Summary
Hier beschreiben wir eine Methode zum Trennen und Bestandteil der Tumor immun und nicht-immunen Mikroumgebung in etablierte subkutane Tumoren zu bereichern. Diese Technik ermöglicht die separate Analyse der Tumor immun infiltrieren und nicht-immunen Tumor Fraktionen die umfassende Charakterisierung der Tumor immun Mikroumgebung ermöglichen können.
Abstract
Der Tumor immun Mikroumgebung (Zeit) wurde vor kurzem als kritischer Vermittler der Behandlungserfolg bei soliden Tumoren, vor allem für Immuntherapien anerkannt. Jüngste klinische Fortschritte in der Immuntherapie unterstreichen die Notwendigkeit für reproduzierbare Methoden genau und gründlich den Tumor und seine damit verbundenen immun infiltrieren zu charakterisieren. Tumor enzymatischen Verdauung und durchflusszytometrischen Analyse ermöglichen umfassende Charakterisierung von zahlreichen Immunzelle Teilmengen und Phänotypen; Tiefe der Analyse wird jedoch oft durch Fluorophor Beschränkungen der Panel-Design und die Notwendigkeit, große tumorproben erwerben seltene immun Populationen von Interesse zu beobachten begrenzt. So haben wir eine effektive und hohe Durchsatz-Methode zum Trennen und bereichern das Tumor immun Infiltrat aus den nicht-immunen Tumor-Komponenten entwickelt. Die beschriebenen Tumor Verdauung und zentrifugale Dichte basierenden Trennung Technik ermöglicht separate Charakterisierung des Tumors und Tumor immun Infiltrat Brüche und zelluläre Rentabilität bewahrt und stellt somit eine umfassende Charakterisierung des Tumors immunologischen Status. Diese Methode wurde verwendet, um die umfangreichen räumlichen immun Heterogenität in soliden Tumoren, charakterisieren die weiterer Beweis für die Notwendigkeit einer einheitlichen ganzen Tumor immunologischen profiling Techniken. Insgesamt bietet diese Methode eine wirksame und anpassungsfähige Technik für die immunologische Charakterisierung von subkutanen soliden murinen Tumoren; So kann dieses Tool verwendet werden, um den Tumor immunologischen Funktionen besser zu charakterisieren und in die präklinische Bewertung der neuartigen immunotherapeutic Strategien.
Introduction
Die unterdrückende Zeit ist vor kurzem als ein Markenzeichen von Krebs erkannt worden und bekannt, um eine bedeutende Rolle in der Entwicklung, Fortschritt und Schutz der soliden Tumoren Krebserkrankungen sowie ihre Anfälligkeit für Immuntherapie1zu mildern. Die Zeit besteht aus zahlreichen zellulären Teilmengen und Phänotypen, die kritischen Einblick in den immunologischen Status des Tumors liefern. Diese immunologischen Teilmengen können weiter in Zellen Lymphozyten oder myeloischen Ursprungs geschichtet werden, bilden zusammen die Mehrheit der angeborenen und der adaptiven Immunantwort2,3. Die jüngsten Fortschritte auf dem Gebiet der Krebsimmuntherapie haben gezeigt, dass immunotherapeutic Strategien (z.B. immun Checkpoint-Inhibitoren, chimeric Antigen Rezeptor T-Zellen, etc.) das Potenzial haben, dauerhafte Krebs auslösen Regressionen; Sie bleiben jedoch relativ unwirksam bei soliden Tumoren Krebserkrankungen4,5. Zahlreiche Gruppen haben der kritische Hürde gezeigt, dass die Zeit am Behandlung Erfolg6,7spielen kann, und somit müssen genau bewertet werden neue Immuntherapien in der präklinischen Einstellung mit Schwerpunkt speziell bleibt auf ihre Fähigkeit, zu modulieren oder zu überwinden, die Zeit8.
