Summary
Her beskriver vi en metode til at adskille og berige komponenter af tumor immun- og ikke-immune mikromiljø i etablerede subkutane tumorer. Denne teknik giver mulighed for en separat analyse af tumor immun infiltrere og ikke-immune tumor fraktioner, som kan tillade omfattende karakterisering af tumor immun mikromiljø.
Abstract
Tumor immun mikromiljø (tid) er for nylig blevet anerkendt som en kritisk mægler af behandlingsrespons i solide tumorer, især for immunoterapi. Nylige kliniske fremskridt i immunterapi fremhæve behovet for reproducerbare metoder til præcist og grundigt karakterisere tumor og dens tilknyttede immun infiltrere. Tumor enzymatisk fordøjelse og flow cytometric analyse giver bred karakterisering af talrige immun celle subsets og fænotyper; Men, dybde på analysen er ofte begrænset af fluorophore restriktioner på panel design og behovet for at erhverve store tumor prøver at observere sjældne immun populationer af interesse. Således har vi udviklet en effektiv og høj overførselshastighed metode til adskillelse og berigende tumor immun infiltrere fra ikke-immune tumor komponenter. Beskrevet tumor fordøjelse og centrifugal tæthed-baseret adskillelse teknik giver mulighed for separate karakterisering af tumor og tumor immun infiltrere fraktioner og bevarer cellulære levedygtighed og således giver en bred karakterisering af tumor immunologiske stat. Denne metode blev brugt til at karakterisere den omfattende rumlige immun heterogenitet i solide tumorer, som yderligere viser behovet for konsekvent hele tumor immunologiske profilering teknikker. Samlet set giver denne metode en effektiv og fleksibel teknik for immunologiske karakterisering af subkutane solid murine tumorer; som sådan, dette værktøj kan bruges til bedre karakteriserer de tumorsygdomme immunologiske funktioner og i de prækliniske evaluering af roman immunterapeutisk strategier.
Introduction
Den smittespredningshæmmende tid er for nylig blevet anerkendt som et adelsmærke for kræft, og er kendt for at spille en væsentlig rolle i udvikling, progression og beskyttelse af solid tumor kræftformer samt afbøde deres følsomhed over for immunterapi1. TID er sammensat af mange cellulære delmængder og fænotyper, som alle giver kritisk indsigt i den immunologiske tilstand af tumor. Disse immunologiske delmængder kan yderligere stratificeret til celler af lymfocyt eller myeloide oprindelse, der sammen udgør flertallet af medfødte og adaptive immunrespons2,3. De seneste fremskridt inden for cancer immunterapi har påvist at immunterapeutisk strategier (dvs., immun checkpoint hæmmere, kimære antigen receptor T-celler, etc.) har potentiale til at fremkalde holdbare regressioner; de er dog stadig relativt ineffektive i solid tumor kræftformer4,5. Adskillige grupper har vist den kritiske hurdle at tiden kan spille på behandling succes6,7, og således er der stadig skal præcist vurdere nye immunoterapi i indstillingen prækliniske specifikt fokuserer på deres evne til at modulere eller overvinde tid8.
Igangværende bestræbelser på at karakterisere tid typisk udnytte enten mikroskopi eller flow flowcytometri sammen med antistof mærkning strategier til at identificere immun cellulære delmængder og deres funktioner9,10. Disse to strategier give entydigt forskellige oplysninger, som mikroskopi giver rumlige påskønnelse af cellulære delmængder og flowcytometri giver høj overførselshastighed og bredere kvantificering af cellulære ændringer. Trods de nylige forbedringer i fluorescerende multiplex Immunhistokemi optimering spektrale Billeddannende systemer, som nu kan understøtte op til 7 parametre, begrænset panel størrelse vanskeliggør bred plan immun profilering og denne teknik er således ofte forbeholdt mere fokuseret analyser. Som et resultat, flowcytometri er fortsat en af de mest udbredte immun profilering teknikker. På trods af dens udbredte brug i tid karakterisering er metoderne til forarbejdning og farvning meget varierende. Oftest protokoller udnytte en tumor miljøomkostningerne enzym (dvs., collagenases, DNase, etc.) og manuel dissociation metoder til at opnå én celle suspensioner, efterfulgt af antistof farvning og analyse7. Trods fordelene ved hver metode, har talrige grupper vist den omfattende variation, der kan være fremkaldt gennem disse teknikker11. Dette gør cross-undersøgelse sammenligninger af tumor mikromiljø profilering yderst vanskeligt, selv ved vurderingen af den samme murine tumor model. Desuden, disse metoder giver begrænset potentiale til at vurdere tumor cellulære og tumor immun infiltrere komponenter uafhængigt, da begge komponenter er afbrudt efter fordøjelsen. Vareprøveantal derefter begrænser multi-panel farvning og analyse, som bliver et stort problem, når du forsøger at karakterisere sjældne immunologiske delmængder (dvs. tumor-specifikke T-celler)12. Nyere teknikker såsom masse flowcytometri eller flowcytometri af tid for flyvning (CyTOF), Tillad high-dimensionelle fænotypiske analyser af cellulære delmængder med nogle systemer understøtter panel design af større end 42 uafhængige parametre13. Trods den enorme magt CyTOF teknologi i immun profilering, fortsat det begrænset på grund af regning, analyse ekspertise og adgang til udstyret. Desuden mange CyTOF protokoller anbefaler rensning af immun delmængder at forbedre signal-støj forhold14, og derfor foreslår vi, at vores berigelse metode kan anvendes forud for CyTOF analyse til at forbedre datakvaliteten.
