire campioni di grande tumore di osservare rari popolazioni immuni di interesse. Così, abbiamo sviluppato un metodo efficace e ad alta produttività per la separazione e arricchendo l'infiltrato immune tumore dai componenti del tumore non immune. La digestione di tumore descritto e separazione centrifuga basati su densità tecnica permette separato caratterizzazione del tumore e tumore immuni si infiltra in frazioni e preserva la vitalità cellulare e quindi, fornisce un'ampia caratterizzazione del tumore stato immunologico. Questo metodo è stato usato per caratterizzare la vasta eterogeneità immuni spaziale nei tumori solidi, che dimostra ulteriormente la necessità di tecniche di analisi immunologiche coerente intero tumore. Nel complesso, questo metodo fornisce una tecnica efficace ed adattabile per la caratterizzazione immunologica dei tumori murini solidi sottocutanei; come tale, questo strumento può essere utilizzato per caratterizzare meglio le caratteristiche immunologiche tumorale e nella valutazione preclinica di nuove strategie immunoterapeutiche.
Introduction
Il tempo soppressivo recentemente è stato riconosciuto come un marchio di garanzia di cancro ed è conosciuto per svolgere un ruolo significativo nello sviluppo, progressione e nella protezione dei cancri solidi del tumore così come mitigare la loro suscettibilità all'immunoterapia1. Il tempo è composto di numerosi cellulari sottoinsiemi e fenotipi, che forniscono approfondimenti critici dello stato immunologico del tumore. Questi sottoinsiemi immunologici possono essere ulteriormente stratificati nelle cellule del linfocita o origine mieloide, che insieme costituiscono la maggior parte della risposta immunitaria innata e adattativa2,3. I recenti progressi nel campo dell'immunoterapia del cancro hanno dimostrato che strategie di immunoterapia (cioè, gli inibitori di checkpoint immuni, recettore chimerico antigene T-cellule, ecc.) hanno il potenziale di indurre cancro durevole regressioni; Tuttavia, rimangono relativamente inefficace nel tumore solido cancri4,5. Numerosi gruppi hanno mostrato la transenna critica che il tempo può svolgere il trattamento successo6,7, e così, ci rimane la necessità di valutare con precisione le nuove immunoterapie in ambito pre-clinico, occupandosi in particolare del loro capacità di modulare o superare il tempo8.
Gli sforzi attuali per caratterizzare il tempo in genere utilizzano entrambi microscopia o flusso cytometry insieme strategie per identificare immuni cellulari sottoinsiemi e loro caratteristiche9,10di contrassegno dell'anticorpo. Queste due strategie forniscono informazioni in modo univoco diverse, come la microscopia permette spaziale apprezzamento dei sottoinsiemi cellulare e citometria a flusso fornisce throughput elevato e più ampia quantificazione dei cambiamenti cellulari. Nonostante i recenti miglioramenti in immunoistochimica multisala fluorescente l'ottimizzazione di sistemi di imaging spettrale, che ora possono supportare fino a 7 parametri, dimensioni pannello limitato rendono vasto livello immunitario profilatura difficile e così questa tecnica è spesso riservati per più concentrata di analisi. Di conseguenza, citometria a flusso rimane uno del sistema immunitario più ampiamente usato tecniche di profilatura. Nonostante il suo uso diffuso nella caratterizzazione di tempo, i metodi utilizzati per la lavorazione e colorazione sono molto variabili. Più spesso protocolli utilizzano un tumore dissociando enzima (cioè, collagenasi, DNasi, ecc.) e metodi di dissociazione manuale per raggiungere sospensioni unicellulari, seguita da anticorpo che macchia e analisi7. Nonostante i vantaggi di ciascun metodo, numerosi gruppi hanno dimostrato la notevole variabilità che può essere indotta attraverso queste tecniche11. Questo rende la croce-Studio comparazioni di profilatura di microambiente del tumore estremamente difficile, anche quando valutare lo stesso modello di tumore murino. Inoltre, questi metodi forniscono un potenziale limitato per valutare il tumore cellulare e immunitaria tumore infiltrarsi componenti in modo indipendente, dal momento che entrambi i componenti sono sparpagliati dopo la digestione. Quantità di campione limita quindi multi-pannello di colorazione e di analisi, che diventa un grosso problema durante il tentativo di caratterizzare sottoinsiemi immunologiche rare (cioè, tumore-specifiche cellule T)12. Tecniche più recenti come massa cytometry, o citometria a tempo di volo (CyTOF), permettono di alto-dimensionali analisi fenotipica di sottopopolazioni cellulari con alcuni sistemi di supporto disegni pannello superiore a 42 parametri indipendenti13. Nonostante l'enorme potenza di tecnologia CyTOF in profilatura immuni, resta limitato a causa di spese, competenze di analisi e l'accesso all'apparecchiatura. Inoltre, molti protocolli di CyTOF consiglia di purificazione dei sottoinsiemi immuni per migliorare i rapporti segnale-rumore14, e quindi suggeriamo che il nostro metodo di arricchimento poteva essere utilizzato a monte dell'analisi CyTOF per migliorare la qualità dei dati.
