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Cancer Research

肿瘤免疫和非免疫微环境在小鼠皮下肿瘤中的富集与鉴定

doi: 10.3791/57685 Published: June 7, 2018
* These authors contributed equally

Summary

在这里, 我们描述了一个方法, 以分离和丰富的组成部分, 肿瘤免疫和非免疫微环境的建立皮下肿瘤。该技术允许对肿瘤免疫浸润和非免疫肿瘤分数进行单独分析, 从而可以对肿瘤免疫微环境进行综合表征。

Abstract

肿瘤免疫微环境 (时间) 最近被认为是一个关键的调解者的治疗反应, 在实体肿瘤, 特别是免疫疗法。最近在免疫治疗方面的最新进展突出了需要重现的方法, 准确和彻底的特点肿瘤及其相关的免疫渗透。肿瘤酶消化和流细胞分析可以广泛地描述多种免疫细胞亚群和表型;然而, 分析的深度往往受到限制的荧光限制的面板设计和需要获得大量的肿瘤样本, 以观察罕见的免疫人群的兴趣。因此, 我们已经开发出一种有效的高通量的方法来分离和丰富肿瘤免疫浸润的非免疫肿瘤成分。所描述的肿瘤消化和离心密度分离技术允许分离的肿瘤和肿瘤免疫浸润分数的特点, 并保持细胞活力, 从而提供了一个广泛的描述肿瘤免疫状态。该方法用于表征实体肿瘤中广泛的空间免疫异质性, 进一步证明了对肿瘤免疫分析技术的一致性要求。总体上, 该方法为皮下固体小鼠肿瘤的免疫学特性提供了一种有效、适应性强的技术;因此, 这个工具可以用来更好地表征肿瘤免疫功能和在临床前评价新的免疫治疗策略。

Introduction

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抑制时间最近被认为是癌症的一个标志, 众所周知, 在肿瘤的发展、进展和保护方面发挥重要作用, 并减轻他们对免疫治疗1的敏感性。时间由大量的细胞子集和表型组成, 所有这些都为肿瘤的免疫状态提供了重要的洞察力。这些免疫亚群可以进一步分层成淋巴细胞或髓系细胞的起源, 这共同构成了大多数先天和适应性免疫反应2,3。最近在癌症免疫治疗领域的进展表明, 免疫治疗策略 (免疫检查点抑制剂, 嵌合体抗原受体 T 细胞) 有可能导致持久性癌症回归然而, 它们在45的实体肿瘤癌症中仍然相对无效。许多团体已经显示了时间可以在治疗成功6,7的关键障碍, 因此, 仍然需要准确地评估新的免疫疗法在临床前的设置专门关注其能够调节或克服时间8

目前的工作特点的时间通常利用显微镜或流式细胞术, 以及抗体标签策略, 以确定免疫细胞子集和其特点9,10。这两种策略提供独特的不同信息, 因为显微镜允许细胞子集的空间欣赏和流式细胞术提供高吞吐量和更广泛的细胞变化量化。尽管最近有改进的荧光复合免疫组化优化光谱成像系统, 现在可以支持多达7参数, 有限的面板大小使广泛的免疫分析困难, 因此这种技术往往为更集中的分析预留。因此, 流式细胞术仍然是最广泛使用的免疫分析技术之一。尽管其在时间表征中的广泛应用, 但用于加工和染色的方法相当多变。通常的协议使用肿瘤游离酶 (胶原酶, DNase) 和手工离解方法, 以实现单细胞悬浮, 其次是抗体染色和分析7。尽管每种方法都有好处, 但许多群体显示了通过这些技术11可以诱发的广泛的变异性。这使得跨研究比较的肿瘤微环境分析非常困难, 即使在评估相同的小鼠肿瘤模型。此外, 这些方法提供了有限的潜力, 以评估肿瘤细胞和肿瘤免疫渗透成分独立, 因为两个组成部分是散置后消化。样本数量, 然后限制多面板染色和分析, 这成为一个主要的问题时, 试图描述罕见的免疫子集 (肿瘤特异性 T 细胞)12。最近的技术, 如大规模细胞术, 或飞行时间的细胞术 (CyTOF), 允许高维细胞子集的表型分析与一些系统支持面板设计超过42独立参数13。尽管 CyTOF 技术在免疫分析方面具有巨大的威力, 但由于费用、分析专业知识和对设备的访问, 它仍然受到限制。此外, 许多 CyTOF 协议建议纯化免疫子集, 以提高信噪比14, 因此我们建议, 我们的浓缩方法可以用于 CyTOF 分析的上游, 以提高数据质量。

