Summary
Her beskriver vi en metode for å skille og berike komponenter av svulst immun og ikke-immune microenvironment i etablerte subkutan svulster. Denne teknikken tillater for egen analyse av tumor immun infiltrere og ikke-immune svulst fraksjoner som kan tillate omfattende karakteristikk av svulst immun microenvironment.
Abstract
Svulst immun microenvironment (tid) har nylig blitt anerkjent som en kritisk megler av behandlingsrespons i solide svulster, spesielt for immunotherapies. Nylige klinisk fremskritt innen immunterapi fremheve behovet for reproduserbar metoder å nøyaktig og grundig karakterisere svulsten og dens tilknyttede immun infiltrere. Svulst enzymatisk fordøyelsen og flyt cytometric analyse tillate bred karakterisering av mange immun celle undergrupper og fenotyper; men er dyp analyse ofte begrenset av fluorophore restriksjoner på panelet design og behovet for å skaffe stor svulst prøver å observere sjeldne immun bestander av interesse. Derfor har vi utviklet en effektiv og høy gjennomstrømning metode for separasjon og berikende svulst immun infiltrere fra ikke-immune svulst komponentene. Beskrevet svulst fordøyelsen og sentrifugal tetthet-baserte separasjon teknikken tillater egen karakterisering av svulsten og tumor immun infiltrere fraksjoner og beholder mobilnettet levedyktighet, og dermed gir bred karakteristikk av svulsten immunologiske tilstand. Denne metoden ble brukt til å beskrive den omfattende romlige immune heterogenitet i solide svulster, som ytterligere viser behovet for konsekvent hele svulst immunologic profilering teknikker. Total, denne metoden gir en effektiv og tilpasningsdyktig teknikk for immunologiske karakterisering av subkutan solide murine svulster; som sådan, dette verktøyet kan brukes til å bedre karakteriserer tumoral immunologic funksjonene og i preklinisk evalueringen av romanen immunterapeutisk strategier.
Introduction
Undertrykkende tiden har nylig blitt anerkjent som et kjennetegn på kreft, og er kjent for å spille en betydelig rolle i utviklingen, progresjon og beskyttelse av solid tumor kreft samt redusere deres mottakelighet for immunterapi1. TIDEN er sammensatt av mange mobilnettet delsett og fenotyper, alle gi viktig innsikt i immunologic staten av svulsten. Disse immunologic delsett kan være ytterligere lagdelt i celler av lymfocytt eller myelogen opprinnelse, som til sammen utgjør flertallet av det medfødte og adaptive immunreaksjoner2,3. Nylige fremskritt innen kreft immunterapi har vist at immunterapeutisk strategier (dvs. immun checkpoint hemmere, chimeric antigen reseptor T-celler, etc.) har potensial til å indusere holdbar kreft regresjoner; men forblir de relativt ineffektiv i solid tumor kreft4,5. Flere grupper har vist det avgjørende hinderet at tiden kan spille på behandling suksess6,7, og derfor det fortsatt behov for å vurdere nøyaktig nye immunotherapies i pre-klinisk innstillingen spesielt fokusere på deres muligheten til å modulate eller overvinne tid8.
Dagens innsats å karakterisere tiden vanligvis benytte enten mikroskopi eller flow cytometri sammen med antistoff merking strategier for å identifisere immun mobilnettet delsett og deres funksjoner9,10. Disse to strategier gir unikt forskjellig informasjon, som mikroskopi tillater romlige styrking av mobilnettet delsett og flowcytometri gir høy gjennomstrømning og bredere kvantifisering av mobilnettet endringer. Til tross for de siste forbedringene i fluorescerende multiplex immunohistochemistry optimalisere spectral imaging-systemer, som nå kan støtte opptil 7 parametere, begrenset panelet størrelse gjør bredt nivå immun profilering vanskelig og dermed denne teknikken er ofte forbeholdt mer fokusert analyser. Resultatet fortsatt flowcytometri en av de mest brukte immunt profilering teknikker. Til tross for utbredt bruk i tid karakterisering er metodene som brukes for behandling og flekker ganske variable. Oftest protokoller utnytte en svulst dissociating enzym (dvs. collagenases, DNase, etc.) og manuell dissosiasjon metoder å oppnå encellede suspensjoner, etterfulgt av antistoff flekker og analyse7. Til tross for fordelene med hver metode, har mange grupper vist omfattende variasjon som kan bli overtalt til disse teknikker11. Dette gjør kryss-studie sammenligninger av svulst microenvironment profilering svært vanskelig, selv når vurdere samme murine svulst modell. Videre disse metodene gir begrenset mulighet til å vurdere svulst mobilnettet og svulst immun infiltrere komponenter uavhengig, siden begge komponentene er utblandet etter fordøyelsen. Eksempel antallet deretter begrenser flere panelet flekker og analyse, som blir et stort problem når du prøver å beskrive sjeldne immunologic delsett (dvs. svulst-spesifikke T-celler)12. Nyere teknikker som masse cytometri, eller cytometri av tiden for flygningen (CyTOF), lar høy-dimensjonale fenotypiske analyse av mobilnettet delsett med noen systemer støtter panel design på mer enn 42 uavhengig parametere13. Til tross for den enorme kraften av CyTOF teknologi i immun profilering, fortsatt det begrenset på grunn av bekostning, analyse kompetanse og tilgang til utstyret. I tillegg mange CyTOF protokoller anbefale rensing av immun delsett å forbedre signal-til-støy-forhold14, og derfor foreslår vi at vår berikelse metoden kan brukes over CyTOF analyse for å bedre datakvaliteten.