Qui descriviamo una digestione microambiente del tumore e analisi metodo che incorpora immunitaria tumore infiltrarsi separazione. Lo scopo di questo metodo è quello di consentire indipendente high throughput profilatura del si infiltra in sistema immunitario in tumore e frazioni cellulari del tumore per la più ampia caratterizzazione del microambiente tumorale. Utilizzando questo metodo, noi dimostrare ulteriormente l'importanza di eseguire analisi di intero tumore, come un modello di tumore solido sottocutaneo è stato trovato per avere significativa eterogeneità spaziale immunologica. Nel complesso, questo metodo può più accuratamente e costantemente confrontare tra campioni perché arricchisce per sottoinsiemi immuni cellulari all'interno del tumore e permette per la profilatura indipendente delle cellule del tumore e frazioni immunitarie di un tumore.
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Protocol
Tutti i metodi descritti qui sono stati approvati dal istituzionale Animal Care e uso Committee (IACUC) del Baylor College of Medicine.
1. digestione e raccolto tumore
Nota: Il tempo richiesto per il raccolto è ~ 3-5 min/tumore e il tempo necessario per l'elaborazione è ~ 1 h + 2-3 min/tumore.
- Eutanasia di topi per inalazione di anidride carbonica e spray ogni mouse giù con etanolo al 70% prima della raccolta per evitare la contaminazione di capelli. Chirurgicamente rimuovere tumori sottocutanei dai topi e garantire che i tumori sono privi di qualsiasi tessuto contaminante (cioè, capelli, pelle, peritoneo, ecc.). Posizionare ogni tumore in 1,8 mL di base RPMI-1640 media senza siero bovino fetale (FBS) in una piastra a 24 pozzetti. Per raccolti più abbondanti, mantenere piastre fredde sul ghiaccio per preservare la vitalità cellulare.
Nota: Se è richiesta la sterilità, necessario essere eseguita in una cappa di biosicurezza con strumenti chirurgici sterili (cioè, forbici, pinze, ecc.), come pure qualsiasi ulteriore procedura tutte le dissezioni di tumore. I tumori con il diametro più lungo tra 0,5 - 1 cm sono ottimali, e tumori maggiori o minori richiederanno ridimensionamento dei reagenti. - Usare le forbici per tagliare i tumori in meno di 1 mm3 pezzi all'interno di ciascun pozzetto.
- Preparate un 10 x cocktail di digestione sciogliendo collagenosi sono a 10 mg/mL, collagenasi IV a 2.500 U/mL e dnasi I a 200 U/mL in base RPMI-1640 media (senza FBS).
Nota: La digestione cocktail può essere preparata un giorno in anticipo e conservata a-20 ° C; Tuttavia, una conservazione prolungata non è raccomandata come enzimi perderà l'attività nel corso del tempo una volta sciolto. - Aggiungere 200 µ l di 10 x cocktail di dissociazione contenente collagenasi I, IV collagenosi e dnasi I per ciascun pozzetto con il mm 13 pezzi.
- Consentire ai campioni di digerire per 1h a 37 ° C agitando leggermente a 60-100 rpm usando un agitatore orbitale.
Nota: L'elevazione della temperatura a 37 ° C durante la digestione enzimatica può causare l'attivazione delle cellule immuni. - Dopo 1 h, neutralizzare la reazione aggiungendo 1 mL di terreno RPMI-1640 completati con 5% FBS e 2 mM EDTA in ciascun pozzetto.
- In un colino di cella di 40 µm seduto sulla cima di un tubo di centrifuga da 50 mL, pipettare la digestione di tumore e i restanti pezzi di tumore.
Nota: Tagliare la punta al largo di punta di una pipetta da 1 mL per il trasferimento più facile della digestione tumore al filtro. - Utilizzare un pistone della siringa da 10 mL per disaggregare meccanicamente i pezzi del tumore attraverso il colino. Sciacquare periodicamente il filtro con 2 mL di completati RPMI-1640 media (contenente 5% FBS) e ripetere fino a quando il filtro cella è chiaro del tumore.
Nota: 4-10 mL circa di media totale dovrebbe essere sufficiente adeguatamente sciacquare il filtro del tumore.