Heri beskrives en tumor mikromiljø fordøjelse og analyse metode, der inkorporerer tumor immun infiltrere adskillelse. Formålet med denne metode er at tillade uafhængige høj overførselshastighed profilering af tumor immun infiltrere og tumor cellulære brøker for bredere karakterisering af tumor mikromiljø. Bruger denne metode, demonstrere vi yderligere vigtigheden af udfører hele tumor analyse, som en subkutan solid tumor model blev fundet for at have betydelig rumlig immunologiske heterogenitet. Samlet set kan denne metode mere nøjagtigt og konsekvent sammenligne mellem prøver fordi det beriger for immun cellulære delmængder inden for tumor og giver mulighed for uafhængige profilering af tumor celle og immun brøkdele af en tumor.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle metoder beskrevet her er blevet godkendt af institutionelle Animal Care og brug udvalg (IACUC) af Baylor College of Medicine.
1. tumor høst og fordøjelse
Bemærk: Den nødvendige tid til høst er ~ 3-5 min/tumor, og den nødvendige tid til behandling er ~ 1 h + 2-3 min/tumor.
- Aflive mus ved CO2-indånding og sprøjte hver musen ned med 70% ethanol før høsten for at forhindre hår forurening. Kirurgisk fjerne subkutane tumorer fra mus og sikre, at tumorer er fri for enhver kontaminerende væv (dvs., hår, hud, bughinde, osv.). Placer hver tumor i 1,8 mL af base RPMI-1640 medier uden føtal bovint serum (FBS) i en 24-godt plade. For større høstudbytte, holde plader kold på is at bevare cellulære levedygtighed.
Bemærk: Hvis sterilitet er påkrævet, skal alle tumor dissektioner skal udføres i et kabinet med steril kirurgiske værktøjer (dvs., saks, pincet, etc.), samt yderligere skridt biosikkerhed. Tumorer med den længste diameter mellem 0,5 - 1 cm er optimal, og større eller mindre tumorer vil kræve skalering af reagenser. - Brug saks til at skære tumorer i mindre end 1 mm3 stykker i hver brønd.
- Forberede en 10 x fordøjelsen cocktail ved at opløse collagenase jeg på 10 mg/mL, collagenase IV på 2.500 U/mL og DNase jeg på 200 U/mL i base RPMI-1640 medier (uden FBS).
Bemærk: Cocktail fordøjelsen kan være forberedt en dag i forvejen og opbevares ved-20 ° C; længere tids opbevaring anbefales dog ikke, som enzymer vil miste aktivitet over tid en gang opløst. - Tilføje 200 µL af 10 x dissociation cocktail indeholdende collagenase jeg, collagenase IV og DNase I til hver brønd med 1 mm3 stykker.
- Tillad prøver at fordøje for 1 timer ved 37 ° C mens let ryste på 60-100 rpm ved hjælp af en orbital plade shaker.
Bemærk: Udvidelse af temperaturen til 37 ° C under den enzymatiske fordøjelsen kan forårsage immun celle aktivering. - Efter 1 time, neutralisere reaktionen ved tilsætning af 1 mL af RPMI-1640 media suppleret med 5% FBS og 2 mM EDTA til hver brønd.
- Der afpipetteres tumor fordøjelsen og de resterende tumor stykker i en 40 µm celle si siddende på toppen af en 50 mL-centrifugerør.
Bemærk: Skåret spidsen af en 1 mL pipette tip til nemmere overførsel af tumor fordøjelse til sien. - Bruge en 10 mL sprøjte stemplet til mekanisk disaggregate tumor stykker gennem sien. Periodisk skyl si med 2 mL af suppleres med RPMI-1640 medier (indeholdende 5% FBS) og Gentag indtil cellen si fremgår af tumor.
Bemærk: Ca. 4-10 mL total media skulle være tilstrækkeligt til tilstrækkeligt skyl sien af tumor.
Bemærk: Placere prøver på is, indtil dette trin er fuldført for alle prøver at bevare cellulære levedygtighed. - Justere hver 50 mL-centrifugerør på den samme diskenhed ved hjælp af den suppleres med RPMI-1640 medier.