Her beskriver vi en svulst microenvironment fordøyelsen og analyse metode som bruker svulst immun infiltrere separasjon. Formålet med denne metoden er at uavhengige høy gjennomstrømming profilering av svulst immun infiltrere og svulst mobilnettet brøker for bredere karakteristikk av svulst microenvironment. Bruker denne metoden, demonstrere vi ytterligere viktigheten av hele svulst analyse, som en subcutaneous solid tumor modell ble funnet for å ha betydelig romlige immunologic heterogenitet. Total, denne metoden kan mer nøyaktig og konsekvent sammenligne mellom prøvene fordi det beriker for immun mobilnettet delsett i svulst og gir uavhengige profilering av svulst celle og immun fraksjoner av en svulst.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle metodene som er beskrevet her er godkjent av institusjonelle Animal Care og bruk Committee (IACUC) av Baylor College of Medicine.
1. svulst Harvest og fordøyelse
Merk: Tiden det tar for innhøsting er ~ 3-5 minutter/svulst, og tiden som kreves for behandling er ~ 1 t + 2-3 min/svulst.
- Euthanize mus ved karbondioksid innånding og spray hver musen ned med 70% etanol før høsting for å hindre hår forurensning. Kirurgisk fjerne subkutan svulster fra mus og sikre at svulstene er noen forurensende vev (dvs. hår, hud, peritoneum, etc.). Plass hver svulst i 1,8 mL av base RPMI-1640 media uten fosterets bovin serum (FBS) i en 24-vel plate. For større avlinger, holde platene kaldt på is å bevare mobilnettet levedyktighet.
Merk: Hvis sterilitet, alle svulst disseksjoner må utføres i en biosafety kabinett med sterilt kirurgiske redskaper (dvs., saks, pinsett, etc.), samt ytterligere skritt. Svulster med den lengste diameteren mellom 0,5 - 1 cm er optimale, og større eller mindre svulster krever skalering av reagenser. - Bruk saks til å kutte tumorer i mindre enn 1 mm3 brikker i hver brønn.
- Forberede en 10 x fordøyelsen cocktail ved oppløsning collagenase jeg på 10 mg/mL, collagenase IV 2500 U/mL og DNase jeg på 200 U/mL i base RPMI-1640 media (uten FBS).
Merk: Fordøyelsen cocktail kan utarbeidet en dag i forveien og lagret på 20 ° C; langvarig lagring anbefales imidlertid ikke da enzymer mister aktivitet over tid en gang oppløst. - Legge til 200 µL av 10 x dissosiasjon cocktail som inneholder collagenase jeg collagenase IV og DNase jeg hver brønn med 1 mm3 stykker.
- Tillate prøvene å fordøye 1t på 37 ° C mens lett riste på 60-100 rpm med en orbital plate shaker.
Merk: Høyden av temperatur 37 ° c under enzymatisk fordøyelsen kan forårsake immun celle aktivering. - Etter 1 h, nøytralisere reaksjonen ved å legge til 1 mL av RPMI-1640 media med 5% FBS og 2 mM EDTA i hver brønn.
- Pipetter svulst fordøyelsen og gjenværende svulst bitene i en 40 µm celle sil sitter på en 50 mL sentrifuge rør.
Merk: Klipp spissen av en 1 mL pipette tips for enklere overføring av svulst fordøyelsen til silen. - Bruk en 10 mL sprøytestempelet å mekanisk disaggregate svulst bitene gjennom silen. Regelmessig skyll silen med 2 mL supplert RPMI-1640 media (som inneholder 5% FBS) og gjenta til celle silen er klart svulst.
Merk: Ca 4-10 mL av totalt medier bør være tilstrekkelig tilstrekkelig skylle silen svulst.