Aktuellen Bemühungen um die Zeit in der Regel charakterisieren nutzen entweder Mikroskopie oder flow Cytometry zusammen mit Antikörper labeling Strategien zur Ermittlung immun zellulären Teilmengen und ihre Funktionen9,10. Diese beiden Strategien informieren einzigartig anders, wie Mikroskopie räumliche Aufwertung des zellulären Teilmengen ermöglicht und Durchflusszytometrie hohen Durchsatz und breiteren Quantifizierung der Zellveränderungen bietet. Trotz der jüngsten Verbesserungen in fluoreszierenden multiplex Immunohistochemistry Optimierung spectral imaging Systeme, die nun bis zu 7 Parameter unterstützen können, begrenzt Panelgröße erschwert breiten Ebene immun Profilierung und somit ist diese Technik oft reserviert für weitere Analysen konzentriert. Infolgedessen bleibt Durchflusszytometrie eines der am weitesten verbreitete Immune profiling Techniken. Trotz seiner weiten Verbreitung in Zeit Charakterisierung sind die Methoden zur Verarbeitung und Färbung sehr variabel. Am häufigsten Protokolle nutzen ein Tumors abkoppelt Enzym (d. h. Collagenases, DNase, etc.) und manuelle Dissoziation Methoden, einzellige Suspensionen zu erreichen, gefolgt von Antikörper Färbung und Analyse7. Trotz der Vorteile der einzelnen Methoden haben zahlreiche Gruppen die umfangreiche Variabilität gezeigt, die durch diese Techniken11induziert werden kann. Dadurch Kreuz-Studie Vergleiche des Tumors Mikroumgebung profiling extrem schwierig, selbst wenn das gleiche Modell murine Tumor zu bewerten. Darüber hinaus diese Methoden bieten begrenzten Potential, Tumor zellulären bewerten und Tumor-Immunantwort zu infiltrieren Komponenten unabhängig voneinander, da beide Komponenten nach der Verdauung durchsetzt sind. Probenmenge begrenzt dann Multi-Panel zu beflecken und Analyse, die ein wichtiges Thema wird bei dem Versuch, seltene immunologische Teilmengen zu charakterisieren (z.B. Tumor-spezifischen T-Zellen)12. Neuere Techniken wie Masse zytometrie oder Cytometry durch Flugzeit (CyTOF), ermöglichen hochdimensionalen phänotypische Analyse der zellulären Teilmengen mit einigen Systemen Panel Entwürfe von mehr als 42 unabhängige Parameter13zu unterstützen. Trotz der enormen Kraft CyTOF Technologie in immun-profiling bleibt es wegen der Kosten, Analyse-Kompetenz und der Zugang zu den Geräten begrenzt. Darüber hinaus viele CyTOF Protokolle empfehlen Reinigung immun Teilmengen, Signal-Rausch-Verhältnis14zu verbessern, und so empfehlen wir, dass unsere Bereicherung-Methode verwendet werden könnte oberhalb der CyTOF Analyse zur Verbesserung der Datenqualität.
Hier beschreiben wir eine Tumor Mikroumgebung Verdauung und Analyse-Methode, die Tumor-Immunantwort enthält infiltrieren Trennung. Diese Methode soll ermöglichen, unabhängige Hochdurchsatz-Profilierung der Tumor immun infiltrieren und Tumor zellulären Fraktionen zur weiteren Charakterisierung von Tumor Mikroumgebung. Mit dieser Methode zeigen wir weiter die Bedeutung der ganze Tumor Analyse, wie eine subkutane soliden Tumoren Modell gefunden wurde, um erhebliche räumliche immunologischen Heterogenität zu haben. Insgesamt kann diese Methode genauer und konsequent zwischen Proben vergleichen, weil es für immun zellulären Teilmengen im Tumor bereichert und ermöglicht unabhängige Profilierung der Tumorzelle und immun Bruchteile eines Tumors.
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Protocol
Alle hier beschriebene Methoden wurden von den institutionellen Animal Care und Nutzung Committee (IACUC) vom Baylor College of Medicine genehmigt.
1. Tumor Ernte und Verdauung
Hinweis: Der Zeitaufwand für die Ernte ist ~ 3-5 min/Tumor, und der Zeitaufwand für die Bearbeitung ist ~ 1 h + 2 – 3 min./Tumor.
- Einschläfern Sie Mäuse durch Kohlendioxid Einatmen und sprühen Sie jede Maus nach unten mit 70 % Ethanol vor der Ernte um Haare Kontamination zu verhindern. Chirurgisch entfernen Sie subkutane Tumoren von den Mäusen und sicherzustellen Sie, dass die Tumoren frei von kontaminierenden Gewebe (z.B. Haare, Haut, Peritoneum, etc. sind). Jeder Tumor in 1,8 mL Basis RPMI-1640-Medien ohne fetalen bovine Serum (FBS) in einer 24-Well-Platte zu platzieren. Halten Sie für größere ernten die Platten kalt auf dem Eis, zelluläre Lebensfähigkeit zu erhalten.
Hinweis: Wenn Sterilität erforderlich ist, müssen alle Tumor Sezierungen in eine biologische Kabinett mit sterilen chirurgischen Werkzeugen (z.B. Scheren, Zangen, etc.) sowie weitere Schritte durchgeführt werden. Tumoren mit der längsten Durchmesser zwischen 0,5 - 1 cm sind optimal, und größere oder kleinere Tumoren erfordern Skalierung der Reagenzien. - Mit einer Schere die Tumoren in weniger als 1 mm3 Stück innerhalb jedes gut geschnitten.
- Bereiten Sie ein 10 x Verdauung Cocktail durch Auflösen von Kollagenase ich bei 10 mg/mL, Kollagenase IV bei 2.500 U/mL und DNase I bei 200 U/mL in base RPMI-1640-Medien (ohne FBS).
Hinweis: Die Verdauung cocktail kann einen Tag im Voraus zubereitet und bei-20 ° C gelagert werden; längerer Lagerung wird jedoch nicht empfohlen, da Enzyme Aktivität im Laufe der Zeit einmal aufgelöst verliert. - Fügen Sie 200 µL 10 x Dissoziation Cocktail mit Kollagenase, I, IV Kollagenase und DNase ich in jede Vertiefung mit 1 mm3 Stücken.
- Lassen Sie die Proben für 1 h bei 37 ° C zu verdauen, während leicht bei 60-100 u/min mit einem orbital Platte Shaker schütteln.
Hinweis: Die Höhe der Temperatur auf 37 ° C während der enzymatischen Verdauung verursachen immun-Zell-Aktivierung. - Neutralisieren Sie nach 1 h die Reaktion durch Zugabe von 1 mL RPMI-1640 Medien ergänzt mit 5 % FBS und 2 mM EDTA in jede Vertiefung.