在此, 我们描述了一种肿瘤微环境消化和分析方法, 纳入肿瘤免疫渗透分离。这种方法的目的是允许独立高通量的肿瘤免疫浸润和肿瘤细胞分数的分析, 以更广泛地描述肿瘤微环境。利用该方法, 我们进一步论证了进行全肿瘤分析的重要性, 认为皮下实体瘤模型具有显著的空间免疫异质性。总的来说, 这种方法可以更准确和一致地比较样本, 因为它丰富的免疫细胞亚群在肿瘤和允许独立的分析肿瘤细胞和免疫分数的肿瘤。

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Protocol

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这里描述的所有方法都已被贝勒医学院的机构动物护理和使用委员会 (IACUC) 批准。

1. 肿瘤的收获和消化

注: 收割所需时间为 3-5 分钟/肿瘤, 加工所需时间为1小时 + 2-3 分/肿瘤。

  1. 弄死小鼠通过二氧化碳吸入和喷雾每只老鼠下来与70% 乙醇在收割前防止头发污染。手术切除小鼠皮下肿瘤, 确保肿瘤没有任何污染组织 (毛发、皮肤、腹膜等). 将每个肿瘤放置在1.8 毫升的基 RPMI-1640 培养基中, 而不需要胎牛血清 (血清) 在24井板中。为了更大的收成, 在冰上保持盘子的低温以保持细胞的活力。
    注: 如果需要不育, 所有的肿瘤解剖将需要在一个生物安全柜内使用无菌外科工具 (剪刀, 钳), 以及任何进一步的步骤。最长直径在 0.5-1 厘米之间的肿瘤是最佳的, 更大或更小的肿瘤将需要试剂的缩放。
  2. 用剪刀把肿瘤切成少于1毫米的3块。
  3. 通过溶酶 i 10 毫克/毫升, 胶原酶 IV 在 2500 u/毫升, 和 DNase I 在 200 U/毫升在基 RPMI-1640 培养基 (没有血清), 制备10x 消化鸡尾酒。
    注: 消化鸡尾酒可以提前一天准备, 储存在-20 摄氏度;但是, 不推荐长时间贮存, 因为酶一旦溶解就会失去活性。
  4. 添加200µL 的10x 离解鸡尾酒含有胶原酶 i, 胶原酶 IV, 和 DNase i 到每个井与1毫米3件。
  5. 允许样品消化1小时在37°c, 而轻微晃动 60-100 rpm 使用轨道平板振动筛。
    注: 在酶消化过程中, 温度升高到37摄氏度可能会导致免疫细胞活化。
  6. 1小时后, 加入1毫升的 RPMI-1640 培养基, 补充5% 的血清和2毫米 EDTA, 以抵消反应。
  7. 将肿瘤消化和剩余的肿瘤片注入40µm 细胞过滤器, 安装在50毫升离心管的顶端。
    注: 切断1毫升吸管尖端的尖端, 以便更容易地将肿瘤消化转移到滤网。
  8. 使用10毫升注射器柱塞通过过滤器机械地将肿瘤碎片分解。定期冲洗过滤器与2毫升补充 RPMI-1640 培养基 (含5% 的血清) 和重复, 直到细胞过滤器是明确的肿瘤。
    注: 大约 4-10 毫升的总介质应该足以充分冲洗滤网的肿瘤。
    注: 将样品放在冰上, 直到完成所有样品的步骤, 以保持细胞的生存能力。
  9. 使用补充的 RPMI-1640 介质, 将每50毫升离心管调整到同一体积。
    注: 容积调整对离心机平衡至关重要。跳过这一步可能会导致离心机损坏或人身伤害。
  10. 离心机细胞悬浮液 (5 分钟, 805 x g, 4 °c), 丢弃上清液, 并在2毫升补充 RPMI-1640 介质中重新悬浮。
    注: 细胞骨料可能形成后, 离心, 是难以并用重悬。使用5毫升血清吸管, 并迅速混合, 以打破它之前, 继续。