Merk: Plasserer prøvene på is til dette trinnet er fullført for alle prøver å bevare mobilnettet levedyktighet. - Juster hver 50 mL sentrifuge rør til samme volum bruker supplert RPMI-1640 media.
Merk: Justering av volum er avgjørende for sentrifuge balansering. Hopper over dette trinnet kan resultere i sentrifuge skade eller personskade. - Virvel av cellen suspensjon (5 min, 805 x g, 4 ° C), forkaste supernatants og å avbryte 2 mL supplert RPMI-1640 media.
Merk: En celle samlet kan danne etter sentrifugering som er vanskelig å resuspend. Bruk en 5 mL serologisk pipette og bland raskt bryte den opp før du fortsetter.
2. skille immun og Tumor mobilnettet brøker
Merk: Tiden som kreves for dette trinnet er ca 1 h.
- Legge 3 mL tetthet gradert medium til bunnen av en 15 mL sentrifuge rør. Forberede og etiketten nok rør for hver svulst.
- Lag 2 mL av svulst celle suspensjon på tetthet gradert mediet av pipettering sakte ned på siden av røret for å hindre blanding av de to lagene.
- Forsiktig plassere lagdelt rør i sentrifuge og spinn for 20 min 805 x g, 20 ° C, med ingen brems.
Merk: Det er svært viktig å bekrefte riktig balansering og sikre at ingen brems brukes under sentrifugering. Eventuelle avbrudd av denne prosessen vil føre lag blanding og full prøve utvinning vil være vanskelig. - Nøye overføre svulsten infiltrere leukocytter (TIL) laget og topp media laget til en ny 15 mL tube med en overføring pipette. Forkaste alle gjenstående tetthet gradert medium og resuspend svulst pellet nederst på røret i 2 mL supplert RPMI-1640.
Merk: Etter sentrifugering vil det være fire synlige lag fra topp til bunn som henholdsvis tilsvarer: media, TILs, tetthet gradert medium og svulst celle pellets. Se figur 2A for et eksempel på de forskjellige lagene. - Sentrifuge både TIL og svulst prøver skille rør (5 min, 805 x g, 4 ° C) og kast nedbryting.
- Resuspend TIL prøven i 200 µL og svulst pellet i 2 mL supplert RPMI-1640 medier. Hold på is å bevare levedyktighet.
3. plating og flekker
Merk: Tiden som kreves for plating er 30 s/svulst; tiden som kreves for overflate flekker er 1 h; tiden som kreves for intracellulær flekker er 40 min; tiden som kreves for flyt cytometri analyse er 1 - 4 min/svulst.
- Forberede og etiketten en 96-brønns U-bunn plate for hver immun flekker panel og en ekstra plate for celle teller.
Merk: Vanligvis tre plater er forberedt totalt: en lymfocytt-fokusert panelet plate, en myelogen-fokusert panelet plate og en celle teller plate. - Aliquot av encellede suspensjon i hver av den flekker panel plater og et angitt volum inn i antall plate.
Merk: Antall platen brukes til å beregne antall celler lagt til hver flekker panel, og dermed slik at nøyaktig celletall befolkningen. En flyt cytometer med 96-brønns plate prøvetaking og volumetric analyse kan gi antall celler per µL i hver prøve, og derfor beregne antall celler lagt til hver flekker panel. Antall plater kan skaffes dagen etter fiksering overnatting på 4 ° C, skylling med FACs buffer (fosfat bufret saltvann (PBS) med 2% FBS), og resuspending i en angitt mengde FACs buffer. - Vask cellene to ganger med 200 µL Dulbeccos fosfat bufret saltoppløsning (DPBS) per prøve av sentrifugering (5 min, 805 x g, 4 ° C) og forkaster nedbryting mellom hver skylling for å fjerne alle gratis FBS.
- Legge til 50 µL av Fc blokk, bland eksemplene bruker en flerkanals pipette og ruge etter 20 min på 4 ° C.
- Legge til 50 µL av 2 x konsentrert ekstracellulære målretting antistoff og fixable levedyktighet flekken blanding, blander med en flerkanals pipette, og ruge i 30 min i mørket på RT eller 4 ° C.
Merk: Den eksakte flekker forholdene antistoffer, avhenger av produsentens instruksjoner. Alle flekker fortynninger må være i DPBS, med ingen ekstra FBS å hindre metning av fixable levedyktighet fargestoffet. Se Tabell over materialer/utstyr for de optimale fortynninger av flekker panelet brukes i dette manuskriptet. Antistoff og fixable levedyktighet flekker løsning er utarbeidet i en 2 x konsentrasjon å gi endelige 1 x flekker konsentrasjon i 100 µL av flekker totalvolum når lagt til Fc blokken. - Vask prøvene to ganger med FACs buffer av sentrifugering (5 min, 805 x g, 4 ° C) og forkaster supernatants mellom hver skylling.