- Die Tumor-Verdauung und die restlichen Stücke der Tumor in einem 40 µm Zelle Sieb sitzt auf einem 50 mL Zentrifugenröhrchen Pipette.
Hinweis: Schneiden Sie die Spitze weg von einer 1 mL-PIPETTENSPITZE für einfacher Transfer der Tumor Verdauung in das Sieb. - Verwenden Sie einen 10 mL Spritzenkolben, um mechanisch die Tumor-Stücke durch das Sieb disaggregieren. Spülen Sie regelmäßig das Sieb mit 2 mL ergänzt RPMI-1640-Medien (mit 5 % FBS) und wiederholen Sie, bis die Zelle Sieb frei von Tumor ist.
Hinweis: Ca. 4-10 mL der gesamten Medien sollte ausreichen, um das Sieb des Tumors ausreichend spülen.
Hinweis: Legen Sie Proben auf Eis bis dieser Schritt, für alle Proben abgeschlossen ist, zelluläre Lebensfähigkeit zu erhalten. - Passen Sie jede 50 mL Zentrifugenröhrchen, das gleiche Volumen mit Hilfe der ergänzten RPMI-1640-Medien.
Hinweis: Die Einstellung der Lautstärke ist wichtig für den Ausgleich der Zentrifuge. Überspringen diesen Schritt führen Zentrifuge Sach- oder Personenschäden. - Zentrifugieren Sie Zellsuspensionen (805 X g, 5 min, 4 ° C), verwerfen Sie die Überstände zu und neu in 2 mL ergänzt RPMI-1640 Medien auszusetzen.
Hinweis: Es kann eines zellverbandes bilden nach der Zentrifugation, die schwer zu Aufschwemmen. Verwenden Sie eine serologische 5-mL-Pipette und mischen schnell, um es oben zu brechen, bevor Sie fortfahren.
2. Trennung von immun- und Tumor zellulären Brüche
Hinweis: Der Zeitaufwand für diesen Schritt ist ca. 1 h.
- 3 mL Dichte Gradienten Medium am unteren Rand eine 15 mL Zentrifugenröhrchen hinzugeben. Bereiten Sie vor und beschriften Sie genug Rohre für jeder Tumor.
- Schicht 2 mL der Tumor Zellsuspension auf Dichte Gradienten Mediums durch pipettieren langsam hinunter die Seite des Rohres zu verhindern, vermischen der beiden Schichten.
- Legen Sie vorsichtig die geschichteten Röhren in der Zentrifuge und Spin für 20 min bei 805 X g, 20 ° C, mit keine Bremse.
Hinweis: Es ist äußerst wichtig, die richtige Abwägung zu überprüfen und sicherzustellen, dass keine Bremse während der Zentrifugation verwendet wird. Jede Störung dieses Prozesses führt Schicht zu mischen und die vollständige Probenrückgewinnung wird schwierig sein. - Den Tumor infiltriert Leukozyten (TIL) Schicht und die Top-Medien-Schicht, eine neue 15 mL Tube mit einer transferpipette sorgfältig zu übertragen. Verwerfen Sie alle verbleibenden Dichte Gradienten Medium und Aufschwemmen der Tumor Pellet am Boden des Röhrchens in 2 mL ergänzt RPMI-1640.
Hinweis: Nach Zentrifugation werden vier sichtbare Ebenen von oben nach unten die zu entsprechen: Medien, TILs, Dichte-Gradienten-Medium und Tumor Zelle Pellet. Siehe Abbildung 2A ein Beispiel der verschiedenen Schichten. - Zentrifugieren Sie beide die TIL und tumorproben in Röhren (5 min, 805 X g, 4 ° C) zu trennen und entsorgen den überstand.
- Aufschwemmen Sie TIL Probe in 200 µL und der Tumor Pellet in 2 mL ergänzt RPMI-1640-Medien. Halten Sie auf dem Eis, Lebensfähigkeit zu erhalten.
3. Beschichtung und Färbung
Hinweis: Der Zeitaufwand für die Beschichtung ist 30 s/Tumor; der Zeitaufwand für die Oberfläche Färbung ist 1 h; der Zeitaufwand für die intrazelluläre Färbung ist 40 min; der Zeitaufwand für das Flow-zytometrie-Analyse 1 - 4 min/Tumor.
- Vorbereiten und Label eine 96-Well U-Boden-Platte für jede Färbung Panel und einer zusätzlichen Platte für Zelle Immune zählt.
Hinweis: In der Regel drei Platten sind insgesamt bereit: eine Lymphozyten-fokussierten Panel Platte, einer myeloischen ausgerichtete Panel Platte und eine Zellplatte zählen. - Aliquoten panel die einzelligen Suspensionen in jede der Färbung Platten und einer eingestellten Lautstärke in die Graf-Platte.