Nota: Posizionare il campione sul ghiaccio fino al completamento di questo passaggio per tutti i campioni preservare la vitalità cellulare. - Regolare ogni 50 mL provetta dello stesso volume utilizzando il supporto di RPMI-1640 completato.
Nota: La regolazione del volume è fondamentale per il bilanciamento della centrifuga. Saltare questo passaggio potrebbe provocare lesioni personali o danni della centrifuga. - Centrifugare le sospensioni delle cellule (5 min, 805 x g, 4 ° C), eliminare i sovranatante e risospendere in 2 mL di completati RPMI-1640 media.
Nota: Un aggregato di cellule può formare dopo la centrifugazione che è difficile risospendere. Utilizzare una pipetta sierologica da 5 mL e mescolare velocemente per rompere in su prima di procedere.
2. separazione delle frazioni cellulari del tumore e immunitario
Nota: Il tempo necessario per questo passaggio è circa 1 h.
- Aggiungere 3 mL di terreno di gradienti di densità sul fondo di una provetta da centrifuga da 15 mL. Preparare ed etichettare il numero necessario di provette per ogni tumore.
- Strato da 2 mL di sospensione cellulare del tumore in cima il mezzo di gradienti di densità pipettando lentamente lungo il lato del tubo per evitare la miscelazione dei due strati.
- Posizionare i tubi a più livelli nella centrifuga e spin per 20 min a 805 x g, 20 ° C, con freno non.
Nota: È estremamente importante verificare il corretto bilanciamento e assicurarsi che nessun freno viene utilizzato durante la centrifugazione. Qualsiasi interruzione di questo processo si tradurrà in strato di miscelazione e il recupero completo del campione sarà difficile. - Trasferire con cautela il tumore infiltrante del leucocita (TIL) strato e lo strato superiore media ad un nuovo tubo da 15 mL utilizzando una pipetta di trasferimento. Eliminare tutti i rimanenti densità gradiente terreno e risospendere il pellet di tumore nella parte inferiore del tubo in 2 mL di RPMI-1640 completati.
Nota: Dopo la centrifugazione ci saranno quattro livelli visibili dall'alto verso il basso che corrispondono rispettivamente a: media, TILs, densità gradiente medio e pellet cellulare del tumore. Vedere la Figura 2A per un esempio dei vari strati. - Centrifugare l'entrambi TIL e campioni di tumore in separano tubi (5 min, 805 x g, 4 ° C) e scartare il surnatante.
- Risospendere il campione TIL in 200 µ l e il pellet di tumore in 2 mL di completati RPMI-1640 media. Tenere sul ghiaccio per preservare la vitalità.
3. placcatura e colorazione
Nota: Il tempo richiesto per la placcatura è 30 s/tumore; il tempo richiesto per la marcatura di superficie è 1h; il tempo necessario per la colorazione intracellulare è 40 min; il tempo necessario per l'analisi di citometria a flusso è 1 - 4 min/tumore.
- Preparare e conta di targhetta di identificazione un fondo U 96 pozzetti per ogni immunitario macchiatura pannello e una targhetta supplementare per cella.
Nota: In genere, tre piatti sono preparati in totale: un concentrato del linfocita pannello piatto, un piatto di pannello mieloide-messa a fuoco e un piatto di conteggio delle cellule. - Aliquotare le sospensioni unicellulari in ciascuna della colorazione pannello piastre e un volume impostato nella piastra del conteggio.
Nota: La piastra di conteggio viene utilizzata per calcolare il numero totale di celle aggiunte ad ogni pannello di colorazione, consentendo in tal modo i conteggi delle cellule accurata della popolazione. Un citometro a flusso con capacità di campionamento e analisi volumetrica di piastra a 96 pozzetti può fornire il numero di cellule per µ l di ciascun campione e quindi, calcolare il numero di celle aggiunte ad ogni pannello di colorazione. Piastre di conteggio possono essere acquistati il giorno seguente dopo la fissazione durante la notte a 4 ° C, risciacquo con buffer di FACs (tampone fosfato salino (PBS) con 2% FBS) e risospendere in un volume di tampone di FACs. - Lavare le cellule due volte con 200 µ l di soluzione salina tampone fosfato di Dulbecco (DPBS) per campione di centrifugazione (5 min, 805 x g, 4 ° C) e scartare il supernatante tra ogni risciacquo per rimuovere qualsiasi FBS gratis.
- Aggiungere 50 µ l di blocco Fc, mescolare i campioni utilizzando una pipetta multicanale e incubare per 20 min a 4 ° C.