- Resuspend i 200 µL av 1 x fiksering/permeabilization løsning og ruge over natten ved 4 ° C beskyttet mot lyset.
Merk: Eksperimentet kan pauses natten på dette punktet: holde eksempler på 4 ° C beskyttet mot lyset. - Dagen sentrifuge plater (5 min, 805 x g, 4 ° C) og kast nedbryting.
- Skyll når med 200 µL av 1 x permeabilization buffer, sentrifuger (5 min, 805 x g, 4 ° C) og kast nedbryting.
- Legg 100 µL 1 x konsentrert intracellulær antistoff flekker panelet i 1 x permeabilization buffer og ruge i 30 min i mørket på RT eller 4 ° C (dette avhenger av flekker anbefalinger fra produsenten).
- Skyll når med 1 x permeabilization buffer (5 min, 805 x g, 4 ° C), forkaste nedbryting, og skyll en gang med FACs buffer (PBS med 2% FBS).
- Resuspend prøvene i 300 µL av FACs buffer (PBS med 2% FBS), overføre prøvene til flyt cytometri rør og utføre flyt cytometri analyse.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Våre resultater viser betydelig fordel for TIL separasjon fra ikke-immune svulst komponenter, som forklart i protokollen. I tillegg viser vi bruke metoden beskrevet den betydelige immunologic heterogeniteten etablerte solide svulster.
Et betydelig problem med mange svulst dissosiasjon teknikker er tap av prøven levedyktighet, oftest som følge av harde fordøyelsen forhold (dvs. forhøyet temperatur, utilstrekkelig næringsstoff levering, etc.). Bruk av metoden beskrevet fordøyelsen med eller uten tetthet gradert middels berikelse, gir ca 70-90% totalt mobilnettet levedyktighet som vurdert av flowcytometri (figur 1A). Lignende viabilities ble observert i TIL beriket og svulst beriket fraksjoner, noe som tyder på at denne metoden forårsaker minimal generelle toksisiteten (figur 1en, figur 2C). Videre tetthet gradert middels anriking forfremmet større enn 2-fold økning i CD45 positiv TIL brøkdel blant totalt levedyktige cellers analysert sammenlignet med ikke-beriket svulst digestions (figur 1B, C). I tillegg ble berikelse funnet for å forbedre mange immun celle undergrupper vanligvis vurdert i immune microenvironment studier, inkludert myelogen-avledet suppressor cellene (MDSCs), dendrittiske celler (DCer), makrofager, CD8 T-celler og CD4 T-celler ( Figur 1D, E). Dette tyder på at tetthet gradert middels anriking fremmer globale immunocyte enrichments og ikke isolere bestemte lymfocytt eller myelogen populasjoner (se supplerende figur 1A, B for flowcytometri gating metoden brukes til å identifisere bestemt celle populasjoner). Det er verdt å merke seg imidlertid at mange kommersielt tilgjengelig tetthet gradert separasjon medier at en betydelig andel av erytrocytter og granulocytter skjedde separasjon fasen. Dermed, hvis populasjonene er av interesse, ytterligere protokollen optimalisering kan være nødvendig.
Figur 1 : Skånsom og effektiv anriking av svulst immun infiltrere. Etablerte MEER svulster ble fjernet og fordøyd med metoden beskrevet. Etter fordøyelsen, encellede suspensjoner ble delt slik at halvparten gjennomgikk tetthet gradert middels berikelse og den andre halvparten ble direkte farget. (A) kumulativ flyt cytometri vurdering av mobilnettet levedyktigheten for svulst digestions med eller uten tetthet gradert middels berikelse. (B) representant flowcytometri gating tomter viser CD45 positiv immun celle berikelse av en enkelt svulst fordøyelsen med og uten tetthet gradert middels berikelse. (C) kumulativ flyt cytometri CD45 positiv celle prosenter blant totalt levedyktig celler fra svulst digestions med eller uten tetthet gradert middels berikelse. (D) berikelse prosenter av ulike myelogen og lymfocytt immun populasjoner. Svulster ble fordøyd i én celle suspensjon før blir farget direkte eller gjennomgår tetthet gradert berikelse før farging og flyt cytometri analyse. Hver celle-type berikelse forholdet ble beregnet ved å dele en gitt celle-befolkning prosent (blant totalt levedyktige cellers vurdert) fra tetthet gradert beriket svulst fordøyelsen av motparten ikke-beriket. Linjene representerer medianen og kantene av baren representerer minimum og maksimum prosenter. (E) tabell immun mobilnettet markør uttrykket brukes til å identifisere hver immun celle befolkningen analysert. Statistisk signifikans identifiserte med en kort t- eller Mann Whitney testen. p < 0,05, **p < 0,01, ***p < 0,001, ***p < 0,0001, (n = 20 svulster, N = 2 for alle grafer). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