2. 免疫和肿瘤细胞分数的分离

注: 此步骤所需的时间约为1小时。

  1. 将3毫升的密度梯度介质添加到15毫升离心管的底部。为每个肿瘤准备和贴上足够的管子。
  2. 将2毫升的肿瘤细胞悬浮在密度梯度介质的顶部, 吹打缓慢地向下侧管以防止两层混合。
  3. 小心地放置在离心机的分层管和旋转20分钟在 805 x g, 20 °c, 没有刹车。
    注意: 验证适当的平衡并确保在离心过程中不使用刹车是非常重要的。此过程的任何中断都会导致图层混合, 并且完整的样本恢复将会很困难。
  4. 将肿瘤浸润的白细胞 (直至) 层和顶层培养基, 用转移吸管小心转移到新的15毫升管上。丢弃所有剩余的密度梯度介质, 并在2毫升的补充 RPMI-1640 中并用重悬在管底部的肿瘤颗粒。
    注: 离心后从上到下将有四个可见层, 分别对应于: 培养基、TILs、密度梯度介质和肿瘤细胞颗粒。有关各个层的示例, 请参见图 2A
  5. 在分离的管子 (5 分钟, 805 x g, 4 °c) 中, 离心两个直到和肿瘤标本, 并丢弃上清。
  6. 并用重悬在200µL 和肿瘤颗粒在2毫升补充 RPMI-1640 培养基中, 直到样品。保持冰块以保持生存能力。

3. 电镀和染色

注: 电镀所需时间为三十年代/肿瘤;表面染色所需时间为1小时;细胞内染色所需时间为40分钟;流式细胞术分析所需的时间为 1-4 min/肿瘤。

  1. 为每个免疫染色板准备并标记一个96井的 U 型底板, 并为细胞计数增加一个盘子。
    注: 通常, 总共准备了三个板块: 淋巴细胞聚焦板、髓系聚焦板和细胞计数板。
  2. 整除将单细胞悬浮液放入每一个染色板, 并将一组容积放入计数板中。
    注: 计数板用于计算添加到每个染色面板的单元格总数, 从而允许准确的细胞数量计数。96井板取样和容积分析能力的流式细胞仪可以提供每个样本中每个µL 的单元数, 因此计算添加到每个染色面板中的单元格数。计数板可以获得第二天后固定过夜4摄氏度, 冲洗与外地资产管制署缓冲 (磷酸盐缓冲盐水 (PBS) 与2% 的血清), 并 resuspending 在一套量的外地资产管制署缓冲区。
  3. 用200µL 的 Dulbecco 磷酸盐缓冲盐水 (DPBS) 以离心 (5 分钟, 805 x g, 4 摄氏度) 清洗两次细胞, 并在每次冲洗之间丢弃上清, 以除去任何自由的血清。
  4. 添加50µL 的 Fc 块, 混合样品使用多通道吸管, 并孵化20分钟4摄氏度。
  5. 添加50µL 的2x 浓缩细胞外靶向抗体和固定生存能力染色混合物, 混合使用多通道吸管, 并孵化30分钟在黑暗中的 RT 或4°c。
    注: 抗体的确切染色条件取决于制造商的指示。所有染色稀释必须在 DPBS, 没有添加的血清, 以防止饱和的可修复的活性染料。请参阅本手稿中使用的染色面板的最佳稀释的材料/设备表。抗体和可修复的生存能力染色解决方案是在2x 浓度, 以提供最终1x 染色浓度100µL 的总染色量时添加到 Fc 块。
  6. 用离心 (5 分钟, 805 x g, 4 °c) 将样品清洗两次, 并在每次冲洗之间丢弃上清液。
  7. 并用重悬在200µL 1x 固定/通透溶液和孵化过夜4摄氏度保护免受光照。
    注意: 这个实验可以在一夜之间暂停, 在这一点上: 保持样品在4摄氏度的保护免受光照。
  8. 第二天, 离心板 (5 分钟, 805 x g, 4 °c), 并丢弃上清。
  9. 冲洗一次与200µL 1x 通透缓冲器, 离心机 (5 分钟, 805 x g, 4 °c), 并丢弃上清。
  10. 添加100µL 1x 浓缩细胞内抗体染色板, 在1x 通透缓冲和孵化30分钟在黑暗中的 RT 或4°c (这取决于染色建议从制造商)。
  11. 冲洗一次与1x 通透缓冲 (5 分钟, 805 x g, 4 °c), 放弃上清, 和漂洗第二次与资产管制署缓冲 (PBS 与2% 血清)。
  12. 并用重悬300µL (PBS 2% 胎) 的样品, 将样本转移到流式细胞术管, 进行流式细胞仪分析。