Hinweis: Die Graf-Platte wird verwendet, um die Gesamtzahl der Zellen hinzugefügt, um jedes Färbung Paneel, wodurch genaue zellenzahlen Bevölkerung zu berechnen. Ein Durchflusszytometer mit 96-Well-Platte-Probenahme und volumetrische Analyse-Funktionen bieten die Anzahl der Zellen pro Mikroliter in jeder Probe, und deshalb berechnen die Anzahl der Zellen, jede Färbung Panel hinzugefügt. Anzahl Platten können erworben werden, am nächsten Tag nach der Fixierung über Nacht bei 4 ° C, mit FACs Puffer spülen (Phosphat gepufferte Kochsalzlösung (PBS) mit 2 % FBS), und resuspending in einem bestimmten Volumen von FACs-Puffer. - Waschen Sie die Zellen zweimal mit 200 µL Dulbeccos Phosphat gepufferte Kochsalzlösung (DPBS) pro Probe durch Zentrifugieren (5 min, 805 X g, 4 ° C) und dem abwerfen des Überstands zwischen jedem spülen, freie FBS zu entfernen.
- Fügen Sie 50 µL der Fc-Block, die Proben mit einer Multi-Kanal-Pipette mischen und 20 min bei 4 ° c inkubieren
- Fügen Sie 50 µL 2 X konzentriert extrazelluläre targeting Antikörper und fixierbar Lebensfähigkeit Fleck Mischung, mischen, mit einer Multi-Kanal-Pipette und 30 min im Dunkeln bei RT oder 4 ° c inkubieren
Hinweis: Die genaue Färbung Bedingungen für den Antikörper ist abhängig von den Anweisungen des Herstellers. Alle Färbung Verdünnungen müssen DPBS, mit keine zusätzlichen FBS, Sättigung des Farbstoffs fixierbar Lebensfähigkeit zu verhindern. Entnehmen Sie bitte der Tabelle der Materialien/Geräte für die optimale Verdünnungen des Bereichs Färbung verwendet in diesem Manuskript. Antikörper und fixierbar Lebensfähigkeit Färbelösung ist bereit in einer Konzentration von 2 X eine endgültige 1 x Färbung Konzentration in 100 µL Gesamtvolumen Färbung bei dem Fc-Block hinzugefügt. - Waschen Sie die Proben zweimal mit FACs Puffer durch Zentrifugieren (5 min, 805 X g, 4 ° C) und die Überstände zwischen jedem spülen zu verwerfen.
- In 200 µL 1 x Fixierung/Permeabilisierung Lösung aufschwemmen und Inkubation über Nacht bei 4 ° C, vor Licht geschützt werden.
Hinweis: Das Experiment kann angehalten werden über Nacht an dieser Stelle: halten Sie die Proben bei 4 ° C, vor Licht geschützt werden. - Am folgenden Tag, Zentrifugieren Sie die Platten (805 X g, 5 min, 4 ° C) und verwerfen Sie den überstand.
- Einmal mit 200 µL 1 x Permeabilisierung Puffer, Zentrifuge (5 min, 805 X g, 4 ° C), spülen und den überstand verwerfen.
- Fügen Sie 100 µL 1 X konzentrierte intrazellulären Antikörper Färbung Panel in 1 X Permeabilisierung Puffer vorbereitet und inkubieren Sie für 30 Minuten im Dunkeln bei RT oder 4 ° C (Dies hängt Färbung Empfehlungen vom Hersteller).
- Spülen, einmal mit 1 X Permeabilisierung Puffer (805 X g, 5 min, 4 ° C), den überstand verwerfen und ein zweites Mal mit FACs Puffer spülen (PBS mit 2 % FBS).
- Aufschwemmen der Proben in 300 µL Puffer FACs (PBS mit 2 % FBS), übertragen Sie die Proben auf Flow Cytometry Röhren und Flow-zytometrie-Analyse durchführen.
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Representative Results
Unsere Ergebnisse zeigen den bedeutenden Nutzen von TIL Trennung von nicht-immunen Tumor Komponenten, wie im Protokoll erklärt. Darüber hinaus zeigen mit der beschriebenen Methode wir die bedeutende immunologische Heterogenität der etablierten soliden Tumoren.
Ein erhebliches Problem mit vielen Tumor Dissoziation Techniken ist der Verlust der Probe Entwicklungsfähigkeit, meist als Folge der harten Verdauung Bedingungen (z.B. erhöhte Temperaturen, unzureichende Nährstoffversorgung, etc.). Einsatz der beschriebenen Verdauung Methode, mit oder ohne Dichte Gradienten mittlere Bereicherung bietet ca. 70-90 % total zellulären Lebensfähigkeit wie Durchflusszytometrie (Abb. 1A) bewertet. Ähnlich wie künstliche verzeichneten die TIL bereichert und Tumor bereichert Brüche, was darauf hindeutet, dass diese Methode bewirkt, minimale allgemeine Toxizität (Abbildung 1, Abbildung 2C dass). Darüber hinaus die Dichte Gradienten mittlere Anreicherung gefördert mehr als 2-fache Erhöhung in der CD45 analysiert Positive TIL Bruchteil unter insgesamt vitaler Zellen im Vergleich zu nicht-angereicherte Tumor-Verdauung (Abbildung 1B, C). Darüber hinaus fand man Bereicherung zu zahlreichen Immunzelle Teilmengen häufig in immun Mikroumgebung Studien, einschließlich myeloid abgeleitet Suppressor-Zellen (MDSCs), Dendritische Zellen (DCs), Makrophagen, CD8 T-Zellen und CD4-T-Zellen ( bewertet Abbildung 1D, E). Dies deutet darauf hin, dass die Dichte Gradienten mittlere Anreicherung fördert die globale Immunocyte Bereicherungen und nicht isolieren, spezifische Lymphozyten oder myeloische Populationen (siehe ergänzende Abbildung 1A, B für die Durchflusszytometrie Anspritzung Methode zur Ermittlung spezifische Zellpopulationen). Es ist erwähnenswert jedoch, dass viele im Handel erhältlichen Dichte Gradienten Trennung Medien einen erheblichen Anteil der Erythrozyten und Granulozyten durchlaufen die Ablösungsphase ermöglichen. Also, wenn diese Populationen von Interesse sind, kann weitere Protokoll Optimierung notwendig sein.