- Aggiungere 50 µ l di 2x concentrato anticorpo targeting extracellulare e attuabilità risolvibile macchia miscela, mescolare utilizzando una pipetta multicanale ed incubare per 30 min al buio a RT o 4 ° C.
Nota: Le esatte condizioni che macchia per l'anticorpo dipendono le istruzioni del produttore. Tutte le diluizioni di colorazione devono essere in DPBS, con nessun FBS aggiunto per evitare la saturazione della tintura attuabilità risolvibile. Si prega di consultare la Tabella dei materiali/attrezzature per le diluizioni ottimale del pannello di colorazione utilizzata in questo manoscritto. Dell'anticorpo e risolvibile vitalità colorazione soluzione è preparato ad una concentrazione di 2 x per fornire un finale 1 x colorazione concentrazione in 100 µ l di volume totale colorazione quando aggiunto al blocco Fc. - Lavare i campioni due volte con tampone di FACs centrifugazione (5 min, 805 x g, 4 ° C) ed eliminando i surnatanti tra ogni risciacquo.
- Risospendere in 200 µ l di soluzione di fissazione/permeabilizzazione 1x e incubare per una notte a 4 ° C al riparo dalla luce.
Nota: L'esperimento può essere messo in pausa durante la notte a questo punto: conservare i campioni a 4 ° C al riparo dalla luce. - Il giorno seguente, centrifugare le piastre (5 min, 805 x g, 4 ° C) e scartare il surnatante.
- Sciacquare una volta con 200 µ l di tampone di permeabilizzazione, centrifugare (5 min, 805 x g, 4 ° C), 1x e scartare il surnatante.
- Aggiungere 100 µ l di 1 pannello colorazione x anticorpo intracellulare concentrato preparato in tampone di permeabilizzazione 1x e incubare per 30 min al buio a RT o a 4 ° C (questo dipende dalla colorazione consigli dal produttore).
- Sciacquare una volta con permeabilizzazione 1x buffer (5 min, 805 x g, 4 ° C), scartare il surnatante e risciacquare una seconda volta con buffer di FACs (PBS con 2% FBS).
- Risospendere i campioni a 300 µ l di tampone di FACs (PBS con 2% FBS), trasferire i campioni a tubi di flusso cytometry ed eseguire analisi di citometria a flusso.
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Representative Results
I nostri risultati dimostrano il beneficio significativo di TIL separazione da componenti del tumore non immune, come spiegato nel protocollo. Inoltre, utilizzando il metodo descritto dimostriamo la significativa eterogeneità immunologica dei tumori solidi stabiliti.
Un problema significativo con molte tecniche di dissociazione del tumore è la perdita di vitalità del campione, più spesso a causa delle condizioni difficili digestione (cioè, elevate temperature, inadeguato apporto di nutrienti, ecc.). Utilizzare il metodo descritto digestione, con o senza densità gradiente medio arricchimento, fornisce circa 70-90% totale vitalità cellulare valutata da citometria a flusso (Figura 1A). Viabilità simili sono stati osservati nel TIL arricchita e tumore arricchito frazioni, suggerendo che questo metodo provoca tossicità complessiva minima (Figura 1, Figura 2C). Inoltre, l'arricchimento di medio gradiente di densità promosso un maggiore di aumento di 2 volte nel CD45 positiva TIL frazione tra cellule vitali totale analizzato digestioni del tumore rispetto ai non-arricchito (Figura 1B, C). Inoltre, arricchimento è stato trovato per migliorare numerosi sottoinsiemi delle cellule immuni comunemente valutati in studi microambiente immuni, compreso le cellule mieloidi-derivato del soppressore (MDSC), cellule dendritiche (DCs), macrofagi, cellule T CD8 e CD4 T-cellule ( Figura 1D, E). Questo suggerisce che l'arricchimento di medio gradiente di densità promuove arricchimenti immunocyte globale e non isolare dei linfociti specifici o popolazioni mieloide (Vedi Figura supplementare 1A, B per la citometria a flusso gating metodo utilizzato per identificare popolazioni di cellule specifiche). Vale la pena notare tuttavia, che molti medias separazione gradienti di densità commercialmente disponibili consentono una frazione significativa degli eritrociti e granulociti di passare attraverso la fase di separazione. Così, se queste popolazioni sono di interesse, ulteriore ottimizzazione dei protocolli può essere necessario.