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Representative Results

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我们的研究结果表明, 从非免疫性肿瘤成分分离的显著优势, 如议定书所解释的。此外, 使用所描述的方法, 我们证明了明显的免疫异质性的建立实体肿瘤。

许多肿瘤离解技术的一个重要问题是样本生存能力的丧失, 最常见的原因是严酷的消化条件 (高温、营养供给不足)。使用描述的消化方法, 有或没有密度梯度培养基富集, 提供大约 70-90% 总细胞生存能力由流式细胞仪评估 (图 1A)。类似的可行性被观察到丰富和肿瘤丰富的分数, 表明这种方法导致最小的总体毒性 (图 1A,图 2C)。此外, 密度梯度培养基的富集促进了大于2倍的 CD45 阳性细胞比非富集肿瘤消解 (图 1B, C) 的总生存率的分数增加。此外, 在免疫微环境研究中发现了大量的免疫细胞亚群, 包括髓源抑制细胞 (MDSCs)、树突状细胞 (DCs)、巨细胞、CD8 t 细胞和 CD4 t 细胞 (图 1D, E)。这表明, 密度梯度培养基富集促进全球免疫充实, 并没有隔离特定的淋巴细胞或髓细胞群 (见补充图 1A, B为流式细胞学检测方法用于识别特定的细胞群)。然而值得注意的是, 许多商业上可用的密度梯度分离媒体允许大量的红细胞和粒细胞通过分离阶段。因此, 如果这些群体感兴趣, 可能需要进一步的协议优化。

Figure 1
图 1: 温和有效地丰富肿瘤免疫浸润.采用所述方法对建立的 MEER 肿瘤进行切除和消化。消化后, 单细胞悬浮液分为半密度梯度培养基富集, 另一半为直接染色。(A) 累积流式细胞仪评估肿瘤消解的细胞生存能力或无密度梯度培养基富集。(B) 具有代表性的流式细胞术门地块, 显示 CD45 阳性免疫细胞丰富的单肿瘤消化和无密度梯度培养基富集。(C) 累积流式细胞术 CD45 肿瘤消解总存活细胞与或无密度梯度培养基富集的阳性细胞百分比。(D) 各种髓细胞和淋巴细胞免疫种群的浓缩比率。在染色和流式细胞术前, 肿瘤经直接染色或密度梯度浓缩后, 被消化为单细胞悬浮液。每种细胞的富集比都是通过其非富集物的密度梯度富集肿瘤消化率除以给定的细胞-人口百分比 (在可评估的总存活细胞中)。条形线表示中间值, 条形图的边缘表示最小和最大比率。(E) 用于识别每个免疫细胞种群的免疫细胞标记表达式表。统计学意义是通过配对 t 检验或曼惠特尼测试确定的。*p < 0.05, **p < 0.01, ***p < 0.001, ***p < 0.0001, (n = 20 肿瘤, n = 2 为所有图)。请单击此处查看此图的较大版本.

这种方法所提供的最重要的优点之一是能够独立地配置非免疫性肿瘤分数。在分离出经过密度梯度介质阶段的颗粒非免疫肿瘤分数后, 可以执行复杂的肿瘤分析板, 以前可能受到荧光数和样本数量限制的限制。图 2以70% 的生存能力和 99% CD45 阴性细胞富集为例, 展示了肿瘤流式细胞术的特点。CD45 阴性分数可以被描述为许多肿瘤的特点, 如整体肿瘤的生存能力或细胞凋亡 (caspase 3, 蛋白 V), 增殖容量 (Ki67), 并表达各种免疫抑制标记 (程序性死亡-配体 1 (PD-L1) 或 PD-L2)。然而, 应该指出, CD45 阴性分数包括肿瘤细胞以及其他基质和血管元素的肿瘤微环境。因此, 如果需要直接的肿瘤细胞特征, 需要使用肿瘤细胞特异标记 (角蛋白、特异肿瘤相关抗原)。同样, 其他肿瘤基质元素可以很容易地识别和特点后, 标记与细胞型特定标记, 如肿瘤血管内皮细胞 (CD31) 和癌症相关的成纤维细胞 (α平滑肌肌动蛋白)。然而, 在重复样本中, 生存能力和 CD45 负细胞富集的水平是高度一致的, 表明密度梯度分离技术对非免疫性肿瘤成分富集的鲁棒性 (图 2B, C).