Bemærk: Justering af lydstyrken er kritisk for centrifuge balancering. Spring dette trin kunne resultere i centrifuge skade eller personskade. - Centrifugeres celle suspensioner (5 min, 805 x g, 4 ° C) og kassér analysere genopslæmmes i 2 mL af suppleres med RPMI-1640 medier.
Bemærk: En celle aggregat kan danne efter centrifugering, der er vanskelig at resuspend. Brug en 5 mL serologisk pipette og bland hurtigt til at bryde det, før du fortsætter.
2. adskillelse af immunforsvaret og Tumor cellulære fraktioner
Bemærk: Den nødvendige tid til dette trin er ca 1 time.
- Tilføj 3 mL af tæthed gradient medium til bunden af en 15 mL centrifugeglas. Forberede og etiket nok rør til hver tumor.
- Lag 2 mL af tumor cellesuspension på toppen af den tæthed gradient medium af pipettering langsomt ned langs siden af røret at forebygge sammenblanding af de to lag.
- Omhyggeligt placere de lag rør i centrifuge og spin i 20 min. på 805 x g, 20 ° C, med ingen bremse.
Bemærk: Det er yderst vigtigt at kontrollere korrekt balance og sikre, at ingen bremsen anvendes under centrifugering. Enhver afbrydelse af processen medfører lag blanding og fuld prøve opsving bliver svært. - Omhyggeligt overføre tumor infiltrerer leukocyt (TIL) lag og top media lag til et nyt 15 mL rør ved hjælp af en overførsel pipette. Kassér alle resterende tæthed gradient medium og resuspenderes tumor i bunden af røret i 2 mL af suppleres med RPMI-1640.
Bemærk: Efter centrifugering vil der være fire synlige lag fra top til bund, som henholdsvis svarer til: medier, TILs, tæthed gradient medium og tumor celle pellet. Se figur 2A for et eksempel på de forskellige lag. - Centrifugeres både TIL og tumor prøver i separate rør (5 min, 805 x g, 4 ° C) og supernatanten.
- Resuspend TIL prøven i 200 µL og tumor pellet i 2 mL af suppleres med RPMI-1640 medier. Holde på isen for at bevare levedygtighed.
3. plating og farvning
Bemærk: Den nødvendige tid til plating er 30 s/tumor; den nødvendige tid til overflade farvning er 1 h; den nødvendige tid til intracellulær farvning er 40 min; den tid, der kræves for flow flowcytometri analyse er 1 - 4 min/tumor.
- Forberede og etiket en 96-brønd U-nederste plade for hver immun farvning panel og en ekstra plade for celle tæller.
Bemærk: Typisk tre plader er forberedt i alt: en lymfocyt-fokuserede panel plade, en myeloid-fokuserede panel plade og en celle count plade. - Alikvot encellede suspensioner i hver af farvning panel plader og et sæt volumen i Grev pladen.
Bemærk: Grev plade der bruges til at beregne det samlede antal celler føjes til hver farvning panel, hvorved nøjagtig celle befolkning tæller. En flow Flowcytometret med 96 brønde plade volumetrisk analyse- og prøveudtagningsmetoder kapaciteter kan give antallet af celler pr. µL i hver prøve, og derfor beregne antallet af celler føjes til hver farvning panel. Antal plader kan erhverves i den følgende dag efter fiksering natten over ved 4 ° C, skylning med FACs buffer (fosfatbufferet saltopløsning (PBS) med 2% FBS), og resuspending i et sæt antal FACs buffer. - Cellerne vaskes to gange med 200 µL af Dulbeccos fosfatbufferet saltopløsning (DPBS) pr. prøve ved centrifugering (5 min, 805 x g, 4 ° C) og kassere supernatanten mellem hvert skyl at fjerne enhver gratis FBS.
- Tilsæt 50 µL af Fc blok, bland prøver ved hjælp af en multi-kanal pipette, og Ruger i 20 min. ved 4 ° C.
- Tilsæt 50 µL af 2 x koncentreret ekstracellulære målretning antistof og fixable levedygtighed pletten blanding, blandes med en multikanal-pipette, og Inkuber i 30 min. i mørke ved RT eller 4 ° C.
Bemærk: De nøjagtige farvning betingelser for antistof afhænger af producentens anvisninger. Alle farvning fortyndinger skal være i DPBS, med ingen ekstra FBS at forhindre mætning af fixable levedygtighed farvestof. Se venligst Tabellen af materialer/udstyr til de optimale fortyndinger af panelet farvning anvendes i dette håndskrift. Antistof og fixable levedygtighed farvning løsning er forberedt på en 2 x koncentration til at give en sidste 1 x farvning koncentration i 100 µL af samlede farvning når føjet til Fc blok. - Vask prøver to gange med FACs buffer ved centrifugering (5 min, 805 x g, 4 ° C) og kassere analysere mellem hvert skyl.