Abbildung 1 : Sanfte und wirksame Bereicherung der Tumor immun infiltrieren. Etablierten MEER Tumoren wurden herausgeschnitten und verdaut mit der beschriebenen Methode. Nach Verdauung waren einzellige Suspensionen aufgeteilt, dass die Hälfte unterzog sich Dichte Gradienten mittlere Anreicherung und die andere, die Hälfte direkt gefärbt waren. (A) der kumulative Durchfluss zytometrie Beurteilung der zellulären Lebensfähigkeit für Tumor-Verdauung mit oder ohne Dichte Gradienten mittlere Bereicherung. (B) repräsentative Durchflusszytometrie Anspritzung Grundstücke CD45 positive Immunzelle Anreicherung von einem einzelnen Tumor Verdauung mit und ohne Dichte Gradienten mittlere Anreicherung zeigen. (C) kumulative Flow Cytometry CD45 Positive Zelle Prozentsätze unter insgesamt vitaler Zellen vom Tumor-Verdauung mit oder ohne Dichte Gradienten mittlere Bereicherung. (D) Bereicherung Verhältnisse verschiedener myeloischer und Lymphozyten immun Populationen. Tumoren wurden in einzellige Suspension vor wird direkt gebeizt oder Dichte Gradienten Bereicherung vor der Färbung und Flow Cytometry Analyse unterziehen verdaut. Jeder Zelltyp Anreicherung Verhältnis war dividiert einen bestimmten Zellpopulation Prozentsatz (unter insgesamt vitaler Zellen geprüft) aus der Dichte Gradienten angereicherte Tumor Verdauung von seinem Pendant nicht bereichert. Taktstriche den Median und die Kanten der Bar darstellen die minimalen und maximalen Verhältnisse. (E) Tabelle Meinungsäußerung immun zellulären Marker zur Identifizierung jeder Immunzelle Bevölkerung analysiert. Statistischer Signifikanz wurde mit einem ungepaarten t-Test oder Mann-Whitney-Test ermittelt. p < 0,05, **p < 0,01, ***p < 0,001 ***p < 0,0001, (n = 20 Tumoren, N = 2 für alle Graphen). Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Einer der wichtigsten Vorteile, die diese Methode bietet ist die Fähigkeit, nicht-immunen Tumor Bruchteil selbständig zu profilieren. Nach Isolierung der gebeizte nicht-immunen Tumor-Fraktion, die die Dichte Gradienten mittlere Phase durchläuft, komplexen Tumor Profilierung Platten durchgeführt werden kann, die zuvor durch Fluorophor Anzahl begrenzt kann und Probe Mengenbeschränkungen. Abbildung 2 A zeigt ein Beispiel für die Tumor Flow Cytometry Charakterisierung mit über 70 % Lebensfähigkeit und 99 % CD45 negativen Zelle Bereicherung. Der CD45 negative Bruchteil kann dann für zahlreiche Tumor Eigenschaften wie allgemeine Tumor Lebensfähigkeit oder Apoptose (z.B. Caspase 3, annexin V, etc.), Verbreitung Kapazität (z.B. Ki67) und den Ausdruck verschiedener profiliert immunsuppressiven Marker (d. h. programmierten Tod-Liganden 1 (PD-L1) oder PD-L2). Anzumerken ist jedoch, dass die CD45 negative Bruchteil Tumorzellen sowie andere Stromazellen und vaskulären Elemente der Tumor Mikroumgebung enthält. Also, wenn direkte Tumor Zelle Charakterisierung erforderlich ist, eine bestimmte Zelle Tumormarker müsste verwendet (z. B. Cytokeratin, Tumor-assoziierten Antigens, etc.). In ähnlicher Weise könnte andere Tumor Stromazellen Elemente leicht identifiziert und charakterisiert nach Kennzeichnung mit einem Zelltyp spezifische Marker wie Tumor vascular endothelial Zellen (CD31) und Krebs assoziierten Fibroblasten (α-Glattmuskel Aktin). Allerdings ist das Niveau der Lebensfähigkeit und CD45 negativen Zelle Bereicherung sehr konsistent über wiederholte Proben, unter Angabe der Robustheit der Dichte-Gradienten-Trenntechnik für nicht-immunen Tumor Komponente Bereicherung (Abbildung 2B, C ).