En av de viktigste fordelene som denne metoden gir er evnen å uavhengig profil ikke-immune svulst brøken. Etter isolering av pelleted ikke-immune svulst brøken som passerer gjennom den tetthet graderte middels fasen, kan komplekse svulst profilering paneler utføres som tidligere kan ha vært begrenset av fluorophore og prøve antall begrensninger. Figur 2 En viser et eksempel på svulst flyt cytometri karakterisering med over 70% levedyktighet og 99% CD45 negativ celle berikelse. CD45 negative brøken kan deretter bli profilert for mange svulst funksjoner som samlet svulst levedyktighet eller apoptose (dvs. caspase 3, annexin V, etc.), spredning kapasitet (dvs. Ki67) og uttrykk for ulike suppressive markører (dvs. programmert død-ligand 1 (PD-L1) eller PD-L2). Det bemerkes imidlertid at CD45 negative delen omfatter både kreftceller samt andre stromal og vaskulær elementer av svulst microenvironment. Dermed, hvis direkte svulst celle karakterisering, merketråd svulst celle bestemt må være brukt (dvs. cytokeratin, spesifikke svulst-assosiert antigen, osv.). Andre svulst stromal elementer kunne likeledes identifiseres enkelt og preget etter merking med en celle-type spesifikk markør som vaskulær endotelial kreftceller (CD31) og kreft tilhørende fibroblaster (α-glatt muskel utgangen). Likevel er levedyktighet og CD45 negativ celle berikelse svært konsekvent over gjentatt prøvene, indikerer robust tetthet gradert separasjon teknikken for ikke-immune svulst komponent anriking (figur 2B, C ).
Figur 2 : Berikelse og profilering av funksjonene ikke-immune svulst komponent. (A) representativt bilde av et utvalg etter tetthet gradert middels berikelse med synlig media-laget (rosa), TIL lag (tynn grumsete hvit), tetthet gradert middels lag (klar) og svulst pellet nederst på røret. (B) representant flowcytometri gating strategi anvendt for profilering komponenten ikke-immune svulst celle levedyktighet spredningsdiagram (øverst), CD45 negativ celle berikelse spredningsdiagram (nederst til venstre) og tre uavhengige markører rundt Uttrykk via histogrammet tomter (PD-L1 toppen, PD-L2 midten og Ki67 bunnen). FMO histogrammet representerer et utvalg beiset med alle andre panelet farger, men mangler markøren rundt. Kumulative flyt cytometri vurdering av (C) mobilnettet levedyktighet og (D) CD45 negativ celle prosentdeler blant totalt levedyktige cellers svulst pellet brøken etter tetthet gradert middels berikelse (n = 7-8 svulster). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Til tross for betydelige anstrengelser for å karakterisere den genetisk mangfold i solide svulster, har lite arbeid detaljert de romlige heterogeniteten immunologic delsett i solide svulster. Vi derfor som mål å finne ut hvordan myelogen og lymfocytt immunologic delsett drastisk variert gjennom en enkelt solid svulst. Således, en etablert MEER svulst ble delt i fire like deler med spesiell omsorg å sikre hver del inneholdt omtrent lik intra-tumoral regioner, samt lik dermal og peritoneal-mot deler (Figur 3A). Brikkene svulst ble fordøyd separat, beriket av tetthet gradert medium og delt mellom en myelogen og lymfocytt panel. Dette tillot kvantifisering av forskjellige funksjoner, inkludert en rekke vanligvis vurdert immunocyte bestander: T-celler, CD4 + T celler, CD8 + T celler, makrofager, DCs, MDSCs (se utfyllende figur 1A, B for flowcytometri gating strategi). Innenfor en enkelt svulst var betydelig celle variasjon mellom de ulike svulst partisjonene bemerket (Figur 3b). For eksempel både DC og T-celle totale celletall ble funnet for å variere etter som 4 til 5-fold blant tilstøtende svulst deler. Disse drastiske endringer ble også bemerket når analysere celle populasjoner i prosent av totalt levedyktige cellers (supplerende figur 2A) og ble observert på lignende nivåer i to andre uavhengige svulster (supplerende figur 2B, C). Disse dataene viser betydningen av isolere og analysere hele svulsten når utføre immun microenvironment analyser, som kan virke counterintuitive hvis gjeldende protokoller inkluderer dele svulsten å tillate supplerende analyse av uavhengige metoder (dvs. histology, RNA kvantifisering, osv.). I tillegg kan disse dataene forklare avvik immunologic analyser av svulst biopsier, som regionale intratumoral immunologic heterogenitet kan drastisk skew biopsi resultatene.