- Resuspend i 200 µL 1 x fiksering/permeabilization løsning og inkuberes natten over ved 4 ° C beskyttet mod lys.
Bemærk: Eksperimentet kan være midlertidigt natten på dette punkt: holde prøver ved 4 ° C beskyttet mod lys. - Den følgende dag, centrifugeres plader (5 min, 805 x g, 4 ° C) og supernatanten.
- Skyl en gang med 200 µL 1 x permeabilization buffer, centrifugeres (5 min, 805 x g, 4 ° C), og supernatanten.
- Tilsæt 100 µL 1 x koncentreret intracellulære antistof farvning panel forberedt i 1 x permeabilization buffer og Inkuber i 30 min. i mørke ved RT eller 4 ° C (dette afhænger af farvning anbefalinger fra fabrikanten).
- Skyl når med 1 x permeabilization buffer (5 min, 805 x g, 4 ° C), supernatanten, og skyl en anden gang med FACs buffer (PBS med 2% FBS).
- Resuspend prøverne i 300 µL af FACs buffer (PBS med 2% FBS), overføre prøverne at flow flowcytometri rør og udføre flow flowcytometri analyse.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Vores resultater viser betydelig gavn af TIL adskillelse fra ikke-immune tumor komponenter, som forklaret i protokollen. Derudover påvise ved hjælp af metoden beskrevet vi betydelige immunologiske heterogenitet af etablerede solide tumorer.
Et stort problem med mange tumor dissociation teknikker er tabet af prøven levedygtighed, oftest som følge af barske fordøjelse betingelser (dvs., forhøjede temperaturer, utilstrækkelig næringsstofforsyning, osv.). Brug af metoden beskrevet fordøjelse med eller uden tæthed gradient medium berigelse, giver ca 70-90% samlet cellulære levedygtighed som vurderet ved flowcytometri (fig. 1A). Lignende viabilities blev observeret i TIL beriget og tumor beriget fraktioner, tyder på, at denne metode forårsager minimal samlede toksicitet (figur 1, figur 2C). Derudover tæthed gradient medium berigelse fremmes en større end 2-fold stigning i CD45 positive TIL brøkdel blandt samlede levedygtige celler analyseret sammenlignet med ikke-beriget tumor digestions (figur 1B, C). Derudover blev berigelse fundet for at øge talrige immun celle subsets almindeligt vurderet i immun mikromiljø undersøgelser, herunder myeloid-afledte suppressor celler (MDSCs), dendritiske celler (DCs), makrofager, CD8 T-celler og T-CD4-celler ( Figur 1D, E). Dette tyder på, at den tæthed gradient medium berigelse fremmer globale immunocyte enrichments og ikke isolere specifikke lymfocytter eller myeloide populationer (Se supplerende figur 1A, B til flowcytometri gating metode, der bruges til at identificere bestemt cellepopulationer). Det er værd at bemærke, at mange kommercielt tilgængelige tæthed gradient adskillelse medier giver mulighed for en betydelig del af erytrocytter og granulocytter til at passere gennem adskillelse fase. Således, hvis disse populationer er af interesse, yderligere protokol optimering kan være nødvendigt.
Figur 1 : Skånsom og effektiv berigelse af tumor immun infiltrere. Etablerede MEER tumorer var skåret ud og fordøjet ved hjælp af metoden beskrevet. Efter fordøjelse, encellede suspensioner var opdelt således at halvdelen undergik tæthed gradient medium berigelse og den anden halvdel var direkte farves. (A) kumulativ flow flowcytometri vurdering af cellulære levedygtighed for tumor digestions med eller uden tæthed gradient medium berigelse. (B) repræsentative flowcytometri gating parceller viser CD45 positive immun celle berigelse af en enkelt tumor fordøjelse med og uden tæthed gradient medium berigelse. (C) kumulativ flow flowcytometri CD45 positive celle procentdele blandt samlede levedygtige celler fra tumor digestions med eller uden tæthed gradient medium berigelse. (D) berigelse nøgletal af forskellige myeloid og lymfocyt immun populationer. Tumorer blev fordøjet i encellede suspension før at være plettet direkte eller undergår tæthed gradient berigelse før farvning og flow flowcytometri analyse. Hver celle-type berigelse forholdet blev beregnet ved at dividere en given celle-befolkning procentdel (blandt samlede levedygtige celler vurderet) fra tæthed gradient beriget tumor fordøjelse af de ikke-beriget modstykke. Bar linjer repræsenterer medianen og kanterne af baren repræsenterer de minimale og maksimale nøgletal. (E) tabel af immun cellulære markør udtryk bruges til at identificere hver immun celle befolkning analyseret. Statistisk signifikans blev fastsat med en uparret t-test eller Mann-Whitney test. p < 0,05, **p < 0,01, ***p < 0,001, ***p < 0,0001, (n = 20 tumorer, N = 2 for alle grafer). Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