Figura 1 : Arricchimento delicata ed efficace di infiltrare immune tumore. Tumori di MEER stabiliti sono stati asportati e digerito usando il metodo descritto. A seguito di digestione, sospensioni unicellulari sono stati divisi tale che la metà ha subito arricchimento medio gradiente di densità e l'altra che metà erano macchiata direttamente. (A) valutazione di citometria a flusso cumulativo della vitalità cellulare per digestioni di tumore con o senza arricchimento medio gradiente di densità. (B) rappresentante flusso cytometry gating appezzamenti risultati CD45 arricchimento di positivo delle cellule immuni di una digestione di singolo tumore con e senza arricchimento medio gradiente di densità. (C) cumulativo flusso cytometry CD45 positivo delle cellule percentuali tra totale cellule vitali da digestioni di tumore con o senza arricchimento medio gradiente di densità. (D) rapporti di arricchimento di vari mieloide e immuni popolazioni linfocitarie. I tumori sono digeriti in cella singola sospensione prima di essere macchiato direttamente o in fase di arricchimento gradienti di densità prima dell'analisi di citometria a flusso e colorazione. Ogni rapporto di arricchimento di cellula-tipo è stato calcolato dividendo una percentuale determinata cella-popolazione (tra cellule vitali totale valutato) dalla digestione densità gradiente tumore arricchito dalla sua controparte non-arricchita. Stanghette rappresentano la mediana e i bordi della barra rappresentano le quote minime e massime. (E) tabella di espressione immuni cellulari marcatore utilizzato per identificare ogni popolazione delle cellule immuni analizzati. Significatività statistica è stata determinata con un spaiati t-test o il test di Mann Whitney. p < 0,05, * *p < 0.01, * * *p < 0,001, * * *p < 0,0001, (n = 20 tumori, N = 2 per tutti i grafici). Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Uno dei vantaggi più significativi che fornisce questo metodo è la possibilità di profilare in modo indipendente la frazione non immune tumore. Dopo l'isolamento della frazione pellettato non immune tumore che passa attraverso la fase di medio gradiente di densità, tumore complesso profilatura pannelli può essere eseguita che precedentemente potrebbe sono stati limitati dal numero di fluoroforo e limitazioni di quantità di campione. Figura 2 A Mostra un esempio della caratterizzazione di cytometry di flusso del tumore con oltre 70% redditività e arricchimento di 99% CD45 negativi delle cellule. La frazione di CD45 negativa quindi può essere profilata per numerose caratteristiche del tumore come generale attuabilità del tumore o apoptosi (cioè, caspasi 3, Annessina V, ecc.), capacità di proliferazione (cioè, Ki67) e l'espressione di vari immunosoppressivi marcatori (cioè, programmata morte-legante 1 (PD-L1) o PD-L2). Dovrebbe essere notato tuttavia, che la frazione di CD45 negativa include sia le cellule del tumore, nonché altri elementi stromal e vascolare del microambiente tumorale. Così, se è necessaria la caratterizzazione delle cellule del tumore diretto, un indicatore specifico di tumore delle cellule avrebbe bisogno di essere usato (cioè, il cytokeratin, specifico antigene tumore-associato, ecc.). Allo stesso modo, altri elementi stromal del tumore potrebbero essere facilmente identificati e caratterizzati dopo l'etichettatura con un marker specifico di cellula-tipo come cellule endoteliali vascolari (CD31) di tumore e cancro associati fibroblasti (actina α-liscia del muscolo). Tuttavia, il livello di redditività e arricchimento negativa delle cellule CD45 è altamente coerenza attraverso campioni ripetuti, che indica la robustezza della tecnica di separazione gradienti di densità per arricchimento di componente non immune tumore (Figura 2,B, C ).