Figur 3 : Vurdering av etablerte svulst immun heterogenitet. (A) representativt bilde av en etablert MEER svulst etter kirurgisk resection (venstre) og etter like oppdeling 4 tilstøtende deler (høyre). Skala er 1 cm, vises i svart på hvert bilde. (B) Fold endres av ulike myelogen og lymfocytt cellen teller mellom hver av de 4 tilstøtende svulst delene; avsnittene svulst gjennomgikk den samme fordøyelsen, tetthet gradert middels berikelse prosedyren, flekker og analyse. Hver svulst del vises som en celle antall ganger endring, som bestemmes ved å dele sin celletall delen svulst med den laveste analysert celletall for en gitt celle befolkning. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Supplerende figur 1: Representative flowcytometri gating strategi anvendt for svulst immune komponenten profilering. (A) Gating strategi med respektive scatter tomter brukes for lymfocytt immun profilering. (B) Gating strategi med respektive scatter tomter brukes for svulst myelogen immun profilering. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Supplerende figur 2: ytterligere vurdering av etablerte svulst heterogenitet. (A) Cellular prosent blant totalt levedyktige cellers fold endring fra 4 like svulst deler vist i Figur 3. (B) og (C) to ekstra etablerte MEER tumorer fordelt på 4 tilstøtende deler og analysert for svulst immun heterogenitet. Cellen antall ganger endringer (venstre) og celle prosenter blant totalt levedyktige cellers brett endringer (høyre) for hver myelogen og lymfocytt cellen befolkningen analysert viser variasjon av hver av de 4 tilstøtende svulst delene. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
TIDEN består av varierte og komplekse cellulære komponenter og molekyler. Nyere bevis antyder at nøyaktig karakteristikk av dette miljøet kan gi en bedre forståelse av suksess eller fiasko, og kan også hjelpe identifisere mekanismer for terapeutisk motstand. For eksempel kan øker intratumoral nivåer av ulike suppressive celler (dvs. MDSCs, regulatoriske T-celler, etc.) redusere effektor immunreaksjoner og oppheve immunterapeutisk effekter. På den annen side, kan økende intratumoral tilstedeværelsen av effektor immun populasjoner (f.eks svulst-spesifikke CD8 + T celler, naturlige drepe celler, T hjelper celler) være kraftig prediktorer for suksess. En annen karakteristikk som fortsetter å nøyaktig representere svulst immunologic status er fenotypiske funksjonene for kreftceller seg. Dette inkluderer uttrykk for ulike suppressive ligander, enzymer, eller molekyler rettet mot downregulating effektor immunreaksjoner (dvs. PD-L1, PD-L2, indolamine 2,3 dioxygenase, nitrogenoksid, etc.). Samlet viser dette behovet for nøyaktig og bred karakterisering av både immun og svulst cellular funksjonene i solide svulster.
Teknikken vi beskriver her kan separasjon og berikelse av både immun og svulst celle komponenter av solid murine subkutan svulster. Deretter kan uavhengig flyt cytometric profilering utføres slik at full tid og samhandling av kreftceller med tiden kan bli verdsatt. Etter berikelse, omfattende immun flyt cytometri paneler kan optimaliseres slik at karakteristikk av viktige lymfoide og myeloide cellulære komponenter, samt en rekke funksjoner som beskriver deres fenotypiske status. Tilsvarende kan omfattende svulst celle fokusert panel brukes uavhengig å gi bred karakteristikk av svulst celle funksjoner også. Den relative enkelheten av denne teknikken tillater samtidig analyse av store antall murine svulster, som er avgjørende for å observere trender tross biologisk variasjon av murine svulst modeller. I tillegg gir svulst immun berikelse bedre identifikasjon av sjeldne immunologic delsett (dvs. svulst-spesifikke cytotoxic T celler), som er ofte betydelig underrepresentert i svulsten sammenlignet med andre ikke-immune celle komponenter . Optimalisering av denne teknikken kan tillate flere nedstrøms analyser på disse isolerte delsett som krever berikelse, som coculture ex vivo analyser, mRNA profilering, eller adoptivforeldre celle overføring studier.