En af de mest betydelige fordele, som denne metode giver er muligheden for at uafhængigt profil ikke-immune tumor brøkdel. Efter isolering af pelleted ikke-immune tumor brøkdel, der passerer gennem den tæthed gradient medium fase, komplekse tumor profilering paneler kan udføres som tidligere kan have været begrænset af fluorophore nummer og prøve mængden begrænsninger. Figur 2 A viser et eksempel på en tumor flow flowcytometri karakterisering med over 70% levedygtighed og 99% CD45 negative celle berigelse. CD45 negative brøkdel kan derefter blive profileret for talrige tumor funktioner som samlede tumor levedygtighed eller apoptose (dvs. caspase 3, annexin V, etc.), spredning kapacitet (dvs. Ki67) og udtryk for forskellige immunosuppressiv markører (dvs. programmeret død-ligand 1 (PD-L1) eller PD-L2). Det skal dog bemærkes, at CD45 negative fraktion indeholder både tumorceller samt andre stromale og vaskulære elementer af tumor mikromiljø. Således, hvis direkte tumor celle karakterisering er påkrævet, en tumor celle specifikke markør skulle være brugt (dvs. cytokeratin, specifikke tumor-associerede antigen, osv.). På samme måde, andre tumor stromale elementer kunne nemt identificeret og karakteriseret efter mærkning med en celletype specifikke markør som tumor vascular endothelial celler (CD31) og kræft forbundet fibroblaster (α-glat muskel aktin). Ikke desto mindre er niveau af levedygtighed og CD45 negative celle berigelse meget konsekvent på tværs af gentagne prøver, der angiver robustheden af tæthed gradient adskillelse teknik til ikke-immune tumor komponent berigelse (figur 2B, C ).
Figur 2 : Berigelse og profilering af ikke-immune tumor komponent funktioner. (A) repræsentativt billede af en prøve efter tæthed gradient medium berigelse med synlig medier lag (pink), TIL lag (tynde skumle hvide), tæthed gradient medium lag (klart) og tumor pellet i bunden af røret. (B) repræsentative flowcytometri gating strategi, der anvendes til profilering komponenten ikke-immune tumor celle levedygtighed scatter plot (top), CD45 negative celle berigelse scatter plot (nederst til venstre) og tre uafhængige markører af interesse udtryk via histogram parceller (PD-L1 top, PD-L2 midten og Ki67 bunden). FMO histogrammet repræsenterer en stikprøve farves med alle andre farver, bedømmelseskomite men mangler markør af interesse. Kumulative flow flowcytometri vurdering af (C) cellulære levedygtighed og (D) CD45 negative celle procentdele blandt samlede levedygtige celler i tumor pellet brøk efter tæthed gradient medium berigelse (n = 7-8 tumorer). Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Trods betydelige bestræbelser på at karakterisere de genetiske heterogenitet af solide tumorer, har lidt arbejde detaljeret den rumlige heterogenitet af immunologiske delmængder i solide tumorer. Vi således til formål at afgøre, hvordan myeloid og lymfocyt immunologiske delmængder drastisk varierede i hele en enkelt solid tumor. Således, en etableret MEER tumor var opdelt i fire lige store dele med særlig omhu for at sikre, at hver enkelt afsnit indeholdt ca lige samhandel tumorsygdomme regioner, som lig dermal - og peritoneal-vendende dele (fig. 3A). Hver tumor stykke var fordøjet separat, og derefter beriget af tæthed gradient medium og fordelt blandt en myeloid og lymfocyt panel. Dette gav mulighed for kvantificering af forskellige funktioner, herunder en række almindeligt vurderet immunocyte populationer: T-celler, CD4 + T-celler, CD8 + T-celler, makrofager, DCs, MDSCs (Se supplerende figur 1A, B til flowcytometri gating strategi). Inden for en enkelt tumor var betydelig celle variation mellem de forskellige tumor partitioner bemærket (fig. 3b). For eksempel, både DC og T-celle cellen total tæller blev fundet for at variere så meget som 4 til 5-fold blandt tilstødende tumor dele. Disse drastiske ændringer blev også noteret Hvornår analysere celle populationer som en procentdel af samlede levedygtige celler (supplerende figur 2A) og blev observeret på nogenlunde samme niveau i to andre uafhængige tumorer (supplerende figur 2B, C). Disse data viser vigtigheden af at isolere og analysere hele svulsten, når du udfører immun mikromiljø analyser, som kan virke ulogisk, hvis nuværende protokoller omfatter dividere tumor for at tillade supplerende analyse af uafhængige metoder (dvs., histologi, RNA kvantificering, osv.). Derudover kan disse data forklare forskelle i immunologiske analyser af tumor biopsier, som regionale intratumoral immunologiske heterogenitet kunne drastisk forvrænge biopsi resultater.