Figura 2 : Arricchimento e profilare le funzioni del componente non immune tumore. (A) immagine rappresentativa di un campione dopo arricchimento medio gradiente di densità con il livello visibile (rosa), TIL strato (sottile bianco torbida), livello medio gradiente di densità (chiaro) e pellet di tumore nella parte inferiore del tubo. (B) rappresentante flusso cytometry gating strategia utilizzata per l'analisi della componente del tumore non immune, con grafico a dispersione attuabilità delle cellule (in alto), grafico a dispersione arricchimento negativa delle cellule CD45 (in basso a sinistra) e tre indicatori indipendenti di interesse espressione via trame istogramma (PD-L1 superiore, PD-L2 medio e Ki67 inferiore). Istogramma FMO rappresenta un campione colorato con tutti gli altri colori del pannello ma manca l'indicatore di interesse. Valutazione di citometria a flusso cumulativo di vitalità cellulare (C) e percentuali in negativo delle cellule CD45 (D) tra cellule vitali totale della frazione della pallina del tumore dopo arricchimento medio gradiente di densità (n = 7-8 tumori). Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Nonostante gli sforzi significativi per caratterizzare l'eterogeneità genetica dei tumori solidi, poco lavoro ha dettagliato l'eterogeneità spaziale dei sottoinsiemi immunologiche nei tumori solidi. Così abbiamo mirato a determinare come mieloidi e immunologici sottopopolazioni linfocitarie, variate drasticamente durante un singolo tumore solido. Così, un tumore MEER stabilito è stato diviso in quattro parti uguali con particolare attenzione a garantire che ogni sezione conteneva circa uguale regioni intra-tumorali, come pure uguale dermico peritoneale orientati e porzioni (Figura 3A). Ogni pezzo di tumore è stato digerito, separatamente e poi arricchito da medio gradiente di densità e divisi tra un pannello mieloide e dei linfociti. Questo ha permesso la quantificazione delle diverse funzionalità tra cui un numero di popolazioni comunemente valutati immunocyte: cellule T, cellule T CD4 +, cellule T CD8 +, macrofagi, DCs, MDSC (Vedi Figura complementare 1A, B per la citometria a flusso gating strategia). All'interno di un singolo tumore, cella significativa variabilità tra le partizioni differenti del tumore era noto (Figura 3b). Ad esempio, conta totale delle cellule DC sia delle cellule T sono stati trovati per variare da quanto 4 a 5 volte tra parti adiacenti del tumore. Questi cambiamenti drastici inoltre sono stati notati quando analizzando popolazioni cellulari come percentuale del totale cellule vitali (complementare figura 2A) e sono stati osservati livelli simili nei due altri tumori indipendenti (complementare figura 2B, C). Questi dati dimostrano l'importanza di isolare e analizzare l'intero tumore durante l'esecuzione di analisi del microambiente immuni che possono sembrare controintuitivi se protocolli correnti includono dividendo il tumore per consentire analisi complementari da independent Metodi (cioè, l'istologia, quantificazione di RNA, ecc.). Inoltre, questi dati possono spiegare le discrepanze nelle analisi immunologiche delle biopsie del tumore, come eterogeneità immunologica regionale intratumoral drasticamente potrebbe inclinare i risultati di biopsia.
Figura 3 : Valutazione della eterogeneità immune tumore stabilita. (A) immagine rappresentativa di un tumore MEER stabilito dopo resezione chirurgica (a sinistra) e dopo parti di divisione uguale in 4 adiacente (a destra). Barra della scala è di 1 cm, in nero su ogni immagine. (B) piega cambia di vari mieloide e conteggi delle cellule del linfocita tra ciascuna delle 4 parti adiacenti del tumore; ogni sezione del tumore ha subito la stessa digestione, procedura di arricchimento medio gradiente di densità, colorazione e analisi. Ogni parte del tumore è mostrato come un cambiamento di piega del conteggio delle cellule, come determinato dividendo il conteggio delle cellule da parte del tumore con il numero più basso delle cellule analizzate per una popolazione data cellula. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Supplemental Figura 1: citometria rappresentativa gating strategia utilizzata per il tumore componente immune profiling. (A) strategia di Gating con tracciati a dispersione rispettivi usati per la profilazione immuni del linfocita. (B) strategia di Gating con tracciati a dispersione rispettivi utilizzati per il tumore mieloide immuni profiling. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Supplemental Figura 2: valutazione supplementare di eterogeneità del tumore stabilita. (A) percentuale cellulare tra cellule vitali totale cambiamento di piega da tumore uguale 4 parti mostrate in Figura 3. (B) e (C) sono due ulteriori tumori stabiliti di MEER diviso in 4 parti adiacenti e analizzati per eterogeneità immuni del tumore. Cambiamenti delle cellule totali piega (a sinistra) e percentuali in cella tra cellule vitali totale piegano modifiche (a destra) per ciascuna mieloide e popolazione delle cellule del linfocita analizzato mostrando la variabilità di ciascuna delle 4 parti tumorali adiacenti. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
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Discussion
Il tempo è composto di molecole e componenti cellulari diversi e complessi. La prova recente suggerisce che accurata caratterizzazione di questo ambiente in grado di fornire una migliore comprensione del trattamento esito positivo o negativo e può anche aiutare a identificare i meccanismi di resistenza terapeutica. Ad esempio, aumentando i livelli di intratumoral di varie cellule immunosoppressive (cioè, MDSC, cellule T regolatorie, ecc.) possa attenuare le risposte immunitarie effettrici ed abrogare effetti immunotherapeutic. D'altra parte, la crescente presenza di intratumoral di effettori immuni (ad es., le cellule di T di CD8 + tumore-specifici, cellule natural killer, linfociti T helper) possa essere potenti predittori di successo del trattamento. Un'altra caratterizzazione che continua a rappresentare con precisione lo stato immunologico del tumore è le caratteristiche fenotipiche delle cellule del tumore in se stessi. Questo include l'espressione di vari ligandi immunosopressivi, enzimi o molecole alle risposte immunitarie effettrici di downregulating (cioè, PD-L1, PD-L2, indolamine 2,3 diossigenasi, ossido di azoto, ecc.). Presi insieme, questo dimostra la necessità per la caratterizzazione accurata e ampia del sistema immunitario e tumore caratteristiche cellulari dei tumori solidi.