Abbildung 2 : Anreicherung und Profilierung der nicht-immunen Tumor Komponente Funktionen. (A) repräsentatives Bild einer Probe nach Dichte Gradienten mittlere Anreicherung mit sichtbaren Medienschicht (rosa), TIL Schicht (dünne trübe weiße), Dichte mittlere Verlaufsebene (klar) und Tumor-Pellet am Boden des Röhrchens. (B) repräsentative Durchflusszytometrie Anspritzung Strategie verwendet für die Profilierung der nicht-immunen Tumor-Komponente mit Zelle Lebensfähigkeit Streudiagramm (oben), CD45 negativen Zelle Bereicherung Streudiagramm (unten links) und drei unabhängige Marker von Interesse Ausdruck per Histogramm Grundstücke (PD-L1 oben, PD-L2 Mitte und Ki67 unten). FMO Histogramm stellt eine Probe mit anderen Panel Farben gefärbt aber fehlt die Markierung von Interesse. Der kumulative Durchfluss zytometrie Beurteilung der zellulären Lebensfähigkeit (C) und (D) CD45 negativen Zelle Prozentsätze unter insgesamt vitaler Zellen des Tumors Pellet Bruches nach Dichte Gradienten mittlere Anreicherung (n = 7-8-Tumoren). Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Trotz erhebliche Anstrengungen, um die genetische Heterogenität von soliden Tumoren zu charakterisieren hat wenig Arbeit detailliert die räumliche Heterogenität der immunologischen Teilmengen in soliden Tumoren. Wir wollten damit bestimmen, wie myeloischen und Lymphozyten immunologischen Teilmengen drastisch variiert in einem einzigen soliden Tumoren. So gliederte sich in vier gleiche Teile mit besonderer Sorgfalt um sicherzustellen, dass jeder Abschnitt etwa gleich Intra-Tumor Regionen sowie gleich dermalen und peritoneal-gerichteten Teile(Abbildung 3)enthalten ein etablierte MEER Tumor. Jedes Stück Tumor war separat, verdaut und dann bereichert durch Dichte Gradienten Medium und verteilt sich auf einer myeloischen und Lymphozyten-Panel. Dies ermöglichte Quantifizierung verschiedener Funktionen, darunter eine Reihe von allgemein bewertet Immunocyte Populationen: T-Zellen, CD4 + T-Zellen, CD8 + T-Zellen, Makrophagen, DCs, MDSCs (siehe ergänzende Abbildung 1A, B für die Durchflusszytometrie gating-Strategie). Innerhalb einer einzigen Tumor war wesentliche Zelle Variabilität zwischen den verschiedenen Tumor Partitionen festgestellt (Abb. 3b). Z. B. DC und T Zelle total zellenzahlen erwiesen sich als von mehr als 4 bis 5-fache variieren zwischen benachbarten Tumor teilen. Diese drastischen Veränderungen festgestellt wurden auch wenn Analyse Zelle Bevölkerungen als Prozentsatz der gesamten lebensfähigen Zellen (ergänzende Abbildung 2A) und auf ähnlichem Niveau in zwei unabhängige Tumoren (ergänzende Abbildung 2 b, C) beobachtet wurden. Diese Daten belegen die Wichtigkeit der Isolierung und Analyse des Tumors bei immun Mikroumgebung Analysen, die eingängig, wenn aktuelle Protokolle Aufteilung des Tumors beinhalten um ergänzende Analyse durch unabhängige erlauben mag Methoden (d.h., Histologie, RNA-Quantifizierung, etc.). Darüber hinaus können diese Daten Diskrepanzen in den immunologischen Analysen der Tumor Biopsien, erklären, wie regionale intratumorale immunologischen Heterogenität drastisch Biopsie Ergebnisse verzerren könnten.
Abbildung 3 : Bewertung der etablierten Tumor immun Heterogenität. (A) repräsentatives Bild von einem etablierten MEER Tumor nach chirurgischer Resektion (links) und nach gleicher Aufteilung in 4 angrenzende Teile (rechts). Maßstab ist 1 cm, schwarz auf das jeweilige Bild dargestellt. (B) Falte Änderungen verschiedener myeloischer und Lymphozyten Zelle zählt zwischen jedem der 4 benachbarten Tumor Teile; jeder Tumor-Abschnitt wurde die gleiche Verdauung, Dichte Gradienten mittlere Anreicherung Verfahren, Färbung und Analyse. Jeder Tumor Teil erscheint als eine Zelle Graf Falte ändern, wie bestimmt, indem die Zellzahl durch den Tumor Teil mit der niedrigsten analysierten Zellzahl für einer bestimmten Zellpopulation. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Zusätzliche Abbildung 1: Repräsentative Durchflusszytometrie Anspritzung Strategie für die Tumor immun Komponente Profilerstellung verwendet. (A) Gating Strategie mit jeweiligen Streudiagrammen für die Lymphozyten immun Profilerstellung verwendet. (B) Gating Strategie mit jeweiligen Streudiagrammen für Tumor myeloische immun Profilerstellung genutzt. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Zusätzliche Abbildung 2: zusätzliche Bewertung der etablierten Tumor Heterogenität. (A) zellulären Anteil unter insgesamt vitaler Zellen Falten Wechsel von 4 gleichen Tumor Teile in Abbildung 3dargestellt. (B) und (C) sind zwei weitere etablierte MEER Tumoren in 4 angrenzende Teile geteilt und analysiert für Tumor immun Heterogenität. Graf Falte Zellveränderungen (links) und Zelle Prozentsätze unter insgesamt vitaler Zellen Falten Änderungen (rechts) für jede myeloischen und Lymphozyten Zellpopulation analysiert zeigt die Variabilität jedes der 4 benachbarten Tumor Teile. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
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Discussion
Zur Zeit besteht aus vielfältigen und komplexen zellulären Komponenten und Moleküle. Aktuelle Hinweise darauf, dass genaue Charakterisierung dieser Umgebung bieten ein besseres Verständnis der Behandlungserfolg oder Misserfolg, und sogar helfen kann, Mechanismen der therapeutischen Widerstand zu identifizieren. Intratumorale Anhebung der verschiedenen immunsuppressiven Zellen (d. h. MDSCs, regulatorische T-Zellen, etc.) kann beispielsweise Effektor Immunantworten zu mildern und immuntherapeutischen Wirkungen aufzuheben. Auf der anderen Seite kann die zunehmende Präsenz der intratumorale Effektor immun Populationen (z. B. Tumor-spezifische CD8 + T-Zellen, natürliche Killerzellen, T-Helferzellen) starke Prädiktoren des Behandlungserfolgs. Eine weitere Charakterisierung, die weiterhin genau Tumor immunologischen Status darstellen ist die phänotypische Merkmale der Tumorzellen selbst. Dazu gehören Ausdruck von verschiedenen immunsuppressiven Liganden, Enzyme oder Moleküle, die darauf abzielen, Downregulating Effektor Immunreaktionen (z.B. PD-L1, PD-L2, Indolamine 2,3-Dioxygenase, Stickstoffmonoxid, etc.). Zusammen genommen, zeigt dies die Notwendigkeit für die genaue und umfassende Charakterisierung der immun- und Tumor zelluläre Funktionen von soliden Tumoren.