Figur 3 : Vurdering af etablerede tumor immun heterogenitet. (A) repræsentativt billede af en etableret MEER tumor efter kirurgisk resektion (venstre) og efter samme opdeling i 4 tilstødende dele (til højre). Skalalinjen er 1 cm, vist i sort på hvert billede. (B) Fold ændringer af forskellige myeloid og lymfocytter celle tæller mellem hver af de 4 tilstødende tumor dele; sektionerne tumor undergik den samme fordøjelse, tæthed gradient medium berigelse procedure, farvning og analyse. Hver tumor del er vist som en celle count fold ændring, som bestemmes ved at dividere sin celletal af tumor del med den laveste analyseret celletal for en given celle population. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Supplerende figur 1: repræsentative flowcytometri gating strategi, der anvendes til tumor immune komponent profilering. (A) Gating strategi med respektive scatter parceller bruges til lymfocyt immun profilering. (B) Gating strategi med respektive scatter parceller bruges til tumor myeloide immun profilering. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Supplerende figur 2: yderligere vurdering af etablerede tumor heterogenitet. (A) cellulære procent blandt samlede levedygtige celler fold ændring fra 4 lige tumor dele vist i figur 3. (B) og (C) er to yderligere etablerede MEER tumorer opdelt i 4 tilstødende dele og analyseret for tumor immun heterogenitet. Grev fold celleforandringer (venstre) og celle procentdele blandt samlede levedygtige celler fold ændringer (til højre) for hver myeloid og lymfocytter celle befolkning analyseret viser variationen i hver af de 4 tilstødende tumor dele. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
TID er sammensat af forskellige og komplekse cellulære komponenter og molekyler. Seneste tyder på at nøjagtig karakterisering af dette miljø kan give en bedre forståelse af behandlingen succes eller fiasko, og kan endda hjælpe med at identificere mekanismer af terapeutiske modstand. For eksempel, kan øge intratumoral niveauet af forskellige immunosuppressive celler (dvs., MDSCs, T regulerende celler, etc.) afbøde effektor immunrespons og ophæve immunterapeutisk effekter. På den anden side, kan stigende intratumoral tilstedeværelsen af effektor immun populationer (fx tumor-specifik CD8 + T-celler, natural killer celler, T helper celler) være stærke prædiktorer for behandlingen succes. En anden karakterisering, der fortsætter med at præcist repræsenterer tumor immunologiske status er de fænotypiske egenskaber i tumorcellerne, selv. Dette omfatter udtryk for forskellige immunosuppressive ligander, enzymer eller molekyler sigter mod downregulating effektor immunrespons (dvs., PD-L1, PD-L2, indolamine 2,3 dioxygenase, nitrogenoxid, osv.). Tilsammen, viser dette behovet for nøjagtige og bred karakterisering af både immun og tumor cellulære funktioner af solide tumorer.
Den teknik vi beskrive heri giver adskillelse og berigelse af både immun og tumor celle komponenter af solide murine subkutane tumorer. Derefter, uafhængige flow cytometric profilering kan udføres således at fuld tid og samspillet mellem tumorceller med tiden kan blive værdsat. Efter berigelse, omfattende immun flow flowcytometri paneler kan optimeres til at tillade karakterisering af centrale myeloid og lymfoide cellulære komponenter, samt en række funktioner beskriver deres fænotypiske status. Ligeledes kan omfattende tumor celle fokuseret panel bruges uafhængigt af hinanden til at give bred karakterisering af tumor celle funktioner samt. Den relative enkelhed af denne teknik giver mulighed for simultan analyse af stort antal murine tumorer, som er kritiske for observere tendenser trods den biologiske variation af murine tumor modeller. Derudover giver tumor immun berigelse bedre identifikation af sjældne immunologiske delmængder (dvs. tumor-specifikke cytotoksiske T-celler), som er ofte betydeligt underrepræsenteret inden for tumor i forhold til andre ikke-immun celle komponenter . Optimering af denne teknik kan tillade yderligere downstream analyser på disse isolerede delmængder, som kræver tilsætning, såsom coculture ex vivo assays, mRNA profilering, eller adoptivforældre celle overførsel undersøgelser.