Bruker denne teknikken i en subcutaneous murine svulst modell, viser vi betydelige anriking av global og uavhengige immun delsett. Vi viser også ikke-immune svulsten profilering som kan oppnås fra samme svulst prøvene. Endelig viser vi betydningen av hele svulst immunologic profilering, vi observert betydelig immunologic heterogene i deler av en svulst. Ideelt sett denne teknikken collagenase og DNase-baserte fordøyelsen og gradering basert separasjon av svulst immun og ikke-immune fraksjoner kan brukes til fleste murine svulst modeller, både orthotopic og underhud. Vi har også observert at små ikke-etablerte svulster og mindre kollagen-kompakt svulst modeller (dvs. B16 melanom) ofte krever ikke en enzymatisk fordøyelsen skritt å generere encellede suspensjoner15; imidlertid forløpning-baserte immun berikelse utfører like også i disse svulst modeller, ytterligere validere sin allsidighet. Til tross for tidligere bekymringer om collagenase antigen fordøyelsen på bestemte mobilnettet undergrupper11har vi ennå å observere betydelige tap av flekker kvalitet for noen av markørene som vi har profilert. Likevel bør antigen følsomhet for disse fordøyelsen forholdene vurderes riktig ikke-fordøyd kontroll utvalg før omfattende bruk av denne teknikken.
Avslutningsvis kan våre teknikken for nøyaktig, bred og høy gjennomstrømming karakterisering av svulst immun og ikke-immune komponentene i murine solide svulster. Utfører uavhengige profilering av disse undergrupper, kan forskere grovt karakterisere tid og få bedre mekanistisk innsikt i solid tumor prekliniske terapier. Denne metoden kan lett brukes på de aller fleste murine svulst modeller for høy gjennomstrømning analyse av lymfocytt og myelogen immunocyte innbyggere tellinger og fenotyper via flowcytometri eller andre nedstrøms analyser som krever delsett berikelse.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne ikke avsløre.
Acknowledgments
JMN erkjenner økonomisk støtte fra National Institute of General Medical Sciences (T32GM088129) og National Institute for Dental & Craniofacial forskning (F31DE026682) begge National Institutes of Health. Innholdet er ansvar forfattere og representerer ikke nødvendigvis den offisielle synet til National Institutes of Health. Dette prosjektet ble også støttet av cytometri og celle sortering kjernen ved Baylor College of Medicine med finansiering fra NIH (P30 AI036211 P30 CA125123 og S10 RR024574) og eksperthjelp av Joel M. Sederstrom.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 6 to 12 week old male C57BL/6 mice | Jackson Laboratory | N/A | Mice used in our tumor studies |
| MEER Murine Syngeneic Cancer Cell line | Acquired from collaborator | N/A | E6/E7 HPV antigen expressing murine tonsillar epithelial cancer cell line |
| 70% isopropyl alcohol | EMD Milipore | PX1840 | |
| Murine surgical tool kit | World Precision Instruments | MOUSEKIT | Primarily only need scissors, tweezers, and a scalpel. |
| 24-well plate | Denville Scientific Inc. | T1024 | Or any 24-well flat bottom plate. |
| RPMI-1640 media | Sigma-Aldrich | R0883 | |
| Collagenase I | EMD Milipore | 234153 | |
| Collagenase IV | Worthington Biochemical Corporation | LS004189 | |
| DNase I | Sigma-Aldrich | 11284932001 | |
| Low Speed Orbital Shaker | BioExpress (supplier: Genemate) | S-3200-LS | Or any orbital shaker. |
| Thermoregulating incubator | Fisher Scientific | 13-255-27 | Or any other thermo-regulated incubator |
| FBS | Sigma-Aldrich | F8192 | |
| EDTA | AMRESCO | E177 | |
| 1 mL Pipette and tips | Eppendorf | 13-690-032 | Or any other pipette and tips |
| 40 um Cell Strainers | Fisher Scientific | 22363547 | |
| 50 mL Centrifuge Tubes | Denville Scientific Inc. | C1062-P | |
| 15 mL Conical Tubes | Denville Scientific Inc. | C1012 | |
| 10 mL Luer-Lok Syringe without needles | BD | 309604 | |
| Lymphoprep Density Gradient Medium | STEMCELL Technologies | 7811 | |
| Transfer Pipettes | Denville Scientific Inc. | P7212 | |
| 96-well U-bottom plates | Denville Scientific Inc. | ||
| DPBS | Sigma Aldrich | D8573 | |