Figure 2
图 2: 丰富和分析非免疫性肿瘤的成分特征.(a) 以下的代表性图像: 密度梯度培养基富集, 可见培养基层 (粉红色), 直到层 (薄的混浊白色), 密度梯度介质层 (清晰), 以及在管底部的肿瘤颗粒。(B) 具有代表性的流式细胞术门策略用于分析非免疫性肿瘤成分, 细胞活性散射图 (顶部), CD45 阴性细胞富集散射图 (左下), 和三独立标记的兴趣通过直方图图 (PD-L1 顶部、PD-L2 中部和 Ki67 底部) 表达。FMO 直方图表示与所有其他面板颜色一起着色但缺少感兴趣标记的样本。累积流式细胞术评估 (C) 细胞生存能力和 (D) CD45 密度梯度培养基富集 (n = 7-8 肿瘤) 后肿瘤颗粒分数的总存活细胞中的负细胞百分比。请单击此处查看此图的较大版本.

尽管对实体肿瘤的遗传异质性进行了大量的研究, 但很少有工作详细说明了实体肿瘤免疫亚群的空间异质性。因此, 我们的目的是确定髓细胞和淋巴细胞免疫亚群如何在一个单一的实体肿瘤急剧变化。因此, 一个已建立的 MEER 肿瘤被分为四个相等的部分, 特别照顾, 以确保每个部分包含约相等的肿瘤内区域, 以及相同的真皮和腹膜面部分 (图 3A)。每个肿瘤片断分别被消化, 然后由密度梯度媒介丰富和分裂在髓质和淋巴细胞小组。这允许量化的各种功能, 包括一些常见的评估免疫人口: t 细胞, CD4+ t 细胞, CD8+ t 细胞, 巨细胞, DCs, MDSCs (见补充图 1A, B为流式细胞术门策略)。在单个肿瘤中, 不同肿瘤分区之间存在显著的细胞变异性 (图 3b)。例如, DC 和 T 细胞的总细胞计数被发现在相邻肿瘤部分之间的变化多达4到5倍。当分析细胞数量占总存活细胞的百分比 (补充图 2A) 并在其他两个独立肿瘤的相似水平观察时, 也注意到了这些剧烈变化 (补充图 2B, C)。这些数据表明, 在进行免疫微环境分析时, 隔离和分析整个肿瘤的重要性, 如果目前的协议包括将肿瘤分割为独立分析, 则这似乎是违反常理的。方法 (组织学、RNA 定量)。此外, 这些数据可能解释肿瘤活检免疫学分析中的差异, 因为区域肿瘤免疫异质性可能大幅扭曲活检结果。

Figure 3
图 3: 评价已建立的肿瘤免疫异质性.(A) 在手术切除后 (左) 和4相邻部分 (右) 后, 已建立的 MEER 肿瘤的代表性图像。刻度条为1厘米, 在每个图像上显示为黑色。(B) 在4相邻肿瘤部位中, 各粒细胞和淋巴细胞计数的折变;各肿瘤切片均进行相同的消化、密度梯度培养基浓缩过程、染色及分析。每个肿瘤部分显示为细胞计数褶皱变化, 由肿瘤部分除以其细胞计数的最低分析细胞计数的特定细胞数量确定。请单击此处查看此图的较大版本.

Supplemental Figure 1
补充图 1: 代表性流式细胞术门策略用于肿瘤免疫成分分析.(A) 采用各自散布地块的门控策略, 用于淋巴细胞免疫分析。(B) 采用各自散布地块的门控策略, 用于肿瘤髓细胞免疫分析。请单击此处查看此图的较大版本.

Supplemental Figure 2
补充图 2: 对已建立的肿瘤异质性的额外评估。(A) 从图 3中所示的4个相等肿瘤部分中, 细胞总数中的百分比变化。(B) 和 (C) 是两个额外建立的 MEER 肿瘤, 分为4个相邻部分, 并对肿瘤免疫异质性进行了分析。细胞计数折叠变化 (左) 和细胞百分比之间的总存活细胞折叠变化 (右) 为每个髓和淋巴细胞细胞的人口分析显示, 每一个4相邻肿瘤部分的变异性。请单击此处查看此图的较大版本.