Med denne teknik i en subkutan murine tumor model, påvise vi betydelige berigelse af globale og uafhængige immun delmængder. Vi viser også den ikke-immune tumor profilering, som kan nås fra de samme svulst prøver. Endelig vil vise vi betydningen af hele tumor immunologiske profilering, så vi observeret betydelige immunologiske heterogenitet i tilstødende dele af en tumor. Ideelt set denne teknik collagenase og DNase-baserede fordøjelse og gradient-baseret adskillelse af tumor immun- og ikke-immune fraktioner kunne anvendes på størstedelen af murine tumor modeller, både orthotopic og subkutant. Vi har også observeret at små ikke-etablerede tumorer og mindre kollagen-tætte tumor modeller (dvs. B16 melanom) ofte kræver ikke en enzymatisk fordøjelsen skridt til at generere encellede suspensioner15; dog gradient-baserede immun berigelse udfører lige så godt i disse tumor modeller, yderligere validering af dens alsidighed. Trods forudgående bekymringer om collagenase antigen fordøjelsen på specifikke cellulære delmængder11har vi endnu til at observere en bemærkelsesværdig tab af farvning kvalitet for nogen af de markører, som vi har profileret. Ikke desto mindre bør antigen følsomhed over for disse fordøjelse betingelser vurderes ved hjælp af passende ikke-fordøjet kontrolprøver før bred vedtagelsen af denne teknik.
Afslutningsvis, vores teknik giver mulighed for nøjagtig, bred og høj overførselshastighed karakterisering af tumor immun- og ikke-immune komponenter af murine solide tumorer. Ved at udføre uafhængige profilering af disse delmængder, kan forskere bredt karakterisere tid og få bedre mekanistiske indblik i solid tumor prækliniske behandlingsformer. Denne metode kan nemt anvendes til størstedelen af murine tumor modeller for høj overførselshastighed analyse af lymfocytter og myeloide immunocyte befolkning tæller og fænotyper via flowcytometri, eller andre downstream assays, der kræver delmængde berigelse.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ikke noget at oplyse.
Acknowledgments
Christoffer anerkender finansiel støtte fra National Institute of General Medical Sciences (T32GM088129) og det nationale Institut for Dental & kraniofaciale forskning (F31DE026682) både af National Institutes of Health. Indholdet er udelukkende ansvarlig for forfattere og repræsenterer ikke nødvendigvis de officielle synspunkter af National Institutes of Health. Dette projekt blev også støttet af flowcytometri og celle sortering Core på Baylor College of Medicine med midler fra NIH (P30 AI036211, P30 CA125123 og S10 RR024574) og eksperthjælp af Joel M. Sederstrom.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 6 to 12 week old male C57BL/6 mice | Jackson Laboratory | N/A | Mice used in our tumor studies |
| MEER Murine Syngeneic Cancer Cell line | Acquired from collaborator | N/A | E6/E7 HPV antigen expressing murine tonsillar epithelial cancer cell line |
| 70% isopropyl alcohol | EMD Milipore | PX1840 | |
| Murine surgical tool kit | World Precision Instruments | MOUSEKIT | Primarily only need scissors, tweezers, and a scalpel. |
| 24-well plate | Denville Scientific Inc. | T1024 | Or any 24-well flat bottom plate. |
| RPMI-1640 media | Sigma-Aldrich | R0883 | |
| Collagenase I | EMD Milipore | 234153 | |
| Collagenase IV | Worthington Biochemical Corporation | LS004189 | |
| DNase I | Sigma-Aldrich | 11284932001 | |
| Low Speed Orbital Shaker | BioExpress (supplier: Genemate) | S-3200-LS | Or any orbital shaker. |
| Thermoregulating incubator | Fisher Scientific | 13-255-27 | Or any other thermo-regulated incubator |
| FBS | Sigma-Aldrich | F8192 | |
| EDTA | AMRESCO | E177 | |
| 1 mL Pipette and tips | Eppendorf | 13-690-032 | Or any other pipette and tips |
| 40 um Cell Strainers | Fisher Scientific | 22363547 | |
| 50 mL Centrifuge Tubes | Denville Scientific Inc. | C1062-P | |
| 15 mL Conical Tubes | Denville Scientific Inc. | C1012 | |
| 10 mL Luer-Lok Syringe without needles | BD | 309604 | |
| Lymphoprep Density Gradient Medium | STEMCELL Technologies | 7811 | |
| Transfer Pipettes | Denville Scientific Inc. | P7212 | |
| 96-well U-bottom plates | Denville Scientific Inc. | ||