Die Technik, die wir hier beschreiben kann Trennung und Bereicherung der immun- und Tumor Zellbestandteile von soliden murinen subkutanen Tumoren. Dann kann unabhängige Fluss durchflusszytometrischen Profilerstellung durchgeführt werden, damit die volle Zeit und Interaktion von Tumorzellen mit der Zeit geschätzt werden können. Nach Anreicherung können umfangreiche immun Flow Cytometry Paneele erlauben Charakterisierung von Schlüsselkomponenten myeloischen und lymphatischen Zellen, sowie eine Vielzahl von Funktionen, die ihre phänotypischen Status beschreibt optimiert werden. In ähnlicher Weise umfangreiche Tumor Zelle konzentriert Panel unabhängig lässt sich umfassende Charakterisierung der Tumor Zelle Funktionen sowie zur Verfügung stellen. Die relative Einfachheit dieser Technik ermöglicht die gleichzeitige Analyse einer großen Anzahl von murinen Tumoren, die kritisch für die Beobachtung von Trends trotz der biologischen Variabilität der murinen Tumor-Modelle ist. Darüber hinaus bietet Tumor immun Bereicherung bessere Identifizierung von seltenen immunologischen Teilmengen (d. h. tumorspezifischen zytotoxischen T-Zellen), die oft deutlich, innerhalb des Tumors im Vergleich zu anderen nicht-immunen Zellbestandteile unterrepräsentiert sind . Optimierung dieser Technik können zusätzliche nachgeschaltete Analysen auf diesen isolierten Teilmengen die Bereicherung, wie Coculture ex Vivo Tests erfordern mRNA Profilierung oder Adoptiveltern Zelle Übertragung Studien.
Mit dieser Technik in einem subkutanen murinen Tumor-Modell zeigen wir die bedeutende Bereicherung des globalen und unabhängigen immun Teilmengen. Wir zeigen auch die nicht-immunen Tumor Profilierung, die aus den gleichen tumorproben erreicht werden kann. Schließlich zeigen wir die Bedeutung des ganzen Tumor immunologischen profiling, wie wir signifikante immunologische Heterogenität in den angrenzenden Abschnitten eines Tumors beobachtet. Im Idealfall diese Technik der Kollagenase und DNase-basierte Verdauung und Farbverlauf-basierte Trennung der Tumor immun und nicht-immunen Fraktionen für die Mehrheit der murinen Tumor Modelle, beide orthotopen angewandt werden und subkutane. Wir haben auch beobachtet, dass kleine Tumoren nicht etablierte und weniger Kollagen-Dichte Tumormodellen (d. h. B16 Melanom) erfordern oft keinen enzymatische Verdauung Schritt generieren einzellige Suspensionen15; Farbverlauf-basierte immun Bereicherung führt jedoch gleichermaßen auch in diese Tumormodellen weiter überprüfen seine Vielseitigkeit. Trotz vorheriger Bedenken Kollagenase Antigen Verdauung auf bestimmte zelluläre Teilmengen11müssen wir noch beobachten einen bemerkenswerten Verlust der Färbung Qualität für alle Marken, die wir profiliert haben. Dennoch sollten Antigen Sensibilität für diese Verdauung Bedingungen mit richtigen nicht verdaut Kontrollproben vor der weiten Verbreitung dieser Technik bewertet werden.
Zusammenfassend kann unsere Technik für präzise, breit und Hochdurchsatz-Charakterisierung der Tumor immun und nicht-immunen Komponenten der murinen soliden Tumoren. Durch die Durchführung unabhängiger Profilierung der diese Teilmengen, können Forscher im großen und ganzen charakterisieren die Zeit und besser mechanistische Einblicke in soliden Tumoren präklinischen Therapien. Diese Methode kann leicht angewendet werden, um die überwiegende Mehrheit der murinen Tumor Modelle für Hochdurchsatz-Analyse von Lymphozyten und myeloischer Immunocyte Bevölkerung zählt und Phänotypen über Durchflusszytometrie oder andere nachgeschaltete Assays, die Teilmenge Bereicherung erfordern.