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Discussion

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时间由多种复杂的细胞成分和分子组成。最近的证据表明, 准确的描述这个环境可以提供更好的理解治疗成功或失败, 甚至可以帮助确定机制的治疗耐药性。例如, 增加各种免疫抑制细胞 (MDSCs、T 调节细胞) 的瘤内水平, 可以减轻效应的免疫应答, 并消除免疫治疗效应。另一方面, 效应免疫种群 (肿瘤特异性 CD8+ t 细胞、自然杀伤细胞、t 辅助细胞) 的瘤内存在增加, 可以成为治疗成功的有力预测因子。另一个继续准确表达肿瘤免疫状态的特征是肿瘤细胞自身的表型特征。这包括各种免疫抑制性配体、酶或分子的表达, 目的是 downregulating 效应的免疫应答 (PD-L1, PD-L2, indolamine 23 酶, 一氧化氮)。结合起来, 这表明需要准确和广泛的定性的免疫和肿瘤细胞特征的实体肿瘤。

我们在这里描述的技术允许分离和丰富的固体小鼠皮下肿瘤的免疫和肿瘤细胞成分。然后, 可以进行独立的流细胞分析, 使肿瘤细胞的全时间和相互作用的时间可以被赞赏。经过浓缩, 广泛的免疫流式细胞术板可以优化, 以使关键髓质和淋巴细胞成分的特征, 以及描述其表型状态的各种特征。同样, 广泛的肿瘤细胞聚焦面板可以单独使用, 以提供广泛的特征的肿瘤细胞的特点以及。相对简单的这一技术可以同时分析大量的小鼠肿瘤, 这是至关重要的观察趋势, 尽管生物变异的小鼠肿瘤模型。此外, 肿瘤免疫浓缩提供了更好的鉴定罕见的免疫子集 (肿瘤特异性细胞毒性 T 细胞), 这往往显着在肿瘤内比其他非免疫细胞成分.这种技术的优化可以允许对这些需要浓缩的分离子集进行额外的下游分析, 如共培养的体外检测、mRNA 分析或收养细胞转移研究。

利用这种技术在皮下小鼠肿瘤模型中, 我们证明了全球和独立免疫子集的显著丰富。我们还演示了非免疫肿瘤的分析, 可以实现从相同的肿瘤样本。最后, 我们显示了整个肿瘤免疫分析的重要性, 因为我们观察到肿瘤相邻部分的免疫异质性显著。理想的情况下, 这种胶原酶和 DNase 的消化和梯度分离的肿瘤免疫和非免疫分数可以应用于大多数的小鼠肿瘤模型, 无论是原位和皮下。我们还观察到, 小的非建立的肿瘤和较少的胶原密集的肿瘤模型 (B16 黑色素瘤) 往往不需要酶消化步骤来产生单细胞悬浮15;然而, 基于梯度的免疫浓缩在这些肿瘤模型中的表现也同样好, 进一步验证了它的通用性。尽管以前对胶原酶抗原消化的关注在特定的细胞亚群11, 我们还没有观察到明显的染色质量损失的任何标记, 我们已经分析。然而, 在广泛采用这种技术之前, 应使用适当的不消化控制样本评估对这些消化条件的抗原敏感性。

总之, 我们的技术允许准确, 广泛和高通量的特点, 肿瘤免疫和非免疫成分的小鼠实体肿瘤。通过对这些子集进行独立的分析, 研究人员可以广泛地描述时间, 并获得更好的机械洞察力的固体肿瘤前期治疗。这种方法可以很容易地应用于绝大多数的小鼠肿瘤模型, 高通量分析淋巴细胞和髓免疫人口计数和表型通过流式细胞术, 或其他下游化验, 需要子集浓缩。

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Disclosures

作者没有什么可透露的。

Acknowledgments

JMN 承认国家卫生研究院 (T32GM088129) 和国立牙科 & 颅颌面部研究研究所 (F31DE026682) 的财政支持。内容完全是作者的责任, 不一定代表国家卫生研究院的官方意见。这个项目也得到了在贝勒医学院的细胞和细胞分类核心的支持, 从 NIH (P30 AI036211, P30 CA125123, S10 RR024574) 的资助和乔尔 m. Sederstrom 的专家协助。