| DPBS | Sigma Aldrich | D8573 | |
| FoxP3 Transcription Factor Staining Buffer Set | ThermoFisher Scientific | 00-5523-00 | Fix/Permeabilization Buffer and Permeabilization Buffer |
| Thermoregulated Centrifuge | Eppendorf | 5810 R | |
| Attune NxT Flow Cytometer | ThermoFisher Scientific | N/A | For 96-well cell volumetric counting |
| Purified Rat Anti-Mouse CD16/CD32 (Mouse BD Fc Block) Clone 2.4G2 | ThermoFisher Scientific | 553141 | Fc Block |
| LIVE/DEAD Fixable Blue Dead Cell Stain Kit, for UV excitation | ThermoFisher Scientific | L34962 | Fixable viability stain |
| CD45 Monoclonal Antibody (30-F11), APC-eFluor 780 | ThermoFisher Scientific | 47-0451-80 | |
| TCR beta Monoclonal Antibody (H57-597), APC | ThermoFisher Scientific | 17-5961-82 | |
| CD8-α Antibody (KT15), PE | Santa Cruz Biotechnology | sc-53473 | |
| CD4 Monoclonal Antibody (GK1.5), PE-Cyanine5 | ThermoFisher Scientific | 15-0041-81 | |
| MHC Class II (I-A/I-E) Monoclonal Antibody (M5/114.15.2), Alexa Fluor 700 | ThermoFisher Scientific | 56-5321-82 | |
| CD11c Monoclonal Antibody (N418), PE-Cyanine5 | ThermoFisher Scientific | 15-0114-82 | |
| F4/80 Monoclonal Antibody (BM8), eFluor 450 | ThermoFisher Scientific | 48-4801-80 | |
| CD11b Monoclonal Antibody (M1/70), APC | ThermoFisher Scientific | 17-0112-81 | |
| Ly-6G (Gr-1) Monoclonal Antibody (RB6-8C5), PE | ThermoFisher Scientific | 12-5931-82 | |
| CD274 (PD-L1, B7-H1) Monoclonal Antibody (MIH5), PE-Cyanine7 | ThermoFisher Scientific | 25-5982-80 | |
| CD273 (B7-DC) Monoclonal Antibody (122), PerCP-eFluor 710 | ThermoFisher Scientific | 46-9972-82 | |
| Ki-67 Monoclonal Antibody (B56), BV711 | BD Biosciences | 563755 |
References
- Fouad, Y. A., Aanei, C. Revisiting the hallmarks of cancer. American Journal of Cancer Research. 7 (5), 1016-1036 (2017).
- Gajewski, T. F., Schreiber, H., Fu, Y. -X. Innate and adaptive immune cells in the tumor microenvironment. Nature Immunology. 14 (10), 1014-1022 (2013).
- Whiteside, T. L. The tumor microenvironment and its role in promoting tumor growth. Oncogene. 27 (45), 5904-5912 (2008).
- Chiou, V. L., Burotto, M. Pseudoprogression and Immune-Related Response in Solid Tumors. Journal of Clinical Oncology. 33 (31), 3541-3543 (2015).
- Menon, S., Shin, S., Dy, G. Advances in Cancer Immunotherapy in Solid Tumors. Cancers. 8 (12), 106 (2016).
- Denkert, C., et al. Tumor-Associated Lymphocytes As an Independent Predictor of Response to Neoadjuvant Chemotherapy in Breast Cancer. Journal of Clinical Oncology. 28 (1), 105-113 (2010).
- Lee, Y., et al. Therapeutic effects of ablative radiation on local tumor require CD8+ T cells: changing strategies for cancer treatment. Blood. 114 (3), 589-595 (2009).
- Stakheyeva, M., et al. Role of the immune component of tumor microenvironment in the efficiency of cancer treatment: perspectives for the personalized therapy. Current Pharmaceutical Design. 23, (2017).
- Gerner, M. Y., Kastenmuller, W., Ifrim, I., Kabat, J., Germain, R. N. Histo-Cytometry: A Method for Highly Multiplex Quantitative Tissue Imaging Analysis Applied to Dendritic Cell Subset Microanatomy in Lymph Nodes. Immunity. 37 (2), 364-376 (2012).
- Bayne, L. J., Vonderheide, R. H. Multicolor Flow Cytometric Analysis of Immune Cell Subsets in Tumor-Bearing Mice. Cold Spring Harbor Protocols. 2013 (10), (2013).
- Goodyear, A. W., Kumar, A., Dow, S., Ryan, E. P. Optimization of murine small intestine leukocyte isolation for global immune phenotype analysis. Journal of Immunological Methods. 405, 97-108 (2014).
- Casadevall, A., Fang, F. C. Rigorous Science: A How-To Guide. mBio. 7 (6), 01902-01916 (2016).
- Yao, Y., et al. CyTOF supports efficient detection of immune cell subsets from small samples. Journal of Immunological Methods. 415, 1-5 (2014).
- Kay, A. W., Strauss-Albee, D. M., Blish, C. A. Application of Mass Cytometry (CyTOF) for Functional and Phenotypic Analysis of Natural Killer Cells. Methods Mol. Biol. 1441, 13-26 (2016).
- Pachynski, R. K., Scholz, A., Monnier, J., Butcher, E. C., Zabel, B. A. Evaluation of Tumor-infiltrating Leukocyte Subsets in a Subcutaneous Tumor Model. Journal of Visualized Experiments. (98), (2015).