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Disclosures
Die Autoren haben nichts preisgeben.
Acknowledgments
JMN erkennt finanziellen Unterstützung vom National Institute of General Medical Sciences (T32GM088129) und dem nationalen Institut der Dental & Craniofacial Research (F31DE026682) sowohl von den National Institutes of Health. Der Inhalt ist ausschließlich in der Verantwortung der Autoren und nicht unbedingt die offizielle Meinung der National Institutes of Health. Dieses Projekt wurde auch durch die Zytometrie und Zellkern Sortierung am Baylor College of Medicine unterstützt mit Mitteln aus dem NIH (P30 AI036211, P30 CA125123 und S10 RR024574) und die Unterstützung durch Experten der Joel M. Sederstrom.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 6 to 12 week old male C57BL/6 mice | Jackson Laboratory | N/A | Mice used in our tumor studies |
| MEER Murine Syngeneic Cancer Cell line | Acquired from collaborator | N/A | E6/E7 HPV antigen expressing murine tonsillar epithelial cancer cell line |
| 70% isopropyl alcohol | EMD Milipore | PX1840 | |
| Murine surgical tool kit | World Precision Instruments | MOUSEKIT | Primarily only need scissors, tweezers, and a scalpel. |
| 24-well plate | Denville Scientific Inc. | T1024 | Or any 24-well flat bottom plate. |
| RPMI-1640 media | Sigma-Aldrich | R0883 | |
| Collagenase I | EMD Milipore | 234153 | |
| Collagenase IV | Worthington Biochemical Corporation | LS004189 | |
| DNase I | Sigma-Aldrich | 11284932001 | |
| Low Speed Orbital Shaker | BioExpress (supplier: Genemate) | S-3200-LS | Or any orbital shaker. |
| Thermoregulating incubator | Fisher Scientific | 13-255-27 | Or any other thermo-regulated incubator |
| FBS | Sigma-Aldrich | F8192 | |
| EDTA | AMRESCO | E177 | |
| 1 mL Pipette and tips | Eppendorf | 13-690-032 | Or any other pipette and tips |
| 40 um Cell Strainers | Fisher Scientific | 22363547 | |
| 50 mL Centrifuge Tubes | Denville Scientific Inc. | C1062-P | |
| 15 mL Conical Tubes | Denville Scientific Inc. | C1012 | |
| 10 mL Luer-Lok Syringe without needles | BD | 309604 | |
| Lymphoprep Density Gradient Medium | STEMCELL Technologies | 7811 | |
| Transfer Pipettes | Denville Scientific Inc. | P7212 | |
| 96-well U-bottom plates | Denville Scientific Inc. | ||
| DPBS | Sigma Aldrich | D8573 | |
| FoxP3 Transcription Factor Staining Buffer Set | ThermoFisher Scientific | 00-5523-00 | Fix/Permeabilization Buffer and Permeabilization Buffer |
| Thermoregulated Centrifuge | Eppendorf | 5810 R | |
| Attune NxT Flow Cytometer | ThermoFisher Scientific | N/A | For 96-well cell volumetric counting |
| Purified Rat Anti-Mouse CD16/CD32 (Mouse BD Fc Block) Clone 2.4G2 | ThermoFisher Scientific | 553141 | Fc Block |
| LIVE/DEAD Fixable Blue Dead Cell Stain Kit, for UV excitation | ThermoFisher Scientific | L34962 | Fixable viability stain |
| CD45 Monoclonal Antibody (30-F11), APC-eFluor 780 | ThermoFisher Scientific | 47-0451-80 | |
| TCR beta Monoclonal Antibody (H57-597), APC | ThermoFisher Scientific | 17-5961-82 | |
| CD8-α Antibody (KT15), PE | Santa Cruz Biotechnology | sc-53473 | |
| CD4 Monoclonal Antibody (GK1.5), PE-Cyanine5 | ThermoFisher Scientific | 15-0041-81 | |
| MHC Class II (I-A/I-E) Monoclonal Antibody (M5/114.15.2), Alexa Fluor 700 | ThermoFisher Scientific | 56-5321-82 | |
| CD11c Monoclonal Antibody (N418), PE-Cyanine5 | ThermoFisher Scientific | 15-0114-82 | |
| F4/80 Monoclonal Antibody (BM8), eFluor 450 | ThermoFisher Scientific | 48-4801-80 | |
| CD11b Monoclonal Antibody (M1/70), APC | ThermoFisher Scientific | 17-0112-81 | |
| Ly-6G (Gr-1) Monoclonal Antibody (RB6-8C5), PE | ThermoFisher Scientific | 12-5931-82 | |
| CD274 (PD-L1, B7-H1) Monoclonal Antibody (MIH5), PE-Cyanine7 | ThermoFisher Scientific | 25-5982-80 | |
| CD273 (B7-DC) Monoclonal Antibody (122), PerCP-eFluor 710 | ThermoFisher Scientific | 46-9972-82 | |
| Ki-67 Monoclonal Antibody (B56), BV711 | BD Biosciences | 563755 |
References
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