La tecnica che descriviamo qui permette la separazione e arricchimento del sistema immunitario e tumore componenti delle cellule dei tumori sottocutanei murini solidi. Quindi, la profilatura cytometric di flusso indipendente può essere eseguita affinché il tempo pieno e l'interazione delle cellule del tumore con il tempo può essere apprezzato. A seguito di arricchimento, pannelli di vasto sistema immunitario flusso cytometry possono essere ottimizzati per consentire la caratterizzazione di componenti cellulari mieloidi e linfoidi chiave, nonché una varietà di caratteristiche che descrivono la loro condizione fenotipica. Allo stesso modo, vasto tumore cellulare concentrato pannello può essere utilizzato in modo indipendente per fornire ampia caratterizzazione delle caratteristiche delle cellule del tumore come pure. La relativa semplicità di questa tecnica permette l'analisi simultanea di un gran numero di tumori murini, che è critico per osservare tendenze nonostante la variabilità biologica di modelli murini del tumore. Inoltre, arricchimento immune tumore fornisce migliore identificazione dei sottoinsiemi immunologiche rare (cioè, tumore-specifiche cellule di T citotossiche), che sono spesso significativamente sottorappresentate all'interno del tumore rispetto alle altre componenti delle cellule non immune . Ottimizzazione di questa tecnica può consentire ulteriori analisi a valle su questi sottoinsiemi isolati che richiedono arricchimento, quali analisi ex vivo di coculture, mRNA profilatura, o studi di trasferimento adottivo delle cellule.
Utilizzando questa tecnica in un modello di tumore murino sottocutaneo, dimostriamo l'arricchimento significativo dei sottoinsiemi immuni globale e indipendente. Inoltre dimostriamo il tumore non immune che può essere raggiunto dagli stessi campioni tumorali di profilatura. Infine, vi mostriamo l'importanza dell'intero tumore analisi immunologiche, come abbiamo osservato significativa eterogeneità immunologica in sezioni adiacenti di un tumore. Idealmente, questa tecnica di collagenasi e digestione basati su DNasi e basati su gradiente separazione delle frazioni immuni e non immuni del tumore potrebbe essere applicati alla maggior parte dei modelli di tumore murino, entrambi orthotopic e sottocutaneo. Abbiamo anche osservato che piccoli tumori non stabilito e modelli meno collagene-densa del tumore (cioè, B16 melanoma) spesso non richiedono un passaggio di digestione enzimatica per generare sospensioni unicellulari15; Tuttavia, basato su gradiente immune arricchimento esegue ugualmente anche in questi modelli di tumore, ulteriore convalida la sua versatilità. Malgrado le preoccupazioni precedenti circa digestione dell'antigene della collagenosi su sottoinsiemi specifici cellulari11, dobbiamo ancora osservare una notevole perdita di qualità per uno qualsiasi dei marcatori che abbiamo abbiamo ipotizzato di colorazione. Tuttavia, antigene sensibilità a queste condizioni di digestione deve essere valutata utilizzando campioni di controllo corretto non digerito prima un'ampia adozione di questa tecnica.
In conclusione, la nostra tecnica permette per caratterizzazione accurata, ampio e alto-rendimento dei componenti immuni e non immuni tumore murino tumori solidi. Eseguendo analisi indipendenti di questi sottoinsiemi, ricercatori possono genericamente caratterizzano il tempo e guadagnare meglio informazioni mecanicistiche preclinici terapie tumore solido. Questo metodo può essere applicato facilmente per la stragrande maggioranza dei modelli di tumore murino per alta analisi di rendimento dei linfociti e mieloide immunocyte popolazione conteggi e fenotipi tramite citometria a flusso, o altri dosaggi a valle che richiedono arricchimento sottoinsieme.
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Disclosures
Gli autori non hanno nulla a rivelare.