| FoxP3 Transcription Factor Staining Buffer Set | ThermoFisher Scientific | 00-5523-00 | Fix/Permeabilization Buffer and Permeabilization Buffer |
| Thermoregulated Centrifuge | Eppendorf | 5810 R | |
| Attune NxT Flow Cytometer | ThermoFisher Scientific | N/A | For 96-well cell volumetric counting |
| Purified Rat Anti-Mouse CD16/CD32 (Mouse BD Fc Block) Clone 2.4G2 | ThermoFisher Scientific | 553141 | Fc Block |
| LIVE/DEAD Fixable Blue Dead Cell Stain Kit, for UV excitation | ThermoFisher Scientific | L34962 | Fixable viability stain |
| CD45 Monoclonal Antibody (30-F11), APC-eFluor 780 | ThermoFisher Scientific | 47-0451-80 | |
| TCR beta Monoclonal Antibody (H57-597), APC | ThermoFisher Scientific | 17-5961-82 | |
| CD8-α Antibody (KT15), PE | Santa Cruz Biotechnology | sc-53473 | |
| CD4 Monoclonal Antibody (GK1.5), PE-Cyanine5 | ThermoFisher Scientific | 15-0041-81 | |
| MHC Class II (I-A/I-E) Monoclonal Antibody (M5/114.15.2), Alexa Fluor 700 | ThermoFisher Scientific | 56-5321-82 | |
| CD11c Monoclonal Antibody (N418), PE-Cyanine5 | ThermoFisher Scientific | 15-0114-82 | |
| F4/80 Monoclonal Antibody (BM8), eFluor 450 | ThermoFisher Scientific | 48-4801-80 | |
| CD11b Monoclonal Antibody (M1/70), APC | ThermoFisher Scientific | 17-0112-81 | |
| Ly-6G (Gr-1) Monoclonal Antibody (RB6-8C5), PE | ThermoFisher Scientific | 12-5931-82 | |
| CD274 (PD-L1, B7-H1) Monoclonal Antibody (MIH5), PE-Cyanine7 | ThermoFisher Scientific | 25-5982-80 | |
| CD273 (B7-DC) Monoclonal Antibody (122), PerCP-eFluor 710 | ThermoFisher Scientific | 46-9972-82 | |
| Ki-67 Monoclonal Antibody (B56), BV711 | BD Biosciences | 563755 |
References
- Fouad, Y. A., Aanei, C. Revisiting the hallmarks of cancer. American Journal of Cancer Research. 7 (5), 1016-1036 (2017).
- Gajewski, T. F., Schreiber, H., Fu, Y. -X. Innate and adaptive immune cells in the tumor microenvironment. Nature Immunology. 14 (10), 1014-1022 (2013).
- Whiteside, T. L. The tumor microenvironment and its role in promoting tumor growth. Oncogene. 27 (45), 5904-5912 (2008).
- Chiou, V. L., Burotto, M. Pseudoprogression and Immune-Related Response in Solid Tumors. Journal of Clinical Oncology. 33 (31), 3541-3543 (2015).
- Menon, S., Shin, S., Dy, G. Advances in Cancer Immunotherapy in Solid Tumors. Cancers. 8 (12), 106 (2016).
- Denkert, C., et al. Tumor-Associated Lymphocytes As an Independent Predictor of Response to Neoadjuvant Chemotherapy in Breast Cancer. Journal of Clinical Oncology. 28 (1), 105-113 (2010).
- Lee, Y., et al. Therapeutic effects of ablative radiation on local tumor require CD8+ T cells: changing strategies for cancer treatment. Blood. 114 (3), 589-595 (2009).
- Stakheyeva, M., et al. Role of the immune component of tumor microenvironment in the efficiency of cancer treatment: perspectives for the personalized therapy. Current Pharmaceutical Design. 23, (2017).
- Gerner, M. Y., Kastenmuller, W., Ifrim, I., Kabat, J., Germain, R. N. Histo-Cytometry: A Method for Highly Multiplex Quantitative Tissue Imaging Analysis Applied to Dendritic Cell Subset Microanatomy in Lymph Nodes. Immunity. 37 (2), 364-376 (2012).
- Bayne, L. J., Vonderheide, R. H. Multicolor Flow Cytometric Analysis of Immune Cell Subsets in Tumor-Bearing Mice. Cold Spring Harbor Protocols. 2013 (10), (2013).
- Goodyear, A. W., Kumar, A., Dow, S., Ryan, E. P. Optimization of murine small intestine leukocyte isolation for global immune phenotype analysis. Journal of Immunological Methods. 405, 97-108 (2014).
- Casadevall, A., Fang, F. C. Rigorous Science: A How-To Guide. mBio. 7 (6), 01902-01916 (2016).
- Yao, Y., et al. CyTOF supports efficient detection of immune cell subsets from small samples. Journal of Immunological Methods. 415, 1-5 (2014).
- Kay, A. W., Strauss-Albee, D. M., Blish, C. A. Application of Mass Cytometry (CyTOF) for Functional and Phenotypic Analysis of Natural Killer Cells. Methods Mol. Biol. 1441, 13-26 (2016).
- Pachynski, R. K., Scholz, A., Monnier, J., Butcher, E. C., Zabel, B. A. Evaluation of Tumor-infiltrating Leukocyte Subsets in a Subcutaneous Tumor Model. Journal of Visualized Experiments. (98), (2015).