Materials

Name Company Catalog Number Comments
6 to 12 week old male C57BL/6 mice Jackson Laboratory  N/A Mice used in our tumor studies
MEER Murine Syngeneic Cancer Cell line Acquired from collaborator  N/A E6/E7 HPV antigen expressing murine tonsillar epithelial cancer cell line 
70% isopropyl alcohol  EMD Milipore  PX1840
Murine surgical tool kit World Precision Instruments MOUSEKIT Primarily only need scissors, tweezers, and a scalpel. 
24-well plate  Denville Scientific Inc. T1024 Or any 24-well flat bottom plate. 
RPMI-1640 media Sigma-Aldrich R0883
Collagenase I  EMD Milipore 234153
Collagenase IV Worthington Biochemical Corporation LS004189
DNase I  Sigma-Aldrich 11284932001
Low Speed Orbital Shaker BioExpress (supplier: Genemate)  S-3200-LS Or any orbital shaker. 
Thermoregulating incubator Fisher Scientific 13-255-27 Or any other thermo-regulated incubator
FBS Sigma-Aldrich F8192
EDTA AMRESCO E177
1 mL Pipette and tips Eppendorf 13-690-032 Or any other pipette and tips
40 um Cell Strainers Fisher Scientific 22363547
50 mL Centrifuge Tubes Denville Scientific Inc. C1062-P
15 mL Conical Tubes Denville Scientific Inc. C1012
10 mL Luer-Lok Syringe without needles BD 309604
Lymphoprep Density Gradient Medium STEMCELL Technologies 7811
Transfer Pipettes Denville Scientific Inc. P7212
96-well U-bottom plates Denville Scientific Inc.
DPBS Sigma Aldrich  D8573
FoxP3 Transcription Factor Staining Buffer Set  ThermoFisher Scientific 00-5523-00 Fix/Permeabilization Buffer and Permeabilization Buffer
Thermoregulated Centrifuge Eppendorf  5810 R
Attune NxT Flow Cytometer ThermoFisher Scientific N/A For 96-well cell volumetric counting 
Purified Rat Anti-Mouse CD16/CD32 (Mouse BD Fc Block) Clone 2.4G2  ThermoFisher Scientific 553141 Fc Block
LIVE/DEAD Fixable Blue Dead Cell Stain Kit, for UV excitation ThermoFisher Scientific L34962 Fixable viability stain
CD45 Monoclonal Antibody (30-F11), APC-eFluor 780 ThermoFisher Scientific 47-0451-80
TCR beta Monoclonal Antibody (H57-597), APC ThermoFisher Scientific 17-5961-82
CD8-α Antibody (KT15), PE Santa Cruz Biotechnology sc-53473 
CD4 Monoclonal Antibody (GK1.5), PE-Cyanine5 ThermoFisher Scientific 15-0041-81
MHC Class II (I-A/I-E) Monoclonal Antibody (M5/114.15.2), Alexa Fluor 700 ThermoFisher Scientific 56-5321-82
CD11c Monoclonal Antibody (N418), PE-Cyanine5 ThermoFisher Scientific 15-0114-82
F4/80 Monoclonal Antibody (BM8), eFluor 450 ThermoFisher Scientific 48-4801-80
CD11b Monoclonal Antibody (M1/70), APC ThermoFisher Scientific 17-0112-81
Ly-6G (Gr-1) Monoclonal Antibody (RB6-8C5), PE ThermoFisher Scientific 12-5931-82
CD274 (PD-L1, B7-H1) Monoclonal Antibody (MIH5), PE-Cyanine7 ThermoFisher Scientific 25-5982-80
CD273 (B7-DC) Monoclonal Antibody (122), PerCP-eFluor 710 ThermoFisher Scientific 46-9972-82
Ki-67 Monoclonal Antibody (B56), BV711 BD Biosciences 563755

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

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肿瘤免疫和非免疫微环境在小鼠皮下肿瘤中的富集与鉴定
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Newton, J. M., Hanoteau, A., Sikora, A. G. Enrichment and Characterization of the Tumor Immune and Non-immune Microenvironments in Established Subcutaneous Murine Tumors. J. Vis. Exp. (136), e57685, doi:10.3791/57685 (2018).More

Newton, J. M., Hanoteau, A., Sikora, A. G. Enrichment and Characterization of the Tumor Immune and Non-immune Microenvironments in Established Subcutaneous Murine Tumors. J. Vis. Exp. (136), e57685, doi:10.3791/57685 (2018).

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