Acknowledgments
JMN riconosce sostegno finanziario dal National Institute of General Medical Sciences (T32GM088129) e dal National Institute of Dental & Craniofacial Research (F31DE026682) entrambi i National Institutes of Health. Il contenuto è di esclusiva responsabilità degli autori e non rappresentano necessariamente il punto di vista ufficiale del National Institutes of Health. Questo progetto è stato supportato anche dalla citometria e nucleo di ordinamento delle cellule presso il Baylor College of Medicine con finanziamenti dal NIH (P30 AI036211, P30 CA125123 e S10 RR024574) e l'assistenza di esperti di Joel M. Sederstrom.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 6 to 12 week old male C57BL/6 mice | Jackson Laboratory | N/A | Mice used in our tumor studies |
| MEER Murine Syngeneic Cancer Cell line | Acquired from collaborator | N/A | E6/E7 HPV antigen expressing murine tonsillar epithelial cancer cell line |
| 70% isopropyl alcohol | EMD Milipore | PX1840 | |
| Murine surgical tool kit | World Precision Instruments | MOUSEKIT | Primarily only need scissors, tweezers, and a scalpel. |
| 24-well plate | Denville Scientific Inc. | T1024 | Or any 24-well flat bottom plate. |
| RPMI-1640 media | Sigma-Aldrich | R0883 | |
| Collagenase I | EMD Milipore | 234153 | |
| Collagenase IV | Worthington Biochemical Corporation | LS004189 | |
| DNase I | Sigma-Aldrich | 11284932001 | |
| Low Speed Orbital Shaker | BioExpress (supplier: Genemate) | S-3200-LS | Or any orbital shaker. |
| Thermoregulating incubator | Fisher Scientific | 13-255-27 | Or any other thermo-regulated incubator |
| FBS | Sigma-Aldrich | F8192 | |
| EDTA | AMRESCO | E177 | |
| 1 mL Pipette and tips | Eppendorf | 13-690-032 | Or any other pipette and tips |
| 40 um Cell Strainers | Fisher Scientific | 22363547 | |
| 50 mL Centrifuge Tubes | Denville Scientific Inc. | C1062-P | |
| 15 mL Conical Tubes | Denville Scientific Inc. | C1012 | |
| 10 mL Luer-Lok Syringe without needles | BD | 309604 | |
| Lymphoprep Density Gradient Medium | STEMCELL Technologies | 7811 | |
| Transfer Pipettes | Denville Scientific Inc. | P7212 | |
| 96-well U-bottom plates | Denville Scientific Inc. | ||
| DPBS | Sigma Aldrich | D8573 | |
| FoxP3 Transcription Factor Staining Buffer Set | ThermoFisher Scientific | 00-5523-00 | Fix/Permeabilization Buffer and Permeabilization Buffer |
| Thermoregulated Centrifuge | Eppendorf | 5810 R | |
| Attune NxT Flow Cytometer | ThermoFisher Scientific | N/A | For 96-well cell volumetric counting |
| Purified Rat Anti-Mouse CD16/CD32 (Mouse BD Fc Block) Clone 2.4G2 | ThermoFisher Scientific | 553141 | Fc Block |
| LIVE/DEAD Fixable Blue Dead Cell Stain Kit, for UV excitation | ThermoFisher Scientific | L34962 | Fixable viability stain |
| CD45 Monoclonal Antibody (30-F11), APC-eFluor 780 | ThermoFisher Scientific | 47-0451-80 | |
| TCR beta Monoclonal Antibody (H57-597), APC | ThermoFisher Scientific | 17-5961-82 | |
| CD8-α Antibody (KT15), PE | Santa Cruz Biotechnology | sc-53473 | |
| CD4 Monoclonal Antibody (GK1.5), PE-Cyanine5 | ThermoFisher Scientific | 15-0041-81 | |
| MHC Class II (I-A/I-E) Monoclonal Antibody (M5/114.15.2), Alexa Fluor 700 | ThermoFisher Scientific | 56-5321-82 | |
| CD11c Monoclonal Antibody (N418), PE-Cyanine5 | ThermoFisher Scientific | 15-0114-82 | |
| F4/80 Monoclonal Antibody (BM8), eFluor 450 | ThermoFisher Scientific | 48-4801-80 | |
| CD11b Monoclonal Antibody (M1/70), APC | ThermoFisher Scientific | 17-0112-81 | |
| Ly-6G (Gr-1) Monoclonal Antibody (RB6-8C5), PE | ThermoFisher Scientific | 12-5931-82 | |
| CD274 (PD-L1, B7-H1) Monoclonal Antibody (MIH5), PE-Cyanine7 | ThermoFisher Scientific | 25-5982-80 | |
| CD273 (B7-DC) Monoclonal Antibody (122), PerCP-eFluor 710 | ThermoFisher Scientific | 46-9972-82 | |
| Ki-67 Monoclonal Antibody (B56), BV711 | BD Biosciences | 563755 |
References
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